CN105274199A - 一种同时检测金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种同时检测金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌的试剂盒及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105274199A
CN105274199A CN201510337639.3A CN201510337639A CN105274199A CN 105274199 A CN105274199 A CN 105274199A CN 201510337639 A CN201510337639 A CN 201510337639A CN 105274199 A CN105274199 A CN 105274199A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seqidno
slope
cronobacter sakazakii
streptococcus aureus
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510337639.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105274199B (zh
Inventor
刘舟
谢雪钦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xiamen Products Quality Supervision & Inspection Institute
Xiamen Medical College
Original Assignee
Xiamen Products Quality Supervision & Inspection Institute
Xiamen Medical College
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xiamen Products Quality Supervision & Inspection Institute, Xiamen Medical College filed Critical Xiamen Products Quality Supervision & Inspection Institute
Priority to CN201510337639.3A priority Critical patent/CN105274199B/zh
Publication of CN105274199A publication Critical patent/CN105274199A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105274199B publication Critical patent/CN105274199B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种同时检测金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌的试剂盒及其使用方法，具有快速、可靠、灵敏度高、特异性强的特点，通过一次反应能同时完成金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌的定性和/或定量检测。

Description

一种同时检测金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌的试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于微生物检测领域，具体涉及可用于同步、高特异性、高灵敏度地快速、定性/定量同时检测金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌的试剂盒及其使用方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureas)是一种广泛分布的致病菌，可污染多种食物，菌体对热敏感，但其在体内累积达105CFU/g时可产生不被常规烹饪处理方式所破坏的致病性肠毒素，引起严重的食物中毒症状。阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)是近年来乳品中新发现的一种条件致病菌，能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎、败血症及坏死性结肠炎，死亡率高达40％～80％。自2002年美国FDA首次报道在其本土的一些国际乳业巨头生产的婴儿配方奶粉中检出阪崎克罗诺杆菌以来，类似事件多次被曝光，引起世界各国相关部门的广泛关注。金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌目前已成为我国婴幼儿配方奶粉的定量强检项目。
上述两种致病菌的传统检测方法仍依赖生化分析及形态鉴定法，操作繁琐、耗时费力。同时，PCR、环介导恒温扩增法等现代快速检测方法的研究开发亦仅停留于定性检测。随着我国食品安全检测及监管的日益科学化，对食源性致病菌的控制逐渐由“不得检出”的定性限制转向“允许一定安全限量”的定量指标，如2013年出台的《GB29921-2013食品中致病菌限量》即对11类食品中5种关键致病菌经行了限量规定。然而，国内外对致病菌定量检测仍多采用传统的平板计数法或MPN法，难以满足快速检测的需求。综上，亟需建立一套快速简便、高效灵敏的关键性食源性致病菌定量检测方法体系。
