CN118086539A

CN118086539A - 长双歧杆菌婴儿亚种的PMA-qPCR活菌定量检测方法

Info

Publication number: CN118086539A
Application number: CN202410245562.6A
Authority: CN
Inventors: 姚粟; 宋程羽; 蓝航莲; 郭立峥; 于学健; 宋智泉; 刘艺茹; 洪维鍊; 葛媛媛; 冯会粉; 刘冲; 景宇; 徐韵梅
Original assignee: China National Research Institute of Food and Fermentation Industries; Inner Mongolia Yili Industrial Group Co Ltd
Current assignee: China National Research Institute of Food and Fermentation Industries; Inner Mongolia Yili Industrial Group Co Ltd
Priority date: 2024-03-05
Filing date: 2024-03-05
Publication date: 2024-05-28

Abstract

本发明公开了用于鉴定长双歧杆菌婴儿亚种的快速检测方法，具体涉及一组检测长双歧杆菌婴儿亚种的引物组、利用PMA‑qPCR检测长双歧杆菌婴儿亚种活菌数的方法及应用。本发明提出如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列在用于鉴定长双歧杆菌婴儿亚种菌株中的应用，特异性PCR检测引物如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。本发明使用PMA染料并利用提供的引物组进行qPCR分析实现对长双歧杆菌婴儿亚种活菌的快速定量检测。本方法检测灵敏度高、特异性强、耗时短，可以对复合益生菌产品中的长双歧杆菌婴儿亚种进行靶向、准确的活菌定量检测，为企业生产过程中对益生菌相关产品质量控制和检测部门提供了技术支撑。

Description

长双歧杆菌婴儿亚种的PMA-qPCR活菌定量检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及鉴定复合益生菌中长双歧杆菌婴儿亚种的引物和特异性活菌的PMA-qPCR快速准确的检测方法。

背景技术

长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)，曾用名婴儿双歧杆菌，是一种细胞呈小细棒状、革兰氏阳性、不运动、无芽孢、严格厌氧，在健康母乳喂养的婴儿肠道中占据主导地位的菌种。该菌种具有独特的碳水化合物代谢特征，能够利用母乳低聚糖。该菌种还具有抗氧化、抑制炎症、调节胆固醇等益生功能。目前，长双歧杆菌婴儿亚种已收录于我国《可用于食品菌种名单》以及欧盟安全资格认定(qualifiedpresumption of safety，QPS)名单中，在食品、饲料、微生态制剂等领域中具有潜在的应用前景。

益生菌的活菌数量是评价益生菌产品质量的重要指标之一，为保证产品质量，需要确认产品中所添加菌株的数量以及类型与产品所称是否相符。目前最为常见的活菌检测方法为平板计数法，但传统的平板计数法耗时费力，不能满足对复合益生菌产品中各菌种/株的活菌数量进行同步检测的需求。而PCR、qPCR等检测技术，虽然灵敏度高、特异性强，但是不能有效地区分活、死菌，因此会导致结果出现“假阳性”的情况。

叠氮溴化丙锭(PMA)是一种常见的活菌染料，能够穿透死亡细胞/膜损伤细胞的细胞膜插入核酸，在强光照射下能够与DNA形成稳定的共价氮碳键不可逆地修饰DNA，阻止死细胞/膜损伤细胞的DNA进行PCR扩增。当其与qPCR技术结合时，可以有效地区分活、死菌。目前已有众多学者将PMA-qPCR技术应用在活菌检测中，包括金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌等，同时PMA-qPCR已成为益生菌产品中乳酸菌活菌数量检测的有效方法。但暂未见该方法应用于检测长双歧杆菌婴儿亚种的研究与相关专利。因此，本发明采用PMA-qPCR特异性检测技术，建立复合益生菌中长双歧杆菌婴儿亚种“亚种”水平活菌靶向精准鉴定及定量检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一对可以靶向鉴定长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacteriumlongum subsp.infantis)的引物组，结合PMA-qPCR特异性检测技术，实现对复合益生菌中长双歧杆菌婴儿亚种的靶向精准鉴定和活菌定量检测。

