CN105695560A - 婴幼儿配方乳粉中乳双歧杆菌的鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种婴幼儿配方乳粉中乳双歧杆菌的鉴定方法，包括如下步骤：提取待检样品的总DNA；设置样品管、阳性对照管、阴性对照管，分别加入待测样品总DNA、乳双歧杆菌基因组总DNA、无DNA 的蒸馏水为模版；各管加入引物Lactis 16-23 F、Lactis 16-23 R 和其他PCR 试剂；对以上各管进行PCR扩增；对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；结果判定：当阳性对照呈现529bp扩增条带，阴性对照没有扩增条带时，如果待测样品出现529bp条带时，待测样品为双歧杆菌，反之待测样品不是双歧杆菌。本发明的方法仅需要一次常规的PCR反应结合测序，即可得到精确的到亚种水平的鉴定结果，更加准确、简便、快捷，易于推广。

Description

婴幼儿配方乳粉中乳双歧杆菌的鉴定方法

技术领域

本发明涉及双歧杆菌菌种鉴定方法，尤其是动物双歧杆菌中乳双歧杆菌亚种(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)的鉴定方法。

背景技术

目前，为了改善婴幼儿肠道菌群的比例，维持肠道菌群平衡，帮助婴幼儿肠道和全身健康，在婴幼儿配方乳粉中需要添加乳酸菌菌种，所述的乳酸菌如双歧杆菌等，合适的双歧杆菌为动物双歧杆菌(主要为乳双歧杆菌亚种)、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌等；

由于双歧杆菌属(Bifidobacterium)涉及众多的不同种和亚种的双歧杆菌，如表1所示：

表1双歧杆菌各类菌株鉴定结果比较

为了能够确保所添加的乳酸菌为符合我国国家规定婴幼儿配方食品中允许使用的动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种，因此，需要对添加在乳粉中的双歧杆菌进行鉴定。

目前，常规的方法是生化鉴定方法，如GB/T4789.34-2012食品微生物学检验双歧杆菌的鉴定的方法，以及16SrRNA双歧杆菌属特异鉴定方法(KaufmannP1,PfefferkornA,TeuberM,MeileL.IdentificationandquantificationofBifidobacteriumspeciesisolatedfromfoodwithgenus-specific16SrRNA-targetedprobesbycolonyhybridizationandPCR.ApplEnvironMicrobiol.1997Apr；63(4):1268-73)。但是，所述方法存在鉴定操作复杂，结果不好判读，不能精确到菌种以及亚种水平的缺陷，不能满足相关领域的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种婴幼儿配方乳粉中双歧杆菌的鉴定方法，以克服现有技术存在的缺陷，满足人们的需要。

本发明首先涉及一对乳双歧杆菌16S-23SrRNAITS的PCR扩增引物：所述的引物序列为：

Lactis16-23F:5'-CGTCCTTCATCGGTACTGTCTG-3'

Lactis16-23R:5'-CGGCTGGATCACCTCCTTTC-3'

所述的乳双歧杆菌16S-23SrRNAITS的序列为：

CGTCCTTCATCGGTACTGTCTGCCAAGGCATCCACCATACGCCCATCACGACAACCACAACACGGCCGCCATGACCAAAGCACTACTGAAAAACCCTAGAACGACATCAGATCACGGGGACGCACCACACACGGCACGCCCCCATACGATTACGAACGAACCCAAGAAAAAACAATTCCTCGGATCCGAATCACAGTACGAACACCAACCCCACCCCAACGGGCGGGCCGATGCTCGCGTCCACTATCCAGTTCTCAAACCACCACCCCACCAGGACACCCACCCCGCACCAACAGGCACCGGGCAACCGACCTGGGGGACACACTGGCAACCACACCCCACACCAGGGGCCGGTGGCGGCCAGGGAACCCAACAGCACGCACCACACCACACAATCCAATACGACTCTTCCACGCCAGCAAGCCAGGGCGGCGACGACAAACCATCGCACTCGGCAAACCCCAGCCACAAAACCGTGCACAAAACCATGCACGCCCATATTCTCCGTAGAAAGGAGGTGATCCAGCCG

