CN106319083A - 嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测试剂盒、检测方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测试剂盒，所述检测试剂盒包括用于检测乳粉中嗜酸乳杆菌成分的特异性扩增引物对。同时，本发明还公开了一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的快速检测方法，包括待测样品预处理、待测样品总DNA提取、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、分析判断步骤。此外，本发明还公开了所述快速定性检测试剂盒在制备嗜酸乳杆菌的检测试剂中的应用以及在检测乳粉中嗜酸乳杆菌成分中的应用。本发明设计的特异性引物对，并构建快速定性检测试剂盒，应用于嗜酸乳杆菌成分的定性检测，其检测方法准确、快速，具有较好的工业应用价值。

Description

嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测试剂盒、检测方法及应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测试剂盒、快速定性检测方法及应用。
背景技术
益生菌(Probiotics)是一类能够促进宿主肠内微生物菌群的生态平衡，对宿主健康和/或生理功能产生有益作用的活性微生物。其作用主要是经摄入宿主体内后，能改善肠道菌群结构，促进肠道中有益菌的增殖，抑制有害菌的生长，提高机体特异性或非特异性免疫力，从而有利于抵御各种疾病的发生。近年来，作为一类对人类有独特的营养与保健作用的微生物，益生菌越来越受到人们广泛关注。目前，市场上很多品牌纷纷推出益生菌婴幼儿配方乳粉产品，所添加的益生菌包括乳杆菌、嗜酸乳杆菌，出现了不同益生菌组合配方，宣称具有不同的功效。商家宣传通过添加益生菌，能对婴幼儿肠道功能进行调节，促进婴幼儿免疫力发展，成为一个新的卖点。而有部分配方乳粉并未对添加菌种进行明确标识，使消费者处于陷入模糊消费的境地。
WHO/FAO联合出台的《食品中益生菌评价指南》中定义，添加在食品中的益生菌必须具备三大条件：第一，必须摄入足够的数量；第二，必须对人或动物健康有益；第三，必须是活的微生物。明确指出益生菌功效具有菌株特异性；要求食品包装上要注明使用菌的菌株名称、储存条件及货架期内活性菌的数量。为了规范益生菌在食品中的使用，国家卫计委相继颁布了相应的法律法规。该规定包括使用菌种、标签标识、活菌数量的相关规定。关于使用菌种，2010年，卫计委发布了卫办监督发〔2010〕65号《可用于食品的菌种名单》，2011年第25号公告制定了《可用于婴幼儿食品的菌种名单》。2016年第6号公告将发酵乳杆菌CECT5716列入《可用于婴幼儿食品的菌种名单》。目前，我国卫计委允许在婴幼儿配方乳粉中允许使用的乳杆菌菌株为嗜酸乳杆菌NCFM、鼠李糖乳杆菌HN001、发酵乳杆菌CECT5716。目前中国市场流通领域产品主要以添加嗜酸乳杆菌NCFM为主。随着消费者对新兴产品追求的热度提升和维权意识的提高，益生菌婴幼儿配方乳粉的安全监管需求将会凸显，急需开发新的检测技术，对该类产品中菌种的添加种类进行深入研究，进一步提升婴幼儿配方乳粉的质量安全监管能力。
现有乳酸菌检测方法标准有《GB 4789.35-2010食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》，该方法仅能对乳杆菌属进行常见种的生化分型，存在鉴定操作复杂，结果不好判读的缺陷，不能满足相关领域的需要，也无法满足按照卫生部要求添加特定菌株的监管需求。为了能够确保所添加的乳酸菌为符合我国国家规定婴幼儿配方食品中允许使用的菌种，有必要建立一种快速、简便、高效、准确的乳粉中嗜酸乳杆菌的快速定性检测方法。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测试剂盒，以使嗜酸乳杆菌成分的检测快速、准确；本发明的第二个目的是提供一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测方法，以解决现有的用于检测嗜酸乳杆菌成分的方法复杂、结果不好判读的缺陷；本发明的第三个目的是提供一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测盒的应用，用于乳粉中嗜酸乳杆菌成分的检测和鉴定。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
作为本发明的第一个方面，一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测试剂盒，包括用于检测乳粉中嗜酸乳杆菌成分的特异性扩增引物对，所述特异性扩增引物对的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