本发明提出如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列在用于鉴定长双歧杆菌婴儿亚种的应用。

本发明提出一种长双歧杆菌婴儿亚种菌株的鉴定方法，检测步骤如下：

S1、提取待测菌株的基因组DNA；

S2、针对SEQ ID No.1所示的核苷酸序列设计引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示；

S3、利用引物对基因组DNA进行PCR扩增，获得实际扩增产物；

S4、目的扩增产物长度为209bp，如实际扩增产物与目的扩增产物长度不一致，则待测菌株鉴定为非长双歧杆菌婴儿亚种；

S5、如实际扩增产物于目的扩增产物长度一致，则待测菌株鉴定为长双歧杆菌婴儿亚种。

本发明提供一种利用PMA-qPCR检测长双歧杆菌婴儿亚种活菌数量的方法，检测步骤如下：

S1、对待测样品进行PMA处理；

S2、提取经PMA染色后样品的DNA；

S3、利用上述引物组对样品进行qPCR扩增；

S4、将扩增得到的Ct值代入基于标准品建立的标准曲线回归方程中，得到待检样品中长双歧杆菌婴儿亚种的活菌数量。

所述PMA染色时PMA的质量浓度为30μmol/L；

所述PMA染色时暗孵育时间为5min；

所述PMA染色时曝光时间为10min；

本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：

本发明利用了长双歧杆菌婴儿亚种的保守基因序列，提供了基于该特异性分子标记设计的一种鉴定长双歧杆菌婴儿亚种的特异性PCR检测引物，并提出了一种可以快速、准确定量长双歧杆菌婴儿亚种活菌数量的PMA-qPCR方法。

附图说明

图1是特异性引物扩增验证电泳图，其中M-2K marker；CK-空白对照；1-长双歧杆菌婴儿亚种Bifidobacterium longum subsp.Infantis CICC 6069^T；2-长双歧杆菌婴儿亚种Bifidobacterium longum subsp.infantis CICC 10168R；3-长双歧杆菌婴儿亚种Bifidobacterium longum subsp.infantis CICC 10172R；4-长双歧杆菌婴儿亚种Bifidobacterium longum subsp.infantis CICC 10173R；5-长双歧杆菌婴儿亚种Bifidobacterium longum subsp.infantis CICC 10175R；6-长双歧杆菌婴儿亚种Bifidobacterium longum subsp.infantis CICC 10177R；7-长双歧杆菌长亚种Bifidobacterium longum subsp.longum CICC 6186^T；8-长双歧杆菌猪亚种Bifidobacterium longum subsp.suis CICC 6198^T；9-长双歧杆菌猪瘟亚种Bifidobacterium longum subsp.suillum CICC 10184R；10-两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum CICC 6071^T；11-动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacteriumanimalis subsp.lactis CICC 24210^T；12-动物双歧杆菌Bifidobacterium animalisCICC 6250^T；13-青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis CICC 6070^T；14-短双歧杆菌Bifidobacterium breve CICC 6079^T。

图2是长双歧杆菌婴儿亚种qPCR标准曲线(Standard curve)。

图3是长双歧杆菌婴儿亚种qPCR熔解曲线(Melting curve)。

图4是产品中长双歧杆菌婴儿亚种qPCR熔解曲线(Melting curve)。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明实施例的第一个方面提供了一条长双歧杆菌婴儿亚种的保守基因序列在鉴定长双歧杆菌婴儿亚种的菌株中的应用，包括特异性引物设计、PCR扩增验证引物特异性。

本发明利用CD-hit预测泛基因组，获得长双歧杆菌婴儿亚种核心基因集，于NCBI数据库中将核心基因集与长双歧杆菌婴儿亚种的同种不同亚种菌株基因进行比对。选择长双歧杆菌婴儿亚种具有亚种特异性且高度保守的单拷贝基因支链氨基酸转运系统Ⅱ载体蛋白作为靶序列，以长双歧杆菌婴儿亚种模式菌株CICC 6069^T为模板，核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

