CN116479145A - 一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量pcr引物探针组、方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR引物探针组、方法及试剂盒。所述多重荧光PCR体系包括3组引物探针组合：针对婴儿双歧杆菌PurF基因的引物探针组合、针对长双歧杆菌PurF基因的引物探针组合和短歧双歧杆菌RecA基因的引物探针组合，其序列依次为SEQ ID No.1～9。本发明结合实时荧光定量PCR以及多重荧光定量PCR技术，所述引物探针组合仅对各自双歧杆菌的目的基因片段进行特异性扩增，提高了检测效率、节约了检测成本，适用于益生菌制品中双歧杆菌成分的大规模快速检测。

Description

一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR引物探针组、 方法及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR引物探针组、方法及试剂盒。

背景技术

双歧杆菌存在于人类体内和动物体内，是一种重要的肠道微生物，它能产短链脂肪酸、维生素、细菌素、类抗生素，具有维持微生态平衡、生物拮抗、免疫调节、营养、协同降解多糖等多方面重要的生理功能。其中，婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)和短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)被广泛用于食物补充剂中，以期在机体内发挥调节肠胃功能、降低和控制内毒素、提高免疫机能、产生有利于宿主代谢的酶等“益生”功能。

近年来益生菌产业呈现爆发式发展，市面上涌现出大量益生菌产品制品。这些产品制品宣称含有标识菌种及大量的活菌数量。但是由于受到研发生产技术的限制，益生菌产品制品出现了质量参差不齐的状况。如何能准确、快速地检测双歧杆菌制品，迄今为止尚未有一个有效的标准及方法.这就直接影响了双歧杆菌制剂的研发及销售。因此，为了对双歧杆菌制品质量进行正确的评价和监督，建立一套可靠、快速且易行的双歧杆菌检测和鉴定技术势在必行。

早期，关于双歧杆菌的分类学多以生理表型为准绳，但往往缺乏可靠性，特别是近缘物种间系统发育关系一直存有争议。而正确可靠的分类与鉴定不仅是分类学研究的主要目标，也是双歧杆菌开发试剂盒和科学交流的基础。实时荧光PCR技术是近年来得到广泛试剂盒的快速核酸检测技术，具有灵敏度高、检测周期短、特异性强等优点。而多重实时荧光定量PCR，是在普通单一体系荧光定量PCR技术基础上开发的，利用多种不同荧光基团的组合，结合仪器对不同通道荧光的检测能力，实现在同一体系内对多个靶标的实时定量检测。目前，急需建立一种可以同时检测多种双歧杆菌的荧光定量PCR体系并开发成检测试剂盒。无论是在常规食品抽检中，还是在应对大规模快速筛查，具有重要的实践意义和实用价值。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR引物探针组、方法及试剂盒的技术方案。

本发明具体采用以下技术方案：

本发明第一方面提供了同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR引物探针组，所述引物探针组包含分别针对婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌和短双歧杆菌的PurF基因、RecA基因的引物探针组及探针两端的荧光报告基团和荧光淬灭基团；

其中，针对婴儿双歧杆菌PurF基因的上游引物为序列如SEQ ID No.1所示的Binfa_purF_F，下游引物为序列如SEQ ID No.2所示的Binfa_purF_R，探针为序列如SEQ IDNo.3所示的Binfa_purF_P；

针对长双歧杆菌PurF基因的上游引物为序列如SEQ ID No.4所示的Blong_purF_F，下游引物为序列如SEQ ID No.5所示的Blong_purF_R，探针为序列如SEQ ID No.6所示的Blong_purF_P；

针对短双歧杆菌RecA基因的上游引物为序列如SEQ ID No.7所示的Bbrev_recA_F，下游引物为序列如SEQ ID No.8所示的Bbrev_recA_R，探针为序列如SEQ ID No.9所示的Bbrev_recA_P。

本发明第二方面提供了一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物探针组。

进一步，该试剂盒还包括反应液A、反应液B和反应液C；反应液A为2×PCR Mix，包含：Taq酶0.2U/μL、dNTP 0.4mM、Tris-HCl(pH 8.3)20mM、MgCl₂ 4mM、KCl 100mM、BSA2mg/mL；反应液B为Primer Mix，包括三种双歧杆菌的引物Binfa_purF_F、Binfa_purF_R、Blong_purF_F、Blong_purF_R、Bbrev_recA_F和Bbrev_recA_R，各自浓度为1.7nM；反应液C为ProbeMix，包括探针Binfa_purF_P、Blong_purF_P、Bbrev_recA_P，各自浓度为3.3nM。