实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光报告基团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析，使PCR技术从定性水平发展到定量水平。由于其大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性并能有效地减少实验过程中产生污染的危险而广泛应用于各个领域。近年来国外研究者将实时荧光定量PCR法用于微生物定量研究，并在包括细菌、酵母和丝状真菌在内的各类微生物定量中证实了该方法与传统计数法的良好相关性，但目前国内外仍未见采用TaqMan双重实时荧光定量PCR法实现金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌同步、快速、定性/定量检测的试剂及产品。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种同时检测金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌的试剂盒及其使用方法，具有快速、可靠、灵敏度高、特异性强的特点，通过一次反应能完成金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌的定性和/或定量检测。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一种同时检测金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括如序列SEQIDNo.1至SEQIDNo.6所示的引物和探针，其中，SEQIDNo.1和SEQIDNo.2分别为检测金黄色葡萄球菌nuc基因的引物对；SEQIDNo.3和SEQIDNo.4分别为检测阪崎克罗诺杆菌MMS基因的引物对；SEQIDNo.5为检测检测金黄色葡萄球菌nuc基因的探针；SEQIDNo.6为检测阪崎克罗诺杆菌MMS基因的探针；还包括如下的双重荧光PCR反应体系：
PCR反应通用预混液，包括：
及：
一实施例中：所述探针SEQIDNo.5和SEQIDNo.6均为TaqMan探针，且探针SEQIDNo.5和SEQIDNo.6的5’端均标记有荧光报告基因FAM、JOE、VIC、HEX、CY3、CY5、TET中的一种，且所述探针SEQIDNo.5的5’端和SEQIDNo.6的5’端标记的荧光报告基因不同；所述探针SEQIDNo.5和SEQIDNo.6的3’端均标记有荧光淬灭基因BHQ1、BHQ2、TAMRA中的一种。
一实施例中：所述双重荧光PCR反应体系为：
PCR反应通用预混液，包括：
2×PremixExTaqTM(ProbeqPCR)10μL
及：
一实施例中：还包括细菌DNA提取试剂，阳性对照、阴性对照、空白对照；所述细菌DNA提取试剂为细菌基因组DNA提取试剂盒；所述阳性对照为金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌DNA混合液；所述阴性对照为：沙门氏菌DNA；所述空白对照为在上述双重荧光PCR反应体系中用ddH2O替代模板DNA，用于检测试剂是否受到污染。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
上述的试剂盒的使用方法，用于金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌的定性检测，包括：
1)对经过增菌培养的样品提取细菌DNA作为模板DNA；
2)制备如序列SEQIDNo.1至SEQIDNo.6所示的以金黄色葡萄球菌nuc基因和阪崎克罗诺杆菌MMS基因为靶基因的引物和探针；
3)配置双重荧光PCR反应体系；
4)将双重荧光PCR反应体系在荧光定量PCR仪上进行核酸扩增反应，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录各检测样品达到预设荧光阈值所需的PCR扩增循环数Ct值；
5)根据各样品的Ct值，按照建立的定性判断标准，判断样品中是否含有金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌。
一实施例中：所述步骤5)中，定性判断标准为：若出现靶基因的扩增反应曲线，且Ct值小于38，则判断为阳性；若38≤Ct≤40，判断为可疑，可加大模板量，重复扩增，若得到相同的试验结果，则判断为阳性，否则为阴性；若Ct＞40，则判断为阴性。
上述的试剂盒的使用方法，用于金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌的定量检测，包括：
1)对样品提取细菌DNA作为模板DNA；
2)制备如序列SEQIDNo.1至SEQIDNo.6所示的以金黄色葡萄球菌nuc基因和阪崎克罗诺杆菌MMS基因为靶基因的引物和探针；
3)配制双重荧光PCR反应体系；
4)将双重荧光PCR反应体系在荧光定量PCR仪上进行核酸扩增反应，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录各检测样品达到预设荧光阈值所需的PCR扩增循环数Ct值；
5)根据各样品的Ct值，按照建立的定量判断标准，判断样品中是否含有金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌及其污染量。
一实施例中：所述步骤5)中，定量判断标准为：建立以10倍梯度递进稀释的各浓度菌液样品的Ct值与菌液浓度对数值之间的标准曲线，以未知样品Ct值套入标准方程求得其菌液浓度。
一实施例中：所述步骤4)中，核酸扩增反应的反应参数为：94～96℃28～32s；94～96℃4～6s、59～61℃28～32s，35～40个循环。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
本发明建立的可同步、定性/定量检测金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌的TaqMan双重实时荧光定量PCR技术，为快速定量检测病原菌提供了新的技术手段。相对于传统方法，该法有如下无以比拟的优势：1、检测时间短。通过建立两种致病菌菌落数与循环阈值(Ct值)的标准曲线来实现未知样本中两种靶标菌浓度的同步定量，可在2～5h内完成检测，大大提高了检测效率；2、可靠性高。实时荧光定量PCR法定量结果与传统平板计数法的良好相关性已在国内外研究中被广泛证实，可用于致病菌的快速定量，本研究的平行试验结果亦得到类似结论；3、特异性强，操作简单。无需进行靶标菌的分离鉴定，提取样本总DNA后通过种特异性基因获得特征扩增曲线即用于定量；4、检测通量大。荧光定量PCR仪同批次至少可以处理96个样本，能满足大量样本的高通量检测。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为实施例1特异性试验的实时荧光PCR检测结果，图中AmplificationPlot表示扩增图谱，Cycle表示循环数，ΔRn表示PCR过程中探针降解的量，即PCR产物的量。