在NCBI NT数据库中检索SEQ ID NO:1序列，序列相似度大于90％且序列覆盖率等于100％的只有27条长双歧杆菌婴儿亚种结果；其余亚种的长双歧杆菌检索结果，序列相似度均小于90％且序列覆盖率小于95％。因此，SEQ ID NO:1在长双歧杆菌婴儿亚种上具有一定的亚种特异性。利用Prime Express软件V3.0(ABI,Foster City,CA,USA)设计出引物，经产物长度，引物温度等条件过滤，筛选得到1对引物用于数据库比对验证引物特异性，引物详细信息见表1。

表1长双歧杆菌婴儿亚种引物信息

提取待测菌株的基因组DNA，利用上述引物组进行PCR扩增，获得实际扩增产物。

目的扩增产物长度为209bp，如实际扩增产物与目的扩增产物长度不一致，则待测菌株鉴定为非长双歧杆菌婴儿亚种；

如实际扩增产物于目的扩增产物长度一致，则待测菌株鉴定为长双歧杆菌婴儿亚种。

本发明所述扩增体系为25μL，包括premix Taq 12.5μL，上、下游引物(10μmol/L)各1.0μL，DNA模板2μL，无菌ddH₂0补足体积至25μL。扩增条件为95℃预变性5min，循环参数为95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸25s，共35个循环，72℃延伸10min。

本发明的第二个目的是提供一种利用PMA-qPCR检测长双歧杆菌婴儿亚种活菌数，步骤如下。

1)叠氮溴化丙锭(PMA)处理

使用无菌生理盐水调节长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069^T的菌体浓度至10⁸CFU/mL(OD₆₂₀为0.5左右)。将菌液分成两份，一份为活菌，一份为死菌(75℃水浴处理10min)，分别取500μL菌液，加入30μmol/L PMA，暗孵育5min，每隔1min混匀一次，于LED光敏仪(美国Bioyium PT-H18A)曝光10min。12000rpm室温离心10min收集菌体。使用200μL无菌ddH₂O悬浮菌体，用于活、死菌基因组DNA提取。

2)基因组DNA提取

将上述重悬菌液全部转移至2mL无菌研磨管中，管内提前装入0.25g、0.1mm粒径大小无菌玻璃珠。采用珠式样品研磨仪对样品DNA进行提取，设置珠式样品研磨仪速度为6m/s，时间12s，对菌体进行破碎，收集菌体DNA粗提液。

3)实时荧光定量PCR检测

qPCR反应体系：SYBR qPCR Mix 10μL，上、下游引物(10μmol/L)各0.6μL，50×Rox0.08μL，稀释的DNA模板2μL，添加无菌超纯水补足体积至20μL，使用ABI 7500定时定量扩增PCR仪进行qPCR扩增。qPCR反应条件：95℃/30s，1个循环；95℃/10s，60℃/30s(收集荧光)，72℃/25s，40个循环。

4)标准曲线绘制

将长双歧杆菌婴儿亚种于37℃厌氧、固体培养48h，挑取适量菌体于无菌生理盐水中，调节菌体浓度至10⁸CFU/mL(OD₆₂₀为0.5左右)，检测活菌总数(CFU/mL)。取500μL菌悬液经PMA处理后按照3)方法进行基因组DNA提取。将提取的基因组DNA以10倍梯度进行稀释，建立菌落浓度(log₁₀CFU/mL)与Ct值之间的线性关系，通过公式E＝10^-1/s-1计算扩增效率，其中s为标准曲线的斜率。

