CN108588245A - 乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的荧光定量pcr检测方法、检测试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法、检测试剂盒及应用，所述的乳酸菌饮料中的嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法包括的步骤有：一、以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；二、检测扩增产物的荧光信号；三、计算待测样品中嗜酸乳杆菌成分的含量；其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对和嗜酸乳杆菌成分的特异性探针。本发明根据嗜酸乳杆菌NCFM的SPIDR保守区域设计引物和探针，并构建检测试剂盒，应用于嗜酸乳杆菌成分的定量检测，其检测方法准确、快速，具有较好的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法、检测试剂盒及应用。
背景技术
嗜酸乳杆菌是重要的益生菌，被大量应用在食品中。研究表明嗜酸乳杆菌能在乳制品中产生乳酸，并能通过氨基酸代谢增加风味。其主要作用有降低pH，产生抗菌素，如嗜酸菌素和乳酸杀菌素等，在一定程度上抑制肠道中有害微生物的有害作用。Kumar等人发现嗜酸乳杆菌对大肠杆菌、腹泻致病菌等均有抑制作用(A.Kumar,W.A.Alrefai,A.Borthakur,P.K.Dudeja,Lactobacillus acidophilus counteracts enteropathogenicE.coli-induced inhibition of butyrate uptake in intestinal epithelial cells,American Journal of Physiology Gastrointestinal & Liver Physiology,309(2015)G602)；大量的嗜酸乳杆菌还可阻碍胆固醇的合成，降低血浆中胆固醇含量；另外，对于乳糖不耐症也有一定的疗效。嗜酸乳杆菌对肠道菌群的平衡和对微生态的调节也证明其具有健康促进的作用(Y.Huang,Y.Zheng,The probiotic Lactobacillus acidophilus reducescholesterol absorption through the down-regulation of Niemann-Pick C1-like1in Caco-2cells,British Journal of Nutrition,103(2010)473)。在我国，饮料中添加益生菌特别是嗜酸乳杆菌成为新的发展趋势。
关于益生菌的使用我国发布了一系列的法律法规，2010年，在《卫生部公安厅关于印发<可用于食品的菌种名单>的通知》(卫办监督发[2010]65号)，规定了食品中允许使用的菌种。2013年卫生部发布了关于食品中使用菌种标签标识有关问题的复函(卫办监督函[2013]367号)中明确指出，预包装食品中使用了上述菌种的，应当按照《预包装食品标签通则》(GB7718-2011)的要求标注其菌种名称，企业可同时在预包装食品上标注相应的菌株名、菌株号和活菌量。2016年制定了关于乳酸菌检测方法的标准《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》并在《GB 7101-2015食品安全国家标准饮料》规定乳酸菌饮料产品标签应标明活菌或非活菌，标识活菌的其活菌数至少要达到1×106CFU/mL。但是，该标准的检测方法基于培养法，操作复杂、结果判读时间长，耗时耗力，而且结果受操作者经验影响较大，很难满足市场快速检测和精确定量的要求。
目前，利用分子生物法进行检测的手段已在食品微生物检测中得到应用。Guo等人研究了发酵食品中嗜酸乳杆菌的检测技术(Z.Guo,H.Fang,Z.Xia,X.Zhu,Z.Sun,H.Yu,J.Xia,Detection of Lactobacillus acidophilus in Fermented Material by Real-time Fluorescent Quantitative PCR,Animal Husbandry & Feed Science,(2016)54-57)；Liu利用荧光定量PCR方法对发酵乳中的双歧杆菌进行检测，并与平板计数法进行比较，结果显示PCR法与平板法技术结果相符(劉佳欣,Liu,JiaXin,Identification andquantification of Bifidobacterium in simulated fermented milk by real-timequantitative PCR,(2011))。这些均证明实时荧光定量PCR可以在乳酸菌饮料的检测中应用，且具有快速、通量高、重复性高等优点。但是，目前国内外对嗜酸乳杆菌的定量检测研究报道较少。
为防止市场上出现滥竽充数的情况，有必要建立一种快速、简便、高效、准确的乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌的定量检测方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法，以解决现有的用于检测乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的方法操作复杂、费时费力的问题；本发明的第二个目的是提供一种乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的检测试剂盒，以使乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的检测快速、准确；本发明的第三个目的是提供一种乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的检测试剂盒的应用。本发明的第四个目的是提供一种乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对和特异性探针。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
