JP5279049B2 - 特異的遺伝子の多重検出によるSalmonellaEnteritidisの迅速同定法 - Google Patents
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Description
分離されたサルモネラが、家畜伝染病予防法で「家畜伝染病」または「届出伝染病」と規定している主要6血清型(Gallinarum、Typhimurium、Dublin、Enteritidis、Choleraesuis、Abortusequi)であるか否かでその後の対応が異なるため、血清型の特定が必須である。また、2004年にと畜場法が改正され、食肉衛生検査所では、肉眼病変の認められた材料について上記の6血清型のサルモネラ検査を行う必要がある。現行のサルモネラ血清型別法では判定までに2週間を必要とする。このため、飼料から上記6血清型のサルモネラが検出されても、その判定結果が出るまでに当該飼料が消費されてしまう可能性が高い。また、食肉衛生検査所では判定まで枝肉を保留する必要があるため、食品衛生上大きな問題となっている。以上のことから、飼料検査および食肉検査現場で、サルモネラの6血清型迅速同定法の開発が強く求められている。6血清型の迅速同定法が実用化されれば、家畜保健衛生所における日常検査、血清型別不能菌の同定、スクリーニング検査等へも応用可能である。畜産物の安全・安心を確保する上で、飼料および畜産物を汚染するサルモネラのリスク管理、および生産現場でのサルモネラ保菌動物の早期摘発・淘汰は、極めて重要である。
〔1〕下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型を判別する方法;
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)下記(A)から(E)からなる群より選択される少なくとも1つに記載のDNAを増幅する工程、及び
(c)工程(b)において
下記(A)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合にサルモネラの血清型がTyphimuriumであると示され、
下記(B)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合にサルモネラの血清型がCholeraesuisであると示され、
下記(C)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合にサルモネラの血清型がEnteritidisであると示され、
下記(D)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合にサルモネラの血清型がDublinであると示され、
下記(E)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合にサルモネラの血清型がGallinarumであると示される工程、
(A)下記(1)〜(4)に記載のDNA
(1)配列番号:1に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:2に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:3に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:4に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(B)下記(1)〜(5)に記載のDNAのうち少なくとも3つのDNA
(1)配列番号:5に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:6に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:7に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:8に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:9に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(C)下記(1)〜(5)に記載のDNAのうち少なくとも4つのDNA
(1)配列番号:10に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:11に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:12に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:13に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:14に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(D)下記(1)〜(6)に記載のDNAのうち少なくとも3つのDNA
(1)配列番号:15に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:16に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:17に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:18に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:19に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(6)配列番号:20に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(E)下記(1)〜(4)に記載のDNA
(1)配列番号:21に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:22に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:23に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:24に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
〔2〕下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がTyphimuriumであるか否かを判別する方法;
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)下記(1)〜(4)に記載のDNAを増幅する工程、及び
(c)下記(1)〜(4)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がTyphimuriumであると示される工程、
(1)配列番号:1に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:2に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:3に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:4に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
〔3〕下記(d)及び(e)の工程をさらに含む、〔2〕に記載の方法;
(d)サルモネラのO群血清型を判定する工程、及び
(e)工程(d)においてO群血清型がO4群と判定された場合に、サルモネラの血清型がTyphimuriumであると示される工程、
〔4〕下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がCholeraesuisであるか否かを判別する方法;
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)下記(1)〜(5)からなる群より選択される少なくとも3つのDNAを増幅する工程、及び
(c)下記(1)〜(5)からなる群より選択される少なくとも3つのDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がCholeraesuisであると示される工程、
(1)配列番号:5に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:6に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:7に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:8に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:9に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
〔5〕下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がEnteritidisであるか否かを判別する方法;
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)下記(1)〜(5)からなる群より選択される少なくとも4つのDNAを増幅する工程、及び
(c)下記(1)〜(5)からなる群より選択される少なくとも4つのDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がEnteritidisであると示される工程、
(1)配列番号:10に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:11に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:12に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:13に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:14に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
〔6〕下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がDublinであるか否かを判別する方法;
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)下記(1)〜(6)からなる群より選択される少なくとも3つのDNAを増幅する工程、及び
(c)下記(1)〜(6)からなる群より選択される少なくとも3つのDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がDublinであると示される工程、
(1)配列番号:15に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:16に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:17に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:18に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:19に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(6)配列番号:20に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
〔7〕下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がGallinarumであるか否かを判別する方法;
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)下記(1)〜(4)に記載のDNAを増幅する工程、及び
(c)下記(1)〜(4)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がGallinarumであると示される工程、
(1)配列番号:21に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:22に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:23に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:24に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
〔8〕配列番号:1〜24に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNAとストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
〔9〕配列番号:25〜72のいずれかに記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、
〔10〕下記(i)から(v)からなる群より選択される少なくとも1つのセット;
(i)下記(1)から(4)を含むセット
(1)配列番号:25に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:26に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:27に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:28に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:29に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:30に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:31に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:32に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(ii)下記(1)から(5)のセットから選択される少なくとも3つを含むセット
(1)配列番号:33に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:34に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:35に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:36に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:37に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:38に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:39に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:40に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:41に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:42に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(iii)下記(1)から(5)のセットから選択される少なくとも4つを含むセット
(1)配列番号:43に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:44に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:45に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:46に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:47に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:48に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:49に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:50に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:51に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:52に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(iv)下記(1)から(6)のセットから選択される少なくとも3つを含むセット
(1)配列番号:53に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:54に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:55に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:56に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:57に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:58に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:59に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:60に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:61に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:62に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(6)配列番号:63に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:64に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(v)下記(1)から(4)を含むセット