该引物用于扩增双歧杆菌基因组DNA，可获得位于乳双歧杆菌16S-23SrRNAITS的529bp的扩增片断。

所述的双歧杆菌基因组DNA，为用核酸提取方法获得的双歧杆菌基因组总DNA。

所述的乳双歧杆菌16S-23SrRNAITS区特异性的PCR扩增引物，是这样获得的：

从GenBank获得不同种双歧杆菌的16SrRNA及23SrRNAITS区序列。利用ClustalW软件对这些序列进行同源性比较，找出特异性乳双歧杆菌16S-23SrRNAITS基因序列，用Primer5.0软件设计具体的乳双歧杆菌亚种鉴定引物，将引物序列在NCBI网站blast比对，结果显示，该对引物对双歧杆菌属有扩增特异性，结合具体序列分析对乳双歧杆菌亚种有特定区分鉴定作用。所述引物可由生工公司合成。

本发明还涉及一种婴幼儿配方乳粉中双歧杆菌的鉴定方法，包括如下步骤：

提取待检样品的总DNA；

所述的待检样品为添加双歧杆菌的婴幼儿配方乳粉；

设置样品管、阳性对照管、阴性对照管，分别加入待测样品总DNA、乳双歧杆菌基因组总DNA、无DNA的蒸馏水为模板各2μL；各管加入引物Lactis16-23F(5μmol·L^-1)、Lactis16-23R(5μmol·L^-1)各1μL和其他PCR试剂；

对以上各管进行常规PCR扩增；

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；

结果判定：当阳性对照呈现529bp扩增条带，阴性对照没有扩增条带时，如果待测样品出现529bp条带时，待测样品为双歧杆菌，反之待测样品不是双歧杆菌。

在进一步优选的方案中，PCR反应的条件为：

98℃变性10s，58℃退火5s，72℃延伸40s，32个循环。

优选的，所述的其他PCR试剂：

ddH₂O8.5μL，TakaraPrimeSTARMaxPremix(2×)12.5uL[Mg²⁺conc.(2×)＝2mmol·L^-1,dNTPMixture(2×)＝0.4mmol·L^-1each]，总体积25μL。

扩增产物用引物Lactis16-23F、Lactis16-23R送双向测序，结果通过与NCBI网站中GENBANK序列进行比对，进行菌种的确定，序列与乳双歧杆菌匹配率最高且大于97％可判定该分离菌株属于动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种；仅与其他某个菌种或亚种匹配且匹配率大于97％可判定该分离菌株属于该菌种或亚种类型。

本发明提供的利用位点特异性PCR结合测序准确鉴别双歧杆菌的方法，当退火温度在56～60℃范围内时，只有双歧杆菌能扩增出相应条带，不是双歧杆菌均为阴性，重复检测得到相同结果。测序结果能精确鉴定到双歧杆菌属内各个种的亚种水平。该鉴别方法与传统的鉴别方法比较，具有更好的特异性和重现性。能有效的将动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种从其它双歧杆菌中鉴别出来。

与利用生化反应方法和16SrRNA方法进行双歧杆菌鉴别的方法比较，本发明的方法仅需要一次常规的PCR反应结合测序，即可得到精确的到亚种水平的鉴定结果，更加准确、简便、快捷，易于推广。

附图说明

图1为实施例3和4的电泳图。

具体实施方式

实施例1、双歧杆菌标准菌株基因组总DNA的提取

实验所用样本分别标号，分别为1：动物双歧杆菌(乳双歧亚种)Bi07；2：动物双歧杆菌(乳双歧亚种)Bb12；3：动物双歧杆菌(乳双歧亚种)NH019；4：动物双歧杆菌(动物双歧亚种)ATCC25527；5：短双歧杆菌Bb-03；6：长双歧杆菌(长双歧亚种)ATCC15707；7：长双歧杆菌(婴儿双歧亚种)ATCC15697；8：两歧双歧杆菌ATCC25921。