图2为实施例2敏感性试验1的实时荧光PCR检测结果，图中AmplificationPlot表示扩增图谱，Cycle表示循环数，ΔRn表示PCR过程中探针降解的量，即PCR产物的量。
图3为实施例3敏感性试验2的实时荧光PCR检测结果，图中AmplificationPlot表示扩增图谱，Cycle表示循环数，ΔRn表示PCR过程中探针降解的量，即PCR产物的量。
图4为实施例4染菌样品的实时荧光PCR检测结果，图中AmplificationPlot表示扩增图谱，Cycle表示循环数，ΔRn表示PCR过程中探针降解的量，即PCR产物的量。
图5为实施例4中染菌样品实时荧光PCR结果的金黄色葡萄球菌标准曲线。
图6为实施例4中染菌样品实时荧光PCR结果的阪崎克罗诺杆菌标准曲线。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容：
实施例1：特异性试验
本实施例通过如下实验对金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌的引物和探针进行了特异性验证。
以金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureas)CMCC26112和阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)ATCC51329的混合物作为阳性对照。以副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)ATCC17802、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)ATCC14506、铜绿假单胞杆菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC27853、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)ATCC19115、英诺克李斯特氏菌(Listeriainnocua)ATCC33090、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)ATCC13124、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)ATCC19258、溶血性链球菌(Streptococcuspyogenes)CMCC32201、大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)CMCC44113、甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonellaser.ParatyphiA)CMCC50001、福氏志贺氏菌(Shigellaflexnei)CMCC51571、大肠埃希氏杆菌O157：H7(EscherichiacoliO157:H7)ATCC43888、伊氏李斯特氏菌(Listeriaivanovii)ATCC19119、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)CGMCC1.6279、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)CGMCC1.3301作为阴性对照，以ddH2O替代模板DNA作为空白对照。通过对上述模板进行nuc和MMS基因部分序列的扩增，来验证本发明中引物及探针的特异性。
所使用的主要检测仪器：
微量移液器(10μL、100μL、1000μL，Eppendorf)、离心机(5424R，德国Eppendorf公司)、核酸蛋白分析仪(Nanodrop2000，美国Thermoscientific公司)、荧光PCR扩增仪(7500RealTimePCRsystem，美国ABI公司)等。
检测用主要试剂：
细菌基因组DNA提取试剂盒(QIAampDNAminikit)购自QIAGEN公司；实时荧光PCR反应试剂PremixExTaqTM(ProbeqPCR)购自TAKARA公司；肉浸液肉汤购自北京陆桥公司。
检测主要步骤：
1)菌株培养及模板DNA的制备
将上述17个菌株接种于2mL肉浸液肉汤培养液，36℃培养过夜。取1mL细菌培养液，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA作为模板DNA，具体操作按说明书进行。用蛋白核酸分析仪测DNA的纯度和浓度，调整DNA浓度为1-5ng/μL作为为检测用的DNA模板；
2)制备实时双重荧光PCR检测用的引物对及探针
引物对序列为SEQIDNo.1、2、3和4；探针序列为SEQIDNo.5和6，且在探针SEQIDNo.5的5’末端连接有FAM，3’末端连接有BHQ1，探针SEQIDNo.6的5’末端连接有JOE，3’末端连接有BHQ2。
3)配置双重荧光PCR反应体系20μL：
PCR反应通用预混液，包括：
2×PremixExTaqTM(ProbeqPCR)10μL
及：
注：每次PCR检测均设立相应的空白对照(用配制反应体系的ddH2O代替DNA模板)，检测试剂是否受到污染。
4)将双重荧光PCR反应体系在荧光定量PCR仪上进行核酸扩增反应，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录各检测样品达到预设荧光阈值所需的PCR扩增循环数Ct值；所述核酸扩增反应参数：
95℃30s；
95℃5s；
60℃30s；
40个循环。
如图1所示，用双重荧光PCR反应扩增nuc及MMS基因时，金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌混合菌液产生典型扩增曲线，而副溶血性弧菌、粪肠球菌、铜绿假单胞杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、产气荚膜梭菌、嗜热链球菌、酿脓链球菌、大肠埃希氏杆菌、甲型副伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、大肠埃希氏杆菌O157：H7、伊氏李斯特氏菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌及空白对照没有扩增曲线产生，充分说明本实验设计的引物对和探针对金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌表现较好的特异性。