标准曲线如图2所示，qPCR扩增信号Ct值与菌落浓度的对数值(log₁₀CFU/mL)之间具有良好的线性关系(R²>0.98)，其回归方程为y＝-3.3941x+42.950，其中y代表Ct值，x代表活菌总数对数值(log₁₀CFU/mL)。由标准曲线可见PMA-qPCR针对长双歧杆菌婴儿亚种的检测限为4.4×10³CFU/mL，扩增效率为97％。

5)结果判定

所建立的PMA-qPCR方法可以有效抑制长双歧杆菌婴儿亚种死菌的扩增。针对长双歧杆菌婴儿亚种模式菌株CICC 6069^T建立的基于菌液浓度对数值和Ct值之间的PMA-qPCR标准曲线回归方程线性关系良好，扩增效率为97％，可以实现对长双歧杆菌婴儿亚种进行活菌定量检测。

本发明的益处在于：采用PMA-qPCR技术检测长双歧杆菌婴儿亚种的活菌数量，方法特异性强，可有效靶向检测长双歧杆菌婴儿亚种的活菌数，且操作简单，检测时间短，是一种高效、准确的针对长双歧杆菌婴儿亚种的检测手段。

下面通过具体实施例进一步说明本发明实施例。

实施例1

本实施例用于说明特异性引物正确检测长双歧杆菌婴儿亚种的能力。

1)引物包容性模拟验证

为检验所设计的引物于长双歧杆菌婴儿亚种内是否普遍适用，于NCBI全基因组数据库中，以模式菌株、有文献发表菌株、有国内外菌种保藏中心编号菌株、商业化菌株、分类学地位明确菌株为参考依据，收集39株长双歧杆菌婴儿亚种的39条全基因组序列(WGS)为比对目标，利用特异性引物对WGS序列开展模拟验证。

表2引物包容性检测结果

注：“√”表示有特异性，“×”表示无特异性。

引物组SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3均与目标菌株模板DNA相对应碱基100％匹配，可以将39株长双歧杆菌婴儿亚种全部检出，引物包容性表现好，对长双歧杆菌婴儿亚种的全基因组序列均具有理论上的特异性。

2)引物包容性PCR验证：

选取6株长双歧杆菌婴儿亚种，作为实验验证菌株，如表3所示，提取基因组DNA后使用引物组进行PCR扩增验证。

表3实验验证菌株信息

PCR总反应体系为25μL，包括premix Taq 12.5μL，上、下游引物(10μmol/L)各1.0μL，稀释的DNA模板2μL，无菌ddH₂0补足体积至25μL。扩增条件为95℃预变性5min，循环参数为95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸25s，共35个循环，72℃延伸10min。

如图1所示，6株长双歧杆菌婴儿亚种菌株在相应位置均有明亮的条带，阴性对照无条带，表明长双歧杆菌婴儿亚种的引物组SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3在“亚种”间具有良好特异性。

3)引物包容性qPCR验证：

选择表3中菌株提取基因组DNA使用引物组进行qPCR扩增验证，通过Ct值和熔解曲线判断引物是否满足qPCR试验要求。

结果如表4所示，引物组SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3对长双歧杆菌婴儿亚种产生阳性扩增，Ct值在14.45～17.77范围内，且该引物其扩增产物形成的熔解曲线(图3)单一且无杂峰，产物单一且体系无污染，满足qPCR试验标准。

表4引物qPCR特异性检测结果

注：“√”表示有特异性，“×”表示无特异性。

实施例2

本实施例用于说明特异性引物正确排除非目标菌株能力。

1)引物排他性模拟验证

为验证所设计的长双歧杆菌婴儿亚种引物能否排除非目标菌株干扰，在NCBI全基因组数据库中，以模式菌株、有文献发表菌株、有国内外菌种保藏中心编号菌株、商业化菌株、分类学地位明确菌株为参考依据，收集50株长双歧杆菌婴儿亚种的同种的不同亚种、25株同属不同种以及28株不同科菌株的全基因组序列(WGS)为比对目标，利用特异性引物对WGS序列开展模拟验证。经验证，引物组SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3排他性表现良好，均未对非目标菌株产生阳性扩增。

