CN114480680B - 检测沙门菌血清型抗原基因分型的引物组及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种检测沙门菌血清型抗原基因分型的引物组及其应用，提供了检测沙门菌血清型抗原基因分型的引物组，提供的引物组根据200种常见的沙门菌血清型分析得到的55个沙门菌血清型抗原基因的具体基因区域进行设计得到的，确保提供的引物组覆盖范围广，保证采用该引物组能够基于荧光探针熔解曲线法同时检测55个沙门菌血清型抗原基因，在4小时内完成分型检测，大大提高了检测效率，且操作简便，检测成本低，结果稳定可靠，能够代替传统的血清学法进行使用，保证了准确率和检测效率，适宜临床和疾控机构的大规模检测。

Description

检测沙门菌血清型抗原基因分型的引物组及其应用
技术领域
本申请属于生物检测技术领域，尤其涉及一种检测沙门菌血清型抗原基因分型的引物组及其应用。
背景技术
沙门菌(Salmonella)为重要的食源性致病菌，广泛地存在于自然界，能引起多种动物感染，人类主要因食用受污染的动物性食品、牛奶、鱼、贝、新鲜水果、蔬菜等造成感染，引起胃肠炎、菌血症以及伤寒等。每年全球范围内约9千多万人因感染沙门菌而引起胃肠炎，其中约155，000人死亡；沙门菌感染引起的食源性疾病居于全球食源性疾病的前二位。
沙门菌血清型种类繁多，血清型是世界各国学者进行沙门菌研究和交流的国际语言，全球目前已发现超过2700种血清型。与人类疾病密切相关的沙门菌血清型有100多种，沙门菌不同血清型因其遗传结构差异和寄生的宿主类型不同，导致其不同血清型的沙门菌流行特征不同，疾病类型、耐药性以及治疗方案也存在差异。在食品安全风险监测、食源性疾病监测以及临床病原鉴定中，沙门菌型别的鉴定和溯源对于沙门菌病的预防控制、传染源追踪和危险因素分析乃至临床诊疗都具有重要的意义。其中对沙门菌进行血清分型是沙门菌感染治疗及溯源的前提。
血清分型是以White-Kauffmann-Le minor scheme抗原诊断表成为沙门菌血清型鉴定的金标准，血清免疫学的分型鉴定一直是临床和疾病监控以及食品检验机构应用最为广泛的技术之一。这种经典的检测手段存在着一些缺陷：(1)检测结果依赖肉眼观察，容易受到主观因素干扰；(2)操作繁琐，需要通过O、H等多瓶血清逐个筛查反复操作；(3)耗时长，需要诱导抗原多次转种，通常需时3天或者更长的时间；(4)血清质量控制十分复杂，批间差也会出现不一致结果；(5)凝集反应迟缓或反应较弱也容易产生错误的分型结果。另外由于血清质量影响，H抗原II相诱导结果不好，导致部分沙门菌不能分型。而且由于国内血清种类不齐全或有些单价血清凝集效果不好，目前主要依赖进口血清进行分型，菌株鉴定价格昂贵。
随着分子生物学技术的发展，越来越多的学者开始借助聚合酶链式反应(PCR)、荧光PCR技术和芯片技术，但目前这些方法也存在一些问题：(1)多重PCR存在扩增产物需电泳，易产生气溶胶和出现污染的缺陷；(2)已建立的多重荧光PCR方法覆盖的血清型种类少，通量低，不能满足常见血清型的需求；(3)液相悬浮芯片需开盖进行扩增产物杂交，操作繁琐；液相芯片又面临国外垄断、试剂和仪器设备昂贵等问题。因此，现有检测方法需要进行改进。
发明内容
本申请的目的在于提供一种检测沙门菌血清型抗原基因分型的引物组及其应用，旨在解决现有技术中无法快速、准确判断沙门菌血清型抗原基因分型的问题。
为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
第一方面，本申请提供检测沙门菌血清型抗原基因分型的引物组，引物组包括：
用于检测沙门菌O2血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2；
用于检测沙门菌O4血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4；
用于检测沙门菌O6,7血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6；
用于检测沙门菌O6,8血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8；
用于检测沙门菌O9,12血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.9和SEQID No.10；
用于检测沙门菌O3,10血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.11和SEQID No.12；
用于检测沙门菌O11血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.13和SEQ IDNo.14；
用于检测沙门菌a/d血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.15和SEQ IDNo.16；
用于检测沙门菌b/c血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.17和SEQ IDNo.18；
用于检测沙门菌i血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.19和SEQ IDNo.20；
用于检测沙门菌e,h血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.21和SEQ IDNo.22；
用于检测沙门菌f,g/f,g,s/f,g,t血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ IDNo.23和SEQ ID No.24；
用于检测沙门菌g,t/g,s,t血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.25和SEQ ID No.26；
用于检测沙门菌1,7血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.27和SEQ IDNo.28；
用于检测沙门菌1,6血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.29和SEQ IDNo.30；
用于检测沙门菌w-H2血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.31和SEQID No.32；
用于检测沙门菌e,n,x/e,n,z15血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ IDNo.33和SEQ ID No.34；
用于检测沙门菌z35血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.35和SEQ IDNo.36；
用于检测沙门菌O13血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.37和SEQ IDNo.38；
用于检测沙门菌O16血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.39和SEQ IDNo.40；
用于检测沙门菌O18血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.41和SEQ IDNo.42；
用于检测沙门菌O21血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.43和SEQ IDNo.44；
用于检测沙门菌O30血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.45和SEQ IDNo.46；
用于检测沙门菌O35血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.47和SEQ IDNo.48；
用于检测沙门菌O9,46血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.49和SEQID No.50；