实施例2：敏感性试验1
本实施例以金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌的DNA为检测基础，通过如下实验对本发明中靶向金黄色葡萄球菌nuc基因和阪崎克罗诺杆菌MMS基因的引物对和探针进行了灵敏度检测。
所使用的特异性引物对和探针序列同实施例1。所使用的阳性对照为金黄色葡萄球菌CMCC26112和阪崎克罗诺杆菌ATCC51329DNA混合液；所述阴性对照为：沙门氏菌DNA。
所使用的主要检测仪器：
微量移液器(10μL、100μL、1000μL，Eppendorf)、离心机(5424R，德国Eppendorf公司)、核酸蛋白分析仪(Nanodrop2000，美国Thermoscientific公司)、荧光PCR扩增仪(7500RealTimePCRsystem，美国ABI公司)、梯度PCR扩增仪90(Veriti，美国ABI公司)、电泳仪(TanonEPS300,上海天能科技有限公司)、凝胶成像仪(Tanon3500,上海天能科技有限公司)等。检测用主要试剂：
细菌基因组DNA提取试剂盒(QIAampDNAminikit)购自QIAGEN公司；实时PCR反应试剂PremixExTaqTM(ProbeqPCR)购自TAKARA公司；凝胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒、常规PCR试剂盒、Top10感受态细胞购自天根生物公司；pGEM-T连接试剂盒购自美国Promega公司；肉浸液肉汤购自北京陆桥公司。
检测主要步骤：
1)靶序列的扩增及纯化
nuc基因部分序列：以金黄色葡萄球菌(CMCC26112)的基因组DNA为模板，进行常规PCR反应。反应体系总体积为50μL，其中模板2μL，PCR缓冲液(10×)5μL，dNTP0.2mM，Taq酶2.5U，上下游引物SEQIDNo.1和SEQIDNo.2各0.2μM，ddH2O补齐50μL。反应条件：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃15s，35个循环；72℃延伸7min。产物用凝胶回收试剂盒进行切胶回收，具体操作按照说明书进行。
MMS基因部分序列：以阪崎克罗诺杆菌(ATCC51329)的基因组DNA为模板，进行常规PCR反应。反应体系总体积为50μL，其中模板2μL，PCR缓冲液(10×)5μL，dNTP0.2mM，Taq酶2.5U，上下游引物SEQIDNo.7(5′-CGTTCCTGCGAGAAAGCG-3′)和SEQIDNo.3各0.2μM，ddH2O补齐50μL。反应条件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃20s，35个循环；72℃延伸7min。产物用凝胶回收试剂盒进行切胶回收，具体操作按照说明书进行。
2)重组质粒的筛选
将纯化后的PCR产物连接到pGEM-T载体，导入Top10感受态细胞，随机挑取5个阳性克隆进行PCR鉴定，并将阳性克隆进行测序分析。测序结果与目标基因序列完全一致，说明为正确的阳性克隆。
3)质粒标准品的制备
接种具有正确序列的阳性克隆菌于2mL肉浸液肉汤培养液，36℃培养过夜。按照小量质粒提取试剂盒的说明进行质粒提取，测定提取的pGEMT-nuc和pGEMT-MMS质粒浓度分别为31.18μg/mL和10.37μg/mL。根据质粒的分子量，将质粒样品浓度换算为拷贝数浓度。质粒拷贝数的计算按照公式：拷贝数浓度(拷贝/μL)＝[质量(g/μL)/分子量(g/mol)]×6.02×1023(拷贝/mol)，质粒的分子量＝660×(3003+X)，其中660为碱基的平均分子量，3003为T载体的碱基数，X为插入片段的碱基数，其中nuc片段为167bp，MMS片段为242bp。通过计算得出所获得的质粒pGEMT-nuc和pGEMT-MMS的拷贝数浓度分别为8.97×109和2.91×109拷贝/μL。
4)标准曲线的制备及灵敏度检测
进行10倍系列稀释，使得质粒pGEMT-nuc和pGEMT-MMS浓度分别达到8.97×108拷贝/μL至8.26×10-1拷贝/μL(各浓度梯度扩增曲线依次对应图2中标识1-10)和2.91×108拷贝/μL至2.91×10-1拷贝/μL(各浓度梯度扩增曲线依次对应图2中标识a-j)，利用实施例1的双重荧光PCR反应体系和参数进行PCR反应。
对于质粒pGEMT-nuc，当质粒浓度为8.97×10-1拷贝/μL时，重复试验，荧光信号仍然低于阈值，判定不能检出金黄色葡萄球菌。当质粒浓度为8.97×100拷贝/μL时，重复试验，荧光信号高于检测阈值，判定可以检出金黄色葡萄球菌，则对应的Ct值显示检测下限为8.97×100拷贝/μL。如图2所示，每个PCR反应中加入的模板量为2μL，则每个反应管中的拷贝数为17.94，提示每个反应管中有18个拷贝的目的基因时即可被检出，表明建立的双重荧光PCR反应能够检出金黄色葡萄球菌的含量为18拷贝/反应体系。
对于质粒pGEMT-MMS，当质粒浓度为2.91×100拷贝/μL时，重复试验，荧光信号仍然低于阈值，判定不能检出阪崎克罗诺杆菌。当质粒浓度为2.91×101拷贝/μL时，重复试验，荧光信号高于检测阈值，判定可以检出阪崎克罗诺杆菌，则对应的Ct值显示检测下限为2.91×101拷贝/μL。如图2所示，每个PCR反应中加入的模板量为2μL，则每个反应管中的拷贝数为58.2，提示每个反应管中有58个拷贝的目的基因时即可被检出，表明建立的双重荧光PCR反应能够检出阪崎克罗诺杆菌的含量为58拷贝/反应体系。
实施例3：敏感性试验2
本实施例以金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌的DNA为检测基础，通过如下实验对本发明中靶向金黄色葡萄球菌nuc基因和阪崎克罗诺杆菌MMS基因的引物对和探针进行了灵敏度检测。
所使用的特异性引物对和探针序列同实施例1。所使用的阳性对照为金黄色葡萄球菌CMCC26112和阪崎克罗诺杆菌ATCC51329DNA混合液；所述阴性对照为：沙门氏菌DNA。
所使用的主要检测仪器：