2)引物排他性PCR验证

选取3株同种不同亚种菌株以及5株同属不同种菌株作为实验验证菌株，如表5所示，提取基因组DNA后使用引物组进行PCR扩增验证。

表5实验验证菌株信息

PCR总反应体系和扩增条件同实施例1。

如图1所示，8株非长双歧杆菌婴儿亚种菌株和阴性对照均无条带，表明长双歧杆菌婴儿亚种的引物组SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3与非目标菌株DNA不会产生PCR扩增，说明该引物可以有效区分长双歧杆菌婴儿亚种与属内种间以及不同亚种之间的其他菌株。

3)引物排他性qPCR验证：

选择表5中的菌株提取基因组DNA使用引物组进行qPCR扩增验证，通过Ct值和熔解曲线判断引物是否满足qPCR试验要求。

qPCR反应体系和反应条件同实施例1。

结果如表6所示，引物组SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3仅对长双歧杆菌婴儿亚种产生阳性扩增，非目标菌株结果均呈阴性，引物具有良好的排他性。

表6引物qPCR特异性检测结果

注：“√”表示有特异性，“×”表示无特异性。

实施例3

本实施例用于说明所建立的PMA-qPCR方法在长双歧杆菌婴儿亚种菌株之间的适用性。

1)PMA处理

分别选取六株长双歧杆菌婴儿亚种，于37℃厌氧、固体培养48h。使用无菌生理盐水调节菌体浓度至10⁸CFU/mL(OD₆₂₀为0.5左右)后将菌液分成两份，一份为活菌，一份为死菌(75℃水浴处理10min)。分别取500μL菌液，加入30μmol/L PMA，暗孵育5min，每隔1min混匀一次，于LED光敏仪(美国Bioyium PT-H18A)曝光10min。12000rpm室温离心10min收集菌体，用于活、死菌基因组DNA提取。通过抑制率(％)对结果进行分析，确保该PMA作用条件能够有效抑制死菌后续qPCR扩增。

抑制率(％)＝(1-C_{死菌-PMA(+)}/C_{死菌-PMA(-)})％

C_{死菌-PMA(+)}：经PMA处理的待测样品菌浓度(CFU/mL)；

C_{死菌-PMA(-)}：未经PMA处理的待测样品菌浓度(CFU/mL)。

2)基因组DNA提取

准备装有0.25g、0.1mm粒径大小玻璃珠的2mL破碎管，121℃高压灭菌30min。使用200μL无菌ddH₂O悬浮菌体，将菌液全部转移至上述的破碎管中，选择最大破碎频率破碎12s，收集菌体DNA粗提液。

3)实时荧光定量PCR检测

4)结果分析

PMA作用条件对死菌qPCR的抑制率如下，所建立的PMA-qPCR方法对于6株长双歧杆菌婴儿亚种死菌的抑制率均达到99.9％。

表7PMA作用条件对死菌qPCR的抑制率

注：PMA(-)：未经PMA处理；PMA(+)经PMA处理。

PMA作用条件对活菌qPCR的检测结果如下。实验结果显示，经PMA处理后的活菌Ct值和未经处理后的Ct之间无显著性差异(P＞0.05)。经基于长双歧杆菌婴儿亚种标准菌株CICC 6069^T建立的PMA-qPCR标准曲线计算得到的活菌数与平板计数结果无显著性差异(P＞0.05)，说明所建立的PMA-qPCR方法于长双歧杆菌婴儿亚种的“亚种”间具有良好的适用性。