用于检测沙门菌c血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.51和SEQ IDNo.52；
用于检测沙门菌d血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.53和SEQ IDNo.54；
用于检测沙门菌r血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.55和SEQ IDNo.56；
用于检测沙门菌z4,z23血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.57和SEQID No.58；
用于检测沙门菌f,g,s/g,m,s/g,s,t/g,t血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.59和SEQ ID No.60；用于检测沙门菌m,t血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.61和SEQ ID No.62；
用于检测沙门菌1,2/1,6血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.63和SEQ ID No.64；
用于检测沙门菌1,5/1,7血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.65和SEQ ID No.66；
用于检测沙门菌e,n,z15血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.67和SEQ ID No.68；
用于检测沙门菌z6血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.69和SEQ IDNo.70；
用于检测沙门菌O42血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.71和SEQ IDNo.72；
用于检测沙门菌O48血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.73和SEQ IDNo.74；
用于检测沙门菌O51血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.75和SEQ IDNo.76；
用于检测沙门菌O39血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.77和SEQ IDNo.78；
用于检测沙门菌O43血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.79和SEQ IDNo.80；
用于检测沙门菌O40血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.81和SEQ IDNo.82；
用于检测沙门菌O3,19/O3,10血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.83和SEQ ID No.84；
用于检测沙门菌y血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.85和SEQ IDNo.86；
用于检测沙门菌k血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.87和SEQ IDNo.88；
用于检测沙门菌v血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.89和SEQ IDNo.90；
用于检测沙门菌z4,z24血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.91和SEQID No.92；
用于检测沙门菌m,t/f,g,t血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.93和SEQ ID No.94；
用于检测沙门菌g,m/g,m,s血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.95和SEQ ID No.96；
用于检测沙门菌O45血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.97和SEQ IDNo.98；
用于检测沙门菌z10血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.99和SEQ IDNo.100；
用于检测沙门菌z35-H1血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.101和SEQ ID No.102；
用于检测沙门菌z13血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.103和SEQID No.104；
用于检测沙门菌z29血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.105和SEQID No.106；
用于检测沙门菌O39血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.107和SEQID No.108；
用于检测沙门菌O6,14血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.109和SEQID No.110。
第二方面，本申请提供一种检测沙门菌血清型抗原基因分型的试剂盒，试剂盒包括引物组。
第三方面，本申请提供一种检测沙门菌血清型抗原基因分型的方法，提供检测沙门菌血清型抗原基因分型的试剂盒，采用基于多重杂交连接反应的荧光探针熔解曲线技术对检测沙门菌血清型抗原基因分型进行检测。
本申请第一方面提供的检测沙门菌血清型抗原基因分型的引物组，提供的引物组根据200种常见的沙门菌血清型分析得到的55个沙门菌血清型抗原基因的具体基因区域进行设计得到的，确保提供的引物组覆盖范围广，保证采用该引物组能够基于荧光探针熔解曲线法同时检测55个沙门菌血清型抗原基因，在4小时内完成分型检测，大大提高了检测效率，且操作简便，检测成本低，结果稳定可靠，能够代替传统的血清学法进行使用，保证了准确率和检测效率，适宜临床和疾控机构的大规模检测。
本申请第二方面提供的试剂盒含有提供的引物组，利用该试剂盒可以采用荧光探针熔解曲线法快速、高效、高通量地对55个沙门菌血清型抗原基因分型同时进行检测，提高了沙门菌血清型抗原基因分型的检测时间和检测准确性，并且保证灵敏度较高、成本较低，有利于进行广泛使用。
本申请第三方面提供的沙门菌血清型抗原基因分型的方法，利用检测沙门菌血清型抗原基因分型的试剂盒，采用基于多重杂交连接反应的荧光探针熔解曲线技术对沙门菌血清型抗原基因分型进行检测。由于试剂盒含有提供的引物组，利用该试剂盒可以采用荧光探针熔解曲线法快速、高效、高通量地对55个沙门菌血清型抗原基因分型同时进行检测，提高了沙门菌血清型抗原基因分型的检测时间和检测准确性，并且保证灵敏度较高、成本较低，有利于进行广泛使用。
附图说明
附图1为本申请实施例1提供的抗原鉴定结果示意图。
附图2为本申请实施例1提供的抗原鉴定结果示意图。
附图3为本申请实施例1提供的抗原鉴定结果示意图。
附图4为本申请实施例1提供的抗原鉴定结果示意图。
附图5为本申请实施例1提供的抗原鉴定结果示意图。
附图6为本申请实施例1提供的抗原鉴定结果示意图。
附图7为本申请实施例1提供的抗原鉴定结果示意图。
附图8为本申请实施例1提供的抗原鉴定结果示意图。
附图9为本申请实施例1提供的抗原鉴定结果示意图。
具体实施方式
为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
本申请实施例第一方面提供一种检测沙门菌血清型抗原基因分型的引物组，引物组包括：