作为本发明的第二个方面，一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测方法，该方法包括如下步骤：
A、待测样品预处理；
B、提取待测样品总DNA；
C、以待测样品总DNA为模板进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；其中，PCR扩增体系中包括如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物对序列；
D、对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；
E、分析待测样品中是否含有嗜酸乳杆菌：如果待测样品DNA组在746bp附近出现特异性条带，则待测样品中含有嗜酸乳杆菌，反之待测样品中不含有嗜酸乳杆菌。
根据本发明，步骤C的PCR反应的条件如下：
PCR扩增程序为：95℃，4min；95℃，30s，66℃，30s，72℃，40s，共35个循环；72℃，5min；
PCR扩增的反应体系为：2×Colorless Reaction Buffer 12.5μL；1μL 5μmol·L-1如SEQ ID NO.7所示的引物和1μL 5μmol·L-1如SEQ ID NO.8所示的引物，样品DNA2μL，ddH2O 8.5μL，总体积25μL。
根据本发明，所述的待测样品为添加有嗜酸乳杆菌的婴幼儿配方乳粉。
根据本发明，步骤A所述的待测样品预处理的方法包括：称取均质混匀的待测样品25g，置于装有225mL生理盐水的无菌均质杯内，于8000r/min～10000r/min均质1min～2min，制成1:10样品匀液；或置于225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min制成1:10的样品匀液；接着选择2个～3个连续的适宜稀释度，于MRS培养基琼脂平板(36℃±1℃)需氧培养48h±2h后，挑2个或2个以上单菌落转划MRS平板扩增，获得供DNA提取的单克隆菌株菌苔。
根据本发明，步骤B的待测样品总DNA的提取方法为：从2个或2个以上步骤A的平板上挑取单克隆菌株菌苔，加入200μL 50mg/mL溶菌酶溶液，37℃保温2h；接着，依次加入10μL20mg/mL蛋白酶K和400μL SDS裂解液[含12.4g/L SDS，0.5mol/L Nacl，0.1mol/L Tris-HCl，0.05mol/L Na2EDTA，PH 8.0]，56℃中水浴2h，而后用酚/氯仿法抽提DNA，测定DNA浓度和纯度，获得待测细菌基因组DNA。
作为本发明的第三个方面，一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测试剂盒在制备嗜酸乳杆菌的检测试剂中的应用。
一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测试剂盒在检测乳粉中嗜酸乳杆菌成分中的应用。
一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对，所述特异性引物对的序列如SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示。
本发明的有益效果是：
(1)本发明所采用的婴幼儿配方乳粉样本的预处理方法和DNA提取方法(包括添加溶菌酶、蛋白酶K等充分对细菌破壁)，使得在益生菌的提取过程中，嗜酸乳杆菌基因组DNA可以充分释放，为一种特异的适用于婴幼儿配方乳粉中嗜酸乳杆菌提取的方法，为本发明首创。
(2)本发明对目前已经报道的嗜酸乳杆菌及食品中可能添加的如鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、双歧杆菌、以及其他乳杆菌如干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌等其他乳杆菌的基因组序列进行了比对分析，选择了嗜酸乳杆菌特异的SPIDR区基因片段作为目的基因，设计了特异性的引物，以该引物对婴幼儿配方乳粉中的嗜酸乳杆菌进行定性检测，该引物具有菌种特异性。
(3)本发明可以在不进行益生菌纯培养的基础上，简便、快速、准确地定性、定量检测婴幼儿配方乳粉中嗜酸乳杆菌，整个过程对婴幼儿配方乳粉中嗜酸乳杆菌的检测程序简单、检测效率高、准确性好，灵敏度高，重复性好。
附图说明
图1为ITS-1引物对扩增各种乳杆菌图。
图2为ITS-2引物对扩增各种乳杆菌图。
图3为S1引物对扩增各种乳杆菌图。
图4为S3引物对扩增各种乳杆菌图。
图5为S2引物对扩增各种乳杆菌图。
图6为嗜酸乳杆菌DNA灵敏度检测扩增图。
图7为婴幼儿配方乳粉样品中嗜酸乳杆菌的鉴别检测电泳图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行。