微量移液器(10μL、100μL、1000μL，Eppendorf)、离心机(5424R，德国Eppendorf公司)、核酸蛋白分析仪(Nanodrop2000，美国Thermoscientific公司)、荧光PCR扩增仪(7500RealTimePCRsystem，美国ABI公司)等。
检测用主要试剂：
细菌基因组DNA提取试剂盒(QIAampDNAminikit)购自QIAGEN公司。实时PCR反应试剂PremixExTaqTM(ProbeqPCR)购自TAKARA公司；肉浸液肉汤、金黄色葡萄球菌计数用Baird-Parker平板购自北京陆桥公司；科玛嘉阪崎克罗诺杆菌显色平板购自郑州博赛生物技术股份有限公司。
检测主要步骤：
1)菌株培养、计数
将金黄色葡萄球菌(CMCC26112)和阪崎克罗诺杆菌(ATCC51329)接种于2mL肉浸液肉汤培养液，36℃培养过夜。10倍梯度稀释后，取合适稀释度菌液100μL分别涂布于Baird-Parker平板和阪崎克罗诺杆菌显色平板上进行计数。
2)模板DNA的制备
取上述经平板计数原始浓度分别为2.4×108CFU/mL和1.3×108的金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌纯培养液体各1mL混匀后，10倍梯度稀释。而后各梯度分别取1mL菌液，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体操作按说明书进行。
3)双重荧光PCR反应
将1mL上述浓度分别为2.4×107至2.4×100CFU/mL(各浓度梯度扩增曲线依次对应图3中标识1-8)和1.3×107至1.3×100(各浓度梯度扩增曲线依次对应图3中标识a-h)的金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌混合菌梯度稀释液提取所得的DNA作为模板，以实施例1的双重荧光PCR反应体系和参数进行PCR反应。
4)灵敏度分析及标准曲线制作。
对于金黄色葡萄球菌，当菌液浓度为2.4×100CFU/mL时，重复试验，荧光信号仍然低于阈值，判定不能检出金黄色葡萄球菌。当质粒浓度为2.4×101CFU/mL时，重复试验，荧光信号高于检测阈值，判定可以检出金黄色葡萄球菌，则对应的Ct值显示检测下限为2.4×101CFU/mL。如图3所示，1mL菌液提取DNA最终定容至100μL，每个PCR反应中加入的模板量为2μL，则每个反应管中的菌落数为0.48，提示每个反应管中有0.5CFU的菌落时即可被检出，表明建立的双重荧光PCR反应能够检出金黄色葡萄球菌的含量为1CFU/反应体系。
对于阪崎克罗诺杆菌，当菌液浓度为1.3×101CFU/mL时，重复试验，荧光信号仍然低于阈值，判定不能检出阪崎克罗诺杆菌。当质粒浓度为1.3×102CFU/mL时，重复试验，荧光信号高于检测阈值，判定可以检出阪崎克罗诺杆菌，则对应的Ct值显示检测下限为1.3×102CFU/mL。如图3所示，1mL菌液提取DNA最终定容至100μL，每个PCR反应中加入的模板量为2μL，则每个反应管中的菌落数为2.6，提示每个反应管中有2.6CFU的菌落时即可被检出，表明建立的双重荧光PCR反应能够检出阪崎克罗诺杆菌的含量为3CFU/反应体系。
实施例4：染菌样本标准曲线试验
本实施例以金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌掺入奶粉样本，制成梯度浓度人工污染样品，提取其DNA作为模板，通过如下实验构建奶粉中上述两种致病菌浓度对数与Ct值间关系的标准曲线。
所使用的特异性引物对和探针序列同实施例1。所使用的阳性对照为金黄色葡萄球菌CMCC26112和阪崎克罗诺杆菌ATCC51329DNA混合液；所述阴性对照为：沙门氏菌DNA。
所使用的主要检测仪器：
微量移液器(10μL、100μL、1000μL，Eppendorf)、离心机(5424R，德国Eppendorf公司)、核酸蛋白分析仪(Nanodrop2000，美国Thermoscientific公司)、荧光PCR扩增仪(7500RealTimePCRsystem，美国ABI公司)等。
检测用主要试剂：
细菌基因组DNA提取试剂盒(QIAampDNAminikit)购自QIAGEN公司。实时PCR反应试剂PremixExTaqTM(ProbeqPCR)购自TAKARA公司；改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉(mLST-Vm)、金黄色葡萄球菌计数用Baird-Parker平板、缓冲蛋白胨水(BPW)、7.5％NaCl肉汤购自北京陆桥公司；科玛嘉阪崎克罗诺杆菌显色平板购自郑州博赛生物技术股份有限公司。
检测主要步骤：
1)菌株培养、人工染菌样品的制备及靶标菌计数
将金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌接种于2mL肉浸液肉汤培养液，36℃培养过夜。称取25g奶粉，加入含有225mL磷酸盐缓冲液的均质袋中，于BagMixer拍击式匀浆机中均匀拍击60s，吸取拍击混匀后的样液为稀释液对原始浓度的金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌各1mL的混合菌液进行10倍梯度稀释，即成不同浓度靶标菌污染的染菌样品。取合适稀释度染菌样本液各100μL分别涂布于Baird-Parker平板和阪崎克罗诺杆菌显色平板上进行计数。
2)模板DNA的制备
取上述经平板计数原始浓度分别为4.5×108CFU/mL和3.1×108的金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌10倍梯度稀释染菌样本各1mL，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体操作按说明书进行。
3)双重荧光PCR反应
将1mL上述浓度分别为4.5×107至4.5×100CFU/mL(各浓度梯度扩增曲线依次对应图4中标识1-8)和3.1×107至3.1×100(各浓度梯度扩增曲线依次对应图4中标识a-h)的金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌混合梯度染菌样液提取所得的DNA作为模板，以实施例1的双重荧光PCR反应体系和参数进行PCR反应。
4)灵敏度分析及标准曲线制作。