表8PMA作用条件对活菌qPCR的影响

注：PMA(-)：未经PMA处理；PMA(+)经PMA处理

实施例4

本实施例用于说明所建立的PMA-qPCR方法于产品中的适用性。

1)检测样品信息

市售某益生菌滴剂(规格：15mL/瓶，标识菌种组成：婴儿双歧杆菌M-63，标识益生菌活菌数≥2×10⁹CFU/mL)；市售某益生菌固体饮料(规格：21g/瓶，标识菌种组成：婴儿双歧杆菌Bi26、鼠李糖乳杆菌HN001、乳双歧杆菌BI04、鼠李糖乳杆菌LGG、动物双歧杆菌HN019、发酵乳杆菌SBS1、副干酪乳杆菌Lpc37、长双歧杆菌BB536、双歧杆菌M16V、罗伊氏乳杆菌LE1，标识益生菌活菌总数为7.5×10⁹CFU/g，长双歧杆菌婴儿亚种标识活菌数为1×10⁸CFU/g)。

2)PMA处理

根据产品声称活菌数，加入适当体积的生理盐水，使样品菌液浓度为10⁸CFU/mL，混匀并充分溶解产品。取500μL菌液于1.5mL无菌离心管中，12000r/min离心10min，去上清液，收集菌体。另取500μL生理盐水清洗菌体1次后，使用500μL生理盐水充分混匀菌体，加入PMA溶液，使其终浓度为30uM，暗孵育5min，每隔1min混匀一次，于LED光敏仪(美国BiotiumPT-H18A)曝光10min。12000rpm室温离心10min收集菌体，利用qPCR定量检测产品中长双歧杆菌婴儿亚种活菌数并与产品声称菌株数量进行比较。

3)DNA提取

同实施例3。

4)荧光定量PCR检测。

同实施例3。

5)检测结果。

将qPCR检测样品中长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longumsubsp.infantis)得到的Ct值代入利用标准品所建立的标准曲线(y＝-3.3941x+42.950，R²＝0.997)中，从而得到样品的菌落数。样品A和样品B经PMA-qPCR方法检测到的活菌数量与产品声称数量相比两者之间无显著性差异(P>0.05)，且熔解曲线呈单一峰。该方法可以排除体系中非目标菌的存在，仅对长双歧杆菌婴儿亚种形成阳性扩增。

表9PMA-qPCR检测与产品声称菌株数量对比结果

/>

Claims

1. 利用支链氨基酸转运系统Ⅱ载体蛋白基因设计的一种鉴定检测复合益生菌中长双歧杆菌婴儿亚种的特异性PCR检测引物，其特征在于，支链氨基酸转运系统Ⅱ载体蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，特异性PCR检测引物为一对，正向引物核苷酸序列如SEQID NO.2所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种检测长双歧杆菌婴儿亚种的方法，其特征在于，包括如下步骤：提取待测样品的基因组DNA；当所述样品采用权利要求1所述的引物组进行PCR扩增时，若出现对应的阳性扩增产物，则判定样品中含有长双歧杆菌婴儿亚种。

3.一种利用PMA-qPCR检测长双歧杆菌婴儿亚种的方法，其特征在于1）叠氮溴化丙锭处理；2）提取经PMA处理后样品的基因组DNA；3）采用权利要求1所述的引物组进行qPCR扩增；4）将获取的Ct值代入基于标准品建立的标准曲线中，获得长双歧杆菌婴儿亚种的活菌数量。

4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述操作步骤1）中，叠氮溴化丙锭处理参数如下：样品待检溶液500 μL，向待检溶液中加入质量浓度为30 μmol/L的叠氮溴化丙锭，混匀后暗反应5 min，于LED光敏仪曝光10 min，光照反应结束后收集菌体。

5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤3）中，实时荧光定量PCR检测支链氨基酸转运系统 Ⅱ 载体蛋白基因，PCR扩增体系如下：SYBR qPCR Mix 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.6 μL，50×Rox 0.08 μL ，DNA模板2 μL，添加无菌超纯水补足体积至20 μL。

6. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤3）中所述的PCR扩增反应条件如下：95℃/30 s，1个循环；95℃/10 s，60℃/30 s（收集荧光），72℃/25 s，40个循环。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤4）中所述的PMA-qPCR标准曲线回归方程为y=-3.3941x+42.950，相关系数R²=0.997。