CN108203736A

CN108203736A - 一种快速检测食品中沙门氏菌的方法

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Publication number: CN108203736A
Application number: CN201711478860.6A
Authority: CN
Inventors: 孙永军; 王湛; 侯磊; 朱可欣; 杜心培
Original assignee: Beijing University of Technology
Current assignee: Beijing University of Technology
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2018-06-26

Abstract

一种快速检测食品中沙门氏菌的方法，涉及食品检测技术领域。用PCR方法对待测食品样品中沙门氏菌的inVA基因进行检测，包括以下步骤：将待测食品样品加入缓冲蛋白胨水中增菌，然后用生理盐水洗菌后煮沸裂解细胞，离心取上清液；以获得的上清液为PCR反应模板，并利用沙门氏菌inVA基因的检测引物进行PCR检测；其中，沙门氏菌inVA基因的检测引物为：上游引物inVAF：5’‑tcctccgctctgtctactta‑3’；下游引物inVAR：5’‑accgaaatattcattgacgtt‑3’。本发明方法的检测结果与传统培养方法和

Description

一种快速检测食品中沙门氏菌的方法

技术领域

本发明涉及食品检测技术领域，具体涉及一种快速检测食品中沙门氏菌的方法。

背景技术

沙门氏菌是主要食源性病原微生物之一，极易污染肉类、鱼类、禽肉类、奶类、蛋类食品。进出口食品检测的时限性要求非常强，否则将影响合同的履行，或降低货物的价值。特别是对于鲜活食品，如鲜活水产品、冰鲜鸡肉等，更要求缩短检测时间。采用传统培养方法检测沙门氏菌，需要多步增菌富集、分离、筛选和生化鉴定，必要时还需要血清学鉴定，一般为4～6天，费时费力。近年发展起来的PCR方法，能够大大缩短检测时间，且具有较高的特异性和敏感性，已显示出巨大的检测潜力。已经报道的用于检测沙门氏菌的靶基因包括inVA基因、16S RNA基因、SefA基因、hin/H2区域、arfA基因等。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种快速检测食品中沙门氏菌的方法，该方法的检测结果与传统培养方法和系统检测结果一致，检出限为100cfu/25g(甚至可达到1cfu/25g)，准确性达100％。

基于上述目的，本发明提供的一种快速检测食品中沙门氏菌的方法，用PCR方法对待测食品样品中沙门氏菌的inVA基因进行检测，包括以下步骤：

(1)将待测食品样品加入缓冲蛋白胨水中增菌，然后用生理盐水洗菌后煮沸裂解细胞，离心取上清液；

(2)以步骤(1)中获得的上清液为PCR反应模板，并利用沙门氏菌inVA基因的检测引物进行PCR检测；

其中，沙门氏菌inVA基因的检测引物包括：上游引物inVAF(即基因序列SEQ IDNO:1)：5’-tcctccgctctgtctactta-3’；下游引物inVAR(即基因序列SEQ ID NO:2)：5’-accgaaatattcattgacgtt-3’。

研究结果表明，以invA基因为目的基因检测沙门氏菌具有较高的特异性和准确性，因此，本发明选择invA基因作为检测沙门氏菌的目的基因。

在本发明中，优选的，在步骤(1)中，将待测食品样品加入缓冲蛋白胨水中，在37℃下增菌18～24h，获得增菌液，将增菌液离心后获得沉淀，将沉淀用生理盐水洗两次后加入去离子水充分重悬，煮沸后，冷却，离心取上清液。

在本发明中，优选的，上述将增菌液离心为将增菌液在12000rpm离心10min；所述离心取上清液为12000rpm离心5min取上清液。

在本发明中，优选的，所述生理盐水为质量分数为0.85％的NaCl溶液；所述煮沸的时间为15min；所述增菌液与所述去离子水的体积比为10:1。

在本发明中，优选的，在步骤(2)中，PCR反应体系为20μL，包括2μL 10×PCR缓冲液、200μM dNTPs、1.5mM MgCl₂、8pmol上游引物inVAF、8pmol下游引物inVAR、2μL PCR模板，用灭过菌的去离子水补至总体积20μL；

在本发明中，优选的，在步骤(2)中，反应条件为：94℃4min热变性；94℃40s，60℃40s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。

在本发明中，优选的，在步骤(2)中，PCR基因检测后的产物用含有EB的琼脂糖凝胶电泳分析，有阳性条带的待测食品样品即为沙门氏菌感染的食品。

在本发明中，优选的，阳性条带的片段大小为825bp。

在本发明中，优选的，所述食品为全脂奶粉、生牛肉和加工过的鸡肉。

为了将PCR快速检测方法运用到检验检疫工作中，本发明选用已经实验证实为沙门氏菌高度特异性的inVA基因为目的基因，采用传统培养方法、方法和PCR方法3种方法检测人为污染沙门氏菌的样品，以确定PCR方法检测沙门氏菌的最低检出限和检测灵敏度，检出限为100cfu/25g，准确性达100％。

与现有技术相比，本发明的快速检测食品中沙门氏菌的方法具有以下有益效果：

(1)本发明提供的PCR方法与传统检测方法、检测方法的检测结果完全一致，能够达到检测要求。

(2)与传统方法相比，本发明提供的方法在第二天便可得出明确的检测结果，这对于进出口食品的检测，尤其是生鲜食品的检测具有重要的经济意义。

(3)用本发明提供的方法，样品非选择性增菌后无需再转选择性增菌液和选择性培养基，只需取1mL增菌液用生理盐水洗2次，煮菌后就可以进行PCR检测，而PCR检测成本每个反应不到1元。与方法相比，本发明所提供的方法对实验室设备要求较低，普通的分子生物学实验室都可以进行，无需购买特殊设备和试剂，检测所需试剂成本很低，不到方法的1％。

附图说明

图1为人为添加沙门氏菌PCR检测结果；其中，A，全脂奶粉；B，生牛肉；C，熟鸡肉；M，DNA分子量标准；添加沙门氏菌的菌量为：泳道1，38cfu；泳道2，16cfu；泳道3，8cfu；泳道4，4cfu；泳道5，≤1cfu；泳道6.0cfu。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

本发明提出了一种快速检测食品中沙门氏菌的方法，操作步骤为，在缓冲蛋白胨水(BPW)中增菌18-24h，生理盐水洗菌2次后煮沸裂解细胞，以invA为目的基因进行PCR，琼脂糖凝胶电泳检测，两天时间即能得到明确结果。以全脂奶粉、生牛肉和加工过的鸡肉为实验对象，人为添加沙门氏菌，检测结果与传统培养方法和系统检测结果一致。实验检出限为100cfu/25g，准确性达100％。

实施例1

1材料和方法：

1.1待检样品的制备

1.1.1细菌培养

肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidiS)菌株(50041)购买自中国菌种保藏中心。蘸取少许活化好的菌液，在营养琼脂上划线分纯，37℃过夜培养后挑单个菌落接种于TSB-YE液体培养基中，37℃培养过夜。

1.1.2初始添加量的确定

取培养好的纯菌液，用TSB-YE液体培养基调整菌液浓度至0.5McFarland。以此浓度菌液为母液，继续用TSB-YE按10倍比例依次稀释直至菌液浓度为母液的10^-8。取10^-5、10^-6稀释物100μL做营养琼脂表面接种，每个梯度接种两块平板，37℃培养过夜后计数。母液浓度可通过下面的公式计算得出。

C：母液浓度(cfu/mL)；

M：相同稀释度的所有平板克隆形成单位的平均数(cfu)；

B：相应稀释倍数；

V：用于铺板的菌液体积(mL)。

1.1.3人为污染

选择的待污染样品为加工过的熟鸡肉、生牛肉和全脂奶粉。样品在污染实验前均经传统培养方法证明为沙门氏菌阴性。根据平板定量结果分别取适当浓度的沙门氏菌稀释液和TSB-YE(作为阴性对照)污染分装好的25g样品，4℃放置1～2h。待菌液被完全吸收后加入225mL缓冲蛋白胨水(BPW)，230rpm均质2min后37℃培养18～24h。

1.2沙门氏菌的检测

1.2.1传统培养方法检测

取BPW增菌液1mL，转接到10mL TTB培养液中，42℃培养18～24h。取TTB增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板，于37℃培养18～24h。若有可疑菌落，则挑取3～5个可疑菌落，接种三糖铁琼脂、尿素琼脂和营养琼脂，于37℃培养18～24h。如果生化反应符合沙门氏菌的特征反应，用VITEK(生物梅里埃)做菌属鉴定。若BS平板和XLD平板上都无可疑菌落，将BS平板于37℃继续培养18～24h。仍无可疑菌落的可确定为沙门氏菌阴性。