进一步，该试剂盒还包括阴性对照和阳性对照；所述阴性对照为DEPC水，所述阳性对照为根据婴儿双歧杆菌的PurF基因片段、长双歧杆菌的PurF基因片段、短双歧杆菌的RecA基因片段构建的质粒按照1:1:1比例的混合物。

本发明第三方面提供了一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR检测方法，其包括以下步骤：

1)提取待测样本的基因组DNA备用；

2)将待测样本的基因组DNA作为模板加入到多重荧光定量PCR反应体系中进行PCR扩增，PCR反应体系包括上述的PCR试剂盒；

3)设定PCR程序并收集扩增过程中的荧光信号，通过荧光信号分析判断是否存在上述三种双歧杆菌。

进一步的，所述步骤2)中PCR反应体系具体包括反应液A12.5μL，反应液B 6μL，反应液C 3μL，加入50ng DNA模板，补水至25μL；

进一步的，所述步骤3)中PCR程序为按照95℃10s，95℃变性5s，60℃退火/延伸30s，40个循环程序进行荧光定量PCR反应；每个循环结束收集PCR扩增过程中的荧光信号，通过待测样本中某一通道基因的Ct值及扩增曲线进行阳性判断。

进一步，所述步骤3)中判断标准为：

a)若待测样本某基因通道扩增有扩增曲线，且Ct值≤35，则判断待测样本含有该种双歧杆菌；

b)若待测样本某基因通道没有扩增曲线，且Ct值≥38，则判断待测样本不含有该种双歧杆菌；

c)若待测样本某基因通道有扩增曲线，且35＜Ct＜38，则判断为不确定样本，需要对样品进行复测。

本发明第四方面提供了上述引物探针组以及上述试剂盒以下任一方式的应用：

(a)检测婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌中至少一种双歧杆菌；

(b)制备用于(a)检测的试剂盒或产品。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明的多重荧光定量PCR引物探针组合具有很高的特异性，仅对各自菌种的目标片段进行特异性扩增。同时，使用本发明的多重荧光定量PCR检测方法可以一次性检测婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌以及短双歧杆菌三个双歧杆菌菌种，较大的提高了检测效率、降低了检测成本；

(2)本发明所涉及方法能快速对婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌以及短双歧杆菌三个双歧杆菌菌种进行鉴定，优化了特定PCR反应体系及程序，PCR过程仅需45min，特别适用于双歧杆菌制品大规模摸底排查和快速检测的实际试剂盒。

(3)本发明试剂盒组分和配比合理，操作简单、使用方便，最大程度上减少交叉污染。

附图说明

图1为(A)婴儿双歧杆菌阳性扩增曲线、空白对照及阴性对照(长双歧杆菌、短双歧杆菌)；(B)长双歧杆菌阳性扩增曲线、空白对照及阴性对照(婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌)；(C)短双歧杆菌阳性扩增曲线、空白对照及阴性对照(婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌)；

图2为婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌以及短双歧杆菌三重荧光定量PCR扩增曲线、空白对照及阴性对照(植物乳杆菌、嗜热链球菌)；

图3为(A)婴儿双歧杆菌、(B)长双歧杆菌、(C)短双歧杆菌荧光定量PCR灵敏度试验；

图4为(A)婴儿双歧杆菌、(B)长双歧杆菌、(C)短双歧杆菌荧光定量PCR标准曲线。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内；以下实施例中采用的材料不限于上述列举，可用其他同类材料替代，仪器未注明具体条件的，按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件；除非特别说明，本发明采用的试剂和方法为本技术领域常规试剂和常规方法。

实施例1：特异性引物及探针的设计

下载Genebank数据库中婴儿双歧杆菌(HQ438388.1)和长双歧杆菌(HQ438401.1)的PurF基因使用Vector NTI软件中AlignX方法比对分析两种双歧杆菌的靶基因序列，选择差异较大的区域作为靶点设计婴儿双歧杆菌和长双歧杆菌的特异性引物及探针，使用NCBI网页PrimerBLAST工具搜索确认所设引物及探针在所有菌种中的特异性。用同样的方法，下载婴儿双歧杆菌(U50269.1)、长双歧杆菌(JF776111.1)、短双歧杆菌(U50268.1)的RecA基因序列，设计短双歧杆菌的特异性引物及探针。在满足引物和探针设计原则的前提下，确保扩增片段在200bp以内。经过一系列前期筛选，引物和探针筛选结果如下所示：

(1)婴儿双歧杆菌特异性引物和探针

SEQ ID No.1上游引物Binfa_purF_F 5’-GCGTCTGGCGCAGGAGTC-3’

SEQ ID No.2下游引物Binfa_purF_R 5’-CACGCACGGCGGACAGC-3’