作为本发明的第一个方面，一种乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法，该方法包括以下步骤：
步骤一：以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；
步骤二：检测扩增产物的荧光信号；
步骤三：计算待测样品中嗜酸乳杆菌的含量；
其中，用于荧光定量PCR扩增的反应体系中含有扩增嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对和嗜酸乳杆菌成分的特异性探针，所述扩增嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；所述嗜酸乳杆菌成分的特异性探针的核苷酸序列如SEQID NO：4所示。
根据本发明，步骤一的PCR扩增的反应体系和反应条件如下：
实时荧光定量PCR的反应体系为20μL，包含TaKaRa Prober Taq mix 10μL，上、下游引物各1μL 5μmol/L，探针0.5μL 5μmol/L，2.0μL DNA模板，去离子水补足至20μL；
进行PCR扩增的反应条件：95℃、30s；95℃、5s，60℃、35s，40个循环。
作为本发明的第二个方面，一种乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：
(a)扩增嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对，所述扩增嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；
(b)嗜酸乳杆菌成分的特异性探针，所述嗜酸乳杆菌成分的特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
根据本发明，所述的检测试剂盒还包括：嗜酸乳杆菌标准参照物。
作为本发明的第三个方面，一种乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的检测试剂盒的应用，所述检测试剂盒在定量检测乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分中的应用。
作为本发明的第四个方面，一种乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对和特异性探针，所述特异性引物对的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的有益效果是：
1、可快速、简便地检测乳酸菌饮料中是否存在嗜酸乳杆菌成分以及定量检测乳酸菌饮料中的嗜酸乳杆菌成分的含量；
2、本发明的乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法的特异性好，灵敏度高，重复性好，抗干扰性强；
3、本发明的乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法的适用范围广，特别适用于乳酸菌饮料中的嗜酸乳杆菌成分的检测，因此可以推广应用，对保障产品的质量，保护消费者知情权和选择权，维护正常的经济秩序等提供了技术支持，为食品的市场监督部门和检验检疫部门提供了技术支持。
4、本发明的乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法的应用性更强，对市场上出现的“活菌型”和“灭菌型”乳酸菌饮料均可检测，更大程度上加强对市场的监督作用。
附图说明
图1为实施例2的21株菌株的实时荧光PCR定量检测方法的特异性检测结果。
图2为乳杆菌通用引物ST16F、ST16R对实施例2的21株菌株的扩增图谱。
图3为乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的定量标准曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行，例如，以下实施例的标准菌株及乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌的培养按照国家标准GB/4789.35-2016进行培养。
以下实施例所采用的仪器与设备
振荡水浴槽5430R德国艾本德有限公司；
电热恒温培养箱美国SHELLAB公司；
生物安全柜ESCO LA2-4A1新加坡艺思高；
荧光定量PCR仪7500Fast美国ABI公司。
实施例1引物对和探针的设计以及PCR的反应条件
1、嗜酸乳杆菌特异性引物和探针的设计
本实施例共设计了4对嗜酸乳杆菌特异性引物和探针，具体如下：
第一组：在NCBI网站上(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)下载嗜酸乳杆菌NCFM基因组，利用SPIDR的保守区域序列，借助ClustalW软件对此序列进行比对，然后使用Primer Express 3软件设计引物、探针。
针对嗜酸乳杆菌成分的扩增片段的长度为213bp，扩增序列如SEQ ID NO：1所示，在NCBI网站上使用BLAST数据库比对引物和探针的理论特异性。
acggtacactatttcagcatgttgtttttggaaaagaaaaaagccctgattagggactttttcttgtgatctttccttcactgcgttaatgtagctccacttttttggagaaaatcttgcccaattattttaaaaatattgtgcttcagggttacctccactttcatagaaaaaataaaaggctctaaaagctacagagttaccatcgaggat(SEQID NO：1)
荧光定量PCR的引物对和探针的序列如下：