实施例1、乳杆菌标准菌株基因组总DNA的提取
实施例1所采用的菌株如表1所示。
表1 乳杆菌标准菌株
将上述19种乳杆菌分别按如下方法进行提取基因组总DNA：
从乳杆菌单克隆平板上挑取菌苔，加入200μL溶菌酶溶液(50mg/mL)，涡旋混匀后，放置于37℃保温2h，溶解菌体。接着，依次加入10μL蛋白酶K(20mg/mL)和400μL SDS裂解液[含12.4g/L SDS，0.5mol/L Nacl，0.1mol/L Tris-HCl，0.05mol/L Na2EDTA，PH 8.0]，涡旋混匀后于56℃中水浴2h。接着，加入600μL的25：24：1的Tris饱和酚/三氯甲烷/异戊醇，摇匀后13000rpm离心10min。吸取上清液转移于另一新的离心管中，加入与上清等体积的三氯甲烷/异戊醇(24：1)，摇匀后13000rpm离心10min，吸取上清液转移于另一新的离心管中，加入与上清液2倍体积的无水乙醇，混匀后静止一会，13000rpm离心2min，弃去上清液，加入1ml70％的乙醇溶液清洗沉淀。将沉淀在室温下放置，自然风干，待风干后加入100μL的TE溶液，溶解沉淀。
待沉淀完全溶解后，涡旋离心，用核酸蛋白仪测定DNA浓度：取一定量DNA加双蒸水稀释，用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定DNA在OD260nm和OD280nm处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按式(1)计算。
c＝A×N×50/1000 (1)
式中：
c——DNA浓度，单位为微克/微升(μg/uL)；
A——A260的值；
N——核酸稀释倍数。
当A260/A280比值介于1.6-2.0之间时，符合PCR检测要求，提取获得DNA置于-20℃长期保存。
结果：获得的乳杆菌标准菌株基因组总DNA浓度介于50-100ng/μL。
实施例2、待测样品中嗜酸乳杆菌的分离和总DNA提取
取市售含嗜酸乳杆菌婴幼儿配方乳粉样品，以无菌操作称取25g样品，置于装有225mL生理盐水的无菌均质杯内，于8000r/min～10000r/min均质1min～2min，制成1:10样品匀液；或置于225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min制成1:10的样品匀液。
用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。
根据对待检样品嗜酸乳杆菌含量的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL样品匀液于MRS培养基琼脂平板，使用灭菌L形棒进行表面涂布，每个稀释度作两个平板。36℃±1℃，需氧培养48h±2h后，挑2个或2个以上单菌落转划MRS平板扩增。
菌株初步鉴定：按GB/T 4789.35的规定操作。
获得样本分离单克隆菌株的菌苔后，按实施例1的方法提取总DNA。
结果：获得的婴幼儿配方乳粉样品中总DNA浓度介于50-100ng/μL。
实施例3、嗜酸乳杆菌标准菌株DNA模板的验证
(1)嗜酸乳杆菌候选引物特异性分析和选择
设置样品管、阳性对照管、阴性对照管、空白对照管，分别加入待测样品总DNA、嗜酸乳杆菌基因组总DNA、植物DNA(大豆基因组DNA，根据CTAB法抽提获得)、无DNA的蒸馏水为模板各2μL；各管加入特异扩增引物上下游5μmol·L-1各1μL和PCR试剂，无菌水补足体积；
所述的PCR试剂为：2×Colorless Reaction Buffer 12.5μL，(含400μMdATP,400μM dGTP,400μM dCTP,400μM dTTP,3mM MgCl2和 DNA Polymerase，pH8.5)；引物SEQ ID NO.7(5μmol·L-1)1μL、SEQ ID NO.8(5μmol·L-1)1μL，样品DNA 2μL，ddH2O 8.5μL，总体积25μL。
反应程序为：95℃，4min；95℃，30s，66℃，30s，72℃，40s，共35个循环；72℃，5min。
电泳程序：用1.5％琼脂糖、9V/cm电压、回流冷却电泳槽凝胶电泳分离PCR产物，用美国Biorad公司凝胶成像仪成像。
本实施例共设计了5对嗜酸乳杆菌特异性扩增引物，其中ITS-1，ITS-2针对嗜酸乳杆菌16S-23S rRNA间区序列设计，S1，S2，S3针对嗜酸乳杆菌NCFM中特异性SPIDR区域设计，如下所示：
该验证实验在各个对照扩增正常情况下为：阴性对照管无扩增条带；样品管扩增出对应长度的特异条带，可确认为嗜酸乳杆菌。如出现以下情况：阳性对照管没有出现扩增条带，而阴性对照管、空白对照管出现扩增条带，则应重新进行扩增实验。
实验结果：
(1)如图1和人图2所示，ITS-1、ITS-2引物对扩增出现较多的非特异条带；对于鼠李糖乳杆菌有非特异扩增；
(2)如图3和图4所示，S1、S3引物对扩增除了主带外，还有另一条非特异条带；