对于金黄色葡萄球菌，当菌液浓度为4.5×100CFU/mL时，重复试验，荧光信号仍然低于阈值，判定不能检出金黄色葡萄球菌。当质粒浓度为4.5×101CFU/mL时，重复试验，荧光信号高于检测阈值，判定可以检出金黄色葡萄球菌，则对应的Ct值显示检测下限为4.5×101CFU/mL。如图4所示，1mL菌液提取DNA最终定容至100μL，每个PCR反应中加入的模板量为2μL，则每个反应管中的菌落数为2.25，提示每个反应管中有2.25CFU的菌落时即可被检出，表明建立的双重荧光PCR反应能够检出金黄色葡萄球菌的含量为3CFU/反应体系。由金黄色葡萄球菌菌液浓度对数值及其对应的CT值绘制的标准曲线如图5所示。
对于阪崎克罗诺杆菌，当菌液浓度为3.1×101CFU/mL时，重复试验，荧光信号仍然低于阈值，判定不能检出阪崎克罗诺杆菌。当质粒浓度为3.1×102CFU/mL时，重复试验，荧光信号高于检测阈值，判定可以检出阪崎克罗诺杆菌，则对应的Ct值显示检测下限为3.1×102CFU/mL。如图4所示，1mL菌液提取DNA最终定容至100μL，每个PCR反应中加入的模板量为2μL，则每个反应管中的菌落数为6.2，提示每个反应管中有6.2CFU的菌落时即可被检出，表明建立的双重荧光PCR反应能够检出阪崎克罗诺杆菌的含量为7CFU/反应体系。由阪崎克罗诺杆菌菌液浓度对数值及其对应的CT值绘制的标准曲线如图6所示。
实施例5：传统方法与本发明建立的TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法的比较
本发明通过如下试验对市售及人工染菌样品中金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌进行定性或定量检测验证。
选购市售乳品10份，同时按传统检测方法和本发明建立的双重荧光PCR反应，以验证本发明所建立的方法的可靠性。称取100g奶粉，放入盛有900mLBPW的无菌均质袋内，于BagMixer拍击式匀浆机中均匀拍击60s，制成1:10样品匀液，37℃增菌培养12h后取出1mL，提取DNA作为PCR反应的模板，以实施例1的双重荧光PCR反应体系和参数进行实时荧光检测，根据各样品的Ct值，按照建立的定性判断标准，判断样品中是否含有金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌，所述定性判断标准为：若出现靶基因的扩增反应曲线，且Ct值小于38，则判断为阳性；若38≤Ct≤40，判断为可疑，可加大模板量，重复扩增，若得到相同的试验结果，则判断为阳性，否则为阴性；若Ct＞40，则判断为阴性。同时按照传统方法(GB4789.10和GB4789.40)对样品进行平行检测。结果显示所有市售样品均未检出金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌，两种方法结果一致。
随机取上述金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌阴性奶粉一份，分别掺入未知浓度的金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌，按照实施例4制成人工染菌样品8份，分别按照传统平板计数法和实时荧光PCR法进行定量检测，根据各样品的Ct值，按照建立的定量判断标准，判断样品中金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌的含量，所述定量判断标准为：按照实施例4中建立的以10倍梯度递进稀释的各浓度菌液样品的Ct值与菌液浓度对数值之间的标准曲线，以未知样品Ct值套入标准方程求得其菌液浓度。同时按照传统平板计数法对样品进行平行检测。结果如下所示(表1)，定量结果统计分析表明两种方法差异不显著(金黄色葡萄球菌：t＝0.8504，p＞0.05；阪崎克罗诺杆菌：t＝1.2617，p＞0.05)，有力地印证了本发明建立的TaqMan双重实时荧光PCR法的可靠性。
表1两种检测方法对人工染菌样品中金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌定量结果比较
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (9)

1.一种同时检测金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如序列SEQIDNo.1至SEQIDNo.6所示的引物和探针，其中，SEQIDNo.1和SEQIDNo.2分别为检测金黄色葡萄球菌nuc基因的引物对；SEQIDNo.3和SEQIDNo.4分别为检测阪崎克罗诺杆菌MMS基因的引物对；SEQIDNo.5为检测检测金黄色葡萄球菌nuc基因的探针；SEQIDNo.6为检测阪崎克罗诺杆菌MMS基因的探针；还包括如下的双重荧光PCR反应体系：
PCR反应通用预混液，包括：
及：
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述探针SEQIDNo.5和SEQIDNo.6的5’端均标记有荧光报告基因FAM、JOE、VIC、HEX、CY3、CY5、TET中的一种，且所述探针SEQIDNo.5的5’端和SEQIDNo.6的5’端标记的荧光报告基因不同；所述探针SEQIDNo.5和SEQIDNo.6的3’端均标记有荧光淬灭基因BHQ1、BHQ2、TAMRA中的一种。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述双重荧光PCR反应体系为：
PCR反应通用预混液，包括：
2×PremixExTaqTM(ProbeqPCR)10μL
及：
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：还包括细菌DNA提取试剂，阳性对照、阴性对照、空白对照。
5.根据权利要求1所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：用于金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌的定性检测，包括：
1)对经过增菌培养的样品提取细菌DNA作为模板DNA；
2)制备如序列SEQIDNo.1至SEQIDNo.6所示的以金黄色葡萄球菌nuc基因和阪崎克罗诺杆菌MMS基因为靶基因的引物和探针；
3)配置双重荧光PCR反应体系；
4)将双重荧光PCR反应体系在荧光定量PCR仪上进行核酸扩增反应，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录各检测样品达到预设荧光阈值所需的PCR扩增循环数Ct值；
