CN117327814A - 同时检测b型和d型诺维氏梭菌的双重实时荧光定量pcr检测试剂盒及其专用引物和探针 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时检测B型和D型诺维氏梭菌的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和探针，属于生物检测技术领域中的兽医动物病原检测。本发明提供的试剂盒中的专用引物和探针分别针对B型诺维氏梭菌的fliA(B)基因和D型诺维氏梭菌的fliA(H)基因的特异性保守区域优化设计得到，能够高灵敏度双重检测B型和D型诺维氏梭菌，且特异性强、重复性好，并能够实现对牛羊B型和D型诺维氏梭菌相关样品的准确定量，可在疫情流行病学的调查、疫病监测净化等领域中发挥作用。

Description

同时检测B型和D型诺维氏梭菌的双重实时荧光定量PCR检测 试剂盒及其专用引物和探针
技术领域
本发明属于生物检测技术领域中的兽医动物病原检测，具体涉及一种用于B型和D型诺维氏梭菌的双重实时荧光定量PCR检测方法、检测试剂盒及其专用引物和TaqMan探针。
背景技术
B型诺维氏梭菌
羊黑疫又称“传染性坏死肝炎”，是由B型诺维氏梭菌引起的一种急性高度致死性传染病。B型诺维氏梭菌无荚膜，由周鞭毛者能运动，主要产生5种外毒素，分别为α、β、ε、η、θ。B型诺维氏梭菌可以引起人的气性坏疽、动物的恶性水肿、绵阳的大头病和绵羊、山羊、牛、马等的黑疫等疾病，发病急、死亡率高，是人畜共患病中危害较大的一类生物因素，是严重危害养殖业的重要疾病，给各国畜牧业发展带来巨大经济损失。
D型诺维氏梭菌
D型诺维氏梭菌又称溶血梭菌，其发病机制与B型诺维氏梭菌相似，常经过损伤组织(例如动物肝脏组织因肝片吸虫游走通过或者其他因素造成损伤)进而感染该病菌，其毒素可引起家兔、绵羊、牛和马等血细胞溶血，进而造成动物家畜死亡，也给各国畜牧业发展带来巨大经济损失。
B型诺维氏梭菌和D型诺维氏梭菌有时单独感染，有时混合感染，在临床上很难鉴别出来，因此对及时预防和治疗带来很大的困难。目前鉴别这两种细菌的实验室方法主要有分离培养和PCR检测，但其中分离培养的鉴别检测方法操作繁琐、耗时较长、且具有发生感染的风险，因此PCR检测方法是目前实验室检测中常用的方法。例如专利文献CN106148548A(以下称文献1)公开一种能同时检测产气荚膜梭菌、溶血梭菌和B型诺维氏梭菌的多重PCR检测方法，其中分别利用溶血梭菌鞭毛蛋白基因FliA(C)、FliA(H)和B型诺维梭菌鞭毛蛋白基因FliA为模板设计用于检测溶血梭菌和B型诺维梭菌的PCR检测引物，能够在2-3个小时内高特异性对溶血梭菌和B型诺维梭菌进行鉴别检测，但是该文献1的检测灵敏度较低，只能检出细菌量为1.2×103CFU/mL以上的样品，这对于一些初期感染、隐性感染或持续低毒感染的牛羊等的鉴别检测是不利的。因此，有必要建立一种针对B型和D型诺维氏梭菌的兼具有更高灵敏度的方法和产品。
发明内容
针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明一个方面提供一种寡核苷酸组合，其包括用于同时检测B型和D型诺维氏梭菌的双重实时荧光定量PCR引物和TaqMan探针，其中：
所述PCR引物包括：
用于检测B型诺维氏梭菌的上游引物(Cn-B-F)和下游引物(Cn-B-R)，其中所述上游引物(Cn-B-F)的核苷酸序列如SED ID NO：3所示，所述下游引物(Cn-B-R)的核苷酸序列如SED ID NO：4所示；以及用于检测D型诺维氏梭菌的上游引物(Cn-D-F)和下游引物(Cn-D-R)，其中所述上游引物(Cn-D-F)的核苷酸序列如SED ID NO：6所示，所述下游引物(Cn-D-R)的核苷酸序列如SED ID NO：7所示；
所述TaqMan探针包括：
用于对B型诺维氏梭菌进行实时荧光定量检测的TaqMan探针(Cn-B-P)，其核苷酸序列如SED ID NO：5所示；以及用于对D型诺维氏梭菌进行实时荧光定量检测的TaqMan探针(Cn-D-P)，其核苷酸序列如SED ID NO：8所示；
所述TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
在一些实施方式中，所述TaqMan探针(Cn-B-P)的5’端标记有FAM荧光报告基团，3’端标记有BHQ1荧光淬灭基团；所述TaqMan探针(Cn-D-P)的5’端标记有HEX荧光报告基团，3’端标记有BHQ1荧光淬灭基团。