(3)如图5所示，S2引物对扩增特异性最佳，所有嗜酸乳杆菌标准菌株和商业菌株均扩增出746bp条带。其中，阳性对照管扩增电泳图见图5中1，2，9，12，13，14泳道。
其中，图1-图2的各泳道说明如表2所示，图3、图5的各泳道说明如表3所示，图4的各泳道说明如表4所示。
表2 图1-图2的各泳道说明
表3 图3，图5的各泳道说明
表4 图4的各泳道说明
实验结论：ITS-1、ITS-2引物对扩增出现较多的非特异条带，对于鼠李糖乳杆菌有非特异扩增；S1、S3引物对扩增除了主带外，还有另一条非特异条带。表明ITS-1、ITS-2、S1、S3引物对的特异性不强。S2引物对扩增各种乳杆菌能够精确地检测和鉴定嗜酸乳杆菌成分，条带单一，扩增效率高，特异性强。
(2)灵敏度实验
按如下方式设置反应管以及加入模板：
反应管1-5(泳道1-5)：1.6ng/ul，160pg/ul，16pg/ul，1.6pg/ul，0.16pg/ul，加入实施例1的嗜酸乳杆菌标准菌株总DNA模板2ul。
反应管6(泳道6)：空白对照管，加入蒸馏水2ul。
所有反应管同样加入PCR试剂、PCR反应程序和电泳程序同实施例3(1)所示。
结果：泳道1-5均扩增出清晰条带，其中第5泳道0.32pg嗜酸乳杆菌标准菌株也能扩增出清晰的746bp条带。本方法灵敏度达到0.32pg嗜酸乳杆菌DNA。阳性扩增电泳图见图6中第1-5泳道。
其中，图6的各泳道说明如表5所示。
表5 图6的各泳道说明
泳道 菌种(ATCC4356) DNA浓度(pg/ul)
1 嗜酸乳杆菌标准菌株总DNA 1600
2 嗜酸乳杆菌标准菌株总DNA 160
3 嗜酸乳杆菌标准菌株总DNA 16
4 嗜酸乳杆菌标准菌株总DNA 1.6
5 嗜酸乳杆菌标准菌株总DNA 0.16
6 蒸馏水 0
实施例4、婴幼儿配方乳粉样品中嗜酸乳杆菌的鉴别检测
按如下方式设置反应管以及加入模板：
反应管1-4(泳道1-4)：阳性对照管，加入实施例1的嗜酸乳杆菌标准菌株DNA模板2ul。
反应管5(泳道5)：空白对照管，加入蒸馏水2ul。
反应管6-7(泳道6-7)：样品中分离的鼠李糖乳杆菌(标签标识及其他方法鉴定)，DNA模板2ul。按GB 4789.35-2010食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验方法分离。
反应管8-11(泳道8-11)：样品中分离的嗜酸乳杆菌(标签标识及其他方法鉴定)，DNA模板2ul。按实施例2方法分离。
所有反应管同样加入PCR试剂，同实施例3。
PCR反应程序和电泳程序同实施例3。
结果：所有嗜酸乳杆菌标准菌株和样品菌株均扩增出746bp条带。即分别为泳道1-4：嗜酸乳杆菌标准菌株；泳道8-11：样品中分离的嗜酸乳杆菌。阳性扩增电泳图见图7中泳道1-4和泳道8-11。
其中，图7的各泳道说明如表6所示。
表6 图7的各泳道说明
泳道 菌种(菌株号)
1 嗜酸乳杆菌标准菌株DNA(AS1.2686 GIM1.208)
2 嗜酸乳杆菌标准菌株DNA(ATCC4356 CICC6081)
3 嗜酸乳杆菌标准菌株DNA(NCFM)
4 嗜酸乳杆菌标准菌株DNA(La-14)
5 蒸馏水
6 样品中分离的鼠李糖乳杆菌DNA
7 样品中分离的鼠李糖乳杆菌DNA
8 样品中分离的嗜酸乳杆菌DNA
9 样品中分离的嗜酸乳杆菌DNA
10 样品中分离的嗜酸乳杆菌DNA
11 样品中分离的嗜酸乳杆菌DNA
实施例5、S2引物对的设计过程
从GenBank获得嗜酸乳杆菌的SPIDR区序列，利用Clustal W软件对不同种乳杆菌的基因组进行比较确认该区域的特异性，然后再用Primer5.0软件设计具体的嗜酸乳杆菌特异性鉴定引物，将引物序列在NCBI网站blast比对，结果显示，该对引物对嗜酸乳杆菌种有扩增特异性，结合具体序列分析对嗜酸乳杆菌种有特定区分鉴定作用。所述引物可由人工设计合成。
获得的引物对的序列如下：
S2F:5'-TGTCTGCCGCCCTTGTAGT-3'(SEQ ID NO：7)
S2R：5'-CACCTAGCGCAAGTCAACC-3'(SEQ ID NO：8)
将上述引物对用于扩增嗜酸乳杆菌基因组DNA，可获得位于嗜酸乳杆菌Spacersinterspersed direct