NCFM F:5’-gtgatctttccttcactgcgt-3’，Tm：55℃(SEQ ID NO：2)
NCFM R:5’-tcctcgatggtaactctgtagc-3’，Tm：56℃(SEQ ID NO：3)
NCFM P 5’-FAM-tgtgcttcagggttacctccactttca-BQH-3’，Tm：62℃(SEQ ID NO：4)
其中，FAM表示荧光报告基团，BQH表示淬灭基团。本发明采用荧光探针法，其检测原理是利用荧光标记特异性探针来识别模板。
第二组：基因组为：Lactobacillus acidophilus ATCC:4356beta-galactosidase(lacZ)gene,complete cds
全序列为：
tagaggaaataaaatgacacaattatcacgttttctttatggtggtgattataatcctgaccaatggccagaagaaacatggtcgaaagatattcacgtatttaaaaaggcggatattaattcggcaacgattaacattttttcttgggcattgcttgaaccaagagaaggaaaatataatttctcaaaattagataaagttgtacaacaattatctgatgctaactttgatattgtgatgggaacagccacagcagcgatgccagcttggatgtttaaaaaatatcccgatattgccagagtagattatcaagacagacgtcatgtatttggtcagcggcataacttctgtcctaatagctcaaattatcaaagattagctggtgaattagtaaagcagttagttgaacgctacaaggataataagcatatcgtagtttggcacataaacaatgaatatggtggcaactgttattgtgagaattgtcaaaacgcttttagaaaatggttgaagaataaatataagaccgttgaaggtcttaacaaggcatggaatatgaatgtatggagccatacgatttatgactgggatgaaattgttgttcctaatgagttaggggatgtatggggaatagaaggtagtgaaactattgtagctggtctttcaattgattatctgcgttttcaatctgaaagtatgcaaaatcttttcaagatggaaaagaagattattaaaaaatatgatccggaaactcctgtaacgactaatttccatggtttgcctaacaagatggttgattatcaaaagtgggcaaaaggtcaagatattatttcatatgatagttatccaacttatgatgctcctgcatataaagcggcattcttgtatgacttaatgcgaagcttgaaacatcagccatttatgttaatggaatctgcgccttcacaagttaactggcaaccatatagtccgcttaagcggcctggacaaatggaagcaactgaatttcaagctgtagcccatggtgctgatacggtacaattcttccaattaaaacaagcagttggtggctccgaaaaattccacagtgcagttattgctcattcgcaaagaaccgatactagagtatttaaagaactagctgatttagggaagaaattaaagaatgctggaccaacgattttagggtcaaagactaaggcaaaggtcgcaattgtctttgattggagtaacttctggtcgtatgagtatgtggacggaattactcaagatttgaactatgtagattctattcttgattactaccgtcagttctatgaacgcaatattccaactgacatcattggtgtagacgatgactttagcaactatgatttggttgtagcgcctgtgctttatatggttaaacatggtcttgataagaagatcaacgactatgttgaaaacggtggtaactttgtcactacttatatgtcaggcatggtgaactcatcagataatgtatatcttggtggctatcctggtccattgaaggaagttacaggcatttgggttgaagaaagtgatgcagtagtcccaggacaaaagattaaggtcttaatgaatggtaaggattatgatactggtctgatctgtaacttgattcatccaaatgacgctaagattttggcaacttatgcgagtgaattttatgcaggtacgccagctgttaccgaaaatcaatatggcaaaggtagggcttggtatattggtacaaggcttgaacatcaagggttaactcaattattcaatcatattatttttgaaacgggtgttgaatcactggtttgcgatagtcataaactagaaataactaagcgtgttactgaagatggtaaggaactttactttgtgcttaatatgagtaatgaagaaagaacgttaccaagcaagttcacaggttatgaagatattttaactggtgaaaaagctcataaagatatgaaaggttgggatgttcaagtattgagaaattag(SEQ ID NO：5)
针对嗜酸乳杆菌成分的扩增片段的长度为198bp，扩增序列如SEQ ID NO：6所示。
cgcctgtgctttatatggttaaacatggtcttgataagaagatcaacgactatgttgaaaacggtggtaactttgtcactacttatatgtcaggcatggtgaactcatcagataatgtatatcttggtggctatcctggtccattgaaggaagttacaggcatttgggttgaagaaagtgatgcagtagtcccaggac(SEQ ID NO：6)
荧光定量PCR的引物对和探针的序列如下：
L acZ 1-F：-gcgcctgtgctttatatggt-3’，Tm：55.8℃(SEQ ID NO：7)