从双歧杆菌单克隆平板上挑取菌苔，加入200μl溶菌酶溶液(50mg/mL)，涡旋混匀后，放置于37℃保温2h，溶解菌体。依次加入10μl蛋白酶K(20mg/mL)和400μlSDS裂解液[含12.4g/LSDS，0.5mol/LNacl,0.1mol/LTris-HCl,0.05mol/LNa₂EDTA,PH8.0]，涡旋混匀后于56℃中水浴2h。加入600μl的25：24：1的Tris饱和酚/三氯甲烷/异戊醇，摇匀后13000rpm离心10min。吸取上清液转移于另一新的离心管中，加入与上清等体积的三氯甲烷/异戊醇(24：1)，摇匀后13000rpm离心10min。吸取上清液转移于另一新的离心管中，加入与上清液2倍体积的无水乙醇，混匀后静止一会，13000rpm离心2min，弃去上清液，加入1ml70％的乙醇溶液清洗沉淀。将沉淀在室温下放置，自然风干，待风干后加入100μl的TE溶液，溶解沉淀。

待沉淀完全溶解后，涡旋离心，用核酸蛋白仪测定DNA浓度：取一定量DNA加双蒸水稀释，用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定DNA在OD260nm和OD280nm处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按式(1)计算。

c＝A×N×50/1000……………………(1)

式中：

c——DNA浓度，单位为微克/微升(μg/uL)；

A——A260的值；

N——核酸稀释倍数。

当A260/A280比值介于1.6-2.0之间时，符合PCR检测要求，提取获得DNA置于-20℃长期保存。

结果：获得的双歧杆菌标准菌株基因组总DNA浓度介于50-100ng/_μl。

实施例2、婴幼儿配方乳粉样品中双歧杆菌的分离和总DNA提取

取市售含双歧杆菌婴幼儿配方乳粉样品分别编号，以无菌操作称取25g样品，置于装有225mL生理盐水的无菌均质杯内，于8000r/min～10000r/min均质1min～2min，制成1:10样品匀液；或置于225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min制成1:10的样品匀液。

用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。

根据对待检样品双歧杆菌含量的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL样品匀液于MUP-TOS培养基琼脂平板，使用灭菌L形棒进行表面涂布，每个稀释度作两个平板。36℃±1℃，厌氧培养48h±2h后，挑2个或2个以上单菌落转划MRS平板扩增。

菌株初步鉴定：按GB/T4789.34的规定操作。

获得样本分离单克隆菌株的菌苔后，按实施例1方法提取总DNA。

结果：获得的婴幼儿配方乳粉样品中总DNA浓度介于50-100ng/μl。

实施例3、双歧杆菌标准菌株DNA模板的验证

设置阳性对照管、阴性对照管，分别加入乳双歧杆菌基因组总DNA、无DNA的蒸馏水为模板各2μL；各管加入引物Lactis16-23F(5μmol·L^-1)、Lactis16-23R(5μmol·L^-1)各1μL和其他PCR试剂；

优选的，所述的其他PCR试剂：

ddH₂O8.5μL，TakaraPrimeSTARMaxPremix(2×)12.5uL[Mg²⁺conc.(2×)＝2mmol·L^-1,dNTPMixture(2×)＝0.4mmol·L^-1each]，总体积25μL。

程序：98℃变性10s，58℃退火5s，72℃延伸40s，32个循环。4℃保存。用1.5％琼脂糖、9V/cm电压、回流冷却电泳槽凝胶电泳分离PCR产物，用美国Biorad公司凝胶成像仪成像。

阴性对照无扩增条带。在各个对照扩增正常情况下，样品扩增出以上529bp特异条带，可送公司测定序列。如出现以下情况：阳性对照没有出现扩增条带、阴性对照出现扩增条带，则应重新进行扩增实验。

