CN112501321B

CN112501321B - 结核分枝杆菌的分子分型方法

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Publication number: CN112501321B
Application number: CN202011302347.3A
Authority: CN
Inventors: 夏子涵; 许晔; 李庆阁
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2020-11-19
Filing date: 2020-11-19
Publication date: 2022-07-15
Anticipated expiration: 2040-11-19
Also published as: CN112501321A

Abstract

本发明涉及生物领域，并具体涉及一种对结核分枝杆菌进行分子分型方法。本发明的方案解决了传统方案中PCR扩增稳定性差、检测通量低、对长片段分辨率低、结果判读困难、人工操作步骤多的难题，能够对＞98％的标本进行准确的VNTR‑9分型，对＞95％的标本进行准确的HV‑3分型，仅需对工作人员进行简单培训即可进行操作。

Description

结核分枝杆菌的分子分型方法

技术领域

本发明涉及生物领域，并具体涉及一种对结核分枝杆菌进行分子分型方法。

背景技术

结核病是一种由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染导致的传染病，为最主要的引起死亡的单一感染的原因。结核病的治疗时间长、治疗费用高、治愈率低。

控制结核病的发生、发展需要从两个方面入手，首先是快速溯源，及时切断传播途径，减少新病例的产生；其次是要采取有效的、合理的诊疗方案，治愈病人，减少继续传播。二者相辅相成，缺一不可。

目前针对结核病的诊疗网络已经基本完善，但是，由于分型技术的复杂性，溯源分析网络仍处于空白阶段，数据零散。

分子流行病学方法被广泛用于研究结核病的暴发流行、传染源的寻找和追踪等，使人们对结核病的传播规律有了新的认识。常用的方法有Spoligotyping¹、MIRU-VNTR²、IS6110-RFLP³等，其中以MIRU-VNTR为基础的方法具有操作简便、可重复性好的优点，并且该方法的结果呈数字化，便于不同实验室之间比较以及国际数据库的建立，是一种容易大范围推广的基因分型方法。

结核分枝杆菌基因组中存在着一些数目可变的串联重复序列(variable numberof tandem repeat,VNTR)，称为结核分枝杆菌散在分布重复单位(mycobacterialinterspersed repetitive units,MIRU)，即MIRU-VNTR。每个特定的VNTR位点由两部分组成：中间的可变区和外围的侧翼区。在不同菌体中，可变区含有一个以上称为重复单元的短序列。一般来说，每个重复单元的碱基对数目恒定，而串联在一起的重复单元的拷贝数是可变的，由此导致DNA片段长度的差异。以MIRU-VNTR为基础的分型方法依靠与各位点侧翼区互补的特异性引物对各位点进行扩增，通过琼脂糖凝胶电泳方法确定扩增产物的长度。侧翼区长度和每一重复单元的长度为已知，所以根据扩增产物的长度能够确定重复单元的拷贝数⁴。对来自不同菌株的同一位点进行扩增，其产物经电泳分离，然后与分子量标准和标准菌株相比较，推算出各菌株在该位点上重复单元的拷贝数。将各位点的拷贝数按照一定顺序进行排列，即标本的分型结果。

不同国家和地区流行菌株的特点是不同的，中国是结核病负担最严重的国家之一，主要的流行菌株为北京型结核分枝杆菌。已有学者根据中国菌株流行特征筛选出一套高分辨率位点组合，由9个一线分型位点(VNTR-9)和3个二线分型位点(HV-3)组成。所有菌株经VNTR-9检测，VNTR-9成簇(9个VNTR位点的拷贝数完全相同)的标本继续进行HV-3检测，而单一型菌株则无需HV-3检测⁵。VNTR 9+3分型方案需9或12个PCR反应即可对一份标本进行基因分型，与金标准VNTR 24相比，分辨率相当但位点数少了一半，提高了分型效率、节约成本，更加适应中国的结核病疫情状况。