SEQ ID No.3荧光探针Binfa_purF_P 5’-FAM-TACGCGGAGGCCGCCG GGC-BHQ1-3’

(2)长双歧杆菌特异性引物和探针

SEQ ID No.4上游引物Blong_purF_F 5’-ACGTCTCGCCGCCGAATC-3’

SEQ ID No.5下游引物Blong_purF_R 5’-AACCACGCTGCGCACAGCA GAG-3’

SEQ ID No.6荧光探针Blong_purF_P 5’-HEX-ATCCGGCTATGCGGAAG CAGCAGGC-BHQ1-3’

(3)短双歧杆菌特异性引物和探针

SEQ ID No.7上游引物Bbrev_recA_F 5’-CTGATTCGCTTATCGTTTCTCA G-3’

SEQ ID No.8下游引物Bbrev_recA_R 5’-CAGAGCCGCCACCGAATC-3’

SEQ ID No.9荧光探针Bbrev_recA_P 5’-ROX-CGGCGAACAGGCTCTTG AAATTGCA-BHQ1-3’

所述的空白对照为DEPC水，三种双歧杆菌互为阴性对照。

实施例2：多重荧光定量PCR反应体系构建

1)提取待测样品DNA(细菌基因组DNA提取试剂盒或者公认的、具有相同效力的其他提取方法)，-20℃保存备用。

2)经过对多重荧光定量PCR反应体系的条件优化，最终的反应总体系25μL如下：反应液A12.5μL，反应液B 6μL，反应液C 3μL，样品DNA模板50ng，其余用水补足。反应条件为95℃预变性10s；95℃变性5s，60℃退火/延伸30s，共40个循环。

3)结果判断：若待测样本某基因通道扩增有扩增曲线，且Ct值≤35，则判断待测样本含有该种双歧杆菌；b)若待测样本某基因通道没有扩增曲线，且Ct值≥38，则判断待测样本不含有该种双歧杆菌；c)若待测样本某基因通道有扩增曲线，且35＜Ct＜38，则判断为不确定样本，需要对样品进行复测。

实施例3：用于快速鉴别婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌以及短双歧杆菌的多重荧光定量PCR检测试剂盒的建立

用于快速鉴别婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌以及短双歧杆菌的多重荧光定量PCR检测试剂盒，包括反应液A、反应液B、反应液C、阳性对照、阴性对照、说明书和盒体。反应液A为2×PCR Mix，组分包含：Taq酶0.2U/μL、dNTP 0.4mM、Tris-HCl(pH 8.3)20mM、MgCl₂ 4mM、KCl 100mM、BSA 2mg/mL；反应液B为包括三种双歧杆菌的引物Binfa_purF_F、Binfa_purF_R、Blong_purF_F、Blong_purF_R、Bbrev_recA_F和Bbrev_recA_R，各自浓度为1.7nM；反应液C为Probe Mix，包括探针Binfa_purF_P、Blong_purF_P、Bbrev_recA_P，各自浓度为3.3nM。所述阳性对照为根据婴儿双歧杆菌的PurF基因片段、长双歧杆菌的PurF基因片段以及短双歧杆菌的RecA基因片段构建的质粒按照1：1：1比例的混合物，质粒浓度为1.0ng/μL，对应的Ct值在18～21。所述的阴性对照为DEPC水。

实施例4：多重荧光定量PCR检测体系特异性验证

为了验证本发明所构建的多重荧光定量PCR检测体系的特异性，提取婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、植物乳杆菌及嗜热链球菌的细菌基因组DNA，作为PCR反应模板对构建的多重荧光定量PCR检测体系进行特异性验证。

DNA提取、PCR反应体系及反应条件与实施例2相同。多重荧光定量PCR特异性验证结果如图1所示，(A)婴儿双歧杆菌、(B)长双歧杆菌及(C)短双歧杆菌分别只在对应的荧光通道有扩增曲线；空白对照以及阴性对照在上述三个通道均未有扩增曲线。该结果表明本发明的多重荧光定量PCR检测体系具有较高的特异性。

实施例5：多重荧光定量PCR检测体系灵敏度验证

取(A)婴儿双歧杆菌、(B)长双歧杆菌及(C)短双歧杆菌的基因组DNA，用微量紫外分光光度计测定其浓度，并按照10倍的浓度梯度稀释，选取1.0×10⁰～1.0×10^-6ng/μL浓度的DNA作为PCR模板，用本发明试剂盒和方法检测。

结果如图3所示，本试剂盒对(A)婴儿双歧杆菌、(B)长双歧杆菌及(C)短双歧杆菌的最低检出浓度为1.0×10^-5ng/μL；根据Ct值平均值构建的标准曲线如图4所示，三种双歧杆菌的标准曲线斜率分别为3.11、2.36和2.93，相关系数R²均大于0.99。