用于检测沙门菌O2血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2；
用于检测沙门菌O4血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4；
用于检测沙门菌O6,7血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6；
用于检测沙门菌O6,8血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8；
用于检测沙门菌O9,12血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.9和SEQID No.10；
用于检测沙门菌O3,10血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.11和SEQID No.12；
用于检测沙门菌O11血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.13和SEQ IDNo.14；
用于检测沙门菌a/d血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.15和SEQ IDNo.16；
用于检测沙门菌b/c血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.17和SEQ IDNo.18；
用于检测沙门菌i血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.19和SEQ IDNo.20；
用于检测沙门菌e,h血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.21和SEQ IDNo.22；
用于检测沙门菌f,g/f,g,s/f,g,t血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ IDNo.23和SEQ ID No.24；
用于检测沙门菌g,t/g,s,t血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.25和SEQ ID No.26；
用于检测沙门菌1,7血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.27和SEQ IDNo.28；
用于检测沙门菌1,6血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.29和SEQ IDNo.30；
用于检测沙门菌w-H2血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.31和SEQID No.32；
用于检测沙门菌e,n,x/e,n,z15血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ IDNo.33和SEQ ID No.34；
用于检测沙门菌z35血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.35和SEQ IDNo.36；
用于检测沙门菌O13血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.37和SEQ IDNo.38；
用于检测沙门菌O16血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.39和SEQ IDNo.40；
用于检测沙门菌O18血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.41和SEQ IDNo.42；
用于检测沙门菌O21血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.43和SEQ IDNo.44；
用于检测沙门菌O30血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.45和SEQ IDNo.46；
用于检测沙门菌O35血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.47和SEQ IDNo.48；
用于检测沙门菌O9,46血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.49和SEQID No.50；
用于检测沙门菌c血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.51和SEQ IDNo.52；
用于检测沙门菌d血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.53和SEQ IDNo.54；
用于检测沙门菌r血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.55和SEQ IDNo.56；
用于检测沙门菌z4,z23血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.57和SEQID No.58；
用于检测沙门菌f,g,s/g,m,s/g,s,t/g,t血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.59和SEQ ID No.60；
用于检测沙门菌m,t血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.61和SEQ IDNo.62；
用于检测沙门菌1,2/1,6血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.63和SEQ ID No.64；
用于检测沙门菌1,5/1,7血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.65和SEQ ID No.66；
用于检测沙门菌e,n,z15血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.67和SEQ ID No.68；
用于检测沙门菌z6血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.69和SEQ IDNo.70；
用于检测沙门菌O42血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.71和SEQ IDNo.72；
用于检测沙门菌O48血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.73和SEQ IDNo.74；
用于检测沙门菌O51血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.75和SEQ IDNo.76；
用于检测沙门菌O39血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.77和SEQ IDNo.78；
用于检测沙门菌O43血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.79和SEQ IDNo.80；
用于检测沙门菌O40血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.81和SEQ IDNo.82；
用于检测沙门菌O3,19/O3,10血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.83和SEQ ID No.84；
用于检测沙门菌y血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.85和SEQ IDNo.86；
用于检测沙门菌k血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.87和SEQ IDNo.88；