本发明另一方面提供一种同时检测B型和D型诺维氏梭菌的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒，其包括上述的寡核苷酸组合。
在一些实施方式中，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为含B型和D型诺维氏梭菌目的基因片段的重组质粒，阴性对照品为不含B型和D型诺维氏梭菌核酸的反应体系，如H2O(双蒸水、无菌去离子水等)。
在一些实施方式中，所述试剂盒中还包括标准品：Cn-B标准品和Cn-D标准品；各标准品为单一包装或等浓度混合包装；使用所述试剂盒对B型和D型诺维氏梭菌进行双重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的标准品等浓度混合或直接使用混合包装的标准品。
本发明再一方面还提供了上述的寡核苷酸组合或双重实时荧光定量PCR检测试剂盒在对B型和D型诺维氏梭菌进行非疾病诊断目的的检测中的应用。
在一些实施方式中，所述的应用为用实时荧光定量PCR技术对B型和D型诺维氏梭菌进行非疾病诊断目的的定性、定量检测，包括以下步骤：
1)建立标准曲线：将Cn-B标准品和Cn-D标准品等浓度混合，并按照10倍梯度将混合液中各标准品浓度稀释至1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL；以不同浓度的标准品混合液作为模板，在上述的寡核苷酸组合的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线；
2)提取待测样品的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，在上述的寡核苷酸组合的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测；
3)用出现的特异性扩增曲线和得到的Ct值对B型和D型诺维氏梭菌型定性检测，再根据步骤1)中的标准曲线，得出待测样品中所含B型和D型诺维氏梭菌的拷贝数，实现定量检测。
在一些实施方式中，所述步骤1)和步骤2)中进行双重实时荧光定量PCR检测时的体系包括：模板4-6μL，实时荧光定量PCR反应液Hieff Unicon Universal TaqMan mμltiplex qPCR master mix 10-15μL，Cn-B-F(10μM)1-2μL，Cn-B-R(10μM)1-2μL，Cn-B-P(10μM)0.5-2μL，Cn-D-F(10μM)0.5-2μL，Cn-D-R(10μM)0.5-2μL，Cn-D-P(10μM)0.5-2μL，RNA-free H2O 2-4μL。
在一些实施方式中，所述步骤1)和步骤2)中的双重实时荧光定量PCR检测条件为：95℃5min；PCR扩增95℃15s，56℃30s，45个循环，在每个循环的退火结束时进行荧光信号检测。
在一些实施方式中，所述步骤3)中的判定方法为：
若待测样品只在Cn-B-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道中出现标准的S型曲线，且10＜Ct值≤38，则结果判定为B型诺维氏梭菌核酸阳性；
若待测样品只在Cn-D-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道中出现标准的S型曲线，且10＜Ct值≤38，则结果判定为D型诺维氏梭菌核酸阳性；
若待测样品在Cn-B-P和Cn-D-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道中均出现标准的S型曲线，且10＜Ct值≤38，则结果判定为B型和D型诺维氏梭菌核酸阳性；
若待测样品38＜Ct值≤40，出现标准的S型曲线，则结果判定为B型和D型诺维氏梭菌核酸可疑，需复检；
若待测样品Ct值＞40或无扩增曲线，则结果判定为B型和D型诺维氏梭菌核酸阴性；
在一些实施方式中，所述待测样品包括用于疫苗生产的原料、疫苗半成品及成品。
基于以上技术方案提供的同时检测B型和D型诺维氏梭菌的双重实时荧光定量PCR专用引物和探针分别针对B型诺维氏梭菌的fliA(B)基因和D型诺维氏梭菌的fliA(H)基因的特异性保守区域优化设计得到，可能够高灵敏度双重检测B型和D型诺维氏梭菌，且特异性强、重复性好，并能够实现对牛羊B型和D型诺维氏梭菌相关样品的准确定量，因此本发明提供的试剂盒可用于疫苗生产过程中原料的筛选、质量监控和合理化配苗(如评估配制疫苗抗原的准确含量，为疫苗抗原含量提供数据基础)，确保疫苗接种的安全性和合理性，对B型和D型诺维氏梭菌疫苗的生产具有指导作用。还可以为临床病原主要流行情况的调查、疫病监测净化等提供有力依据。本发明的试剂盒和检测方法操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好，可以实现同时对B型和D型诺维氏梭菌的定性检测和准确定量，将在样品中B型和D型诺维氏梭菌的准确检测及在疫苗生产、疫情流行病学的调查、疫病监测净化等领域中发挥重要作用，应用前景广阔。
附图说明
图1为实施例1中Cn-B-1+Cn-D-1双重组合和Cn-B-2+Cn-D-2双重组合对梯度浓度的B型和D型诺维氏梭菌进行双重检测的扩增曲线。
图2为实施例2中建立的B型和D型诺维氏梭菌的双重实时荧光定量PCR标准曲线。
图3为本发明提供的B型和D型诺维氏梭菌的双重实时荧光定量PCR检测方法的特异性检测结果。
图4为本发明提供的B型和D型诺维氏梭菌的双重实时荧光定量PCR检测方法的重复性检测结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图详细说明本发明的内容。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《MolecμLar Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，MolecμLar Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
所用引物和探针均由生工生物工程(北京)股份有限公司合成。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。
实施例1、同时检测B型和D型诺维氏梭菌的双重实时荧光定量PCR的引物和TaqMan探针的设计和确定
从NCBI的核酸数据库GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)分别检索获得B型诺维氏梭菌(简称为Cn-B)和D型诺维氏梭菌(简称为Cn-D)基因组的多个标准参考序列(例如B型诺维氏梭菌的标准参考序列可为Genbank登录号AB058938、CP063959等；D型诺维氏梭菌的标准参考序列可为Genbank登录号KM496352、KM496353、AB264051、AB264050、AB058939等)，用DNA Star软件进行比对后，根据引物、TaqMan探针设计原则，分别选取B型诺维氏梭菌的fliA(B)基因、D型诺维氏梭菌的fliA(H)基因的特异性保守区域序列设计同时检测B型和D诺维氏梭菌型的双重实时荧光定量PCR引物和TaqMan探针。
1.1、单独检测B型和D型诺维氏梭菌的引物和探针的筛选
首先针对B型和D型诺维氏梭菌分别设计了多组引物和探针，以从中筛选出可用于独立检测B型和D诺维氏梭菌、且灵敏度较高的引物和探针，以下针对B型和D诺维氏梭菌，均分别列出了其中的两组，如下表1所示。针对每一种细菌，分别利用列出的两组引物探针进行单独检测(具体检测方法可参照以下实施例2)，灵敏度检测结果如下表2所示。
表1：检测B型和D诺维氏梭菌的PCR引物和TaqMan探针
表2：各组引物探针独立检测B型和D诺维氏梭菌的灵敏度结果(结果为循环数)
由上表2所示的各组引物探针分别对B型和D诺维氏梭菌进行单独检测的灵敏度结果可知，Cn-B-1和Cn-B-2单独检测B诺维氏梭菌时均能检测至浓度为1×100拷贝/μL的模板，且两者的检测循环数基本相当，Cn-D-1和Cn-D-2单独检测D诺维氏梭菌时也均能检测至浓度为1×100拷贝/μL的模板，且两者的检测循环数基本相当。因此，Cn-B-1和Cn-B-2均能单独用于高灵敏度检测B诺维氏梭菌，Cn-D-1和Cn-D-2均能单独用于高灵敏度检测D诺维氏梭菌。
1.2、B型和D型诺维氏梭菌的双重PCR检测引物和探针的筛选
将上述步骤1.1中确定的能单独用于高灵敏度检测B诺维氏梭菌的引物探针组合(Cn-B-1和Cn-B-2)与能单独用于高灵敏度检测D诺维氏梭菌的引物探针组合(Cn-D-1和Cn-D-2)进行双重组合(如下表3所示)，利用这些引物探针的双重组合对系列浓度(1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL)的B型和D型诺维氏梭菌的双重检测体系进行检测，以从中筛选确定能够用于高灵敏度检测B型和D型诺维氏梭菌的双重PCR引物和探针组合(具体的灵敏度检测方法可参照以下实施例2)，结果如下表3所示(其中仅示例性记载模板浓度为1×103、1×102、1×101拷贝/μL的结果)。
表3：B型和D型诺维氏梭菌的双重PCR检测的灵敏度结果
由上表3所示的双重检测B型和D型诺维氏梭菌的灵敏度结果可知，针对B型和D型诺维氏梭菌的双重检测体系，在所列的4个双重组合中，仅有Cn-B-1+Cn-D-1双重组合能够检测至浓度为1×101拷贝/μL的模板，而Cn-B-2+Cn-D-2双重组合能够对B型诺维氏梭菌检测至1×102拷贝/μL，而对D型诺维氏梭菌只能检测至1×103拷贝/μL，另外2个双重组合(Cn-B-1+Cn-D-2和Cn-B-2+Cn-D-1)均只能检测至浓度为1×102拷贝/μL的模板。如图1中A-B幅所示，分别示例性示出了双重组合Cn-B-1+Cn-D-1和Cn-B-2+Cn-D-2分别对B型和D型诺维氏梭菌双重检测体系进行检测的扩增曲线。由此可见，即便Cn-B-1和Cn-B-2，以及Cn-D-1和Cn-D-2在分别单独检测B型和D型诺维氏梭菌时均具有较高的检测灵敏度，但是当将它们组合用于双重检测B型和D型诺维氏梭菌时，仅有Cn-B-1+Cn-D-1双重组合的检测灵敏度相对较高，因此确定以Cn-B-1+Cn-D-1双重组合作为同时检测B型和D型诺维氏梭菌的双重PCR检测引物和探针。
实施例2、B型和D型诺维氏梭菌的双重实时荧光定量PCR检测方法
2.1、B型和D型诺维氏梭菌的双重实时荧光定量PCR标准曲线的建立
2.1.1、B型诺维氏梭菌标准品制备
2.1.1.1、提取基因组DNA
采用商品化的细菌DNA提取试剂盒进行B型诺维氏梭菌的DNA提取，例如AxyPrep细菌基因组DNA小量制备试剂盒(康宁生命科学(吴江)有限公司)，具体步骤见试剂盒说明书。
2.1.1.2、PCR扩增靶标序列
使用实施例1中Cn-B-1的特异性引物(Cn-B-F1和Cn-B-R1)，对步骤2.1.1.1提取的B型诺维氏梭菌的基因组DNA进行普通PCR扩增，得到B型诺维氏梭菌的目的基因片段。普通PCR反应体系如下表4所示，反应条件为：95℃5min；PCR扩增95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；终延伸72℃7min。
表4：PCR扩增体系
2.1.1.3、标准品制备
纯化回收上述步骤2.1.1.2的B型诺维氏梭菌的目的基因片段，并将该目的基因片段克隆至pMD19-T载体(购自TakaRa公司)中，构建成重组质粒，再转化到大肠杆菌JM109感受态细胞(购自TakaRa公司)中，并筛选阳性重组大肠杆菌送生工生物工程(北京)股份有限公司测序，验证质粒构建是否成功。测序结果表明获得了序列正确并携带B型诺维氏梭菌的目的基因的重组大肠杆菌菌株，命名为pMD19-T-Cn-B-JM109株，提取质粒DNA得到标准品，命名为Cn-B标准品。
2.1.2、D型诺维氏梭菌标准品制备
2.1.2.1、D型诺维氏梭菌特异性保守基因的合成
本研究在NCBI核酸数据库GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中检索获得D型诺维氏梭菌参考毒株GenBank：AB058939，将编码fliA(H)蛋白开放阅读框的832bp核苷酸序列(作为D型诺维氏梭菌的目的基因)，由生工生物工程(上海)股份有限公司连接至pUC57载体后合成质粒。
2.1.2.2、标准品制备
将上述步骤2.1.2.1合成的重组质粒转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，并筛选阳性重组大肠杆菌送生工生物工程(北京)股份有限公司测序。测序结果表明获得了序列正确并携带D型诺维氏梭菌的目的基因的重组大肠杆菌菌株，命名为pUC57-Cn-D-JM109株，提取质粒DNA得到标准品，命名为Cn-D标准品。
2.1.3、双重实时荧光定量PCR标准曲线的建立
将上述Cn-B标准品和Cn-D标准品分别用Nanodrop测定浓度，并计算各标准品的拷贝数；用TE缓冲液均稀释至1×109拷贝/μL，并将稀释的2种阳性质粒与TE缓冲液按1:1:8的比例混合均匀后，标记为1×108拷贝/μL，命名为Cn-B和Cn-D双重标准品，按照10倍梯度将Cn-B和Cn-D双重标准品稀释至1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL的梯度浓度作为标准样品，每个标准样品检测1次，以不同浓度的标准样品作为模板，在实施例1中Cn-B-1+Cn-D-1的引物和TaqMan探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测。其中实时荧光定量PCR的反应体系(25μL)如下表5所示，双重实时荧光定量PCR的反应条件为：95℃5min；PCR扩增条件：95℃15s，56℃30s，45个循环，在每个循环的退火结束时进行荧光信号检测。
表5：双重实时荧光定量PCR的反应体系
如图1中A幅所示，示出了使用上述实施例1确定的Cn-B-1+Cn-D-1组合对梯度浓度的标准样品进行双重实时荧光定量PCR检测的扩增曲线，可见，各标准样品的扩增曲线均为平滑的“S”形曲线(阳性)，其中八组不带符号的线条从左向右对应的是Cn-B标准品，其浓度分别为：1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL；八组带〇的线条从左向右对应的是Cn-D标准品，其浓度分别为：1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL。检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct(循环数)值(Y轴)作图，绘制标准曲线，结果如图2所示，可见，Cn-B和Cn-D的相关系数分别为R2＝0.996、R2＝0.995，误差较小；线性方程分别为y＝-3.452X+39.782、y＝-3.428X+39.056，因此标准曲线可用于对Cn-B和Cn-D进行双重实时荧光定量PCR检测。
2.2、对B型和D型诺维氏梭菌进行双重实时荧光定量PCR检测
将提取的待测样品基因组DNA作为模板，以制备的适量浓度的阳性质粒(Cn-B和Cn-D双重标准品)作为阳性对照样，以无酶水为阴性对照，根据B型和D型诺维氏梭菌双重实时荧光定量PCR检测结果，对待测样品中的Cn-B和Cn-D进行判定，并对阳性待测样品中B型和D型诺维氏梭菌的拷贝数进行定量。
具体检测方法包括以下步骤：
1)以从待测样品中提取的基因组DNA为模板，在实施例1中Cn-B-1+Cn-D-1的引物和探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测，25μL实时荧光定量PCR的检测体系如上表5所示。实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃5min；PCR扩增95℃15s，56℃30s，45个循环。在每个循环的退火结束时进行荧光信号检测。
2)用得到的Ct值或荧光信号的变化实现对B型和D型诺维氏梭菌定性检测，不同荧光通道出现标准的“S”型扩增曲线，表明待测样品中含有B型诺维氏梭菌和/或D型诺维氏梭菌，再根据Ct值和步骤2.1.3中的标准曲线，得出待测样品中所含有B型诺维氏梭菌和/或D型诺维氏梭菌的拷贝数，实现定量检测。
3)具体判定方法：
若待测样品只在FAM通道中的扩增曲线为标准的S型曲线，且10＜Ct值≤38，则结果判定为B型诺维氏梭菌核酸阳性；
若待测样品只在HEX通道中的扩增曲线为标准的S型曲线，且10＜Ct值≤38，则结果判定为D型诺维氏梭菌核酸阳性；
若待测样品在FAM和HEX两个通道中的扩增曲线均为标准的S型曲线，且10＜Ct值≤38，则结果判定为B型和D型诺维氏梭菌核酸阳性；
若待测样品38＜Ct值≤40，出现“S”型扩增曲线，则结果判定为B型和D型诺维氏梭菌核酸可疑，即该样品需要进行复检；
若待测样品Ct值＞40或无扩增曲线，则结果判定为B型和D型诺维氏梭菌核酸阴性。
实施例3、对B型和D型诺维氏梭菌进行双重实时荧光定量PCR检测方法的特异性、菌落数量敏感性、重复性和最低检测限检测
3.1、特异性检测
按照实施例2中2.1.1.1的方法对B型诺维氏梭菌(Cn-B)、D型诺维氏梭菌(Cn-D)、产气荚膜梭菌A、B、C、D型、腐败梭菌、气肿疽梭菌提取基因组DNA，以无酶水为阴性对照，在实施例1中Cn-B-1+Cn-D-1所示的引物和探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测，PCR反应体系及反应条件参照实施例2中2.1.3。
特异性检测结果如图3(FAM和HEX两通道)所示，可见B型诺维氏梭菌只在FAM通道出现特定的“S”型扩增曲线，结果阳性；D型诺维氏梭菌只在HEX通道出现特定“S”型扩增曲线，结果阳性，而其它样品未出现特定的“S”型扩增曲线，结果阴性。检测结果表明用本发明的方法可特异性地检测出B型和D型诺维氏梭菌。
3.2、菌落数量敏感性检测
使用的B型诺维氏梭菌细菌培养物由金宇保灵生物药品有限公司国家工程实验室提供，其原始菌落数量为5.3×106CFU/mL，10倍梯度稀释至5.3×105CFU/mL，5.3×104CFU/mL，5.3×103CFU/mL，5.3×102CFU/mL，5.3×101CFU/mL，5.3×100CFU/mL的梯度浓度作为Cn-B待测样品，同时将含D型诺维氏梭菌目的基因的重组大肠杆菌菌株pUC57-Cn-D-JM109株的菌液(其原始菌落数量为1.7×109CFU/mL)10倍梯度稀释至1.7×108CFU/mL，1.7×107CFU/mL，1.7×106CFU/mL，1.7×105CFU/mL，1.7×104CFU/mL，1.7×103CFU/mL，1.7×102CFU/mL，1.7×101CFU/mL，1.7×100CFU/mL的梯度浓度作为Cn-D待测样品，按照上述实施例2中的2.1.1.1，将B型诺维氏梭菌的6个稀释度细菌培养物和D型诺维氏梭菌的9个稀释度的菌液提取基因组DNA，以不同浓度的基因组DNA作为模板，在实施例1中Cn-B-1+Cn-D-1的引物和TaqMan探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测，PCR反应体系及反应条件参照实施例2中2.1.3，以验证该方法的菌落数量敏感性。
检测结果如下表6和表7所示，可见，本发明提供的双重实时荧光定量PCR检测方法对B型诺维氏梭菌可以检测至5.3×101CFU/mL(按照上述文献1公开的针对B型和D型诺维氏梭菌的引物组合及其PCR扩增条件，对B型诺维氏梭菌仅能检测至5.3×103CFU/mL)，对D型诺维氏梭菌可以检测至1.7×101CFU/mL(按照上述文献1公开的针对B型和D型诺维氏梭菌的引物组合及其PCR扩增条件，对D型诺维氏梭菌仅能检测至1.7×103CFU/mL)，并且扩增曲线均为特定的“S”型曲线。
表6：B型诺维氏梭菌菌落数量敏感性检测结果
表7：D型诺维氏梭菌菌落数量敏感性检测结果
3.3、重复性检测
按照实施例2中2.1.3的方法，将Cn-B和Cn-D双重标准品1×108拷贝/μL按照10倍梯度稀释至1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100拷贝/μL，以不同浓度的标准品混合液作为模板，每个梯度重复五次，在实施例1中Cn-B-1+Cn-D-1所示的引物和探针的引导下，进行双重实时荧光定量PCR检测，反应体系及反应条件参照实施例2中方法2.1.3。
检测结果如图4和下表8所示(仅示例性列出浓度为1×106、1×104、1×102拷贝/μL的检测数据)，可见针对双重检测体系中的Cn-B和Cn-D标准品，实施例1中Cn-B-1+Cn-D-1所示的引物和探针均能检测至1×101拷贝/μL的浓度，并且B型和D型诺维氏梭菌的6种浓度下每一个浓度的扩增曲线均较聚拢，循环数均无明显差距，变异系数均小于1％。表明本发明提供的用于检测牛羊B型和D型诺维氏梭菌的双重实时荧光定量PCR检测方法的重复性较好。
表8：B型和D型诺维氏梭菌双重实时荧光定量重复性检测结果
3.4、最低检测下限检测
按照实施例2中2.1.3的方法，将Cn-B和Cn-D的双重标准品稀释至1×101、5、1拷贝/μL，以不同浓度的标准品混合液作为模板，每种浓度重复20次，在实施例1中组1所示的引物和探针的引导下进行多重实时荧光定量PCR检测，PCR反应体系及反应条件参照实施例2中步骤2.1.3。评价该方法的最低检测下限。
检测结果如表9所示，本发明提供的双重实时荧光定量PCR检测方法对B型和D型诺维氏梭菌在模板为1×101拷贝/μL时，B型诺维氏梭菌出孔率均为100％，D型诺维氏梭菌出孔率均为100％，并且扩增曲线为特定的“S”型曲线特且Ct值≤38。故将B型和D型诺维氏梭菌双重实时荧光定量PCR检测方法的最低检测下限均定为1×101拷贝/μL。本发明采用的方法为多重实时荧光定量PCR方法，用于单重PCR检测的引物和探针组合在用于进行多重实时荧光定量PCR时，会由于不同引物和探针进行相互干扰造成其检测敏感性下降，也即是说能够用于单重实时荧光定量PCR检测的引物和探针组合不一定能够用于多重PCR检测。
表9：牛羊B型和D型诺维氏梭菌双重实时荧光定量最低检测限试验结果表
实施例4、B型和D型诺维氏梭菌双重实时荧光定量PCR检测试剂盒
本实施例提供的牛羊B型和D型诺维氏梭菌双重实时荧光定量PCR检测及鉴别试剂盒包括：
实施例1中组1所示的用于对Cn-B和Cn-D进行双重实时荧光定量PCR检测的引物(Cn-B-F、Cn-B-R、Cn-D-F和Cn-D-R)和TaqMan探针(Cn-B-P、Cn-D-P)。
具体地，Cn-B和Cn-D的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒包括以下用于25μL双重实时荧光定量PCR检测体系的试剂：模板5μL，实时荧光定量PCR反应液Hieff UniconUniversal TaqMan mμltiplex qPCR master mix 12.5μL，Cn-B-F(10μM)1μL，Cn-B-R(10μM)1μL，Cn-B-P(10μM)0.75μL，Cn-D-F(10μM)0.5μL，Cn-D-R(10μM)0.5μL，Cn-D-P(10μM)0.75μL，RNA-free H2O 3μL。
为方便检测，试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含B型诺维氏梭菌的重组质粒和D型诺维氏梭菌的重组质粒的混合质粒，所述阴性对照为不含B型和D型诺维氏梭菌的反应体系，如H2O(双蒸水、无菌去离子水等)。
为方便检测，试剂盒中还可包括标准品，其为分别携带B型和D型诺维氏梭菌的目的基因的重组质粒Cn-B标准品和Cn-D标准品(参见实施例2)，各标准品可为单独包装，也可等浓度混合包装；使用该试剂盒对Cn-B和Cn-D进行双重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的标准品等浓度混合或直接使用混合包装的标准品。
为方便检测，试剂盒中还可包括实施例2获得的标准曲线和说明书，该说明书内容包括PCR反应程序：95℃5min；PCR扩增95℃15s，56℃30s，45个循环,在每个循环的退火结束时进行荧光信号检测。
实施例5、牛羊B型和D型诺维氏梭菌双重实时荧光定量PCR的样品检测
使用实施例4的试剂盒对金宇保灵生物药品有限公司国家工程实验室提供的50份样品的抗原含量进行检测，待检测编号为1-50，检测方法与实施例2中步骤2.1.3相同。检测结果如下表10所示，检测结果中只有B型诺维氏梭菌核酸阳性为20份，只有D型诺维氏梭菌核酸阳性有10份，B型诺维氏梭菌和D型诺维氏梭菌核酸均为阳性的有2份；B型诺维氏梭菌核酸阴性为28份，D型诺维氏梭菌核酸阴性为38份。可见本发明提供的对B型和D型诺维氏梭菌进行双重实时荧光定量PCR检测的试剂盒能够实现对细菌培养物样品中抗原含量的定量检测，可为环境监测、质量监控提供有力依据。
表10：50份样品检测结果
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种寡核苷酸组合，其特征在于，所述寡核苷酸组合包括用于同时检测B型和D型诺维氏梭菌的双重实时荧光定量PCR引物和TaqMan探针，其中：
所述PCR引物包括：
用于检测B型诺维氏梭菌的上游引物(Cn-B-F)和下游引物(Cn-B-R)，其中所述上游引物(Cn-B-F)的核苷酸序列如SED ID NO：3所示，所述下游引物(Cn-B-R)的核苷酸序列如SEDID NO：4所示；以及用于检测D型诺维氏梭菌的上游引物(Cn-D-F)和下游引物(Cn-D-R)，其中所述上游引物(Cn-D-F)的核苷酸序列如SED ID NO：6所示，所述下游引物(Cn-D-R)的核苷酸序列如SED ID NO：7所示；
所述TaqMan探针包括：
用于对B型诺维氏梭菌进行实时荧光定量检测的TaqMan探针(Cn-B-P)，其核苷酸序列如SED ID NO：5所示；以及用于对D型诺维氏梭菌进行实时荧光定量检测的TaqMan探针(Cn-D-P)，其核苷酸序列如SED ID NO：8所示；
所述TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸组合，其特征在于，所述TaqMan探针(Cn-B-P)的5’端标记有FAM荧光报告基团，3’端标记有BHQ1荧光淬灭基团；
所述TaqMan探针(Cn-D-P)的5’端标记有HEX荧光报告基团，3’端标记有BHQ1荧光淬灭基团。
3.一种同时检测B型和D型诺维氏梭菌的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的寡核苷酸组合。
4.根据权利要求3所述的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为含B型和D型诺维氏梭菌目的基因片段的重组质粒，阴性对照品为不含B型和D型诺维氏梭菌核酸的反应体系，如H2O(双蒸水、无菌去离子水等)。
5.根据权利要求3或4所述的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括标准品：Cn-B标准品和Cn-D标准品；各标准品为单一包装或等浓度混合包装；使用所述试剂盒对B型和D型诺维氏梭菌进行双重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的标准品等浓度混合或直接使用混合包装的标准品。
6.权利要求1或2所述的寡核苷酸组合或权利要求3-5中任一项所述的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒在对B型和D型诺维氏梭菌进行非疾病诊断目的的检测中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
为用实时荧光定量PCR技术对B型和D型诺维氏梭菌进行非疾病诊断目的的定性、定量检测，包括以下步骤：
1)建立标准曲线：将Cn-B标准品和Cn-D标准品等浓度混合，并按照10倍梯度将混合液中各标准品浓度稀释至1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL；以不同浓度的标准品混合液作为模板，在权利要求1或2所述的寡核苷酸组合的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线；
2)提取待测样品的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，在权利要求1或2所述的寡核苷酸组合的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测；
3)用出现的特异性扩增曲线和得到的Ct值对B型和D型诺维氏梭菌型定性检测，再根据步骤1)中的标准曲线，得出待测样品中所含B型和D型诺维氏梭菌的拷贝数，实现定量检测。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
所述步骤1)和步骤2)中进行双重实时荧光定量PCR检测时的体系包括：模板4-6μL，实时荧光定量PCR反应液Hieff Unicon Universal TaqMan mμltiplex qPCR master mix10-15μL，Cn-B-F(10μM)1-2μL，Cn-B-R(10μM)1-2μL，Cn-B-P(10μM)0.5-2μL，Cn-D-F(10μM)0.5-2μL，Cn-D-R(10μM)0.5-2μL，Cn-D-P(10μM)0.5-2μL，RNA-free H2O 2-4μL；和/或
所述步骤1)和步骤2)中的双重实时荧光定量PCR检测条件为：95℃5min；PCR扩增95℃15s，56℃30s，45个循环，在每个循环的退火结束时进行荧光信号检测。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：
所述步骤3)中的判定方法为：
若待测样品只在Cn-B-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道中出现标准的S型曲线，且10＜Ct值≤38，则结果判定为B型诺维氏梭菌核酸阳性；
若待测样品只在Cn-D-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道中出现标准的S型曲线，且10＜Ct值≤38，则结果判定为D型诺维氏梭菌核酸阳性；
若待测样品在Cn-B-P和Cn-D-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道中均出现标准的S型曲线，且10＜Ct值≤38，则结果判定为B型和D型诺维氏梭菌核酸阳性；
若待测样品38＜Ct值≤40，出现标准的S型曲线，则结果判定为B型和D型诺维氏梭菌核酸可疑，需复检；
若待测样品Ct值＞40或无扩增曲线，则结果判定为B型和D型诺维氏梭菌核酸阴性。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的应用，其特征在于，所述待测样品包括用于疫苗生产的原料、疫苗半成品及成品。
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