5)根据各样品的Ct值，按照建立的定性判断标准，判断样品中是否含有金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌。
6.根据权利要求5所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述步骤5)中，定性判断标准为：若出现靶基因的扩增反应曲线，且Ct值小于38，则判断为阳性；若38≤Ct≤40，判断为可疑，可加大模板量，重复扩增，若得到相同的试验结果，则判断为阳性，否则为阴性；若Ct＞40，则判断为阴性。
7.根据权利要求1所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：用于金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌的定量检测，包括：
1)对样品提取细菌DNA作为模板DNA；
2)制备如序列SEQIDNo.1至SEQIDNo.6所示的以金黄色葡萄球菌nuc基因和阪崎克罗诺杆菌MMS基因为靶基因的引物和探针；
3)配制双重荧光PCR反应体系；
4)将双重荧光PCR反应体系在荧光定量PCR仪上进行核酸扩增反应，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录各检测样品达到预设荧光阈值所需的PCR扩增循环数Ct值；
5)根据各样品的Ct值，按照建立的定量判断标准，判断样品中是否含有金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌及其污染量。
8.根据权利要求7所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述步骤5)中，定量判断标准为：建立以10倍梯度递进稀释的各浓度菌液样品的Ct值与菌液浓度对数值之间的标准曲线，以未知样品Ct值套入标准方程求得其菌液浓度。
9.根据权利要求5或7所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述步骤4)中，核酸扩增反应的反应参数为：94～96℃28～32s；94～96℃4～6s、59～61℃28～32s，35～40个循环。
CN201510337639.3A 2015-06-17 2015-06-17 一种同时检测金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌的试剂盒及其使用方法 Active CN105274199B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510337639.3A CN105274199B (zh) 2015-06-17 2015-06-17 一种同时检测金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌的试剂盒及其使用方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510337639.3A CN105274199B (zh) 2015-06-17 2015-06-17 一种同时检测金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌的试剂盒及其使用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105274199A true CN105274199A (zh) 2016-01-27
CN105274199B CN105274199B (zh) 2019-02-05

Family

ID=55144026

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510337639.3A Active CN105274199B (zh) 2015-06-17 2015-06-17 一种同时检测金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌的试剂盒及其使用方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105274199B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106319055A (zh) * 2016-08-30 2017-01-11 天津喜诺生物医药有限公司 一种三联核酸检测试剂盒
CN108265102A (zh) * 2016-12-30 2018-07-10 上海仁度生物科技有限公司 一种克罗诺阪崎肠杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒
CN113005182A (zh) * 2021-05-08 2021-06-22 上海应用技术大学 一种抗辐射不动杆菌的定量检测方法和定量检测试剂盒及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103484557A (zh) * 2013-10-15 2014-01-01 上海市计量测试技术研究院 一种适用于阪崎肠杆菌实时荧光定量pcr检测的质粒标准分子
CN103866034A (zh) * 2014-04-02 2014-06-18 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种胃液中幽门螺杆菌多重实时荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103484557A (zh) * 2013-10-15 2014-01-01 上海市计量测试技术研究院 一种适用于阪崎肠杆菌实时荧光定量pcr检测的质粒标准分子
CN103866034A (zh) * 2014-04-02 2014-06-18 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种胃液中幽门螺杆菌多重实时荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MAMLOUK K等: "Quantification of viable Brochothrix thermosphacta in cooked shrimp and salmon by real-time PCR", 《FOOD MICROBIOLOGY》 *