用于检测沙门菌v血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.89和SEQ IDNo.90；
用于检测沙门菌z4,z24血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.91和SEQID No.92；
用于检测沙门菌m,t/f,g,t血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.93和SEQ ID No.94；
用于检测沙门菌g,m/g,m,s血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.95和SEQ ID No.96；
用于检测沙门菌O45血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.97和SEQ IDNo.98；
用于检测沙门菌z10血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.99和SEQ IDNo.100；
用于检测沙门菌z35-H1血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.101和SEQ ID No.102；
用于检测沙门菌z13血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.103和SEQID No.104；
用于检测沙门菌z29血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.105和SEQID No.106；
用于检测沙门菌O39血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.107和SEQID No.108；
用于检测沙门菌O6,14血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.109和SEQID No.110。
本申请实施例第一方面提供的检测沙门菌血清型抗原基因分型的引物组，提供的引物组根据200种常见的沙门菌血清型分析得到的55个沙门菌血清型抗原基因的具体基因区域进行设计得到的，确保提供的引物组覆盖范围广，保证采用该引物组能够基于荧光探针熔解曲线法同时检测55个沙门菌血清型抗原基因，在4小时内完成分型检测，大大提高了检测效率，且操作简便，检测成本低，结果稳定可靠，能够代替传统的血清学法进行使用，保证了准确率和检测效率，适宜临床和疾控机构的大规模检测。
在一些实施例中，本申请根据对深圳市疾病预防中心菌种库2006-2016年沙门菌血清型菌株数的统计和NCBI沙门菌菌株统计，按照沙门菌血清型菌株数由大到小排序，得到排名前200种沙门菌血清型列单，见表1。此常见200种沙门菌血清型在深圳市疾病预防控制中心沙门菌血清型菌种库中和NCBI中占到了98％，因此申请提供的沙门菌学清型对常见沙门菌血清型具有很大的代表性。
通过在NCBI上查找沙门菌血清型抗原基因并下载相关序列，并进行分析得到各个沙门菌的抗原决定基因，建立沙门菌血清型抗原基因数据库，通过比对得到每个抗原特异基因序列，并将所有特异序列导入NCBI检验特异性，确保不会和其他细菌基因组产生交叉。
表1
Figure BDA0003449346500000051
Figure BDA0003449346500000061
Figure BDA0003449346500000071
Figure BDA0003449346500000081
Figure BDA0003449346500000091
Figure BDA0003449346500000101
其中，沙门菌血清型抗原分子生物学机制：抗原是由菌体最外层类脂-多糖-多肽复合物决定，导致O抗原特异性的核心生物学基础是多糖的寡糖单位，而wzx和wzy两个基因分别特异性合成并识别转移寡糖单位，因此，wzx和wzy基因成为检测O抗原的基础。H抗原特异性是由鞭毛蛋白内氨基酸序列和空间结构决定，而fljC和fliB基因分别合成H1和H2抗原。
进一步的，在表1公开的沙门菌血清型公开的特异性抗原基因的基础上，设计了SEQ ID No.1～SEQ ID No.110提供的杂交连接引物，一共为55对杂交连接引物对，提供的55对杂交连接引物对进行PCR扩增反应中不会产生非特异性峰的引物。在本申请中，将55对杂交连接引物合理分配至3管中，并混合进行试验，要保证混合至一管的杂交连接引物之间进行检测的过程中不会出现干扰，同时还需要保证能够特异性扩增对应抗原基因，提供的就可以同时进行抗原基因分型的检测，检测速度快，准确性高。
具体的，55对杂交连接引物对，包括上游杂交连接引物和下游杂交连接引物。具体的引物序列如表2所示。
表2
Figure BDA0003449346500000102
Figure BDA0003449346500000111
Figure BDA0003449346500000121
Figure BDA0003449346500000131
Figure BDA0003449346500000141
本申请实施例第二方面提供一种检测沙门菌血清型抗原基因分型的试剂盒，试剂盒包括引物组。
本申请第二方面提供的试剂盒含有提供的引物组，利用该试剂盒可以采用荧光探针熔解曲线法快速、高效、高通量地对55个沙门菌血清型抗原基因分型同时进行检测，提高了沙门菌血清型抗原基因分型的检测时间和检测准确性，并且保证灵敏度较高、成本较低，有利于进行广泛使用。
在一些实施例中，试剂盒还包括连接酶、连接酶缓冲液。提供连接酶和连接酶缓冲液用于杂交连接反应。
在一些实施例中，试剂盒还包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、rTaq酶、上下游通用引物和荧光探针。提供的PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、rTaq酶、上下游通用引物和荧光探针用于荧光探针熔解曲线法检测反应。
在一些实施例中，上游通用引物的序列为SEQ ID No.111；其中，SEQ ID No.111为GTGGCAGGGCGCTACGAACAAT；下游通用引物的序列为SEQ ID No.112；其中，SEQ ID No.112为GCCCAGCAAGATCCAATCTCA。
在一些实施例中，荧光探针包括ROX荧光探针、FAM荧光探针、CY5荧光探针中的至少一种。荧光探针是在探针熔解曲线反应过程中用于与上游引物中的熔点温度标签序列进行结合的序列。
其中，ROX荧光探针为SEQ ID No.113，其序列(5’-3’)为CGACTCTGGCTGCTCGTTCGTGACG；FAM荧光探针为SEQ ID No.114，其序列(5’-3’)为CGGTCCTTCATCGCTCAGCCTTCACCGG；Cy5荧光探针为SEQ ID No.115，其序列(5’-3’)为GGTGAGGCCCTTGGCAGGTTGGTATCACCC。
本申请实施例第三方面提供一种检测沙门菌血清型抗原基因分型的方法，提供检测沙门菌血清型抗原基因分型的试剂盒，采用基于多重杂交连接反应的荧光探针熔解曲线技术对检测沙门菌血清型抗原基因分型进行检测。
本申请实施例第三方面提供一种检测沙门菌血清型抗原基因分型的方法，提供检测沙门菌血清型抗原基因分型的试剂盒，采用基于多重杂交连接反应的荧光探针熔解曲线技术对检测沙门菌血清型抗原基因分型进行检测。
在一些实施例中，根据提供的55种沙门菌血清型抗原基因分型进行检测，在检测过程中分为三管试剂，并使用ROX、FAM、CY5三个荧光通道进行检测。
在一些具体实施例中，将55种沙门菌血清型抗原基因分型分为三管，具体如下表3：
表3
Figure BDA0003449346500000142
Figure BDA0003449346500000151
在检测过程中，包括对抗原引物有效性检测以及抗原引物特异性检测，其中，对抗原引物有效性检测，具体为使用该单个抗原检测体系鉴定对应沙门菌菌血清型中的抗原，将不同血清型中的该抗原鉴定出则有效，否则该单抗原检测体系无效；抗原引物特异性检测，具体为将通过有效性检测的抗原鉴定体系鉴定所有抗原基因，如能特异性的鉴定该抗原，则该单重抗原鉴定体系特异性良好。
针对每一个管中，其中一个通道(如ROX)在单个基因检测成功的基础上逐个增加，直至全部抗原基因被检出，最后将三个通道引物混合，要求每个抗原基因都能被特异性检出，无交叉反应，LDR阴性对照显示无非特异信号出现。
在一些实施例中，检测沙门菌血清型抗原基因分型的方法依次包括杂交连接反应以及荧光探针熔解曲线法检测反应，在一些具体实施例中，荧光探针熔解曲线法检测反应依次包括进行荧光探针熔解曲线法PCR扩增反应后，进行荧光探针熔解曲线法荧光分析反应。
在一些实施例中，杂交连接反应包括如下步骤：
S01.将检测沙门菌血清型抗原基因分型的试剂盒的引物组溶液与沙门菌DNA模板混合，进行第一变性处理得到引物组混合液；
S02.将引物组混合液与连接酶、连接酶缓冲液混合，进行杂交连接反应得到杂交连接产物。
步骤S01中，将检测沙门菌血清型抗原基因分型的试剂盒的引物组溶液与沙门菌DNA模板混合，进行第一变性处理得到引物组混合液。在一些实施例中，将检测沙门菌血清型抗原基因分型的试剂盒的引物组溶液与沙门菌DNA模板混合的步骤中，引物组溶液的添加量为1.5uL；沙门菌DNA模板的添加量为5uL；以上述添加量进行混合后，进行第一变性处理。
在一些实施例中，进行第一变性处理得到引物组混合液的步骤中，第一变性处理的条件如下：95℃变性5分钟，75℃暂停取出，添加杂交连接反应液。
步骤S02中，将引物组混合液与连接酶、连接酶缓冲液混合，进行杂交连接反应得到杂交连接产物。
在一些是实施例中，反应体系为10uL，其中，连接酶的添加量为(1U/μL)1μL、连接酶缓冲液的添加量为1μL、ddH2O的添加量为1.5μL，引物组混合液(包括上下游引物和模板)的添加量为6.5μL。
在一些实施例中，进行杂交连接反应得到杂交连接产物的步骤中，杂交连接反应的条件如下：60℃连接80分钟，95℃变性5分钟，4℃保存。
进一步，将得到的杂交连接产物作为模板进行荧光探针熔解曲线法检测反应。
在一些实施例中，荧光探针熔解曲线法检测反应，包括进行荧光探针熔解曲线法PCR扩增反应后，进行荧光探针熔解曲线法荧光分析反应。
在一些实施例中，荧光探针熔解曲线法检测反应的反应体系如下表4所示，
表4
Figure BDA0003449346500000161
在一些实施例中，进行荧光探针熔解曲线法PCR扩增反应的条件如下：95℃预变性3分钟，95℃变性10秒，57℃退火20秒，72℃延伸20秒，设置38个循环反应，同时在57℃采集ROX、Cy5、FAM的荧光信号。
进一步地，进行荧光探针熔解曲线法PCR扩增反应后，进行荧光探针熔解曲线法荧光分析反应，其中，进行荧光探针熔解曲线法荧光分析反应的条件如下：95℃变性1分钟，40℃杂交2分钟，从40℃逐步升温至85℃，并采集ROX、Cy5、FAM的荧光信号，进行荧光熔解曲线分析。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
对沙门菌血清型抗原基因分型进行检测
(一)获取实验菌株
实验所用常见30株阳性沙门菌血清型菌株、验证特异性所用的9株大肠杆菌、奇异变形杆菌等均来自深圳市疾病预防控制中心菌种库，方法学评估所用的1261株临床沙门菌菌株来自广东省、河南省、四川省、江苏省、浙江省和四川省自贡市六个地区疾病预防控制中心，55种沙门菌血清抗原基因质粒由上海生工合成。
(二)分离和鉴定
沙门菌菌株的分离：将沙门菌划线接种于沙门显色平板，于恒温培养箱中37℃培养12小时得到单菌落，接着挑取粉红色菌落接种于3mL的LB培养液中，放置摇床中在37℃，180r/min条件下培养12小时得到沙门菌菌液。
沙门菌血清型鉴定：参考国标《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门菌检验》GB 4789.4-2016，将沙门菌菌株经过选择性培养基筛查，挑取可疑菌落接种到三糖铁和鞭毛诱导液培养(12h，37℃)，经过血清凝集实验，按照White-Kauffmann-Le minor scheme抗原诊断表就可以得到菌株的血清型。
(三)核酸提取
构建体系所用的沙门菌菌株核酸提取采用QIAGEN公司的革兰氏阴性菌细菌基因组提取试剂盒提取，将提取得到的核酸用紫外可见光蛋白核酸分析仪(BioPhotometerUltrospec-2000)进行核酸浓度测定，所有核酸置于-20℃保存。
评估用沙门菌核酸采用水煮法提取核酸，挑取沙门菌单菌落到200μL无菌水中混匀，在沸水中处理5min，最后离心(12000g，3min)得到上清液为沙门菌核酸模板。
(四)探针设计
在NCBI上查找沙门菌血清型抗原基因并下载相关序列，并结合第一章的工作综合提取公共数据库和项目所产出基因组数据中的抗原决定基因，建立沙门菌血清型抗原基因数据库如表1所示。通过比对得到每个抗原特异基因序列，并将所有特异序列导入NCBI检验特异性，确保不会和其他细菌基因组产生交叉。最后根据杂交连接探针设计原则设计55个沙门菌血清型抗原基因引物组(如表2所示SEQ ID No.1～SEQ ID No.110的序列)，所有引物由上海生工有限公司合成和纯化。
(五)多重连接探针熔解曲线体系的建立
根据表3，将55种沙门菌血清型抗原基因分型分为三管进行检测反应。
(1)普通PCR连接反应
连接反应体系总体积为10uL：连接酶(1U/μL)1μL、连接酶缓冲液1μL、连接引物F/Rmix(10nM)1.5μL、模板DNA 5μL，ddH2O 1.5μL；
连接反应程序为：将模板DNA和连接引物F/R mix混合，95℃变性5分钟，75℃暂停取出；再添加其他试剂，并于60℃连接80分钟，95℃变性5分钟，4℃保存。
(2)荧光PCR扩增和熔解曲线分析
荧光探针熔解曲线法检测反应的反应体系为50μL：10×Buffer 5μL、dNTP(2.5mM)4μL、Mg2+(1.5mM)3μL、上游引物(2.5μM)0.3μL、下游引物(50μM)0.3μL、ROX probe(50μM)0.2uL、FAM probe(50μM)0.2μL、CY5 probe(50μM)0.2μL、rTaq(5U/μL)0.2μL、DDW 31.4μL，杂交连接产物5uL。
荧光探针熔解曲线法PCR扩增反应的条件如下：95℃预变性3分钟，95℃变性10秒，57℃退火20秒，72℃延伸20秒，设置38个循环反应，同时在57℃采集ROX、Cy5、FAM的荧光信号；
进行荧光探针熔解曲线法PCR扩增反应后，进行荧光探针熔解曲线法荧光分析反应，其中，进行荧光探针熔解曲线法荧光分析反应的条件如下：95℃变性1分钟，40℃杂交2分钟，从40℃逐步升温至85℃，并采集ROX、Cy5、FAM的荧光信号，进行荧光熔解曲线分析。
实施例2
多重连接探针熔解曲线体系的特异性实验
用建立的探针熔解曲线体系检测本文的常见200种沙门菌血清型，同时以深圳市疾病预防控制中心菌株库中种沙门菌血清型和3种肠道致病菌(大肠杆菌、志贺氏菌和奇异变性杆菌)做体系特异性验证。
实施例3
多重连接探针熔解曲线体系最低检出限实验
选取常见200株沙门菌血清型阳性标准菌株用于最低检出限测定。使用水煮法提取核酸，使用紫外可见光蛋白核酸分析仪(BioPhotometer Ultrospec-2000)检测样本核酸浓度，并将各样本核酸浓度定到102ug/uL级别。按照梯度稀释法得到样本核酸浓度分别为101、100、10-1、10-2ug/uL样本。最后对每个沙门菌血清型的梯度核酸做检测，每株菌做3个平行，避免偶然误差。
实施例4
多重连接探针熔解曲线体系重复性实验
在本体系最低检出限的范围内对每个菌株设置菌含量2×107和2×1010两个浓度梯度，每个梯度做三个平行试验，避免偶然误差。计算三个平行沙门菌样本的抗原的Tm值和标准差，得到批内差和批间差，考察本试验体系的重复性。
实施例5
多重连接探针熔解曲线体系方法学评价
方法学评估所用的1261株临床沙门菌菌株来自广东省、河南省、四川省、江苏省、浙江省和四川省自贡市六个地区疾病预防控制中心进行分子鉴定，与传统金标准方法“血清学”方法做比较。所有菌株经过水煮法提取核酸，上机进行检测，将得到的结果与菌种库中血清型信息做对比。比较两种方法检测结果的一致性，并计算体系灵敏度，特异度和Kappa值。评估该熔解曲线检测体系的临床应用价值。
结果分析
实施例1结果分析
多个基因多重连接探针熔解曲线体系的建立
使用ROX、FAM、CY5三个荧光通道，建立三管55重鉴定体系。抗原鉴定结果如图1～图9所示。具体的结果判读如表5所示。
实施例2结果分析
多重连接探针熔解曲线体系的特异性考察结果
用建立的探针熔解曲线体系以深圳市疾病预防控制中心菌株库中40种沙门菌血清型菌株，55种沙门菌血清型抗原基因和3种肠道致病菌菌株(大肠杆菌、志贺菌和奇异变性杆菌)做体系特异性验证。结果见表5：常见200种沙门菌血清型相同的抗原可被检出，不同抗原不能被检出。3种肠道致病菌(大肠杆菌、志贺菌和奇异变性杆菌)结果显示全部为阴性。常见200种沙门菌和用于特异性鉴定。结果判读说明：例如1-ROX-70.5-O:4(B)群：1代表第一管，ROX代表ROX荧光通道，70.5代表熔解峰温度，O:4(B)群代表血清学上的O:4(B)菌群。实验结果：1-ROX-70.5-O:4(B)群、1-FAM-75-H1-i、2-CY5-66.5-H2-1,2即代表检测到沙门菌抗原O:4(B)群、i、1,2，在沙门菌血清学上是鼠伤寒沙门菌。
表5
Figure BDA0003449346500000181
Figure BDA0003449346500000191
Figure BDA0003449346500000201
Figure BDA0003449346500000211
实施例3结果分析
多重连接探针熔解曲线体系的最低检出限实验结果
选取特异性实验的200株阳性标准菌株用于最低检出限测定。制备各阳性菌落核酸溶液，按照梯度稀释法得到样本核酸浓度分别为101、100、10-1、10-2ug/uL样本，并对每个沙门菌血清型的梯度核酸做检测，每株菌做3个平行，避免偶然误差，该体系最低检出限为1.04-1.56ng/uL，见下表6，目前本体系检测能力为1ng/uL级别。
表6
Figure BDA0003449346500000212
Figure BDA0003449346500000221
Figure BDA0003449346500000231
Figure BDA0003449346500000241
Figure BDA0003449346500000251
Figure BDA0003449346500000261
实施例4结果分析
多重连接探针熔解曲线体系重复性实验结果
在本体系最低检出限的范围内对每个菌株设置菌含量2×107和2×1010两个浓度梯度，每个梯度做三个平行试验，避免偶然误差。得到24个沙门菌血清型抗原的Tm值和标准差，并计算得到批内差和批间差，考察本试验体系的重复性，批内差和批间差的变异系数均小于1％，见表7，这表明建立的体系特异性和重现性均高。
表7
Figure BDA0003449346500000262
Figure BDA0003449346500000271
Figure BDA0003449346500000281
实施例5结果分析
多重连接探针熔解曲线体系的特异性实验
用建立的探针熔解曲线体系鉴定所用常见30株阳性沙门菌血清型菌株、55种沙门菌血清型抗原基因质粒和9株3种肠道致病菌(大肠杆菌、志贺氏菌和奇异变性杆菌)，无交叉反应，特异性良好。
实施例6结果分析
多重连接探针熔解曲线体系方法学评价
方法学评估所用的1261株临床沙门菌菌株来自广东省、河南省、四川省、江苏省、浙江省和四川省自贡市六个地区疾病预防控制中心进行分子鉴定，与传统金标准方法“血清学”方法做比较。所有菌株经过水煮法提取核酸，上机进行检测，将得到的结果与菌种库中血清型信息做对比。比较两种方法检测结果的一致性，结果显示：基于MLMA的常见200种沙门菌血清型鉴定方法的灵敏度为96％，特异度100％，Kappa值为0.99，表8。该体系可特异性检出相对应的抗原，从而准确鉴定沙门菌血清型，无交叉反应，一致性良好。
表8
Figure BDA0003449346500000282
Figure BDA0003449346500000291
注：荧光探针熔解曲线灵敏度：阳性符合率＝A/(A+B)×100％＝96％
荧光探针熔解曲线特异度：阴性符合率＝D/(C+D)×100％＝100％
荧光探针熔解曲线Kappa＝(Po-Pe)/(1-Pe)＝0.99
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市疾病预防控制中心（深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所）
<120> 检测沙门菌血清型抗原基因分型的引物组及其应用
<130> 2021-12-16
<160> 115
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
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gtaaccaaag tacaggttaa tgctcctgtt gcagtgagat tggatcttgc tgggc 55
<210> 23
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gtggcagggc gctacgaaca atcctatcgg tcctttatcg ctcacccttc accggaaaca 60
tttttgcttg attgtaaggt agcagaat 88
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 24
caacattcgc cgcaccactg agattggatc ttgctgggc 39
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<211> 88
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 25
gtggcagggc gctacgaaca atcctatccg ttctttatcg ctcagccttc atcgggtata 60
aacatttttg cttgattgta aggtgcca 88
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 26
tcattaacat tcgctgcacc agcggtaata tctgagattg gatcttgctg ggc 53
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gtggcagggc gctacgaaca atcctacggt gcggaccttt gccgattggc atcacccact 60
ttgttactat tggtggcttt actggtgctg atct 94
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<212> DNA
<213> 人工合成
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cgacaaaaat ggcgattatg aagttaacgt tgctatgaga ttggatcttg ctgggc 56
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 29
gtggcagggc gctacgaaca atcctacggt gaggaccttt gcagattggc atcacccata 60
cagctatcaa agcggctata ggtggtacgc 90
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ttggcacggc ttctgtaacc ggtggtacag tttgagattg gatcttgctg ggc 53
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 31
gtggcagggc gctacgaaca atcctacggt gaggcccttg gcaggttgct atcaccctta 60
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<400> 32
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<400> 33
gtggcagggc gctacgaaca atcctacggt gaagcccttg gcaggtcggt atcacccatg 60
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gtggcagggc gctacgaaca atcctacggt gaagcccttg gcaggtcggt atcacccatc 60
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<212> DNA
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<400> 37
gtggcagggc gctacgaaca atcctaacga ctctggctgc tcgttcgtga cgttctgcag 60
aggctattgc tgaaaaatgg tttag 85
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
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gtggcagggc gctacgaaca atcctaacga ctctagctgc tcgttcgtga cgctttatat 60
tgcttgtcga ctacggtttc aattattc 88
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gtggcagggc gctacgaaca atcctaacga ctctgtcttc tcgttcgtga cgcaatattt 60
ccacaattaa ataattatag gctttaaact cca 93
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 42
tctccataag ataaagacaa cccagcaata aagcagtgag attggatctt gctgggc 57
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gtggcagggc gctacgaaca atcctaacga ctctagctgc ttgttcgtga cggcattatt 60
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<212> DNA
<213> 人工合成
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tctttatcta tttccaagga tgggactacc gtaagctgag attggatctt gctgggc 57
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<213> 人工合成
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gtggcagggc gctacgaaca atcctaacga ctctagcttc tcgttagtga cgtctattgt 60
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c 61
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 64
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<213> 人工合成
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gtggcagggc gctacgaaca atcctacggt gaggaccttt gcagattggc atcaccccba 60
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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c 61
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<213> 人工合成
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 115
ggtgaggccc ttggcaggtt ggtatcaccc 30

Claims (4)

1.一种用于沙门菌血清型抗原基因分型的引物组，其特征在于，所述引物组基于多重杂交连接反应的荧光探针熔解曲线设计，所述引物组包括：
用于检测沙门菌O2血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；
用于检测沙门菌O4血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；
用于检测沙门菌O6,7血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6；
用于检测沙门菌O6,8血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8；
用于检测沙门菌O9,12血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.9和SEQ IDNo.10；
用于检测沙门菌O3,10血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.11和SEQ IDNo.12；
用于检测沙门菌O11血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.13和SEQ IDNo.14；
用于检测沙门菌a/d血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.15和SEQ IDNo.16；
用于检测沙门菌b/c血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.17和SEQ IDNo.18；
用于检测沙门菌i血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.19和SEQ IDNo.20；
用于检测沙门菌e,h血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.21和SEQ IDNo.22；
用于检测沙门菌f,g/f,g,s/f,g,t血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.23和SEQ ID No.24；
用于检测沙门菌g,t/g,s,t血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.25和SEQID No.26；
用于检测沙门菌1,7血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.27和SEQ IDNo.28；
用于检测沙门菌1,6血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.29和SEQ IDNo.30；
用于检测沙门菌w-H2血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.31和SEQ IDNo.32；
用于检测沙门菌e,n,x/e,n,z15血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.33和SEQ ID No.34；
用于检测沙门菌z35血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.35和SEQ IDNo.36；
用于检测沙门菌O13血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.37和SEQ IDNo.38；
用于检测沙门菌O16血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.39和SEQ IDNo.40；
用于检测沙门菌O18血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.41和SEQ IDNo.42；
用于检测沙门菌O21血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.43和SEQ IDNo.44；
用于检测沙门菌O30血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.45和SEQ IDNo.46；
用于检测沙门菌O35血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.47和SEQ IDNo.48；
用于检测沙门菌O9,46血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.49和SEQ IDNo.50；
用于检测沙门菌c血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.51和SEQ IDNo.52；
用于检测沙门菌d血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.53和SEQ IDNo.54；
用于检测沙门菌r血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.55和SEQ IDNo.56；
用于检测沙门菌z4,z23血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.57和SEQ IDNo.58；
用于检测沙门菌f,g,s/g,m,s/g,s,t/g,t血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ IDNo.59和SEQ ID No.60；
用于检测沙门菌m,t血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.61和SEQ IDNo.62；
用于检测沙门菌1,2/1,6血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.63和SEQ IDNo.64；
用于检测沙门菌1,5/1,7血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.65和SEQ IDNo.66；
用于检测沙门菌e,n,z15血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.67和SEQ IDNo.68；
用于检测沙门菌z6血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.69和SEQ IDNo.70；
用于检测沙门菌O42血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.71和SEQ IDNo.72；
用于检测沙门菌O48血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.73和SEQ IDNo.74；
用于检测沙门菌O51血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.75和SEQ IDNo.76；
用于检测沙门菌O39血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.77和SEQ IDNo.78；
用于检测沙门菌O43血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.79和SEQ IDNo.80；
用于检测沙门菌O40血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.81和SEQ IDNo.82；
用于检测沙门菌O3,19/O3,10血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.83和SEQ ID No.84；
用于检测沙门菌y血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.85和SEQ IDNo.86；
用于检测沙门菌k血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.87和SEQ IDNo.88；
用于检测沙门菌v血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.89和SEQ IDNo.90；
用于检测沙门菌z4,z24血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.91和SEQ IDNo.92；
用于检测沙门菌m,t/f,g,t血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.93和SEQID No.94；
用于检测沙门菌g,m/g,m,s血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.95和SEQID No.96；
用于检测沙门菌O45血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.97和SEQ IDNo.98；
用于检测沙门菌z10血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.99和SEQ IDNo.100；
用于检测沙门菌z35-H1血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.101和SEQ IDNo.102；
用于检测沙门菌z13血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.103和SEQ IDNo.104；
用于检测沙门菌z29血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.105和SEQ IDNo.106；
用于检测沙门菌O39血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.107和SEQ IDNo.108；
用于检测沙门菌O6,14血清型抗原基因分型的杂交连接引物SEQ ID No.109和SEQ IDNo.110。
2.一种用于沙门菌血清型抗原基因分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组、连接酶、荧光探针、上游通用引物和下游通用引物；所述荧光探针包括ROX荧光探针、FAM荧光探针、CY5荧光探针，ROX荧光探针为SEQ ID No.113，FAM荧光探针为SEQ ID No.114，CY5荧光探针为SEQ ID No.115；所述上游通用引物的序列为SEQ IDNo.111；所述下游通用引物的序列为SEQ ID No.112。
3.根据权利要求2所述的用于沙门菌血清型抗原基因分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括连接酶缓冲液。
4.根据权利要求2所述的用于沙门菌血清型抗原基因分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、rTaq酶。
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