测序结果通过与NCBI网站中GENBANK序列进行比对，进行菌种的确定，序列与双歧杆菌某菌种匹配且匹配率大于97％，可判定该分离菌株属于该菌种类型；与多个菌种匹配率大于97％、序列匹配率低于97％的情况，应选用其他分型方法作多相鉴定。

结果：所有标准菌株均扩增出529bp条带。产物测序结果在NCBI比对，双歧杆菌标准菌株1-8号均成功鉴定到亚种水平。即分别为1：动物双歧杆菌(乳双歧亚种)；2：动物双歧杆菌(乳双歧亚种)；3：动物双歧杆菌(乳双歧亚种)；4：动物双歧杆菌(动物双歧亚种)；5：短双歧杆菌；6：长双歧杆菌(长双歧亚种)；7：长双歧杆菌(婴儿双歧亚种)；8：两歧双歧杆菌。

扩增电泳图见图1中1-8及15，16泳道。

1号动物双歧杆菌(乳双歧亚种)Bi07的扩增产物测序鉴定结果见表2

表21号动物双歧杆菌(乳双歧亚种)Bi07的扩增产物测序鉴定结果

实施例4、婴幼儿配方乳粉样品中分离双歧杆菌的鉴别反应

按如下方式设置反应管以及加入模板：

反应管1-6：样品管，分别加入样品1-6总DNA模板2ul

反应管7：阳性对照管，加入乳双歧杆菌总DNA模板2ul

反应管8：阴性对照管，加入蒸馏水2ul

所有反应管同样加入其他PCR试剂，同实施例3。PCR反应程序和电泳程序同实施例3。

结果：所有样品均扩增出529bp条带。产物测序结果在NCBI比对，样本中双歧杆菌分离菌株1-6号均成功鉴定到亚种水平。即分别为1：动物双歧杆菌(乳双歧亚种)；2：动物双歧杆菌(乳双歧亚种)；3：动物双歧杆菌(乳双歧亚种)；4：动物双歧杆菌(乳双歧亚种)；5：动物双歧杆菌(乳双歧亚种)；6：长双歧杆菌(长双歧亚种)。

扩增电泳图见图1中9-16泳道。

6号婴幼儿配方乳粉中分离菌株鉴定结果为长双歧杆菌(长双歧亚种)，扩增产物测序鉴定结果表3。

表36号婴幼儿配方乳粉中分离菌株鉴定结果

附：

Claims (4)

1.一对乳双歧杆菌16S-23SrRNAITS的PCR扩增引物，其特征在于，所述的引物序列为：

Lactis16-23F:5'-CGTCCTTCATCGGTACTGTCTG-3'

Lactis16-23R:5'-CGGCTGGATCACCTCCTTTC-3'。

2.婴幼儿配方乳粉中双歧杆菌的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

提取待检样品的总DNA；

所述的待检样品为添加双歧杆菌的婴幼儿配方乳粉；

设置样品管、阳性对照管、阴性对照管，分别加入待测样品总DNA、乳双歧杆菌基因组总DNA、无DNA的蒸馏水为模板各2μL；各管加入引物Lactis16-23F（5μmol·L^-1）、Lactis16-23R（5μmol·L^-1）各1μL和其他PCR试剂；

对以上各管进行PCR扩增；

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；

结果判定：当阳性对照呈现529bp扩增条带，阴性对照没有扩增条带时，如果待测样品出现529bp条带时，待测样品为双歧杆菌，反之待测样品不是双歧杆菌。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，PCR反应的条件为：98℃变性10s，58℃退火5s，72℃延伸40s，32个循环。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的其他PCR试剂为：

ddH₂O8.5μL，TakaraPrimeSTARMaxPremix(2×)12.5uL[Mg²⁺conc.(2×)=2mmol·L^-1,dNTPMixture(2×)=0.4mmol·L^-1each]，总体积25μL。