1.2.2方法检测

操作按检测沙门氏菌的试剂盒说明书进行。取BPW增菌液10μL，加到500μLBHI培养液中于37℃培养3h。根据所做PCR反应数取适量裂解液，按每mL裂解液中加入12.5μL蛋白酶的比例加入蛋白酶试剂，混匀后将裂解液分装到裂解管中，每管200μL。加5μL BHI培养物至相应裂解管中，37℃温育20min后，95℃加热10min，立即置于冰上至完全冷却。在试剂盒提供的PCR管(含有除模板以外所需试剂)中加入50μL裂解物，进行PCR反应。

1.2.3PCR快速检测方法

1.2.3.1DNA提取

取1mL BPW增菌液，12000rpm离心10min，弃上清。沉淀用生理盐水(0.85NaCl)洗两次后加入100μL灭菌的去离子水充分重悬，沸水煮15min，立即置于冰上。待完全冷却后，12000rpm离心5min取上清。此上清即为PCR反应模板。

1.2.3.2PCR反应体系和反应条件

PCR反应体系为20μL，包括2μL 10×PCR缓冲液(100mM Tris-HCl(pH8.3)；500mMKCl)、200μM dNTPs、1.5mM MgCl₂、上下游引物各8pmol(上游引物inVAF：5’-tcctccgctctgtctactta-3’，如SEQ ID NO:1所示；下游引物inVAR：5’-accgaaatattcattgacgtt-3’，如SEQ ID NO:2所示)、2μL模板，用灭过菌的去离子水补至总体积20μL。所用PCR仪为GenAmp PCR 9600(AppIieC Biosystems)。反应条件为：94℃4min热变性；94℃40s，60℃40s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物于4℃保存。

1.2.3.3扩增片段的检测

PCR产物用含有EB的浓度为1.2％的琼脂糖凝胶电泳分析。电泳过程中电压降为5V/cm。取15～20μL反应产物上样。电泳结束后在凝胶成像系统中成像。目的片段大小为825bp。

2结果

2.1初始添加量的确定

为了确定人为添加时较为合适的初始添加量，取稀释度为10^-5、10^-6的稀释物100μL分别做表面接种，实验重复3次。3次实验的平行性较好，其中10^-5稀释物的平板定量结果(单位为cfu)分别为70，73；67，84；78，82。根据1.1.2中公式计算可得调整后的母液浓度为7.6×10⁷cfu/mL。据此，选定6个初始添加量，分别为50μL 10^-5稀释物、200μL 10^-6稀释物、100μL 10^-6稀释物、50μL 10^-6稀释物、100μL 10^-7稀释物和100μL TSB-YE，即38cfu、16cfu、8cfu、4cfu、≤1cfu和0cfu。

2.2人为添加沙门氏菌检测结果

为了验证本文所用PCR方法的灵敏度和准确性，在用PCR方法检测人为污染样品的同时还使用传统培养方法和检测系统进行平行对照。实验重复两次。

实验结果表明，未添加沙门氏菌的样品检测结果均为阴性；添加沙门氏菌的样品，检测结果为阳性，见图1。PCR方法的检出限低至1cfu/25g样品，检测结果与传统培养方法以及方法的检测结果完全一，见表1。图1中C泳道5的PCR检测结果为阴性，传统培养方法检测结果与PCR检测结果一致，说明该样品中没有添加上沙门氏菌。

表1系统、传统培养方法和PCR方法检测人为添加沙门氏菌样品的结果

注：NT表示未检测，“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。

2.3本发明提供的PCR方法与传统检测方法、检测方法的比较

2.3.1检测结果的一致性

由于25g样品或25mL样品中污染1个沙门氏菌就要求检出，因此增菌步骤是必需的。从人为添加样品的检测结果来看，只要样品污染量达到1cfu/25g，增菌18～24h后用本发明提供的DNA提取方法和PCR方法在第二天就可以检测得到阳性结果。MaIorny等用沙门氏菌人工污染碎牛肉得到的最低检出限为≤5cfu/25g，C1en等人工添加沙门氏菌污染鸡肉、生肉和奶这3种样品得到的检出限为≤3cfu/25g。本发明方法的检出限与上述实验结果一致。与传统培养方法和方法两个平行实验相比，3种方法的检测结果也完全一致，这进一步证实本文确定的增菌方法、DNA提取方法和PCR方法能够达到检测要求。

2.3.2本发明提供的PCR方法较传统培养方法快速

传统培养方法检测沙门氏菌需要经过非选择性增菌、选择性增菌、选择性培养基上筛选特征性菌落、生化鉴定和血清学鉴定这几个步骤，得到阴性结果需要4天，阳性结果至少需要6天。与传统方法相比，本发明提供的方法在第二天便可得出明确的检测结果，这对于进出口食品的检测，尤其是生鲜食品的检测具有重要的经济意义。

2.3.3本发明提供的PCR方法较传统培养方法、方法经济

传统培养方法不仅周期长，检测成本也比较高。且不算人力成本，仅用于筛选特征性菌落的选择性培养基XLD和BS平板就约为7元/块，更不用说VITEK生化鉴定卡(约40元/卡)和沙门氏菌诊断血清(约2000元/盒)的成本。用本发明提供的方法，样品非选择性增菌后无需再转选择性增菌液和选择性培养基，只需取1mL增菌液用生理盐水洗2次，煮菌后就可以进行PCR检测，而PCR检测成本每个反应不到1元。

由美国杜邦公司开发的致病菌检测系统是商业化的利用PCR技术筛选食品和环境样品中致病菌的系统之一。该系统对沙门氏菌、单增李斯特氏菌和O157:H7的检测能力已经通过美国农业部(USDA)和AFNOR的认可。该检测系统快速、操作简单、检测灵敏度和特异性都高于98％，但是检测成本太高。目前系统在中国的市场价为40多万元人民币，而且每个检测反应的耗材成本约为100元。这一检测成本无论对于检验检疫系统，还是对于商家来说都是比较高的。本发明提供的方法虽然在操作上较繁琐，但两种方法所需的检测时间相当，检测效果相当。与方法相比，本发明所提供的方法对实验室设备要求较低，普通的分子生物学实验室都可以进行，无需购买特殊设备和试剂，检测所需试剂成本很低，不到方法的1％。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>北京工业大学

<120>一种快速检测食品中沙门氏菌的方法

<160>2

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成

<400>1

tcctccgctc tgtctactta 20

<210>2

<211>21

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<223>人工合成

<400>2

accgaaatat tcattgacgt t 21

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Claims

1.一种快速检测食品中沙门氏菌的方法，其特征在于，用PCR方法对待测食品样品中沙门氏菌的inVA基因进行检测，包括以下步骤：

其中，沙门氏菌inVA基因的检测引物包括：上游引物inVAF即基因序列SEQ ID NO:1；下游引物inVAR即基因序列SEQ ID NO:2。

2.按照权利要求1所述的一种快速检测食品中沙门氏菌的方法，其特征在于，在步骤(1)中，将待测食品样品加入缓冲蛋白胨水中，在37℃下增菌18～24h，获得增菌液，将增菌液离心后获得沉淀，将沉淀用生理盐水洗两次后加入去离子水充分重悬，煮沸后，冷却，离心取上清液。

3.按照权利要求2所述的一种快速检测食品中沙门氏菌的方法，其特征在于，将增菌液离心为将增菌液在12000rpm离心10min；所述离心取上清液为12000rpm离心5min取上清液。

4.按照权利要求2所述的一种快速检测食品中沙门氏菌的方法，其特征在于，生理盐水为质量分数为0.85％的NaCl溶液；所述煮沸的时间为15min；所述增菌液与去离子水的体积比为10:1。

5.按照权利要求1所述的一种快速检测食品中沙门氏菌的方法，其特征在于，在步骤(2)中，PCR反应体系为20μL，包括2μL 10×PCR缓冲液、200μM dNTPs、1.5mM MgCl₂、8pmol上游引物inVAF、8pmol下游引物inVAR、2μL PCR模板，用灭过菌的去离子水补至总体积20μL。

6.按照权利要求1所述的一种快速检测食品中沙门氏菌的方法，其特征在于，在步骤(2)中，反应条件为：94℃4min热变性；94℃40s，60℃40s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。

7.按照权利要求1所述的一种快速检测食品中沙门氏菌的方法，其特征在于，在步骤(2)中，PCR基因检测后的产物用含有EB的琼脂糖凝胶电泳分析，有阳性条带的待测食品样品即为沙门氏菌感染的食品。

8.按照权利要求7所述的一种快速检测食品中沙门氏菌的方法，其特征在于，阳性条带的片段大小为825bp。

9.按照权利要求1所述的一种快速检测食品中沙门氏菌的方法，其特征在于，所述食品选自全脂奶粉、生牛肉和加工过的鸡肉。