(1)配列番号:65に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:66に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:67に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:68に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:69に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:70に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:71に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:72に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
〔11〕〔8〕又は〔9〕に記載のオリゴヌクレオチドを含有するサルモネラの血清型判別用キット、
〔12〕〔10〕に記載のセットを含有するサルモネラの血清型判別用キット、
〔13〕Salmonella Typhimurium、Salmonella Choleraesuis、Salmonella Enteritidis、Salmonella Dublin、及びSalmonella Gallinarumからなる群より選択されるいずれかのサルモネラのゲノムDNAを鋳型とし、下記(i)から(v)からなる群より選択される少なくとも1つのセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるPCR産物;
(i)下記(1)から(4)を含むセット
(1)配列番号:25に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:26に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:27に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:28に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:29に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:30に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:31に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:32に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(ii)下記(1)から(5)のセットから選択される少なくとも3つを含むセット
(1)配列番号:33に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:34に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:35に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:36に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:37に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:38に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:39に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:40に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:41に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:42に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(iii)下記(1)から(5)のセットから選択される少なくとも4つを含むセット
(1)配列番号:43に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:44に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:45に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:46に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:47に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:48に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:49に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:50に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:51に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:52に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(iv)下記(1)から(6)のセットから選択される少なくとも3つを含むセット
(1)配列番号:53に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:54に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:55に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:56に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:57に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:58に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:59に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:60に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:61に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:62に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(6)配列番号:63に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:64に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(v)下記(1)から(4)を含むセット
(1)配列番号:65に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:66に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:67に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:68に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:69に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:70に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:71に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:72に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
〔14〕配列番号:99〜111に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNAとストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
〔15〕配列番号:73〜98のいずれかに記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、
〔16〕以下(1)から(13)からなる群より選択される少なくとも1組のセット;
(1)配列番号:73に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:74に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:75に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:76に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:77に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:78に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:79に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:80に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:81に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:82に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(6)配列番号:83に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:84に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(7)配列番号:85に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:86に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(8)配列番号:87に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:88に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(9)配列番号:89に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:90に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(10)配列番号:91に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:92に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(11)配列番号:93に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:94に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(12)配列番号:95に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:96に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(13)配列番号:97に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:98に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
〔17〕〔15〕に記載のオリゴヌクレオチドを含有するサルモネラの血清型判別用キット、
〔18〕〔16〕に記載のセットを含有するサルモネラの血清型判別用キット、
〔19〕Salmonella Typhimurium、Salmonella Choleraesuis、Salmonella Enteritidis、Salmonella Dublin、及びSalmonella Gallinarumからなる群より選択されるいずれかのサルモネラのゲノムDNAを鋳型とし、下記(1)から(13)からなる群より選択される少なくとも1つのセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるPCR産物;
(1)配列番号:73に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:74に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:75に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:76に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:77に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:78に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:79に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:80に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:81に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:82に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(6)配列番号:83に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:84に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(7)配列番号:85に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:86に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(8)配列番号:87に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:88に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(9)配列番号:89に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:90に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(10)配列番号:91に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:92に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(11)配列番号:93に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:94に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(12)配列番号:95に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:96に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(13)配列番号:97に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:98に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
〔20〕下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がCholeraesuisであるか否かを判別する方法;
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)配列番号:100〜102に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNAを増幅する工程、及び
(c)工程(b)においてDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がCholeraesuisであると示される工程、
〔21〕下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がEnteritidisであるか否かを判別する方法;
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)配列番号:103〜105に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNAを増幅する工程、及び
(c)工程(b)においてDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がEnteritidisであると示される工程、
〔22〕下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がDublinであるか否かを判別する方法;
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)配列番号:106〜108に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNAを増幅する工程、及び
(c)工程(b)においてDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がDublinであると示される工程、
〔23〕下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がDublinであるか否かを判別する方法;
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)配列番号:109〜111に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNAを増幅する工程、及び
(c)工程(b)においてDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がDublinであると示される工程。
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程
(b)下記(A)から(E)からなる群より選択される少なくとも1つに記載のDNAを増幅する工程
(c)工程(b)において
下記(A)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合にサルモネラの血清型がTyphimuriumであると示され、
下記(B)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合にサルモネラの血清型がCholeraesuisであると示され、
下記(C)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合にサルモネラの血清型がEnteritidisであると示され、
下記(D)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合にサルモネラの血清型がDublinであると示され、
下記(E)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合にサルモネラの血清型がGallinarumであると示される工程
ここで(A)から(E)は以下の通りである。
(A)下記(1)〜(4)に記載のDNA
(1)配列番号:1に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:2に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:3に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:4に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(B)下記(1)〜(5)に記載のDNAのうち少なくとも3つのDNA
(1)配列番号:5に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:6に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:7に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:8に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:9に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(C)下記(1)〜(5)に記載のDNAのうち少なくとも4つのDNA
(1)配列番号:10に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:11に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:12に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:13に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:14に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(D)下記(1)〜(6)に記載のDNAのうち少なくとも3つのDNA
(1)配列番号:15に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:16に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:17に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:18に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:19に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(6)配列番号:20に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(E)下記(1)〜(4)に記載のDNA
(1)配列番号:21に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:22に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:23に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:24に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
配列番号:2に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:27に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:28に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:3に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:29に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:30に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:4に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:31に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:32に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:5に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:33に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:34に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:6に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:35に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:36に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:7に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:37に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:38に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:8に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:39に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:40に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:9に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:41に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:42に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:10に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:43に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:44に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:11に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:45に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:46に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:12に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:47に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:48に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:13に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:49に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:50に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:14に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:51に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:52に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:15に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:53に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:54に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:16に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:55に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:56に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:17に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:57に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:58に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:18に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:59に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:60に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:19に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:61に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:62に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:20に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:63に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:64に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:21に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:65に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:66に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:22に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:67に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:68に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:23に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:69に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:70に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:24に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:71に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:72に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:5に記載の塩基配列の一部を含むDNAとして配列番号:100に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。
配列番号:7に記載の塩基配列の一部を含むDNAとして配列番号:101に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。
配列番号:9に記載の塩基配列の一部を含むDNAとして配列番号:102に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。
配列番号:15に記載の塩基配列の一部を含むDNAとして配列番号:103に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。
配列番号:18に記載の塩基配列の一部を含むDNAとして配列番号:104に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。
配列番号:19に記載の塩基配列の一部を含むDNAとして配列番号:105に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。
配列番号:11に記載の塩基配列の一部を含むDNAとして配列番号:106に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。
配列番号:12に記載の塩基配列の一部を含むDNAとして配列番号:107に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。
配列番号:14に記載の塩基配列の一部を含むDNAとして配列番号:108に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。
配列番号:21に記載の塩基配列の一部を含むDNAとして配列番号:109に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。
配列番号:22に記載の塩基配列の一部を含むDNAとして配列番号:110に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。
配列番号:24に記載の塩基配列の一部を含むDNAとして配列番号:111に記載の塩基配列を含むDNAが挙げられる。
配列番号:99に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:73に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:74に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:100に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:75に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:76に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:101に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:77に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:78に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:102に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:79に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:80に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:103に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:81に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:82に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:104に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:83に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:84に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:105に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:85に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:86に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:106に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:87に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:88に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:107に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:89に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:90に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:108に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:91に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:92に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:109に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:93に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:94に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:110に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:95に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:96に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
配列番号:111に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA増幅用プライマーセットとして、配列番号:97に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー)、及び配列番号:98に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット
また本発明には、配列番号:99〜111に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNAに相補的な、連続する少なくとも15塩基、より好ましくは連続する少なくとも20塩基を含むプライマーも含まれる。
なお本発明の技術分野が属する比較ゲノム解析の分野では、ゲノムDNAを骨格配列と挿入配列に大別することができる。骨格配列とは主に微生物が生存するために必須の遺伝子群を含む領域で、近縁微生物種が共通に保有する配列である。挿入配列とはファージやトランスポゾンといった外来性の遺伝子に由来する配列であり、進化の過程の比較的新しい時期にゲノムに取り込まれたものと考えられる。挿入配列は一群の遺伝子が微生物ゲノム中に同時に取り込まれた可能性が高い。従って、挿入配列中の遺伝子がサルモネラの血清型に特異的な遺伝子である場合、同じ挿入配列中の他の遺伝子も血清型に特異的な遺伝子である可能性が高い。即ち本発明においては、配列番号:1〜24に記載の塩基配列のいかなる部分配列もサルモネラの血清型に特異的な遺伝子と考えられる。
ST0280(STM0289): 329873-332062(配列番号:1に記載の塩基配列において、1番目〜2190番目の塩基からなる配列)
ST0281(STM0290): 332086-332532(配列番号:1に記載の塩基配列において、2214番目〜2660番目の塩基からなる配列)
ST0282(STM0291): 332551-336645(配列番号:1に記載の塩基配列において、2679番目〜6773番目の塩基からなる配列)
ST0283(STM0292): 337095-337835(配列番号:1に記載の塩基配列において、7223番目〜7963番目の塩基からなる配列)
ST0284(STM0293): 337829-338275(配列番号:1に記載の塩基配列において、7957番目〜8403番目の塩基からなる配列)
ST0285(STM0294): 338838-339275(配列番号:1に記載の塩基配列において、8966番目〜9403番目の塩基からなる配列)
ST0286(STM0294.1N): 339603-339328(配列番号:1に記載の塩基配列において、9456番目〜9731番目の塩基からなる配列)
*カッコ内のSTMで始まる文言はNC_003197(Typhimurium)におけるlocus tagを示す。
*ST0283とST0284にはオーバーラップ有り。
ST0551(STM0571): 629330-632059(配列番号:2に記載の塩基配列において、1番目〜2730番目の塩基からなる配列)
ST0552(STM0572): 633173-632187(配列番号:2に記載の塩基配列において、2858番目〜3844番目の塩基からなる配列)
ST0553(STM0573): 634283-633240(配列番号:2に記載の塩基配列において、3911番目〜4954番目の塩基からなる配列)
ST0554(STM0574): 635170-634316(配列番号:2に記載の塩基配列において、4987番目〜5841番目の塩基からなる配列)
ST0555(STM0575): 635916-635173(配列番号:2に記載の塩基配列において、5844番目〜6587番目の塩基からなる配列)
ST0556(STM0576): 636401-635931(配列番号:2に記載の塩基配列において、6602番目〜7072番目の塩基からなる配列)
ST0557(STM0577): 636828-636379(配列番号:2に記載の塩基配列において、7050番目〜7499番目の塩基からなる配列)
*カッコ内のSTMで始まる文言はNC_003197(Typhimurium)におけるlocus tagを示す。
*ST0556とST0557にはオーバーラップ有り。
ST3627(STM3752): 3949331-3948987(配列番号:3に記載の塩基配列において、1番目〜345番目の塩基からなる配列)
ST3628(STM3753): 3950009-3951199(配列番号:3に記載の塩基配列において、1023番目〜2213番目の塩基からなる配列)
ST3629(STM3754): 3951196-3951546(配列番号:3に記載の塩基配列において、2210番目〜2560番目の塩基からなる配列)
ST3630(STM3755): 3951733-3952770(配列番号:3に記載の塩基配列において、2747番目〜3784番目の塩基からなる配列)
*カッコ内のSTMで始まる文言はNC_003197(Typhimurium)におけるlocus tagを示す。
*ST3628とST3629にはオーバーラップ有り。
ST4250(STM4416): 4656671-4658050(配列番号:4に記載の塩基配列において、1番目〜1380番目の塩基からなる配列)
ST4251(STM4417): 4658541-4659374(配列番号:4に記載の塩基配列において、1871番目〜2704番目の塩基からなる配列)
ST4252(STM4418): 4660858-4659425(配列番号:4に記載の塩基配列において、2755番目〜4188番目の塩基からなる配列)
ST4253(STM4419): 4661317-4662753(配列番号:4に記載の塩基配列において、4647番目〜6083番目の塩基からなる配列)
ST4254(STM4420): 4663915-4663106(配列番号:4に記載の塩基配列において、6436番目〜7245番目の塩基からなる配列)
ST4255(STM4421): 4665445-4663940(配列番号:4に記載の塩基配列において、7270番目〜8775番目の塩基からなる配列)
ST4256(STM4423): 4665886-4666710(配列番号:4に記載の塩基配列において、9216番目〜10040番目の塩基からなる配列)
ST4257(STM4424.S): 4666985-4667890(配列番号:4に記載の塩基配列において、10315番目〜11220番目の塩基からなる配列)
ST4258(STM4425): 4667909-4668919(配列番号:4に記載の塩基配列において、11239番目〜12249番目の塩基からなる配列)
ST4259(STM4426): 4669016-4670359(配列番号:4に記載の塩基配列において、12346番目〜13689番目の塩基からなる配列)
ST4260(STM4427): 4670360-4671193(配列番号:4に記載の塩基配列において、13690番目〜14523番目の塩基からなる配列)
ST4261(STM4428): 4672356-4671190(配列番号:4に記載の塩基配列において、14520番目〜15686番目の塩基からなる配列)
ST4262(STM4433): 4676890-4677912(配列番号:4に記載の塩基配列において、20220番目〜21242番目の塩基からなる配列)
ST4263(STM4434): 4677985-4679211(配列番号:4に記載の塩基配列において、21315番目〜22541番目の塩基からなる配列)
ST4264(STM4435): 4679372-4680187(配列番号:4に記載の塩基配列において、22702番目〜23517番目の塩基からなる配列)
ST4265(STM4436): 4680240-4681124(配列番号:4に記載の塩基配列において、23570番目〜24454番目の塩基からなる配列)
*カッコ内のSTMで始まる文言はNC_003197(Typhimurium)におけるlocus tagを示す。
*ST4260とST4261にはオーバーラップ有り。
SC0970: 1090512-1090718(配列番号:5に記載の塩基配列において、1番目〜207番目の塩基からなる配列)
SC0971: 1091683-1090751(配列番号:5に記載の塩基配列において、240番目〜1172番目の塩基からなる配列)
SC0972: 1092153-1091680(配列番号:5に記載の塩基配列において、1169番目〜1642番目の塩基からなる配列)
SC0973: 1092771-1092304(配列番号:5に記載の塩基配列において、1793番目〜2260番目の塩基からなる配列)
SC0974: 1092942-1093352(配列番号:5に記載の塩基配列において、2431番目〜2841番目の塩基からなる配列)
SC0975: 1093444-1094280(配列番号:5に記載の塩基配列において、2933番目〜3769番目の塩基からなる配列)
SC0976: 1094277-1094972(配列番号:5に記載の塩基配列において、3766番目〜4461番目の塩基からなる配列)
SC0977: 1094986-1095783(配列番号:5に記載の塩基配列において、4475番目〜5272番目の塩基からなる配列)
SC0978: 1096303-1096542(配列番号:5に記載の塩基配列において、5792番目〜6031番目の塩基からなる配列)
*SC0971とSC0972にはオーバーラップ有り。
*SC0975とSC0976にはオーバーラップ有り。
SC1238: 1348838-1348575(配列番号:6に記載の塩基配列において、1番目〜264番目の塩基からなる配列)
SC1239: 1348864-1349382(配列番号:6に記載の塩基配列において、290番目〜808番目の塩基からなる配列)
SC1240: 1350481-1350789(配列番号:6に記載の塩基配列において、1907番目〜2215番目の塩基からなる配列)
SC1241: 1351990-1350920(配列番号:6に記載の塩基配列において、2346番目〜3416番目の塩基からなる配列)
SC1242: 1351955-1352248(配列番号:6に記載の塩基配列において、3381番目〜3674番目の塩基からなる配列)
SC1243: 1354673-1352985(配列番号:6に記載の塩基配列において、4411番目〜6099番目の塩基からなる配列)
SC1244: 1355857-1354892(配列番号:6に記載の塩基配列において、6318番目〜7283番目の塩基からなる配列)
SC1245: 1355902-1356051(配列番号:6に記載の塩基配列において、7328番目〜7477番目の塩基からなる配列)
SC1246: 1356958-1356605(配列番号:6に記載の塩基配列において、8031番目〜8384番目の塩基からなる配列)
SC1247: 1357089-1357265(配列番号:6に記載の塩基配列において、8515番目〜8691番目の塩基からなる配列)
*SC1241とSC1242にはオーバーラップ有り。
SC2137: 2242043-2242762(配列番号:7に記載の塩基配列において、1番目〜720番目の塩基からなる配列)
SC2138: 2243636-2242893(配列番号:7に記載の塩基配列において、851番目〜1594番目の塩基からなる配列)
SC2139: 2243874-2243740(配列番号:7に記載の塩基配列において、1698番目〜1832番目の塩基からなる配列)
SC2140: 2244460-2244086(配列番号:7に記載の塩基配列において、2044番目〜2418番目の塩基からなる配列)
SC2141: 2245155-2244778(配列番号:7に記載の塩基配列において、2736番目〜3113番目の塩基からなる配列)
SC2142: 2245956-2245567(配列番号:7に記載の塩基配列において、3525番目〜3914番目の塩基からなる配列)
SC2143: 2247252-2247494(配列番号:7に記載の塩基配列において、5210番目〜5452番目の塩基からなる配列)
SC2144: 2248246-2247881(配列番号:7に記載の塩基配列において、5839番目〜6204番目の塩基からなる配列)
SC2145: 2249085-2248348(配列番号:7に記載の塩基配列において、6306番目〜7043番目の塩基からなる配列)
SC2146: 2249646-2249113(配列番号:7に記載の塩基配列において、7071番目〜7604番目の塩基からなる配列)
SC2147: 2250691-2250248(配列番号:7に記載の塩基配列において、8206番目〜8649番目の塩基からなる配列)
SC2148: 2251657-2251238(配列番号:7に記載の塩基配列において、9196番目〜9615番目の塩基からなる配列)
SC2149: 2252255-2252091(配列番号:7に記載の塩基配列において、10049番目〜10213番目の塩基からなる配列)
SC2150: 2252930-2252313(配列番号:7に記載の塩基配列において、10271番目〜10888番目の塩基からなる配列)
SC3523(SC3527): 3725291-3724176(配列番号:8に記載の塩基配列において、1番目〜1116番目の塩基からなる配列)
SC3524(SC3528): 3725428-3725264(配列番号:8に記載の塩基配列において、1089番目〜1253番目の塩基からなる配列)
SC3525(SC3529): 3726424-3725471(配列番号:8に記載の塩基配列において、1296番目〜2249番目の塩基からなる配列)
SC3526(SC3530): 3726653-3727534(配列番号:8に記載の塩基配列において、2478番目〜3359番目の塩基からなる配列)
SC3527(SC3531): 3727648-3728466(配列番号:8に記載の塩基配列において、3473番目〜4291番目の塩基からなる配列)