韩齐等: "实时荧光定量PCR技术在金黄色葡萄球菌检测中的应用", 《食品工业科技》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106319055A (zh) * 2016-08-30 2017-01-11 天津喜诺生物医药有限公司 一种三联核酸检测试剂盒
CN106319055B (zh) * 2016-08-30 2019-12-13 天津喜诺生物医药有限公司 一种三联核酸检测试剂盒
CN108265102A (zh) * 2016-12-30 2018-07-10 上海仁度生物科技有限公司 一种克罗诺阪崎肠杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒
CN113005182A (zh) * 2021-05-08 2021-06-22 上海应用技术大学 一种抗辐射不动杆菌的定量检测方法和定量检测试剂盒及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105274199B (zh) 2019-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102605055B (zh) 副溶血性弧菌多重定量pcr检测试剂盒及检测方法
Qin et al. Multiplex real-time PCR coupled with sodium dodecyl sulphate and propidium monoazide for the simultaneous detection of viable Listeria monocytogenes, Cronobacter sakazakii, Staphylococcus aureus and Salmonella spp. in milk
CN102206703A (zh) 三种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒
CN102230013B (zh) 检测肺炎支原体的靶序列、引物和探针及其试剂盒
CN102676664B (zh) 同时检测多种水产品致病菌的荧光定量pcr引物和探针及检测方法
CN104263838A (zh) 单增李斯特菌 lamp-lfd检测试剂盒及其检测方法
CN105274199A (zh) 一种同时检测金黄色葡萄球菌和阪崎克罗诺杆菌的试剂盒及其使用方法
CN111378774A (zh) 一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物组、试剂盒及方法
CN116814821A (zh) 一种检测微生态四联活菌制品中4种活菌的引物探针组合、试剂盒及应用
CN103184279B (zh) 非标记荧光pcr结合hrma检测副溶血弧菌的方法
CN103993090A (zh) 对普罗威登斯菌o31，o41，o42，o43和o50特异的核苷酸及其应用
CN109735635B (zh) 一种同时检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌的方法
Zhou et al. LAMP, PCR, and real-time PCR detection of Acetobacter aceti in yogurt
CN116479145A (zh) 一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量pcr引物探针组、方法及试剂盒
CN102534038A (zh) 一种空肠弯曲菌的高灵敏快速检测试剂盒
CN105624285A (zh) 肺炎支原体荧光pcr检测试剂盒
CN104388554A (zh) 检测八种金黄色葡萄球菌耐药基因的试剂盒及检测方法
CN112795673B (zh) 一种食品中克罗诺杆菌属的crispr检测方法及其试剂盒
CN101570781A (zh) 乳酸杆菌检测试剂盒及分种检测方法
CN103409535B (zh) 检测克罗诺杆菌的引物对、探针和方法
CN103740839B (zh) 荧光定量pcr检测肉毒杆菌的通用型试剂盒及非诊断性检测方法
CN107012233A (zh) 一种散囊菌的探针荧光定量pcr快速检测方法
Cheng et al. Simultaneous detection of food pathogens, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica, Bacillus cereus and Vibrio parahaemolyticus by multiplex real-time polymerase chain reaction
CN104862399A (zh) 检测食品中蜡样芽孢杆菌的含扩增内标的pcr方法及试剂盒
CN114657273B (zh) 一种检测多种牛乳腺炎病原的引物对和探针组合及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: 361000 No. 1999, Guan Kou Middle Road, Jimei District, Xiamen, Fujian.

Applicant after: Xiamen Medical College

Applicant after: Xiamen Products Quality Supervision & Inspection Institute

Address before: 361000 No. 8, Qian Pu Yan Road, Siming District, Xiamen, Fujian.

Applicant before: Xiamen Medical College

Applicant before: Xiamen Products Quality Supervision & Inspection Institute

CB02 Change of applicant information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant