CN113736894B

CN113736894B - 四种肠道保护菌的检测方法及核酸检测试剂盒

Info

Publication number: CN113736894B
Application number: CN202110897558.4A
Authority: CN
Inventors: 方鹏宇; 郭红辉
Original assignee: Guangdong Jundao Nutrition Technology Co ltd
Current assignee: Guangdong Jundao Nutrition Technology Co ltd
Priority date: 2021-08-05
Filing date: 2021-08-05
Publication date: 2022-11-11
Anticipated expiration: 2041-08-05
Also published as: CN113736894A

Abstract

本发明公开了四种肠道保护菌的检测方法及核酸检测试剂盒，四种肠道保护菌即假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌。本发明以上述四种肠道保护菌的16S rRNA的高度保守区为靶区域，通过设计筛选特异性引物及探针，建立了可同时检测上述四种肠道保护菌的检测方法和检测试剂盒。所述肠道保护菌的检测方法与传统的细菌鉴定方法相比，具有特异性强，灵敏度高，操作便捷，检测快速、准确等优势，可用于实际样本中肠道保护菌的定性检测。

Description

四种肠道保护菌的检测方法及核酸检测试剂盒

技术领域

本发明属于肠道微生物检测技术领域。更具体地，涉及四种肠道保护菌的检测组合物、检测方法及核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)。

背景技术

肠道微生物对生物体的物质代谢、能量流动以及信号传导等有重要的调控作用，并且对动物的饮食、营养、免疫、神经调节以及慢性疾病的产生有重要的影响。对肠道微生物进行深入细致的研究是理解各种慢性疾病及免疫与病原微生物疾病发生机理的重要的方式方法。

2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM)是临床常见的一种代谢性疾病，机体多发生糖脂代谢紊乱，导致患者血糖长时间处于较高水平，对其身体健康造成严重影响。2型糖尿病的发生原因不仅限于饮食结构和运动量的变化，还和肠道菌群有着密不可分的关系，目前对肠道菌群的研究已成为防治2型糖尿病世界研究热点。研究发现，糖尿病与肠道菌群的数量发展有着一定的相关性，当血糖值偏高时，肠道内的假小链双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)和艾克曼菌(Akkermansiamuciniphila)等肠道保护菌的数量会相应减少，它们作为益生菌可以减少2型糖尿病及并发症的发生，而建立一种灵敏、精确、快速的用于定性检测肠道保护菌的方法，有助于肠道保护菌与2型糖尿病的研究。

荧光定量PCR是一种新型的定量检测技术，现已被广泛应用于mRNA表达的研究、单核苷酸多态性(SNPs)的测定以及病原体的测定等多个方面。荧光定量PCR虽具有价格便宜，适用性广等优点，但其特异性差，不能区分扩增产物与非特异性扩增，也不能对不同目标产物进行分别定量。而探针法荧光定量PCR则弥补了这些不足，多重荧光定量PCR则实现了同时对多个目标产物进行定量。如中国专利CN110904250A公开了一种用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物、试剂盒及检测方法。但由于多重扩增具有偏好性，且各产物间相互干扰性较强，使其引物和探针的设计，以及方法的建立难度增大，并且检测方案设计与检测对象基因信息特点有直接的关系。目前还未有针对假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌的肠道保护菌同时进行检测的试剂和方法报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种能够同时检测假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌四种肠道保护菌的检测组合物、检测方法及检测试剂盒。

本发明的第一个目的是提供假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌四种肠道保护菌的检测组合物。

本发明的第二个目的是提供假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌四种肠道保护菌的检测方法。

本发明的第三个目的是提供假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌四种肠道保护菌的核酸检测试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明分析了假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌四种保护菌的基因组信息与特性，最终选择了16S rRNA保守区域，并在这些保守区域中设计出针对检测4种保护菌的特异性引物和探针序列。通过大量的筛选和优化，最终确定了一套灵敏度和特异性最优的引物和探针组合序列。

本发明首先提供了四种肠道保护菌的检测组合物，其包含检测假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌的多重qPCR引物和探针；其中，检测假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、艾克曼菌的上游引物分别为Bi.p-F、Clo.b-F和AK.m-F，其序列依次如SEQ IDNO.1～3所示，检测假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、艾克曼菌的下游引物为Bi.p-R，其序列如SEQ ID NO.4所示；检测干酪乳酸杆菌的上下游引物Lac.c-F/R序列依次如SEQ ID NO.5～6所示；检测小链双歧杆菌、丁酸梭菌、艾克曼菌和干酪乳酸杆菌的探针分别为Bi.p-P、Clo.b-P、AK.m-P和Lac.c-P，其序列依次如SEQ ID NO.7～10所示；上述探针的5’端标记有不同的荧光发射基团，3’端标记有淬灭基团。

优选地，探针Bi.p-P的5’端荧光发射基团为FAM，3’淬灭基团为BHQ1；探针Clo.b-P的5’端荧光发射基团为VIC，3’淬灭基团为BHQ1；探针Lac.c-P的5’端荧光发射基团为TEXASRED，3’淬灭基团为BHQ2；探针AK.m-P的5’端荧光发射基团为CY5，3’淬灭基团为BHQ2，见实施例1。

本发明还提供了假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌四种肠道保护菌的检测方法，首先提取待测样本中的核酸作为模板，加入含有SEQ ID NO.1～10所示检测组合物的反应体系中进行多重荧光PCR反应，通过不同荧光通道的多重qPCR反应结果判断所测样本中是否含有假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和/或艾克曼菌，阳性检测结果的判断依据为对应荧光通道内出现扩增曲线且Ct值≤38。

其中，所述样本可为粪便。

优选地，多重荧光PCR反应的反应体系为：待检测核酸样本5μL，5×DNA PCRBuffer 5μL，Bi.p-F 0.25μL，Clo.b-F 0.25μL，AK.m-F 0.15μL，Lac.c-F 0.25μL，Lac.c-R0.25μL，Bi.p-R 0.25μL，Bi.p-P 0.4μL，Clo.b-P 0.25μL，AK.m-P 0.25μL，Lac.c-P 0.15μL，酶系3μL，dNTPs 1μL，H₂O 8.55μL，见实施例2。

其中，所述dNTPs中含有2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸盐(dUTP)；所述酶系中包含0.5μL的热启动Taq酶和0.5μL的尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)，其余为酶稀释液。

UDG酶的作用为防止扩增产物的污染，其作用机理是选择性水解断裂含有dUTP的双链或者单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成有缺失碱基的DNA链，使其在碱性介质以及高温下进一步水解断裂，从而被消除。

优选地，多重荧光PCR反应的反应条件为：50℃，2min，1个循环；95℃，15min，1个循环；94℃，15sec，55℃，45sec，40个循环，见实施例2。

更优选地，引物Bi.p-F、Clo.b-F、Bi.p-R、Lac.c-F和Lac.c-R的终浓度为10pmol，引物AK.m-F的终浓度为6pmol，探针Bi.p-P的终浓度为8pmol，探针Clo.b-P、AK.m-P和Lac.c-P的终浓度为5pmol，见实施例2。

本发明还提供假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌四种肠道保护菌的核酸检测试剂盒，其含有SEQ ID NO.1～10所示引物和探针及荧光PCR反应所需试剂。

优选地，所述荧光PCR反应所需试剂中的酶为热启动Taq酶，见实施例2。

优选地，所述试剂盒中还含有尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)和含2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸盐(dUTP)的dNTPs，见实施例2。

本发明具有以下有益效果：

本发明基于PCR-荧光探针法，以假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌四种肠道保护菌的16S rRNA的高度保守区为靶区域，通过设计筛选特异性引物及荧光探针，建立了可同时检测上述四种肠道保护菌的检测方法及核酸检测试剂盒。本发明所述四种肠道保护菌的检测方法与传统的细菌鉴定方法相比，具有特异性强，灵敏度高，操作简洁，检测快速、准确等优势，为2型糖尿病肠道保护菌的研究提供快速、特异、可重复的检测手段，可用于实际样本中肠道保护菌的定性检测，用于肠道保护菌的研究。

附图说明

图1为假小链双歧杆菌检测引物及探针的灵敏度检测结果。

图2为丁酸梭菌检测引物及探针的灵敏度检测结果。

图3为干酪乳酸杆菌检测引物及探针的灵敏度检测结果。

图4为艾克曼菌检测引物及探针的灵敏度检测结果。

图5为假小链双歧杆菌检测引物及探针的精密度检测结果。

图6为丁酸梭菌检测引物及探针的精密度检测结果。

图7为干酪乳酸杆菌检测引物及探针的精密度检测结果。

图8为艾克曼菌检测引物及探针的精密度检测结果。

图9为多重qPCR引物和探针的特异性检测结果。

图10为实际临床粪便样本的检测结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1引物、探针的设计和筛选

1、引物和探针的设计

本发明分析了假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌四种肠道保护菌的基因信息特点，选择了16S rRNA保守区域作为靶区域，并针对每一种菌均设计了2对特异性引物及2条特异性探针(其中假小链双歧杆菌、丁酸梭菌和艾克曼菌共用1条下游引物)，对应的基因登录号依次为NZ_CABHOD010000015.1、CABHIF010000001.1、CP006690.1和CP036293.1。

本发明同时构建了分别含有假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌的目的片段的重组质粒，将合成的4种菌的目的片段连接到构建好的PUC57载体中并转化表达大肠埃希菌DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选获得带有重组质粒的细菌，提取重组质粒进行PCR扩增并测序鉴定。

2、引物和探针的筛选

为从上述设计的引物和探针中选出最佳的引物和探针组合，本发明分别进行了单通道引物探针NTC测试和四通道引物探针测试。

(1)单通道引物探针NTC测试

本发明首先针对单一菌进行了单通道引物探针NTC测试。将设计得到的引物和探针排列组合后，分别配制成单一PCR反应液进行NTC测试，将构建的重组质粒依10倍稀释成4个浓度梯度，作为阳性模板进行检测，选择NTC无非特异性扩增且阳性模板扩增效率好的引物及探针进行下一步实验。

(2)四通道引物探针测试

将(1)中选出的4种菌的最佳引物和探针组合配制成PCR反应体系进行NTC测试，其中假小链双歧杆菌、丁酸梭菌和艾克曼菌共用1条下游引物，将构建的重组质粒依10倍稀释成4个浓度梯度，作为阳性模板进行检测，检测结果发现阳性模板的扩增效率好且无非特异性扩增。

故最终选择以此作为最佳引物及探针组合，具体序列如表1所示：

表1引物及探针序列

其中，检测假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、艾克曼菌的上游引物分别为Bi.p-F、Clo.b-F和AK.m-F，其序列依次如SEQ ID NO.1～3所示，检测假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、艾克曼菌的下游引物为Bi.p-R，其序列如SEQ ID NO.4所示；检测干酪乳酸杆菌的上下游引物Lac.c-F/R序列依次如SEQ ID NO.5～6所示；

检测小链双歧杆菌、丁酸梭菌、艾克曼菌和干酪乳酸杆菌的探针分别为Bi.p-P、Clo.b-P、AK.m-P和Lac.c-P，其序列依次如SEQ ID NO.7～10所示；

Bi.p-P的5’端荧光发射基团为FAM，3’淬灭基团为BHQ1；Clo.b-P的5’端荧光发射基团为VIC，3’淬灭基团为BHQ1；Lac.c-P的5’端荧光发射基团为TEXAS RED，3’淬灭基团为BHQ2；AK.m-P的5’端荧光发射基团为CY5，3’淬灭基团为BHQ2。

实施例2检测方法及核酸检测试剂盒

为了确定引物和探针的检测体系，本发明还分别测试了不同终浓度的引物和探针对荧光PCR反应的影响。

(1)引物和探针用量的优化

将实施例1中经筛选确认得到的引物和探针配制成一定浓度的溶液，再调整引物和探针的用量，组合配制成不同的PCR反应体系，将合成的重组质粒10倍稀释成4个浓度梯度作为阳性模板进行扩增，检测不同引物及探针用量对检测效果的影响，选定合适的引物和探针的浓度及用量。

表2检测体系中引物和探针用量的优化

检测结果发现，当反应体系中引物Bi.p-F、Clo.b-F、Bi.p-R、Lac.c-F和Lac.c-R的终浓度为10pmol，引物AK.m-F的终浓度为6pmol，探针Bi.p-P的终浓度为8pmol，探针Clo.b-P、AK.m-P和Lac.c-P的终浓度为5pmol时，扩增曲线及扩增效率最好。

(2)优化热启动Taq酶、UDG酶的用量

将经筛选确认得到的引物探针组合配制成PCR反应体系，采用不同量的热启动Taq酶(分别为2.5U、5U、7.5U)，配制成多个体系(体系1、体系2、体系3)，并将合成的质粒10倍稀释成4个梯度浓度做为阳性模板进行扩增检测，选定合适的热启动Taq酶的用量。

将经筛选确认得到的引物探针组合配制成PCR反应体系，采用不同量的UDG酶(分别为0.25U、0.5U、0.75U)，配制成多个体系(体系4、体系5、体系6)，取数量级为10³copies/mL的扩增产物作为污染源(待检样本)进行检测。

表3热启动Taq酶、UDG酶量的优化

检测结果发现，当热启动Taq酶的酶量为5U时各浓度模板的扩增效率均较好，最终确定热启动Taq酶的最佳反应浓度为5U/20μL体系；当UDG酶的酶量为0.5U、0.75U时扩增产物的检测结果均为阴性，最终确定UDG酶的最佳反应浓度为0.5U/20μL体系。

经一系列优化后，本发明最终确定多重荧光PCR的反应体系如表4所示：

表4多重荧光PCR的反应体系

表4所用dNTPs中含有2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸盐(dUTP)；所用酶系中包含0.5μL的热启动Taq酶和0.5μL的尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)，其余为热启动酶稀释液。

荧光PCR反应在ABI7500荧光PCR仪上进行，最终反应条件如表5所示：

表5荧光PCR反应条件

检测时，以提取的待测样本中的核酸为模板，将表1所示检测假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌的qPCR引物和探针按表4混合配制反应体系进行反应，通过不同荧光通道的PCR反应结果判断所测样本中是否含有假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和/或艾克曼菌，阳性结果的判断依据为出现扩增曲线且Ct值≤38。

本发明还提供了检测假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌四种肠道保护菌的核酸检测试剂盒，其包含SEQ ID NO.1～10所示引物和探针及荧光PCR反应所需试剂。

荧光PCR反应所需试剂中的酶可以为热启动Taq酶。

为获得更佳的检测效果，还可在试剂盒中使用含dUTP的dNTPs以及UDG酶。

实施例3灵敏度检测

将分别含4种保护肠道菌目的基因的重组质粒混合后作为初始样本，并稀释至浓度为10⁶copies/mL，再依次稀释至10⁵、10⁴、10³和500copies/mL作为待检样本，检测引物及探针的灵敏度，反应体系及条件同实施例2。

为避免曲线相互重叠影响查看，本发明通过检测探针所对应的荧光通道对结果进行了观察，结果如图1～4所示，其中图1为假小链双歧杆菌检测引物及探针的灵敏度检测结果，图2为丁酸梭菌检测引物及探针的灵敏度检测结果，图3为干酪乳酸杆菌检测引物及探针的灵敏度检测结果，图4为艾克曼菌检测引物及探针的灵敏度检测结果。由图1～4可知，四种菌梯度稀释后的样本的检测结果的线性较好，灵敏度高，最低检测限为500copies/mL。

实施例4精密度检测

分别选取浓度为10⁵copies/mL和10⁴copies/mL的含4种保护肠道菌目的基因的重组质粒进行精密度检测，重复10次。

为避免曲线相互重叠影响查看，本发明通过检测探针所对应的荧光通道对结果进行了观察，结果如图5～8所示，图5～8依次对应假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌的检测引物及探针的精密度检测结果，由图5～8可知，检测的重复性较好。

实施例5特异性检测

为检测所设引物及探针的特异性，本发明以嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、大肠杆菌、啤酒酵母、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、白色念珠菌、产气杆菌和变形杆菌等肠道菌的核酸为模板进行特异性检测，结果如图9所示，由图可知，本发明所设引物及探针与其他肠道菌无交叉反应，具有较高的特异性。

实施例6临床样本的实际检测

本发明收集并提取了13例临床粪便样本的核酸，阴性质控品同步参与提取；取5μL提取的核酸样本加入配制好的PCR反应体系中，进行扩增反应。结果如图10所示，13例样本的检测结果均为阳性，表明本发明所建立的检测方法可用于临床样本的实际检测。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东君道营养科技有限公司

<120> 四种肠道保护菌的检测方法及核酸检测试剂盒

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatccctgaa aaccggtct 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcgagagtga gcaaaactat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgaggcggag gaaatcctaa 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgatbcgcg attactag 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgcgtgagtg aagaaggctt 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggataacgct tgccacctac g 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gagtctgcaa cccgactcca t 21

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggctgaaact cgcctacatg aagctg 26

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcaacccgcc tacacgaagc c 21

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aatggtcggc agagtaactg ttgtcggc 28

Claims

1.四种肠道保护菌的检测组合物，其特征在于，包含检测假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌的多重qPCR引物和探针；其中，检测假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、艾克曼菌的上游引物分别为Bi.p-F、Clo.b-F和AK.m-F，其序列依次如SEQ ID NO.1～3所示，检测假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、艾克曼菌的下游引物为Bi.p-R，其序列如SEQ ID NO.4所示；检测干酪乳酸杆菌的上下游引物Lac.c-F/R序列依次如SEQ ID NO.5～6所示；检测小链双歧杆菌、丁酸梭菌、艾克曼菌和干酪乳酸杆菌的探针分别为Bi.p-P、Clo.b-P、AK.m-P和Lac.c-P，其序列依次如SEQ ID NO.7～10所示；上述探针的5’端标记有不同的荧光发射基团，3’端标记有淬灭基团。

2.根据权利要求1所述组合物，其特征在于，Bi.p-P的5’端荧光发射基团为FAM，3’淬灭基团为BHQ1；Clo.b-P的5’端荧光发射基团为VIC，3’淬灭基团为BHQ1；Lac.c-P的5’端荧光发射基团为TEXAS RED，3’淬灭基团为BHQ2；AK.m-P的5’端荧光发射基团为CY5，3’淬灭基团为BHQ2。

3.假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌四种肠道保护菌的非疾病诊断目的的检测方法，其特征在于，提取待测样本中的核酸作为模板，加入含有权利要求1所述检测组合物的反应体系中进行多重荧光PCR反应，通过不同荧光通道的多重qPCR反应结果判断所测样本中是否含有假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和/或艾克曼菌，阳性检测结果的判断依据为对应荧光通道内出现扩增曲线且Ct值≤38。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，多重荧光PCR反应的反应体系为：待检测核酸样本5μL，5×DNA PCR Buffer 5μL，Bi.p-F 0.25μL，Clo.b-F 0.25μL，AK.m-F 0.15μL，Lac.c-F 0.25μL，Lac.c-R 0.25μL，Bi.p-R 0.25μL，Bi.p-P 0.4μL，Clo.b-P 0.25μL，AK.m-P 0.25μL，Lac.c-P 0.15μL，酶系3μL，dNTPs 1μL，H₂O 8.55μL。

5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，多重荧光PCR反应的反应条件为：50℃，2min，1个循环；95℃，15min，1个循环；94℃，15sec，55℃，45sec，40个循环。

6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述酶系中含有热启动Taq酶和尿嘧啶DNA糖基化酶。

7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述dNTPs中还含有2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸盐。

8.根据权利要求4所述方法，其特征在于，引物Bi.p-F、Clo.b-F、Bi.p-R、Lac.c-F和Lac.c-R的终浓度为10pmol，引物AK.m-F的终浓度为6pmol，探针Bi.p-P的终浓度为8pmol，探针Clo.b-P、AK.m-P和Lac.c-P的终浓度为5pmol。

9.假小链双歧杆菌、丁酸梭菌、干酪乳酸杆菌和艾克曼菌四种肠道保护菌的核酸检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述检测组合物及荧光PCR反应所需试剂。

10.根据权利要求9所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有尿嘧啶DNA糖基化酶和含2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸盐的dNTPs。