以上实施例显示和描述了本发明的基本原理和特征，结果表明本发明的试剂盒具有准确性好、灵敏度高的特点，适合用于益生菌制品中婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短两歧双歧杆菌的快速检测。

Claims (9)

1.同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR引物探针组，其特征在于：所述探针引物组包含分别针对婴儿双歧杆菌PurF基因、长双歧杆菌PurF基因和短双歧杆菌RecA基因的引物探针组及探针两端的荧光报告基团和荧光淬灭基团，引物探针序列如下所示：

针对婴儿双歧杆菌PurF基因的上游引物Binfa_purF_F 5’-GCGTCTGGCGCAGGAGTC-3’，如SEQ ID No.1所示；下游引物Binfa_purF_R5’-CACGCACGGCGGACAGC-3’，如SEQ ID No.2所示；荧光探针Binfa_purF_P5’-FAM-TACGCGGAGGCCGCCGGGC-BHQ1-3’，如SEQ ID No.3所示。

针对长双歧杆菌PurF基因的上游引物Blong_purF_F 5’-ACGTCTCGCCGCCGAATC-3’，如SEQ ID No.4所示；下游引物Blong_purF_R5’-AACCACGCTGCGCACAGCAGAG-3’，如SEQ IDNo.5所示；荧光探针Blong_purF_P 5’-HEX-ATCCGGCTATGCGGAAGCAGCAGGC-BHQ1-3’，如SEQID No.6所示。

针对短双歧杆菌RecA基因的上游引物Bbrev_recA_F 5’-CTGATTCGCTTATCGTTTCTCAG-3’，如SEQ ID No.7所示；下游引物Bbrev_recA_R 5’-CAGAGCCGCCACCGAATC-3’，如SEQ IDNo.8所示；荧光探针Bbrev_recA_P 5’-ROX-CGGCGAACAGGCTCTTGAAATTGCA-BHQ1-3’，如SEQID No.9所示。

2.一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物探针组。

3.如权利要求2所述的多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：包括反应液A、反应液B和反应液C；反应液A为2×PCR Mix，包括Taq酶0.2U/μL、dNTP 0.4mM、Tris-HCl(pH 8.3)20mM、MgCl₂ 4mM、KCl 100mM、BSA2mg/mL；反应液B为Primer Mix，包括三种双歧杆菌的引物Binfa_purF_F、Binfa_purF_R、Blong_purF__F、Blong_purF__R、Bbrev_recA__F和Bbrev_recA_R，各自浓度为1.7nM；反应液C为Probe Mix，包括探针Binfa_purF_P、Blong_purF_P、Bbrev_recA_P，各自浓度为3.3nM。

4.根据权利要求3所述的PCR试剂盒，其特征在于还包括阴性对照和阳性对照；所述阴性对照为DEPC水，所述阳性对照为根据婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌和短双歧杆菌目的基因构建的质粒按照1:1:1比例的混合物。

5.一种同时检测三种双歧杆菌的多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)提取待测样本的基因组DNA备用；

2)将待测样本的基因组DNA作为模板加入到多重荧光定量PCR反应体系中进行PCR扩增，PCR反应体系包括如权利要求2-4任一所述的PCR试剂盒；

3)设定PCR程序并收集扩增过程中的荧光信号，通过荧光信号分析判断是否存在上述三种双歧杆菌。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中PCR反应体系具体包括反应液A 12.5μL，反应液B 6μL，反应液C 3μL，加入50ng DNA作为模板，补水至25μL。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中PCR程序为按照95℃10s，95℃变性5s，60℃退火/延伸30s，40个循环程序进行荧光定量PCR反应；每个循环结束收集PCR扩增过程中的荧光信号，通过待测样本中某一通道基因的Ct值及扩增曲线进行阳性判断。

8.根据权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于：所述阳性对照Ct值在15-20之间，阴性对照Ct≥38，根据步骤3)中判断标准为：

a)若待测样本某基因通道扩增后有扩增曲线，且Ct值≤35，则判断待测样本含有该种双歧杆菌；

b)若待测样本某基因通道扩增后没有扩增曲线，且Ct值≥38，则判断待测样本不含有该种双歧杆菌；

c)若待测样本某基因通道有扩增曲线，且35＜Ct＜38，则判断为不确定样本，需要适当提高DNA模板量进行复测。

9.根据权利要求1任一所述的引物探针组以及权利要求2-4任一所述的试剂盒的应用：

(a)检测婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌中至少一种双歧杆菌；

(b)制备用于(a)检测的试剂盒或产品。