*カッコ内のSCで始まる文言はNC_006905におけるlocus tagを示す。
*SC3523とSC3524にはオーバーラップ有り。
SC4339(SC4343): 4646619-4647488(配列番号:9に記載の塩基配列において、1番目〜870番目の塩基からなる配列)
SC4340(SC4344): 4648534-4648704(配列番号:9に記載の塩基配列において、1916番目〜2086番目の塩基からなる配列)
SC4341(SC4345): 4649364-4648993(配列番号:9に記載の塩基配列において、2375番目〜2746番目の塩基からなる配列)
SC4342(SC4346): 4649947-4650324(配列番号:9に記載の塩基配列において、3329番目〜3706番目の塩基からなる配列)
SC4343(SC4347): 4651313-4650642(配列番号:9に記載の塩基配列において、4024番目〜4695番目の塩基からなる配列)
SC4344(SC4348): 4651851-4651600(配列番号:9に記載の塩基配列において、4982番目〜5233番目の塩基からなる配列)
SC4345(SC4349): 4652868-4652038(配列番号:9に記載の塩基配列において、5420番目〜6250番目の塩基からなる配列)
SC4346(SC4350): 4654170-4653805(配列番号:9に記載の塩基配列において、7187番目〜7552番目の塩基からなる配列)
SC4347(SC4351): 4654491-4655762(配列番号:9に記載の塩基配列において、7873番目〜9144番目の塩基からなる配列)
SC4348(SC4352): 4655773-4657860(配列番号:9に記載の塩基配列において、9155番目〜11242番目の塩基からなる配列)
SC4349(SC4353): 4658481-4659503(配列番号:9に記載の塩基配列において、11863番目〜12885番目の塩基からなる配列)
SC4350(SC4354): 4660161-4661036(配列番号:9に記載の塩基配列において、13543番目〜14418番目の塩基からなる配列)
*カッコ内のSCで始まる文言はNC_006905(Choleraesuis)におけるlocus tagを示す。
SEN0216: 249114-252176(配列番号:10に記載の塩基配列において、1番目〜3063番目の塩基からなる配列)
SEN0910: 1013812-1014441(配列番号:11に記載の塩基配列において、1番目〜630番目の塩基からなる配列)
SEN0911: 1014335-1015051(配列番号:11に記載の塩基配列において、524番目〜1240番目の塩基からなる配列)
*SEN0910とSEN0911にはオーバーラップ有り。
SEN1006: 1110476-1110946(配列番号:12に記載の塩基配列において、1番目〜471番目の塩基からなる配列)
SEN1432: 1520207-1520926(配列番号:13に記載の塩基配列において、1番目〜720番目の塩基からなる配列)
SEN1433: 1521017-1522129(配列番号:13に記載の塩基配列において、811番目〜1923番目の塩基からなる配列)
SEN1434: 1522077-1523636(配列番号:13に記載の塩基配列において、1871番目〜3430番目の塩基からなる配列)
SEN1435: 1523522-1524289(配列番号:13に記載の塩基配列において、3316番目〜4083番目の塩基からなる配列)
SEN1436: 1524621-1525880(配列番号:13に記載の塩基配列において、4415番目〜5674番目の塩基からなる配列)
*SEN1433とSEN1434にはオーバーラップ有り。
*SEN1434とSEN1435にはオーバーラップ有り。
SEN2420: 2550140-2550748(配列番号:14に記載の塩基配列において、1番目〜609番目の塩基からなる配列)
SD1749: 46331-47743(配列番号:15に記載の塩基配列において、1番目〜1413番目の塩基からなる配列)
SD1750: 47745-48473(配列番号:15に記載の塩基配列において、1415番目〜2143番目の塩基からなる配列)
SD1751: 48479-51214(配列番号:15に記載の塩基配列において、2149番目〜4884番目の塩基からなる配列)
SD1752: 51227-51985(配列番号:15に記載の塩基配列において、4897番目〜5655番目の塩基からなる配列)
SD1753: 51990-53321(配列番号:15に記載の塩基配列において、5660番目〜6991番目の塩基からなる配列)
SD1754: 53324-53857(配列番号:15に記載の塩基配列において、6994番目〜7527番目の塩基からなる配列)
SD1755: 53854-55152(配列番号:15に記載の塩基配列において、7524番目〜8822番目の塩基からなる配列)
SD1756: 55165-56259(配列番号:15に記載の塩基配列において、8835番目〜9929番目の塩基からなる配列)
SD1757: 56217-58070(配列番号:15に記載の塩基配列において、9887番目〜11740番目の塩基からなる配列)
SD1758: 58075-58491(配列番号:15に記載の塩基配列において、11745番目〜12161番目の塩基からなる配列)
SD1759: 58488-59960(配列番号:15に記載の塩基配列において、12158番目〜13630番目の塩基からなる配列)
SD1760: 60030-60161(配列番号:15に記載の塩基配列において、13700番目〜13831番目の塩基からなる配列)
SD1761: 60251-60763(配列番号:15に記載の塩基配列において、13921番目〜14433番目の塩基からなる配列)
SD1762: 60811-60990(配列番号:15に記載の塩基配列において、14481番目〜14660番目の塩基からなる配列)
SD1763: 61384-61902(配列番号:15に記載の塩基配列において、15054番目〜15572番目の塩基からなる配列)
SD1764: 62124-64238(配列番号:15に記載の塩基配列において、15794番目〜17908番目の塩基からなる配列)
*SD1754とSD1755にはオーバーラップ有り。
*SD1756とSD1757にはオーバーラップ有り。
*SD1758とSD1759にはオーバーラップ有り。
SD2163: 110203-111366(配列番号:16に記載の塩基配列において、1番目〜1164番目の塩基からなる配列)
SD2164: 112411-112692(配列番号:16に記載の塩基配列において、2209番目〜2490番目の塩基からなる配列)
SD2165: 112685-113299(配列番号:16に記載の塩基配列において、2483番目〜3097番目の塩基からなる配列)
*SD2164とSD2165にはオーバーラップ有り。
SD2881: 26113-27609(配列番号:17に記載の塩基配列において、1番目〜1497番目の塩基からなる配列)
SD3914: 9282-9398(配列番号:18に記載の塩基配列において、1番目〜117番目の塩基からなる配列)
SD3915: 9460-10434(配列番号:18に記載の塩基配列において、179番目〜1153番目の塩基からなる配列)
SD3916: 10424-11695(配列番号:18に記載の塩基配列において、1143番目〜2414番目の塩基からなる配列)
SD3917: 11695-13125(配列番号:18に記載の塩基配列において、2414番目〜3844番目の塩基からなる配列)
SD3918: 13097-13972(配列番号:18に記載の塩基配列において、3816番目〜4691番目の塩基からなる配列)
SD3919: 13973-15547(配列番号:18に記載の塩基配列において、4692番目〜6266番目の塩基からなる配列)
SD3920: 15595-16440(配列番号:18に記載の塩基配列において、6314番目〜7159番目の塩基からなる配列)
SD3921: 16506-17489(配列番号:18に記載の塩基配列において、7225番目〜8208番目の塩基からなる配列)
SD3922: 17554-18039(配列番号:18に記載の塩基配列において、8273番目〜8758番目の塩基からなる配列)
SD3923: 18052-18477(配列番号:18に記載の塩基配列において、8771番目〜9196番目の塩基からなる配列)
SD3924: 18474-18905(配列番号:18に記載の塩基配列において、9193番目〜9624番目の塩基からなる配列)
SD3925: 18889-19827(配列番号:18に記載の塩基配列において、9608番目〜10546番目の塩基からなる配列)
SD3926: 19832-21226(配列番号:18に記載の塩基配列において、10551番目〜11945番目の塩基からなる配列)
SD3927: 21230-21667(配列番号:18に記載の塩基配列において、11949番目〜12386番目の塩基からなる配列)
SD3928: 21667-22254(配列番号:18に記載の塩基配列において、12386番目〜12973番目の塩基からなる配列)
SD3929: 22263-22394(配列番号:18に記載の塩基配列において、12982番目〜13113番目の塩基からなる配列)
SD3930: 22378-24432(配列番号:18に記載の塩基配列において、13097番目〜15151番目の塩基からなる配列)
SD3931: 24432-24929(配列番号:18に記載の塩基配列において、15151番目〜15648番目の塩基からなる配列)
SD3932: 25145-25420(配列番号:18に記載の塩基配列において、15864番目〜16139番目の塩基からなる配列)
SD3933: 25513-26472(配列番号:18に記載の塩基配列において、16232番目〜17191番目の塩基からなる配列)
SD3934: 26469-27185(配列番号:18に記載の塩基配列において、17188番目〜17904番目の塩基からなる配列)
SD3935: 27257-27514(配列番号:18に記載の塩基配列において、17976番目〜18233番目の塩基からなる配列)
*SD3915とSD3916にはオーバーラップ有り。
*SD3916とSD3917にはオーバーラップ有り。
*SD3917とSD3918にはオーバーラップ有り。
*SD3923とSD3924にはオーバーラップ有り。
*SD3924とSD3925にはオーバーラップ有り。
*SD3927とSD3928にはオーバーラップ有り。
*SD3929とSD3930にはオーバーラップ有り。
*SD3930とSD3931にはオーバーラップ有り。
*SD3933とSD3934にはオーバーラップ有り。
SD4771: 3202-3501(配列番号:19に記載の塩基配列において、1番目〜300番目の塩基からなる配列)
SD4772: 4162-4554(配列番号:19に記載の塩基配列において、961番目〜1353番目の塩基からなる配列)
SD4773: 4538-5014(配列番号:19に記載の塩基配列において、1337番目〜1813番目の塩基からなる配列)
SD4774: 5018-5374(配列番号:19に記載の塩基配列において、1817番目〜2173番目の塩基からなる配列)
*SD4772とSD4773にはオーバーラップ有り。
SD4777: 364-615(配列番号:20に記載の塩基配列において、1番目〜252番目の塩基からなる配列)
SD4778: 1045-1608(配列番号:20に記載の塩基配列において、682番目〜1245番目の塩基からなる配列)
SD4779: 1607-1963(配列番号:20に記載の塩基配列において、1244番目〜1600番目の塩基からなる配列)
SD4780: 2021-2848(配列番号:20に記載の塩基配列において、1658番目〜2485番目の塩基からなる配列)
SD4781: 2985-3524(配列番号:20に記載の塩基配列において、2622番目〜3161番目の塩基からなる配列)
SD4782: 3595-4332(配列番号:20に記載の塩基配列において、3232番目〜3969番目の塩基からなる配列)
SD4783: 4374-4805(配列番号:20に記載の塩基配列において、4011番目〜4442番目の塩基からなる配列)
SD4784: 4809-5558(配列番号:20に記載の塩基配列において、4446番目〜5195番目の塩基からなる配列)
*SD4778とSD4779にはオーバーラップ有り。
SG0263: 306318-307190(配列番号:21に記載の塩基配列において、1番目〜873番目の塩基からなる配列)
SG0264: 307461-308006(配列番号:21に記載の塩基配列において、1144番目〜1689番目の塩基からなる配列)
SG0265: 307747-308286(配列番号:21に記載の塩基配列において、1430番目〜1969番目の塩基からなる配列)
SG0266: 308384-309028(配列番号:21に記載の塩基配列において、2067番目〜2711番目の塩基からなる配列)
SG0267: 309025-309396(配列番号:21に記載の塩基配列において、2708番目〜3079番目の塩基からなる配列)
SG0268: 309368-309772(配列番号:21に記載の塩基配列において、3051番目〜3455番目の塩基からなる配列)
SG0269: 309754-309975(配列番号:21に記載の塩基配列において、3437番目〜3658番目の塩基からなる配列)
SG0270: 309972-310262(配列番号:21に記載の塩基配列において、3655番目〜3945番目の塩基からなる配列)
SG0271: 310278-310757(配列番号:21に記載の塩基配列において、3961番目〜4440番目の塩基からなる配列)
SG0272: 310768-311226(配列番号:21に記載の塩基配列において、4451番目〜4909番目の塩基からなる配列)
SG0273: 311308-311832(配列番号:21に記載の塩基配列において、4991番目〜5515番目の塩基からなる配列)
SG0274: 311843-312097(配列番号:21に記載の塩基配列において、5526番目〜5780番目の塩基からなる配列)
SG0275: 312097-312915(配列番号:21に記載の塩基配列において、5780番目〜6598番目の塩基からなる配列)
SG0276: 313021-313296(配列番号:21に記載の塩基配列において、6704番目〜6979番目の塩基からなる配列)
SG0277: 313366-313779(配列番号:21に記載の塩基配列において、7049番目〜7462番目の塩基からなる配列)
SG0278: 314053-314592(配列番号:21に記載の塩基配列において、7736番目〜8275番目の塩基からなる配列)
SG0279: 314655-315107(配列番号:21に記載の塩基配列において、8338番目〜8790番目の塩基からなる配列)
SG0280: 315104-315556(配列番号:21に記載の塩基配列において、8787番目〜9239番目の塩基からなる配列)
SG0281: 315593-316159(配列番号:21に記載の塩基配列において、9276番目〜9842番目の塩基からなる配列)
SG0282: 316156-316869(配列番号:21に記載の塩基配列において、9839番目〜10552番目の塩基からなる配列)
SG0283: 317130-317591(配列番号:21に記載の塩基配列において、10813番目〜11274番目の塩基からなる配列)
SG0284: 317604-318005(配列番号:21に記載の塩基配列において、11287番目〜11688番目の塩基からなる配列)
SG0285: 318319-318417(配列番号:21に記載の塩基配列において、12002番目〜12100番目の塩基からなる配列)
SG0286: 318423-318779(配列番号:21に記載の塩基配列において、12106番目〜12462番目の塩基からなる配列)
SG0287: 319143-321761(配列番号:21に記載の塩基配列において、12826番目〜15444番目の塩基からなる配列)
SG0288: 321869-322303(配列番号:21に記載の塩基配列において、15552番目〜15986番目の塩基からなる配列)
SG0289: 322340-324028(配列番号:21に記載の塩基配列において、16023番目〜17711番目の塩基からなる配列)
SG0290: 324025-325548(配列番号:21に記載の塩基配列において、17708番目〜19231番目の塩基からなる配列)
SG0291: 325866-327722(配列番号:21に記載の塩基配列において、19549番目〜21405番目の塩基からなる配列)
SG0292: 328069-329589(配列番号:21に記載の塩基配列において、21752番目〜23272番目の塩基からなる配列)
SG0293: 329893-330726(配列番号:21に記載の塩基配列において、23576番目〜24409番目の塩基からなる配列)
SG0294: 330474-331238(配列番号:21に記載の塩基配列において、24157番目〜24921番目の塩基からなる配列)
SG0295: 331606-332244(配列番号:21に記載の塩基配列において、25289番目〜25927番目の塩基からなる配列)
SG0296: 332241-334406(配列番号:21に記載の塩基配列において、25924番目〜28089番目の塩基からなる配列)
SG0297: 334372-334737(配列番号:21に記載の塩基配列において、28055番目〜28420番目の塩基からなる配列)
SG0298: 335047-335123(配列番号:21に記載の塩基配列において、28730番目〜28805番目の塩基からなる配列)
SG0299: 335505-335837(配列番号:21に記載の塩基配列において、29188番目〜29520番目の塩基からなる配列)
*SG0264とSG0265にはオーバーラップ有り。
*SG0266とSG0267にはオーバーラップ有り。
*SG0267とSG0268にはオーバーラップ有り。
*SG0268とSG0269にはオーバーラップ有り。
*SG0269とSG0270にはオーバーラップ有り。
*SG0274とSG0275にはオーバーラップ有り。
*SG0279とSG0280にはオーバーラップ有り。
*SG0281とSG0282にはオーバーラップ有り。
*SG0289とSG0290にはオーバーラップ有り。
*SG0293とSG0294にはオーバーラップ有り。
*SG0295とSG0296にはオーバーラップ有り。
*SG0296とSG0297にはオーバーラップ有り。
SG1032: 1119872-1121167(配列番号:22に記載の塩基配列において、1番目〜1296番目の塩基からなる配列)
SG1033: 1121286-1122023(配列番号:22に記載の塩基配列において、1415番目〜2152番目の塩基からなる配列)
SG1034: 1122020-1124683(配列番号:22に記載の塩基配列において、2149番目〜4812番目の塩基からなる配列)
SG1035: 1124696-1125454(配列番号:22に記載の塩基配列において、4825番目〜5583番目の塩基からなる配列)
SG1036: 1125459-1126790(配列番号:22に記載の塩基配列において、5588番目〜6919番目の塩基からなる配列)
SG1037: 1126793-1127326(配列番号:22に記載の塩基配列において、6922番目〜7455番目の塩基からなる配列)
SG1038: 1127323-1128621(配列番号:22に記載の塩基配列において、7452番目〜8750番目の塩基からなる配列)
SG1039: 1128634-1129728(配列番号:22に記載の塩基配列において、8763番目〜9857番目の塩基からなる配列)
SG1040: 1129686-1131599(配列番号:22に記載の塩基配列において、9815番目〜11728番目の塩基からなる配列)
SG1041: 1131957-1133429(配列番号:22に記載の塩基配列において、12086番目〜13558番目の塩基からなる配列)
SG1042: 1133720-1134232(配列番号:22に記載の塩基配列において、13849番目〜14361番目の塩基からなる配列)
SG1043: 1134853-1135371(配列番号:22に記載の塩基配列において、14982番目〜15500番目の塩基からなる配列)
SG1044: 1135581-1137704(配列番号:22に記載の塩基配列において、15710番目〜17833番目の塩基からなる配列)
SG1045: 1137713-1141114(配列番号:22に記載の塩基配列において、17842番目〜21243番目の塩基からなる配列)
SG1046: 1141142-1142204(配列番号:22に記載の塩基配列において、21271番目〜22333番目の塩基からなる配列)
SG1047: 1142122-1142601(配列番号:22に記載の塩基配列において、22251番目〜22730番目の塩基からなる配列)
*SG1033とSG1034にはオーバーラップ有り。
*SG1037とSG1038にはオーバーラップ有り。
*SG1039とSG1040にはオーバーラップ有り。
*SG1046とSG1047にはオーバーラップ有り。
SG1182: 1264348-1264776(配列番号:23に記載の塩基配列において、1番目〜429番目の塩基からなる配列)
SG1183: 1265107-1266069(配列番号:23に記載の塩基配列において、760番目〜1722番目の塩基からなる配列)
SG3181: 3319694-3320146(配列番号:24に記載の塩基配列において、1番目〜453番目の塩基からなる配列)
上記(A)のDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がTyphimuriumであると判別される。
上記(B)のDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がCholeraesuisであると判別される。
上記(C)のDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がEnteritidisであると判別される。
上記(D)のDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がDublinであると判別される。
上記(E)のDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がGallinarumであると判別される。
配列番号:1に記載の塩基配列からなるDNAをSTR1、
配列番号:2に記載の塩基配列からなるDNAをSTR2、
配列番号:3に記載の塩基配列からなるDNAをSTR3、
配列番号:4に記載の塩基配列からなるDNAをSTR4、
配列番号:5に記載の塩基配列からなるDNAをSCR1、
配列番号:6に記載の塩基配列からなるDNAをSCR2、
配列番号:7に記載の塩基配列からなるDNAをSCR3、
配列番号:8に記載の塩基配列からなるDNAをSCR4、
配列番号:9に記載の塩基配列からなるDNAをSCR5、
配列番号:10に記載の塩基配列からなるDNAをSER1、
配列番号:11に記載の塩基配列からなるDNAをSER2、
配列番号:12に記載の塩基配列からなるDNAをSER3、
配列番号:13に記載の塩基配列からなるDNAをSER4、
配列番号:14に記載の塩基配列からなるDNAをSER5、
配列番号:15に記載の塩基配列からなるDNAをSDR1、
配列番号:16に記載の塩基配列からなるDNAをSDR2、
配列番号:17に記載の塩基配列からなるDNAをSDR3、
配列番号:18に記載の塩基配列からなるDNAをSDR4、
配列番号:19に記載の塩基配列からなるDNAをSDR5、
配列番号:20に記載の塩基配列からなるDNAをSDR6、
配列番号:21に記載の塩基配列からなるDNAをSGR1、
配列番号:22に記載の塩基配列からなるDNAをSGR2、
配列番号:23に記載の塩基配列からなるDNAをSGR3、
配列番号:24に記載の塩基配列からなるDNAをSGR4、
と称することも出来る。Typhimurium、Choleraesuis、Enteritidis、Dublin、及びGallinarumの各血清型のサルモネラゲノム上におけるSTR1〜SGR4の位置、ORFの数等は実施例に記載の表1に示されている。
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)下記(1)〜(4)に記載のDNAを増幅する工程、及び
(c)下記(1)〜(4)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がTyphimuriumであると示される工程。
ここで(1)〜(4)は以下の通りである。
(1)配列番号:1に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:2に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:3に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:4に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
なお本発明のサルモネラの血清型がTyphimuriumであるか否かを判別する方法においては、血清型がMbandakaであるサルモネラにおいて、上記(1)〜(4)に記載のDNAの増幅産物が得られる場合がある。TyphimuriumとMbandakaについてはO群血清型別で識別可能であることから、これら4遺伝子の多重検出とO群血清型別の組み合わせにより、サルモネラの血清型がTyphimuriumであるか否かを判別することが可能である。即ち本発明のサルモネラの血清型がTyphimuriumであるか否かを判別する方法は、さらに下記(d)及び(e)に記載の工程を含んでもよい。
(d)サルモネラのO群血清型を判定する工程、及び
(e)工程(d)においてO群血清型がO4群と判定された場合に、サルモネラの血清型がTyphimuriumであると示される工程
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)下記(1)〜(5)からなる群より選択される少なくとも3つのDNAを増幅する工程、及び
(c)下記(1)〜(5)からなる群より選択される少なくとも3つのDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がCholeraesuisであると示される工程。
ここで(1)〜(5)は以下の通りである。
(1)配列番号:5に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:6に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:7に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:8に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:9に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)下記(1)〜(5)からなる群より選択される少なくとも4つのDNAを増幅する工程、及び
(c)下記(1)〜(5)からなる群より選択される少なくとも4つのDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がEnteritidisであると示される工程。
ここで(1)〜(5)は以下の通りである。
(1)配列番号:10に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:11に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:12に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:13に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:14に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
なお本発明のサルモネラの血清型がEnteritidisであるか否かを判別する方法においては、血清型がBlegdamであるサルモネラにおいて、上記(1)〜(5)からなる群より選択される少なくとも4つのDNAの増幅産物が得られる場合がある。これは、血清型EnteritidisとBlegdamは遺伝的類似度が極めて高いと考えられるためである。しかしながら、血清型がBlegdamであるサルモネラは極めて分離頻度の低いサルモネラであることから、実際にサルモネラの血清型を判別する場面においては、(1)〜(5)からなる群より選択される少なくとも4遺伝子領域が増幅された場合、Enteritidisである可能性が極めて高いと考えることが可能である。
(d)サルモネラの1相H抗原の型別を判定する工程、及び
(e)工程(d)において1相H抗原の型別がg,mと判定された場合に、サルモネラの血清型がEnteritidisであると示される工程
サルモネラの1相H抗原の型別の判定は、市販の免疫血清(例えばデンカ生研株式会社製サルモネラ免疫血清「生研」シリーズ)を用い、添付の指示書に従って行うことが可能である。
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)下記(1)〜(6)からなる群より選択される少なくとも3つのDNAを増幅する工程、及び
(c)下記(1)〜(6)からなる群より選択される少なくとも3つのDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がDublinであると示される工程。
ここで(1)〜(6)は以下の通りである。
(1)配列番号:15に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:16に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:17に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:18に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:19に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(6)配列番号:20に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
なお本発明のサルモネラの血清型がDublinであるか否かを判別する方法においては、血清型がRostock又はNaestvedであるサルモネラにおいて、上記(1)〜(6)からなる群より選択される少なくとも3つのDNAの増幅産物が得られる場合がある。しかしながら、血清型がRostock又はNaestvedであるサルモネラは極めて分離頻度の低いサルモネラであることから、実際にサルモネラの血清型を判別する場面においては、(1)〜(6)からなる群より選択される少なくとも3遺伝子領域が増幅された場合、Dublinである可能性が極めて高いと考えることが可能である。
(d)サルモネラの1相H抗原の型別を判定する工程、及び
(e)工程(d)において1相H抗原の型別がg,pと判定された場合に、サルモネラの血清型がDublinsであると示される工程
サルモネラの1相H抗原の型別の判定は、上述の通り、市販の免疫血清(例えばデンカ生研株式会社製サルモネラ免疫血清「生研」シリーズ)を用い、添付の指示書に従って行うことが可能である。
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)下記(1)〜(5)に記載のDNAを増幅する工程、及び
(c)下記(1)〜(5)に記載のDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がGallinarumであると示される工程。
ここで(1)〜(5)は以下の通りである。
(1)配列番号:21に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(2)配列番号:22に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(3)配列番号:23に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(4)配列番号:24に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
(5)配列番号:25に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNA
本発明のサルモネラの血清型がEnteritidisであるか否かを判別する方法において、DNAの抽出、DNAの増幅は上述の方法によって行うことが可能である。
また本発明は、配列番号:25から72のいずれかに記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、さらに、下記(i)から(v)からなる群より選択される少なくとも1組のセットを提供する。これらのオリゴヌクレオチド及びセットは、例えば、配列番号:1〜24に記載の塩基配列の全部又は一部を含むDNAを増幅するためのプライマーとして有用である。
(1)配列番号:25に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:26に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:27に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:28に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:29に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:30に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:31に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:32に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(ii)下記(1)から(5)のセットから選択される少なくとも3つを含むセット
(1)配列番号:33に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:34に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:35に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:36に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:37に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:38に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:39に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:40に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:41に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:42に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(iii)下記(1)から(5)のセットから選択される少なくとも4つを含むセット
(1)配列番号:43に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:44に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:45に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:46に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:47に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:48に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:49に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:50に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:51に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:52に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(iv)下記(1)から(6)のセットから選択される少なくとも3つを含むセット
(1)配列番号:53に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:54に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:55に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:56に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:57に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:58に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:59に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:60に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:61に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:62に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(6)配列番号:63に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:64に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(v)下記(1)から(4)を含むセット
(1)配列番号:65に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:66に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:67に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:68に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:69に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:70に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:71に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:72に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット。
例えば、サルモネラの血清型がCholeraesuisであるか否かを判別するために用いられるプライマーセットとしては、上記(ii)に記載のセットが例示できるがこれに限定されない。
例えば、サルモネラの血清型がEnteritidisであるか否かを判別するために用いられるプライマーセットとしては、上記(iii)に記載のセットが例示できるがこれに限定されない。
例えば、サルモネラの血清型がDublinであるか否かを判別するために用いられるプライマーセットとしては、上記(iv)に記載のセットが例示できるがこれに限定されない。
例えば、サルモネラの血清型がGallinarumであるか否かを判別するために用いられるプライマーセットとしては、上記(v)に記載のセットが例示できるがこれに限定されない。
(a)配列番号:73に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:74に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット、
(b)配列番号:75に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:76に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット、
(c)配列番号:77に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:78に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット、
(d)配列番号:79に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:80に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット、
(e)配列番号:81に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:82に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット、
(f)配列番号:83に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:84に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット、
(g)配列番号:85に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:86に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット、
(h)配列番号:87に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:88に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット、
(i)配列番号:89に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:90に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット、
(j)配列番号:91に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:92に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット、
(k)配列番号:93に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:94に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット、
(l)配列番号:95に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:96に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット、
(m)配列番号:97に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(フォワードプライマー、及び、配列番号:98に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(リバースプライマー)のセット。
上記(b)〜(d)を含むセットは、サルモネラの血清型がCholeraesuisであるか否かの判別に有用である。
上記(e)〜(g)を含むセットは、サルモネラの血清型がDublinであるか否かの判別に有用である。
上記(h)〜(j)を含むセットは、サルモネラの血清型がEnteritidisであるか否かの判別に有用である。
上記(k)〜(m)を含むセットは、サルモネラの血清型がGallinarumであるか否かの判別に有用である。
(I)上記(A)から(E)からなる群より選択される少なくとも1つのDNAをPCRにより増幅するためのオリゴヌクレオチドのセット
このようなセットとしては、上記(i)から(v)に記載のセットが挙げられるが、これらに限定されない。
(I´)上記(a)から(m)からなる群より選択される少なくとも1つのDNAをPCRにより増幅するためのオリゴヌクレオチドのセット
(II)DNAポリメラーゼ:
本発明の試薬又はキットは、鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒するDNAポリメラーゼを含むことができる。PCRなどの公知の核酸合成反応に利用されている種々のDNAポリメラーゼは、本発明に利用することができる。
(III)ヌクレオチド基質:
本発明の試薬又はキットは、核酸の相補鎖合成反応の基質として利用されるヌクレオチド類を含むことができる。具体的には、dCTP、dGTP、dTPT、およびdATPの少なくとも一つ、通常はこれらの全て(dNTP)をキットに含むことができる。これらのヌクレオチド類は、天然の構造のみならず、誘導体を利用することもできる。蛍光物資や結合性リガンドで修飾したヌクレオチド類が公知である。上記キットには、PCRにより増幅されたPCR産物のサイズが記載された書類を添付することができる。また、PCRにより増幅されたPCR産物のサイズ情報を機械読み取り可能なデータとし、それを格納した記録媒体としてキットに加えることもできる。
(a)対照サルモネラのゲノムDNAを鋳型とし、上記(i)から(v)からなる群より選択される少なくとも1つのセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるPCR産物の種類であって、対照サルモネラに特異的なPCR産物の種類、
(b)被検サルモネラのゲノムDNAを鋳型とし、(a)と同じセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるPCR産物の種類。
(A)下記(1)〜(4)に記載のDNA
(1)配列番号:25に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:26に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(2)配列番号:27に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:28に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
DNA
(3)配列番号:29に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:30に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
DNA
(4)配列番号:31に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:32に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(B)下記(1)〜(5)に記載のDNAのうち少なくとも3つのDNA
(1)配列番号:33に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:34に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(2)配列番号:35に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:36に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
DNA
(3)配列番号:37に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:38に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
DNA
(4)配列番号:39に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:40に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(5)配列番号:41に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:42に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(C)下記(1)〜(5)に記載のDNAのうち少なくとも4つのDNA
(1)配列番号:43に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:44に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(2)配列番号:45に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:46に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(3)配列番号:47に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:48に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(4)配列番号:49に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:50に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(5)配列番号:51に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:52に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(D)下記(1)〜(6)に記載のDNAのうち少なくとも3つのDNA
(1)配列番号:53に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:54に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(2)配列番号:55に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:56に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(3)配列番号:57に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:58に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(4)配列番号:59に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:60に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(5)配列番号:61に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:62に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(6)配列番号:63に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:64に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(E)下記(1)〜(4)に記載のDNA
(1)配列番号:65に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:66に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(2)配列番号:67に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:68に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(3)配列番号:69に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:70に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(4)配列番号:71に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:72に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(1)配列番号:73に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:74に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(2)配列番号:75に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:76に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(3)配列番号:77に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:78に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(4)配列番号:79に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:80に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(5)配列番号:81に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:82に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(6)配列番号:83に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:84に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(7)配列番号:85に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:86に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(8)配列番号:87に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:88に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(9)配列番号:89に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:90に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(10)配列番号:91に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:92に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(11)配列番号:93に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:94に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(12)配列番号:95に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:96に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
(13)配列番号:97に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号:98に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるDNA
1.1 血清型Typhimurium(ST)及びCholeraesuis(SC)特異的塩基配列の特定
遺伝子データベース上に公開されているST LT2株及びSC SC-B67株の全ゲノム塩基配列を用いて2つの異なる手法で比較ゲノム解析を実施し、非共通領域に含まれる遺伝子を血清型特異的遺伝子の候補とした。この中から連続した遺伝子群を挿入配列とし、異なる挿入配列の中から1遺伝子を選び、遺伝子データベースを用いて相同性検索を実施することで血清型特異的遺伝子候補の絞り込みを行った。次に過去30年間にわたって収集した約3,700株の野外分離サルモネラの中から異なる事例に由来するST125株(表2−1〜2−2)、SC29株(表3)、それ以外の118血清型(表7−1〜7−5)から各1株を選び、これらのゲノムDNAを鋳型として上記遺伝子を検出するPCRを実施し、野外分離サルモネラにおける血清型特異的遺伝子候補保有率を調べた。
遺伝子データベース上に公開されているSD str.CT_02021853、SE NCTC13349、SG_NCTC13346の全ゲノム塩基配列データを用いてSDとSE及びSEとSGの間でオーソログ解析に基づく比較ゲノム解析を実施し、非オーソログ対応ORFを血清型特異的遺伝子の候補として抽出した。さらに、遺伝子データベースを用いて相同性検索を行い、血清型特異的遺伝子候補の絞り込みを行った。次に過去30年間にわたって収集した約3,700株の野外分離サルモネラの中から異なる事例に由来するSD、SE、SG、それぞれ162株(表4−1〜4−3)、69株(表5)、13株(表6)を、それ以外の118血清型(表7−1〜7−5)から各1株を選び、これらのゲノムDNAを鋳型として上記遺伝子を検出するPCRを実施し、野外分離サルモネラにおける血清型特異的遺伝子候補保有率を調べた。
2.1 ST及びSC特異的塩基配列の特定
MUMmerソフトウェアによる比較ゲノム解析で抽出した非共通領域には、ST LT2株で372の、SC-B67株で305のCDS配列を認めた。オーソログ解析に基づく比較ゲノム解析ではST LT2株で533の、SC-B67株で549の非一致ORFが抽出できた。これら遺伝子のうち挿入配列から1遺伝子を選び、相同性検索を実施し、他のサルモネラで登録のない遺伝子をST及びSCで、それぞれ4及び5個選び出した(表1)。
SC遺伝子検出用プライマーペア5種(配列番号:33〜42)を用いて同様の実験を行ったところ、各遺伝子の保有率はSC 29株で全て100%、その他血清型118株で0.8〜5.9%であった(表1、表9−1〜9−4)。
一方、SC遺伝子検出用プライマーペア5種を用いてSC以外の血清型118株を解析したとき、3遺伝子以上で増幅陽性の株は認められなかった(表9)。これら5遺伝子の多重検出により、SCの迅速同定が可能であることが示唆された。
SC遺伝子検出用プライマーペア(配列番号:75〜80)を用いて同様の実験を行ったところ、SCR1(SC0971)、SCR3(SC2145)、SCR5(SC4345)の検出率はSC 29株で全て100%、その他血清型118株でそれぞれ0.8、1.7、0.8%であった(表14)。
SDとSEの比較ゲノム解析ではSDで356の、SEで152の非一致ORFが、SEとSGの比較ゲノム解析ではSEで139の、SGで123の非一致ORFが抽出できた。これら遺伝子のうち挿入配列から1遺伝子を選び、相同性検索を実施し、他のサルモネラで登録のない遺伝子をSD、SE、SGで、それぞれ6、5、4個選び出した(表1)。
同様にSE検出用プライマー(配列番号:43〜52)ではSE69株で全て100%、その他の118血清型で7.6〜33.9%(表1、表11−1〜11−5)、SG検出用プライマー(配列番号:65〜72)ではSG13株で全て100%、その他の118血清型で9.3〜13.6%の陽性率であった(表1、表12−1〜12−2)。
SE検出用プライマーペアでSE以外の血清型118株を解析したとき、Blegdam(O9:g,m,q:−)で5遺伝子陽性であった(表11−3)。この血清型はSE(O9:g,m:−)と近縁であると考えられた。他に4遺伝子以上で増幅陽性の株は認められなかった(表11−1〜11−5)。フォールスポジティブの可能性を残しているが、これら5遺伝子の多重検出によりSEの迅速同定が可能と考えられた。
SG検出用プライマーペアでSG以外の血清型118株を解析したとき、4遺伝子で増幅陽性の株は認められなかった(表12−1〜12−2)。これら4遺伝子の多重検出により、SGの迅速同定が可能と考えられた。
SE遺伝子検出用プライマーペア(配列番号:87〜92)を用いて同様の実験を行ったところ、SER2(SE0910)、SER3(SE1006)、SER5(SE2420)の検出率はSE69株で全て100%、その他の118血清型でそれぞれ16.9、11.9、7.6%であった(表16)。
またSG遺伝子検出用プライマーペア(配列番号:93〜98)を用いて同様の実験を行ったところ、SGR1、SGR2、SGR4の検出率はSG13株で全て100%、その他の118血清型でそれぞれ10.2、11.9、9.3%であった(表17)。
Claims (9)
- 下記(a)から(c)の工程を含む、サルモネラの血清型がEnteritidisであるか否かを判別する方法;
(a)サルモネラよりゲノムDNAを抽出する工程、
(b)下記(1)〜(5)からなる群より選択される少なくとも4つのDNAを増幅する工程、及び
(c)下記(1)〜(5)からなる群より選択される少なくとも4つのDNAの増幅産物が得られた場合に、サルモネラの血清型がEnteritidisであると示される工程。
(1)配列番号:10に記載の塩基配列において1番目〜3063番目の塩基からなる配列からなるDNA
(2)配列番号:11に記載の塩基配列において1番目〜630番目の塩基からなる配列からなるDNA又は配列番号:106に記載の塩基配列からなるDNA
(3)配列番号:12に記載の塩基配列において1番目〜471番目の塩基からなる配列からなるDNA又は配列番号:107に記載の塩基配列からなるDNA
(4)配列番号:13に記載の塩基配列において1番目〜720番目の塩基からなる配列からなるDNA
(5)配列番号:14に記載の塩基配列において1番目〜609番目の塩基からなる配列からなるDNA又は配列番号:108に記載の塩基配列からなるDNA - 配列番号:10に記載の塩基配列において1番目〜3063番目の塩基からなる配列からなるDNAが、配列番号:43に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:44に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセットによって増幅され、
配列番号:11に記載の塩基配列において1番目〜630番目の塩基からなる配列からなるDNAが、配列番号:45に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:46に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセットによって増幅され、
配列番号:12に記載の塩基配列において1番目〜471番目の塩基からなる配列からなるDNAが、配列番号:47に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:48に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセットによって増幅され、
配列番号:13に記載の塩基配列において1番目〜720番目の塩基からなる配列からなるDNAが、配列番号:49に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:50に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセットによって増幅され、
配列番号:14に記載の塩基配列において1番目〜609番目の塩基からなる配列からなるDNAが、配列番号:51に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:52に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセットによって増幅され、
配列番号:106に記載の塩基配列からなるDNAが、配列番号:87に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:88に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセットによって増幅され、
配列番号:107に記載の塩基配列からなるDNAが、配列番号:89に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:90に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセットによって増幅され、
配列番号:108に記載の塩基配列からなるDNAが、配列番号:91に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:92に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセットによって増幅される、
請求項1に記載の方法。 - 下記(1)から(5)のセットから選択される少なくとも4つを含むセット
(1)配列番号:43に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:44に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:45に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:46に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:47に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:48に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:49に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:50に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:51に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:52に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット。 - 請求項3に記載のセットを含有するサルモネラの血清型判別用キット。
- Salmonella EnteritidisのサルモネラのゲノムDNAを鋳型とし、下記(iii)のセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるPCR産物;
(iii)下記(1)から(5)のセットから選択される少なくとも4つを含むセット
(1)配列番号:43に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:44に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(2)配列番号:45に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:46に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(3)配列番号:47に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:48に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(4)配列番号:49に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:50に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(5)配列番号:51に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:52に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット。 - 以下(8)から(10)を含むセット;
(8)配列番号:87に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:88に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(9)配列番号:89に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:90に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(10)配列番号:91に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:92に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット。 - 請求項6に記載のセットを含有するサルモネラの血清型判別用キット。
- Salmonella EnteritidisのサルモネラのゲノムDNAを鋳型とし、下記(8)から(10)を含むセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるPCR産物;
(8)配列番号:87に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:88に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(9)配列番号:89に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:90に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
(10)配列番号:91に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号:92に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット。 - さらに以下(d)及び(e)の工程を含む、請求項1又は2に記載の方法;
(d)サルモネラの1相H抗原の型別を判定する工程、及び
(e)工程(d)において1相H抗原の型別がg,mと判定された場合に、サルモネラの血清型がEnteritidisであると示される工程。
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