repeat(SPIDR)的746bp的扩增片断，所述扩增后的序列如下：TGTCTGCCGCCCTTGTAGTCTTTATACATGGCAGTTCTGAAAGTAACTTTGCCCGCATCAAAAGCAACTAAGATATTAGTTGGATCTACTTGTTTAAGAATGGCATCCAACATGTTTTTAAAGGTAAAAATCGCATTAGTGTGCAACCCATCTGGACTAGTAAAGCGATCAAGTTGCCGATACAAAGCATAAAAGGCACGAAAAGCAACTGAATTTCCATCTATTAGAAGTAATTTTTTATCTGCCATTTTATTCCCCCTTATTTATTAATTGATCTATGTTTACTTATCTATTTTACCAGTTTACGGTACACTATTTCAGCATGTTGTTTTTGGAAAAGAAAAAAGCCCTGATTAGGGACTTTTTCTTGTGATCTTTCCTTCACTGCGTTAATGTAGCTCCACTTTTTTGGAGAAAATCTTGCCCAATTATTTTAAAAATATTGTGCTTCAGGGTTACCTCCACTTTCATAGAAAAAATAAAAGGCTCTAAAAGCTACAGAGTTACCATCGAGGATCACCTCCACTTTCGTGGAGAAAATTGGAATCTCATCGTAAGAAATAAGTCGCATATAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATCCTTTTCCTAGGATCTTCATAAGCTTCTCGCCAGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATATCGTAGTCAATCTCGTACTTAAAACCACCCTGGGATCACCTCCACATACGTGGAGAAAATCCAGGTTGACTTGCGCTAGGTG(SEQ ID NO：11)
本发明提供的利用位点特异性PCR准确鉴别嗜酸乳杆菌的方法，当退火温度在66℃时，只有嗜酸乳杆菌能扩增出相应条带，不是嗜酸乳杆菌均为阴性，重复检测得到相同结果。该鉴别方法与传统的鉴别方法比较，具有更好的特异性和重现性，能有效的将嗜酸乳杆菌与其它乳杆菌鉴别开来。
综上所述，本发明设计的乳粉中嗜酸乳杆菌成分的五组特异性引物对中，其中S2组的特异性引物对不仅特异性好，而且灵敏度高，为快速准确地检测乳粉中是否含有嗜酸乳杆菌成分提供了一种很好的方法，在婴幼儿配方乳粉的检测方面具有良好的应用前景，而且，所述特异性引物对可采用本领域中已知的方法，进一步制成检测试剂盒，所述试剂盒除了所述特异性引物对，还可以包括标准参照物，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市质量监督检验技术研究院
<120> 嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测试剂盒、检测方法及应用
<130> 161048
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaggcagggc agatgactgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgtccttcat cggctgttag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctagtaatc gcggatcagc ac 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cattcggaca tctccggatc ac 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caggttgact tgcgctaggt g 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gagagcaatt tcaagcacga tt 22
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgtctgccgc ccttgtagt 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cacctagcgc aagtcaacc 19
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cttctgtctg ccgcccttgt 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gggtggcaat atcttcctt 19
<210> 11
<211> 746
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgtctgccgc ccttgtagtc tttatacatg gcagttctga aagtaacttt gcccgcatca 60
aaagcaacta agatattagt tggatctact tgtttaagaa tggcatccaa catgttttta 120
aaggtaaaaa tcgcattagt gtgcaaccca tctggactag taaagcgatc aagttgccga 180
tacaaagcat aaaaggcacg aaaagcaact gaatttccat ctattagaag taatttttta 240