L acZ 1-R：-tcctgggactactgcatcac-3’，Tm：55.8℃(SEQ ID NO：8)
L acZ 1-P：-FAM-ccttcaatggaccaggatagccacca-BQH-3’，Tm：62.3℃(SEQ ID NO：9)
第三组：基因组为：Lactobacillus acidophilus CdpA(cdpA)gene,completecds，
全序列为：
agacttatacacttaagtcaaatggcagcaaagttacaactactgtttcatcaaataaaagaccacttcaagtaagaatagtaagactactaagtcatcaaagactagtgaaagtacttcaaagaagtcaactaagtctgacactaagagtaagtcaacttcaactactaagaaggaaactgcaactaagtcagatacttcaaaatcagactcaaagaagagtacttcaactaagaaagctacttcatcaaagtcaactaacaagactacttcaaagaagtcagtaaccattaagcctgtaaagattactatgaagaatagagcttacgtttacgacaagaatggtaaaagagtaaaagattacttaggtacaagttacgttggcaagggtgttactgtaaagggcttaggcactaagactattaatggtgttaagtactatgctttacaacctaatcactattacgtaaaagcttcagatgtaactgttaagtaatagatatattgaaagatgtcttttcgattaagaaaagatgtctttttttgtcctaaaattggcaaatttccaatttggatttacaatagagtagatgagtttaaatatagcatgcgaggtatattatcgatgaaattaaatcataagttgattatggtatccagcagctgcattaatgagcgtaagtccatttgtaggtactggcaaaatgttcaagctgctactactaaatcatcaagcaaaactactgctaagaagactacttcagcttcaaagactaagactaagtcttcatcaaagaaggctactagtcaatctacttcaactaagaagacaagttcaacaaaatcaagctctaagactacttcttcaactagtgcaaagagtacttcaactaagaaggcagcttcaaacactattaagttagttcacaatgcttatgtttatgacaagaatggtaagcgtcttactaagtacatgggcagtgcaaagtacactactattgctaaaggtgtaactcttaagtctaatggtacagtgaagatcgatggtgttctttactacagcctcggtaataatgcctatattaaggctgttaacgtagatggcccatctgcttcagcttcatcaactactaagaagccatcttcaagtacttcttcaacagtaactgctgtaagcattaagattgctcgtaattcatacgtttatgatgaaaatggtaagcgtattaaaaagtatgaaggtaaagataaacttactaagggtactactgttgattcatacggtacagaaactattgatggtaagttatactaccaacttaataaaaagggtacagcttttgtaaaggcaagtaatgtagatacaaatgaaacagctactattactttaaagaagaatgcctacatttatgatggcaatggcgatactaagaaaaagaaaattaagaagggcaagagtgtaaaggctactgaagcaagatacattggtactaagctttactacaagattggtgatgatcaatttgtaaaggctgctaatgtgggtaaagtttcaggtgctaagcttgatcctatcaatgaaccagatggagaagcaactgttgatgatccatcgactgataatgttaacccagatgtaactaaggtaactaccattggtgtaactccactttacaatattaagggtcaaaaagacgacaccagattatttggtgctggtcaaagtcaacaagtttcagaattaagatatattgcaacttcagcaaacggtaccccagacttgttctacaaattagctagtggtagaggttacttgaaggctagtgatgtaattgttagtggtaagactttgtcacctgttaatactccagaacaagctaaggctgatgtaactgttgcaactgcagcagataagactaagttgtcagaaagtattaataattctaagaacgttaaaaattctactacttacaagctttcatcatcagacttaagaaataactatgataaggctgtttctgatgcaactgctgttaataacaatgcttcagcaactattgctcaagttaatgaagcagtagctaacattaatgaagcttacgctaagcttaacggtcaaaaaatagttgtagctaacttaagtaatcttactttagatgaagccaaccaaattgttaagttagttgctagtgtaagaaacgttccagaaagtaatgttcaattctcaaataacaacactactttagcaatcgtttcatcaaatggctacaatgaacctttgaatattagcgactttgctcaacaaagataatttgttaacaaaataagacgtacacctaggggtagatgtacgtcttattttttaggatattttcgttgtactagaaagtacacatatattctaacttttttagtggctaatagttagtgattttgcttgttttttattaatgagagcacacaattagtttagtagcattaatcctgcgacattttaacgaaaatcttgttataattagaagtatagtagttctttttagaatgacttttgctaaaatagagctggttaattatttttacggaggaaattatgtcctataaagacgatatgataattttgccctcaactctaatgtaccgttggcacaaaagattgctgatcgtgtaagtattccactttcaaaatcaagtgttgagcgtttt(SEQ ID NO：10)
针对嗜酸乳杆菌成分的扩增片段的长度为195bp，扩增序列如SEQ ID NO：11所示。
ccagaacaagctaaggctgatgtaactgttgcaactgcagcagataagactaagttgtcagaaagtattaataattctaagaacgttaaaaattctactacttacaagctttcatcatcagacttaagaaataactatgataaggctgtttctgatgcaactgctgttaataacaatgcttcagcaactattgct(SEQ ID NO：11)
荧光定量PCR的引物对和探针的序列如下：
L cdpA 1-F：-tccagaacaagctaaggctga-3’，Tm：55.9℃(SEQ ID NO：12)
L cdpA 1-R：-gcaatagttgctgaagcattgt-3’，Tm：55.0℃(SEQ ID NO：13)
L cdpA 1-P：-FAM-aacagcagttgcatcagaaacagcctt-BQH-3’，Tm：62.0℃(SEQ IDNO：14)
第四组：基因组为：Lactobacillus acidophilus CdpA(cdpA)gene,completecds，全序列如SEQ ID NO：10所示。
针对嗜酸乳杆菌成分的扩增片段的长度为187bp，扩增序列如SEQ ID NO：15所示。
atgggcagtgcaaagtacactactattgctaaaggtgtaactcttaagtctaatggtacagtgaagatcgatggtgttctttactacagcctcggtaataatgcctatattaaggctgttaacgtagatggcccatctgcttcagcttcatcaactactaagaagccatcttcaagtacttcttcaa(SEQ ID NO：15)
荧光定量PCR的引物对和探针的序列如下：
L cdpA 2-F：-catgggcagtgcaaagtaca-3’，Tm：55.8℃(SEQ ID NO：16)
L cdpA 2-R：-tgaagaagtacttgaagatggct-3’，Tm：54.0℃(SEQ ID NO：17)
L cdpA 2-P：-FAM-acgtagatggcccatctgcttcagc-BQH-3’，Tm：63.2℃(SEQ ID NO：18)
申请人将上述设计的四对引物和探针采用BLAST数据分析，BLAST结果显示，第一组、第二组和第三组的引物的BLAST结果均为嗜酸乳杆菌，但实际实验结果显示，第二组和第三组的引物对非嗜酸乳杆菌菌株有扩增；而第四组的BLAST结果显示该引物可非特异性的扩增出瑞士乳酸杆菌。因此，后续实验仅针对第一组的引物和探针进行。
2、乳杆菌通用引物的设计
乳杆菌通用引物序列用于扩增提取的DNA，检验提取物中含有核酸，作为对照。引物和探针均由英潍捷基生物公司合成。乳杆菌通用引物序列如下：
ST16F:5'-ctggtctgtaactgacgctgag-3'(SEQ ID NO：19)
ST16R:5'-ccaactgaatgatggcaactaa-3'(SEQ ID NO：20)
3、实时荧光定量PCR的反应体系和反应条件
实时荧光定量PCR的反应体系为20μL，包含TaKaRa Prober Taq mix 10μL，上、下游引物(5μmol/L)各1μL，探针(5μmol/L)0.5μL，2.0μL DNA模板，去离子水补足至20μL。采用实时荧光定量PCR系统进行扩增。
反应条件：95℃、30s；95℃、5s，60℃、35s，40个循环。
实施例2DNA的提取
标准菌株核酸提取：用无菌棉签沾取培养基上的菌株，在装有无菌水的2mL离心管中洗脱，离心，加入400μL浓度为50ng/μL的溶菌酶，37℃孵育2小时，再加入40μL蛋白酶k和400μL SDS，56℃水浴2小时，后按照核酸提取的步骤提取核酸。
样品混匀，取2mL加入离心管中，2000g离心5min，上清液移至新的离心管中，加入5mL无菌水，混匀，沸水中放置10min，2000g离心5min，上清液移至新的离心管中，再次9000g离心10min，去上清，沉淀加入400μL溶菌酶(50ng/μL)，37℃孵育2小时，再加入40μL蛋白酶k(20mg/mL)和400μL SDS，56℃水浴2小时，后按照核酸提取的步骤提取核酸。
本实施例所采用的菌株样本如表1所示。
表1标准菌种名称及其编号
实施例3嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法的特异性检测
以实施例2获得的21株菌株的核酸为模板，采用建立的实时荧光定量PCR体系进行检测。其中，实时荧光定量PCR的反应体系和反应条件如实施例1所示。
结果如图1和图2所示。其中，图1为实施例2的4株标准菌株、17株非特异性菌株及空白对照的实时荧光定量PCR检测方法的特异性检测结果；图2为乳杆菌通用引物ST16F、ST16R对21株菌株的扩增图谱。
图1结果显示，所有的嗜酸乳杆菌的标准菌株均有明显的扩增，且Ct值在16-18之间，其他菌株均无明显的扩增。
图2结果显示，采用乳杆菌通用引物对所有菌株进行扩增时，可见到清晰的扩增条目。
结论：实时荧光定量PCR检测方法对于嗜酸乳杆菌有较好的特异性。
实施例4嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法的灵敏度检测
(1)绝对灵敏度检测：选取4株嗜酸乳杆菌，分别将实施例2提取的核酸溶液进行10倍梯度稀释，核酸浓度依次为：58、5.8、0.58、0.029、0.058、0.0058、0.00058、0.000058ng/μL，进行荧光扩增。结果如表2所示。
表2实时荧光定量PCR检测的绝对灵敏度
如表2所示，嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus ATCC4356；嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus CICC6082；嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus NCFM；嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus La-14等菌株，可稳定检测的最低浓度为0.00058ng/μL，R2＝0.989。每个模板添加4μL，即检测限约在3pg左右。
结论：本实施例的实时荧光定量PCR体系的绝对灵敏度达到3pg。
(2)相对灵敏度检测：将实施例2的嗜酸乳杆菌ATCC4356(CICC6081)培养液按照10倍梯度稀释法从108CFU/mL—102CFU/mL各浓度取1mL提取核酸，以该核酸为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，采用建立的实时荧光定量PCR体系进行检测。灵敏度的检测每个质量浓度设置6个平行，实验重复3次，最终满足不小于96％置信区间的要求。结果如表3所示。
表3实时荧光定量PCR的相对灵敏度检测
如表2所示，嗜酸乳杆菌ATCC 4356的绝对灵敏度可稳定检出的最低浓度为103CFU/mL，R2＝0.987。
综上所述，根据绝对灵敏度和相对灵敏度的检测可得出，本实施例的实时荧光定量PCR的检测限为103CFU/mL。
实施例5嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法的重复性检测
重复性测试：采用嗜酸乳杆菌ATCC4356(CICC6081)标准菌株核酸的6个质量浓度的梯度稀释液进行扩增，每个质量浓度4个平行，计算Ct值的标准偏差(SD)和相对标准偏差(RSD)。结果如表4所示。
表4实时荧光定量PCR的重复性
如表4所示，Ct值的SD介于0.14—0.56之间，RSD介于0.862—2.55之间，均在可接受范围内。
结论：本实施例的实时荧光定量PCR方法的重复性较好。
实施例6嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法的抗干扰能力检测
对建立的实时荧光定量PCR体系抗干扰能力测试包括培养物水平抗干扰能力检测和核酸水平抗干扰能力检测。在实际检测中，样品中的菌株一般是目标菌和其他菌株的混合物，因此在培养物水平进行检测可以排除样品中或在提取过程中混入杂菌的可能性；在纯基因水平进行抗干扰能力的检测可以排除在扩增过程中出现交叉污染的情况。
(1)核酸水平抗干扰能力检测：将提取的的嗜酸乳杆菌ATCC4356(CICC6081)的核酸进行稀释至：58、5.8、0.58、0.058、0.0058、0.00058ng/μL，分别添加30ng、3ng、300pg的大肠杆菌ATCC25922核酸，对制备的混合核酸模板进行实时荧光定量PCR扩增。结果如表5所示。
表5实时荧光定量PCR在纯基因水平上的抗干扰能力
如表5所示，在不同浓度的嗜酸乳杆菌ATCC4356的核酸中添加300pg、3ng、30ng的大肠杆菌ATCC25922的核酸提取物，各浓度梯度核酸检出的Ct值均未受影响。
结论：本实施例的实时荧光定量PCR扩增体系的抗干扰能力强。
(2)培养物水平抗干扰能力检测：将嗜酸乳杆菌ATCC4356(CICC6081)培养至108CFU/mL后依次稀释至10CFU/mL，然后添加浓度为104CFU/mL和106CFU/mL的大肠杆菌ATCC25922，并提取核酸。每个浓度2个平行，每个样品重复3次。结果如表6所示。
表6实时荧光定量PCR在培养物水平上的抗干扰能力
如表6所示，在样品中混入杂菌对实时荧光定量PCR的扩增是没有干扰的，且检出限仍在103CFU/uL。
结论：本实施例的实时荧光定量PCR扩增体系的抗干扰能力强。
实施例7模拟样品检测
(1)利用建立好的实时荧光定量PCR技术对模拟样品进行检测，模拟样品的制作：嗜酸乳杆菌ATCC4356(CICC6081)培养至109CFU/mL，以市场上购买不含嗜酸乳杆菌的乳酸菌饮料作为基质，进行梯度稀释，最终将稀释液进行核酸提取，用该核酸为模板扩增。每个浓度进行5个平行。结果如表7所示。
表7模拟样品的实时荧光定量PCR检测
(2)定量标准曲线的建立
根据荧光定量PCR的数学原理，将表7的数据进行处理，以嗜酸乳杆菌标准株已知的不同稀释菌数对数值(lg(CFU/g))为横坐标，以反应过程中出现荧光信号的ΔCt值为纵坐标，绘制标准曲线，结果如图3所示，标准曲线为：y＝-3.4932x+38.267，R2＝0.999。由图3可知，以不含嗜酸乳杆菌的乳酸菌饮料为基质的模拟样品检测中，检测的线性较好，R2＝0.999，检测限仍在103CFU/mL。
结论：本发明建立的实时荧光定量PCR的检测方法是可行的，且检测的结果与实际添加量是一致的。因此对于需要定量的样品，每次测得样品的Ct值，利用标准曲线公式求得相应的x值。
实施例8实际样品的检测
市场上随机购买样品，按建立的实时荧光定量PCR方法进行检测。每个样品3个平行，重复试验3次。
对市售的6份含嗜酸乳杆菌的乳酸菌饮料和5份不含嗜酸乳杆菌的乳酸菌饮料共11份样品采用建立的实时荧光定量PCR方法进行检测，利用实施例1的乳杆菌通用引物进行扩增，样品核酸全部扩增出目的条带，表明样品中已提出可扩增的DNA，采用实施例1的嗜酸乳杆菌属的SPIDR保守区域的基因引物扩增，含有嗜酸乳杆菌的6份乳酸菌饮料全部扩增出目标条带，定量检测结果表8所示。
表8实际样品的荧光定量PCR检测结果
如表8所示，本发明的乳酸菌饮料中的嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法可以对乳酸菌饮料中的嗜酸乳杆菌成分进行精确鉴定，以及可以检测出乳酸菌饮料中的嗜酸乳杆菌的具体含量。
综上所述，本发明利用嗜酸乳杆菌属的特异性序列设计探针和引物，建立了实时荧光定量PCR检测方法在乳酸菌饮料中的检测应用。实验结果证明，本发明建立的检测方法特异性好，对于其他属内、属间菌株均无扩增；检测限较低，纯基因水平检测限在3pg左右，绝对灵敏度检测达到103CFU/mL，且重复性较好；在抗干扰能力上，无论是培养物水平还是纯基因组水平，其抗干扰能力都很强；模拟样品检测中其检测限未改变，重复性较好，证明适合在市场检测中使用。因此，本发明设计的乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的实时荧光PCR扩增的特异性引物对和探针为快速、准确地区分是否含有嗜酸乳杆菌成分提供了一种很好的检测方法，在乳酸菌饮料中的嗜酸乳杆菌的检测把关上，具有良好的应用前景。而且，所述特异性引物对和探针可采用本领域中已知的方法，进一步制成检测试剂盒，所述检测试剂盒除了所述特异性引物对和探针外，还可以包括标准参照物，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
序列表
<110> 上海市质量监督检验技术研究院
<120> 乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法、检测试剂盒及应用
<130> 181038
<141> 2018-04-19
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 213
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acggtacact atttcagcat gttgtttttg gaaaagaaaa aagccctgat tagggacttt 60
ttcttgtgat ctttccttca ctgcgttaat gtagctccac ttttttggag aaaatcttgc 120
ccaattattt taaaaatatt gtgcttcagg gttacctcca ctttcataga aaaaataaaa 180
ggctctaaaa gctacagagt taccatcgag gat 213
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgatctttc cttcactgcg t 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcctcgatgg taactctgta gc 22
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgtgcttcag ggttacctcc actttca 27
<210> 5
<211> 2017
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tagaggaaat aaaatgacac aattatcacg ttttctttat ggtggtgatt ataatcctga 60
ccaatggcca gaagaaacat ggtcgaaaga tattcacgta tttaaaaagg cggatattaa 120
ttcggcaacg attaacattt tttcttgggc attgcttgaa ccaagagaag gaaaatataa 180
tttctcaaaa ttagataaag ttgtacaaca attatctgat gctaactttg atattgtgat 240
gggaacagcc acagcagcga tgccagcttg gatgtttaaa aaatatcccg atattgccag 300
agtagattat caagacagac gtcatgtatt tggtcagcgg cataacttct gtcctaatag 360
ctcaaattat caaagattag ctggtgaatt agtaaagcag ttagttgaac gctacaagga 420
taataagcat atcgtagttt ggcacataaa caatgaatat ggtggcaact gttattgtga 480
gaattgtcaa aacgctttta gaaaatggtt gaagaataaa tataagaccg ttgaaggtct 540
taacaaggca tggaatatga atgtatggag ccatacgatt tatgactggg atgaaattgt 600
tgttcctaat gagttagggg atgtatgggg aatagaaggt agtgaaacta ttgtagctgg 660
tctttcaatt gattatctgc gttttcaatc tgaaagtatg caaaatcttt tcaagatgga 720
aaagaagatt attaaaaaat atgatccgga aactcctgta acgactaatt tccatggttt 780
gcctaacaag atggttgatt atcaaaagtg ggcaaaaggt caagatatta tttcatatga 840
tagttatcca acttatgatg ctcctgcata taaagcggca ttcttgtatg acttaatgcg 900
aagcttgaaa catcagccat ttatgttaat ggaatctgcg ccttcacaag ttaactggca 960
accatatagt ccgcttaagc ggcctggaca aatggaagca actgaatttc aagctgtagc 1020
ccatggtgct gatacggtac aattcttcca attaaaacaa gcagttggtg gctccgaaaa 1080
attccacagt gcagttattg ctcattcgca aagaaccgat actagagtat ttaaagaact 1140
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ggcaaaggtc gcaattgtct ttgattggag taacttctgg tcgtatgagt atgtggacgg 1260
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acgcaatatt ccaactgaca tcattggtgt agacgatgac tttagcaact atgatttggt 1380
tgtagcgcct gtgctttata tggttaaaca tggtcttgat aagaagatca acgactatgt 1440
tgaaaacggt ggtaactttg tcactactta tatgtcaggc atggtgaact catcagataa 1500
tgtatatctt ggtggctatc ctggtccatt gaaggaagtt acaggcattt gggttgaaga 1560
aagtgatgca gtagtcccag gacaaaagat taaggtctta atgaatggta aggattatga 1620
tactggtctg atctgtaact tgattcatcc aaatgacgct aagattttgg caacttatgc 1680
gagtgaattt tatgcaggta cgccagctgt taccgaaaat caatatggca aaggtagggc 1740
ttggtatatt ggtacaaggc ttgaacatca agggttaact caattattca atcatattat 1800
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<212> DNA
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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aaagattact atgaagaata gagcttacgt ttacgacaag aatggtaaaa gagtaaaaga 360
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tactaaatca tcaagcaaaa ctactgctaa gaagactact tcagcttcaa agactaagac 780
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ttt 2703
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<212> DNA
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<400> 20
ccaactgaat gatggcaact aa 22
Claims (6)
1.一种乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；
步骤二：检测扩增产物的荧光信号；
步骤三：计算待测样品中嗜酸乳杆菌的含量；
其中，用于荧光定量PCR扩增的反应体系中含有扩增嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对和嗜酸乳杆菌成分的特异性探针，所述扩增嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对的序列如SEQID NO：2和SEQ ID NO：3所示；所述嗜酸乳杆菌成分的特异性探针的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示。
2.如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌成分的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤一的PCR扩增的反应体系和反应条件如下：
实时荧光定量PCR的反应体系为20μL，包含TaKaRa Prober Taq mix 10μL，上、下游引物各1μL 5μmol/L，探针0.5μL 5μmol/L，2.0μL DNA模板，去离子水补足至20μL；
进行PCR扩增的反应条件：95℃、30s；95℃、5s，60℃、35s，40个循环。
3.一种乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：
(a)扩增嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对，所述扩增嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；
(b)嗜酸乳杆菌成分的特异性探针，所述嗜酸乳杆菌成分的特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
4.如权利要求3所述的乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：嗜酸乳杆菌标准参照物。
5.一种如权利要求3或4所述的乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的检测试剂盒在定量检测乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分中的应用。
6.一种如权利要求1所述的乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对和特异性探针，其特征在于，所述特异性引物对的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.4所示。
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