tctgccattt tattccccct tatttattaa ttgatctatg tttacttatc tattttacca 300
gtttacggta cactatttca gcatgttgtt tttggaaaag aaaaaagccc tgattaggga 360
ctttttcttg tgatctttcc ttcactgcgt taatgtagct ccactttttt ggagaaaatc 420
ttgcccaatt attttaaaaa tattgtgctt cagggttacc tccactttca tagaaaaaat 480
aaaaggctct aaaagctaca gagttaccat cgaggatcac ctccactttc gtggagaaaa 540
ttggaatctc atcgtaagaa ataagtcgca tataggatca cctccacata cgtggagaaa 600
atccttttcc taggatcttc ataagcttct cgccaggatc acctccacat acgtggagaa 660
aatatcgtag tcaatctcgt acttaaaacc accctgggat cacctccaca tacgtggaga 720
aaatccaggt tgacttgcgc taggtg 746

Claims (9)

1.一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测试剂盒，其特征在于，包括用于检测乳粉中嗜酸乳杆菌成分的特异性扩增引物对，所述特异性扩增引物对的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
2.一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
A、待测样品预处理；
B、提取待测样品总DNA；
C、以待测样品总DNA为模板进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；其中，PCR扩增体系中包括如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物对序列；
D、对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；
E、分析待测样品中是否含有嗜酸乳杆菌：如果待测样品DNA组中在746bp附近出现特异性条带，则待测样品中含有嗜酸乳杆菌，反之待测样品不含有嗜酸乳杆菌。
3.如权利要求2所述的快速定性检测方法，其特征在于，步骤C的PCR反应的条件如下：
PCR扩增程序为：95℃，4min；95℃，30s，66℃，30s，72℃，40s，共35个循环；72℃，5min；
PCR扩增的反应体系为：2×Colorless Reaction Buffer 12.5μL；1μL 5μmol·L-1如SEQ ID NO.7所示的引物和1μL 5μmol·L-1如SEQ ID NO.8所示的引物，样品DNA2μL，ddH2O 8.5μL，总体积25μL。
4.如权利要求2所述的快速定性检测方法，其特征在于，所述的待测样品为添加有嗜酸乳杆菌的婴幼儿配方乳粉。
5.如权利要求2所述的快速定性检测方法，其特征在于，步骤A所述的待测样品预处理的方法包括：称取均质混匀的待测样品25g，置于装有225mL生理盐水的无菌均质杯内，于8000r/min～10000r/min均质1min～2min，制成1:10样品匀液；或置于225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min制成1:10的样品匀液；接着选择2个～3个连续的适宜稀释度，于MRS培养基琼脂平板需氧培养48h±2h后，挑2个或2个以上单菌落转划MRS平板扩增，获得供DNA提取的单克隆菌株菌苔。
6.如权利要求5所述的快速定性检测方法，其特征在于，步骤B的待测样品总DNA的提取方法为：从2个或2个以上步骤A的平板上挑取单克隆菌株菌苔，加入200μL 50mg/mL溶菌酶溶液，37℃保温2h；接着，依次加入10μL 20mg/mL蛋白酶K和400μL SDS裂解液，在56℃中水浴2h；而后用酚/氯仿法抽提DNA，测定DNA浓度和纯度，获得待测细菌基因组DNA。
7.一种如权利要求1所述的快速定性检测试剂盒在制备嗜酸乳杆菌的检测试剂中的应用。
8.一种如权利要求1所述的快速定性检测试剂盒在检测乳粉中嗜酸乳杆菌成分的应用。
9.一种如权利要求1所述的乳粉中嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对，其特征在于，所述特异性引物对的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
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