然而，传统的琼脂糖凝胶电泳需要较多的人工操作、检测时间长并且检测通量低。已有学者提出了多重PCR、多重荧光PCR、毛细管电泳的方法对传统方案进行改进^6-8，10-11，然而这些技术对结果的解释比较复杂，需要有经验的工作人员对结果进行判读，或分辨率仅能满足对较短扩增子进行有效分析，且这些方案没有一套系统的判读规则，即仅简化了检测步骤而未简化结果判读步骤，或难以进行实验室之间以及同一实验室内不同批次之间检测结果的比较。有研究表明⁹，常规多重PCR&毛细电泳检测方案无法解决对长片段分辨率低的局限，对片段长度＞1000bp的标本需要使用琼脂糖凝胶电泳检测。文献6局限性：①所选位点拷贝数大多为10拷贝以内，该方案对长片段的分辨率较低；②15个位点在同一PCR反应中进行扩增检测，仅能通过比较峰图来区分是否成簇或是单一型菌株，无法得知某一具体位点的具体拷贝数；③需要富有经验的工作人员对结果进行判读，难以进行实验室之间以及同一实验室内不同批次之间检测结果的比较。文献7局限性：①所选位点拷贝数大多为10拷贝以内，该方案对长片段的分辨率较低；②仪器耗材比较昂贵。文献8局限性：①检测方案为琼脂糖凝胶电泳，所需人工操作较多；②每一PCR反应扩增两个位点，但两个位点的拷贝数范围容易出现交叉，所得结果仍需要单重PCR进行验证。

在实际应用中，由于标本质量参差不齐，分型检测前对标本定性、定量是一个必不可少的步骤，能够剔除非结核分枝杆菌和质量差或浓度低的结核分枝杆菌，提高检测效率以及检测结果的稳定性和准确性。然而，传统的方案中，缺少对标本定性定量的步骤或使用操作繁琐、耗时长的电泳或培养¹²的方案对标本进行定性定量。以上技术瓶颈严重阻碍了以MIRU-VNTR为基础的检测方案在临床上的推广，不能满足临床的需要。

因此，开发出一套简便、快速、自动化程度高的菌株定性、定量方案及MIRU检测、分析方案有利于以MIRU-VNTR为基础的方法在临床上的推广和应用，能够为探索和研究结核病的传播和流行提供有力的工具。

发明内容

本发明的一个目的是为了解决以MIRU-VNTR为基础的传统基因分型方法通量低、自动化检测方案分辨率低的难题，建立适合中国的高通量、高分辨率、少人工操作且易用于实验室间或国家间进行比较的标准化MIRU-VNTR溯源分析方案。

本发明针对以上局限性进行改进和创新。第一，本发明所用的VNTR位点更加适合对中国流行的结核分枝杆菌进行分型，并且将一线分型方案VNTR-9合并为4个PCR反应，组合最优，从而提高了检测通量，把标本需要单重检测的概率降到最低；第二，根据标准品毛细管电泳的实际检测结果划定各位点不同拷贝数的阈值、确定判读规则，能够得到每一个位点的拷贝数，所得结果便于不同实验室之间比较；第三，本发明开发了一套适用于单重PCR和多重PCR的DNA分子量标志物设计方案，能够提高毛细管电泳检测的分辨率，提高了长片段尤其是1Kb以上PCR产物的检测能力，并且并不局限用于本发明涉及的VNTR分组，同样适合于其它方案；第四，本发明优选出一个最优的标本浓度范围，提高检测结果的稳定性和准确性。

本发明实现了仅需1步实时荧光PCR即可对培养菌株进行定性和定量，并筛选出标本浓度的优选范围，提高了检测结果的稳定性；为9个一线分型位点筛选出一套最优组合，使4个PCR反应检测9个一线分型位点，提高了检测通量和分析速度；开发一套适用于单重和多重PCR的DNA分子量标志物设计方案，提高了毛细管电泳的分辨率尤其是对长片段PCR产物的分辨率；根据不同位点分组的特点分别制定判读规则，使毛细管电泳的结果能够通过软件自动判读。总之，本发明的方案解决了传统方案中PCR扩增稳定性差、检测通量低、对长片段分辨率低、结果判读困难、人工操作步骤多的难题，能够对＞98％的标本进行准确的VNTR-9分型，对＞95％的标本进行准确的HV-3分型，仅需对工作人员进行简单培训即可进行操作。

本发明建立自动化程度高且标准化VNTR 9+3检测方案，能够进一步用于研究结核病爆发路线、追踪传染源、鉴别内源性复发和外源性再感染、鉴定实验室交叉污染、分析耐药传播等。

在一个方面，本发明建立了基于VNTR-9的多重PCR分组检测方案。VNTR-9包括：MIRU26、Mtub04、Mtub21、VNTR2372、QUB11b、QUB26、MIRU31、MIRU40、QUB18，本发明将这9个位点分为4组进行多重PCR扩增以提高检测通量。

具体分组方案为：MIRU26-Mtub04为第一组(即用于扩增位点MIRU26和Mtub04的引物在同一个PCR反应中进行扩增反应，下同)；Mtub21-VNTR2372为第二组；QUB11b-QUB26为第三组；MIRU31-MIRU40-QUB18为第四组。其中，在上述分组方案中，第一组、第二组、第三组和第四组仅用来表示区分不同的分组，其并不代表任何固定的顺序。

分组的依据及原则：本发明根据不同位点高频拷贝数片段长度的特点将2-3个位点分为一组，在合适区域设计引物使同一分组中各位点高频拷贝数扩增子长度分布范围有较大区分度。若高频拷贝数分布范围出现交叉，则使该范围位于450bp以下(一般而言，长度越短，则分辨率越高，区分能力越强)，如图2-图5中图形所示(统计结果来自我国不同地区约550份标本，气泡图中气泡的大小与该拷贝数(长度)下的标本量成正比)。

PCR产物可使用琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳检测，特别是毛细管电泳检测。其中，毛细管电泳检测结果判读更简单，准确性更高。

在另一个方面，本发明开发了2套适用于毛细管电泳多重PCR和单重PCR检测的DNA分子量标志物构建方法。

针对毛细管电泳的DNA分子量标志物构建方法主要包括：无论是单重PCR还是多重PCR，在同一条件下，扩增效率(或PCR产物浓度)与PCR产物长度大致呈反比关系，即同一条件(标本浓度、PCR程序)下，片段越长，PCR产物信号越低。可通过对PCR母液中的成分进行调整，使一套完整PCR检测方案(例如本发明为VNTR9+3方案)、不同PCR反应(例如本发明为4+3个不同的PCR反应)中一定浓度范围内(例如本发明中标本浓度为10³-10⁴个菌/μL)标本的PCR产物的浓度和相应长度的分子量标志物指示带的浓度相当(即信号强度相当)；

针对毛细管电泳的DNA分子量标志物构建方法具体包括①针对多重PCR的DNA分子量标志物设计原则为：在各分组中高频拷贝数扩增子长度分布范围区分度不足的位置(例：Mtub21-VNTR2372分组的高频拷贝数分布范围在450bp以下基本重合，判定为区分度不足，如图4所示)，每隔1/2-1个重复单元长度设置一条指示带，以保证对相邻扩增子有较大的区分能力；在各分组不同拷贝数片段长度区分度较大但高频出现的范围(例：Mtub04-MIRU26分组的高频拷贝数分布范围有较大区分度，高频范围分别为256-386bp和438-660bp，如图2所示)可根据仪器的分辨率每隔1-2个重复单元设置一条指示带；在一定拷贝数(通常为6-8个拷贝)以后，拷贝数越多，扩增产物长度越长，出现扩增产物的概率越低，相邻指示带间隔的重复单元可根据仪器的分辨率提升至3-5个或4-6个或3-8个或3个或4个或5个或6个或7个或8个重复单元；

针对毛细管电泳的DNA分子量标志物构建方法具体还包括②针对单重PCR的DNA分子量标志物设计原则为：在分辨率允许的情况下，每隔1个重复单元设置一条指示带；片段长度越长，仪器对其分辨率越低(表现为两条指示带的长度相差较大才能够被区分开)，相邻指示带可根据实际情况间隔2-4个或2-6个或2个或3个或4个或5个或6个重复单元。

以上DNA分子量标志物构建方法能够使毛细管电泳的分辨率达到最佳，结果的稳定性最好。

在本方案中，根据Qsep100/400全自动核酸蛋白分析系统的分辨率，VNTR-9的DNA分子量标志物在100-2000bp范围内共计18条指示带(本领域技术人员可以理解的是，具体的指示带的数量可根据具体情况进行调整)，在450bp以下每隔1/2-1个重复单元设置一条指示带，在450-1000bp范围内每隔1-2个重复单元设置一条指示带，在1000-2000bp每隔3-5个或4-6个或3-8个或3个或4个或5个或6个或7个或8个重复单元设置一条指示带；HV-3为单重PCR检测，在300-2000bp范围内共计16条指示带(本领域技术人员可以理解的是，具体的指示带的数量可根据具体情况进行调整)，在1000bp以下每隔一个重复单元的长度设置一条指示带，在1000-2000bp间隔2-4个或2-6个或2个或3个或4个或5个或6个重复单元设置一条指示带。

在又一个方面，本发明提供了适用于多重和单重PCR检测方案、特别是Qsep100/400全自动核酸蛋白分析系统的判读规则(判读规则表仅适用于Qsep100/400全自动核酸蛋白分析系统，但制订判读规则和逻辑图的方案也适用于其它型号的毛细管电泳仪)。根据标准品的实际检出结果赋予不同位点、不同拷贝数标本的判读范围并制作逻辑图，能够对＞98％的临床标本进行准确的VNTR-9分型，对＞95％的临床标本进行准确的HV-3分型，读取结果步骤由软件完成，使该方案标准化。

本发明的具体执行方式为：①分别使用多重和单重PCR检测各位点不同拷贝数的标准品以确定各位点不同拷贝数在多重和单重PCR反应中的长度波动范围和浓度波动范围以划定阈值，尽量保证同一PCR反应中不同位点、不同拷贝数标本的检测范围不会出现交叉，如图2-图5中表格所示；②VNTR-9按照图6的判读逻辑图进行判读：先确定扩增产物的个数，再确定“唯一结果”碱基数的个数，最后对符合自动判读条件的标本直接判读，不符合自动判读条件的标本进行人工判读或单重PCR检测；③HV-3为单重PCR，根据各个拷贝数的阈值(具体的阈值参见图7-图9中表格)进行判读。

由图2的右侧表格可知，Mtub04-MIRU26组合中每一种检测结果都只对应某一个位点的某一种拷贝数，其对应的判读逻辑为图6。具体地，该位点为2个位点的组合，所以对应于图6左侧的2个位点组合的逻辑图进行判读。本领域技术人员在对检测结果进行判断时(该判读过程可由人工完成，也可由计算机软件完成，例如由计算机软件针对Qsep100/400全自动核酸蛋白分析系统的检测结果进行判读)，首先判断其是否存在2个扩增子。如果没有检测到2个扩增子，则可能为某一个位点缺失，则需要给出提示由单重PCR进行检测；如果能够检测到2个扩增子，进一步根据表格判断是否能够得到2个“唯一结果”(该组合均为“唯一结果”)。如果是2个“唯一结果”，则直接按照表格进行判读；如果不能得到2个“唯一结果”(针对其他组合而言)，则进一步判断是否能够得到1个“唯一结果”，如果其中1个为“唯一结果”，则该结果正常判读，另一个扩增子为另一个位点对应的拷贝数；如果两个扩增子都非“唯一结果”，则给出提示：人工判读。

在另一个方面，本发明还提供了标本的优选起始浓度。当标本浓度为10³-10⁴个菌/μL时，检测结果最稳定(该范围特别适用于针对本发明所用的PCR组分、PCR条件、检测条件和Qsep100/400全自动核酸蛋白分析系统；当上述条件发生改变时，该浓度范围可能会发生相应的改变，但依然会存在一个使检测结果最稳定的标本浓度范围)。在多重PCR反应中，同一组内的两个位点不同拷贝数扩增子的长度可能相差较小，且毛细管电泳结果受PCR产物浓度的影响。在进行分型检测之前对标本进行定性定量能够剔除非结核分枝杆菌和质量差、浓度低的结核分枝杆菌的影响，提高了检测结果的稳定性和准确性，简化了操作步骤，填补了传统方案对分型前标本定性、定量一体化检测的空白。

定义

本发明所提到的高频，指的是在一定长度范围内标本出现的概率＞90％。

本发明所提到的较大区分度，指的是在同一分组中高频拷贝数扩增子长度分布范围不交叉。

本发明所提到的唯一结果，指的是所得结果在判读规则表中只对应一个位点的一种拷贝数。

本发明所提到的单拷贝的gyrB是普遍存在于细菌中编码促旋酶B亚单位的基因。该基因进化速率快，每100万年的平均碱基替换率为0.1％-0.8％。该区段基因能对假单胞菌、芽孢杆菌、弧菌、肠杆菌、分枝杆菌、气单胞菌、乳酸菌等不同属或科内的近缘种进行区分鉴定，还可通过设计种特异性引物进行定量PCR或者限制性片段分析。可以针对结核分枝杆菌复合群的gyrB(即DNA促旋酶的B亚单位蛋白，其在NCBI上的编号为：GQ247736.1)基因设计引物，由于该基因高度保守并广泛存在于各结核分枝杆菌菌种中，因此针对该基因的引物能够扩增并检测出结核分枝杆菌复合群所有菌种。

本发明所提到的IC，即internal control，也可称为内控、内对照等。

本发明所提到的SUC₂或suc2是拟南芥蔗糖转运蛋白2基因。在本发明中将该基因的部分序列插入至质粒载体中作为PCR反应液的内控基因。

本发明所提到的IC-P是针对内控基因设计的探针，从而对suc2基因的特定片段进行检测，以达到质控PCR的目的(检测PCR混合反应液是否合格、标本中是否含有抑制PCR反应的抑制剂等等)。

本发明所提到的分子量标志物指示带(或简称为指示带)，指的是分子量标志物中不同的长度的条带，其为不同的具有已知长度的PCR产物。指示带能够起到对一定范围内未知长度的扩增子的计算扩增子长度的作用。

本发明的有益效果

根据不同位点扩增产物的分布范围，通过合理的引物设计方案将合适位点的侧翼序列延长或缩短，使得不同位点扩增产物的分布范围有较大的区分度，从而能够将更多位点置于同一PCR反应中，进一步提高检测通量。

本发明根据不同分组的特点制作DNA分子量标志物的方案也适用于其它不同位点分组，可根据位点的具体分组特征在本发明所用DNA分子量标志物的基础上增加或减少指示带的数目或改变指示带的长度。在本领域对结核分枝杆菌进行分型时可以采用很多不同的位点。本发明的方案选择12个位点进行分型，有其他学者筛选出其它的位点组合，或者国际通用的VNTR-15或VNTR-24中的位点和本发明的方案中的位点不完全相同。但无论是其他学者筛选到的其它位点还是国际通用的位点，本发明的分子量标志物的设计方案是都适用的。

因此，在一方面，本发明提供一种结核分枝杆菌的分型方法，其包括：

提取标本中结核分枝杆菌的核酸；

确定结核分枝杆菌的核酸中VNTR位点的拷贝数；以及

根据所确定的VNTR位点的拷贝数对标本中结核分枝杆菌进行分型；

其中通过基于9个VNTR位点的多重PCR分组检测方案确定各VNTR位点的拷贝数，所述分组方案为：MIRU26-Mtub04为第一组；Mtub21-VNTR2372为第二组；QUB11b-QUB26为第三组；MIRU31-MIRU40-QUB18为第四组。

在一个实施方案中，本发明的方法在确定结核分枝杆菌的核酸中VNTR位点的拷贝数之前对标本进行预处理，以确定和/或调整标本中结核分枝杆菌的浓度。

在另一个实施方案中，本发明的方法通过PCR扩增结核分枝杆菌的核酸中的VNTR位点。

在又一个实施方案中，本发明的方法使用琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳检测PCR产物。

在另一个实施方案中，本发明的方法包括在Qsep100/400全自动核酸蛋白分析系统中，针对9个VNTR位点的DNA分子量标志物在100-2000bp范围内设置指示带的数量，在450bp以下每隔1/2-1个重复单元设置一条指示带，在450-1000bp范围内每隔1-2个重复单元设置一条指示带，在1000-2000bp每隔3-5个或4-6个或3-8个或3个或4个或5个或6个或7个或8个重复单元设置一条指示带。

在又一个实施方案中，本发明的方法进一步包括确定结核分枝杆菌的核酸中另外三个VNTR位点的拷贝数，所述三个VNTR位点选自VNTR3820、VNTR4120和QUB3232。

在另一个实施方案中，本发明的方法包括在Qsep100/400全自动核酸蛋白分析系统中，针对另外三个VNTR位点的DNA分子量标志物在300-2000bp范围内设置指示带的数量，在1000bp以下每隔1个重复单元的长度设置一条指示带，在1000-2000bp间隔2-4个或2-6个或2个或3个或4个或5个或6个重复单元设置一条指示带。

在又一个实施方案中，本发明的方法通过计算机执行指令来判读Qsep100/400全自动核酸蛋白分析系统的检测结果，其中计算机指令如图6所示。

在另一个实施方案中，本发明的方法所使用的引物包括：

在另一个实施方案中，本发明的方法所使用的引物还包括：

在又一个实施方案中，本发明的方法在预处理所使用的引物包括：

在又一个实施方案中，本发明的方法所使用的探针包括：

MIRU-gyrB-P FAM-5′-TCTGCACGGCGTCGGCGTGTCGGT-BHQ1

IC-P HEX-5′-CGCTGCCGATATAGGTCACAGC-BHQ1。

在另一个实施方案中，本发明的方法针对Qsep100/400全自动核酸蛋白分析系统的检测结果，根据图2的右表判读Mtub04位点和MIRU26位点的拷贝数，根据图3的右表判读QUB11b位点和QUB26位点的拷贝数，根据图4的右表判读Mtub21位点和VNTR2372位点的拷贝数，根据图5的右表判读MIRU31位点、MIRU40位点和QUB18位点的拷贝数。

在另一个实施方案中，本发明的方法针对Qsep100/400全自动核酸蛋白分析系统的检测结果，进一步根据图7-9的右表判读VNTR3820位点、VNTR4120位点和QUB3232位点的拷贝数。

在另一方面，本发明提供结核分枝杆菌分型引物组，其包括以下引物：

在一个实施方案中，本发明的引物组还包括：

在另一个实施方案中，本发明的引物组还包括：

在又一方面，本发明提供了本发明的引物组在制备用于对结核分枝杆菌进行分型的试剂盒中的用途。

在另一方面，本发明提供了用于对结核分枝杆菌进行分型的试剂盒，其包括本发明的引物组。

在一个实施方案中，本发明的试剂盒进一步包括本发明的探针。

在又一个实施方案中，本发明的试剂盒进一步包括Taq酶、PCR缓冲液和DNA分子量标志物。

在又一方面，本发明提供了包括计算机执行的指令的非瞬态计算机可读介质，所述计算机执行的指令在由计算机执行时，使计算机执行以获得结核分枝杆菌的核酸中VNTR位点的拷贝数，根据所获得的VNTR位点的拷贝数对标本中结核分枝杆菌进行分型，

其中通过基于9个VNTR位点的多重PCR分组检测方案确定各VNTR位点的拷贝数，所述分组方案为：MIRU26-Mtub04为第一组；Mtub21-VNTR2372为第二组；QUB11b-QUB26为第三组；MIRU31-MIRU40-QUB18为第四组，

其中计算机指令如图6所示。

在一个实施方案中，本发明的包括计算机执行的指令的非瞬态计算机可读介质，其中所述对标本中结核分枝杆菌进行分型还包括确定结核分枝杆菌的核酸中另外三个VNTR位点的拷贝数，所述三个VNTR位点选自VNTR3820、VNTR4120和QUB3232。

因此，本发明包括以下实施方案：

1.结核分枝杆菌的分型方法，其包括：

提取标本中结核分枝杆菌的核酸；

确定结核分枝杆菌的核酸中VNTR位点的拷贝数；以及

2.根据实施方案1所述的结核分枝杆菌的分型方法，其中在确定结核分枝杆菌的核酸中VNTR位点的拷贝数之前对标本进行预处理，以确定和/或调整标本中结核分枝杆菌的浓度。

3.根据实施方案1或2所述的结核分枝杆菌的分型方法，其中通过PCR扩增结核分枝杆菌的核酸中的VNTR位点。

4.根据实施方案3所述的结核分枝杆菌的分型方法，其中使用琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳检测PCR产物。

5.根据实施方案4所述的结核分枝杆菌的分型方法，其中在Qsep100/400全自动核酸蛋白分析系统中，针对9个VNTR位点的DNA分子量标志物在100-2000bp范围内设置指示带的数量，在450bp以下每隔1/2-1个重复单元设置一条指示带，在450-1000bp范围内每隔1-2个重复单元设置一条指示带，在1000-2000bp每隔3-5个或4-6个或3-8个或3个或4个或5个或6个或7个或8个重复单元设置一条指示带。

6.根据前述任一项实施方案所述的方法，其中进一步包括确定结核分枝杆菌的核酸中另外三个VNTR位点的拷贝数，所述三个VNTR位点选自VNTR3820、VNTR4120和QUB3232。

7.根据实施方案6所述的方法，其中在Qsep100/400全自动核酸蛋白分析系统中，针对另外三个VNTR位点的DNA分子量标志物在300-2000bp范围内设置指示带的数量，在1000bp以下每隔1个重复单元的长度设置一条指示带，在1000-2000bp间隔2-4个或2-6个或2个或3个或4个或5个或6个重复单元设置一条指示带。

8.根据前述任一项实施方案所述的方法，其中通过计算机执行指令来判读Qsep100/400全自动核酸蛋白分析系统的检测结果，其中计算机指令如图6所示。

9.根据前述任一项实施方案所述的方法，其中所使用的引物包括：

10.根据前述任一项实施方案所述的方法，其中所使用的引物还包括：

11.根据前述任一项实施方案所述的方法，其中预处理所使用的引物包括：

所使用的探针包括：

MIRU-gyrB-P FAM-5′-TCTGCACGGCGTCGGCGTGTCGGT-BHQ1

IC-P HEX-5′-CGCTGCCGATATAGGTCACAGC-BHQ1。

12.根据前述任一项实施方案所述的方法，其中针对Qsep100/400全自动核酸蛋白分析系统的检测结果，根据图2的右表判读Mtub04位点和MIRU26位点的拷贝数，根据图3的右表判读QUB11b位点和QUB26位点的拷贝数，根据图4的右表判读Mtub21位点和VNTR2372位点的拷贝数，根据图5的右表判读MIRU31位点、MIRU40位点和QUB18位点的拷贝数。

13.根据前述任一项实施方案所述的方法，其中针对Qsep100/400全自动核酸蛋白分析系统的检测结果，进一步根据图7-9的右表判读VNTR3820位点、VNTR4120位点和QUB3232位点的拷贝数。

14.结核分枝杆菌分型引物组，其包括以下引物：

15.根据实施方案14所述的引物组，其还包括：

16.根据实施方案14或15所述的引物组在制备用于对结核分枝杆菌进行分型的试剂盒中的用途。

17.用于对结核分枝杆菌进行分型的试剂盒，其包括根据实施方案13或14所述的引物组。

18.根据实施方案17所述的试剂盒，其进一步包括：

MIRU-gyrB-P FAM-5′-TCTGCACGGCGTCGGCGTGTCGGT-BHQ1

IC-P HEX-5′-CGCTGCCGATATAGGTCACAGC-BHQ1。

19.根据实施方案17或18所述的试剂盒，其还包括Taq酶、PCR缓冲液和DNA分子量标志物。

20.包括计算机执行的指令的非瞬态计算机可读介质，所述计算机执行的指令在由计算机执行时，使计算机执行以获得结核分枝杆菌的核酸中VNTR位点的拷贝数，根据所获得的VNTR位点的拷贝数对标本中结核分枝杆菌进行分型，

其中计算机指令如图6所示。

21.根据实施方案20所述的非瞬态计算机可读介质，其中所述对标本中结核分枝杆菌进行分型还包括确定结核分枝杆菌的核酸中另外三个VNTR位点的拷贝数，所述三个VNTR位点选自VNTR3820、VNTR4120和QUB3232。

附图简要说明

图1显示了本发明的基本检测原理。

图2是Mtub04-MIRU26判读规则。

图3是QUB11b-QUB26判读规则。

图4是Mtub21-VNTR2372判读规则。

图5是MIRU31-MIRU40-QUB18判读规则。

图6是VNTR-9的判读逻辑图。

图7是VNTR3820判读规则。

图8是VNTR4120判读规则。

图9是QUB3232判读规则。

图10是定性、定量典型结果。

图11是VNTR-9典型结果示意图。

图12显示了VNTR-9分子量标志物。

图13显示了HV-3分子量标志物。

图14本发明的检测方案与传统检测方案的比较。

具体实施方式

本发明可通过以下实施方案进行实施，但本发明并不限于此。

实施例

实施例1-

本实施例所采用的试剂如下：

引物序列：

本实施例使用的方法及仪器：

灭活方法

通过水煮法进行灭活。

核酸提取

通过热裂解法提取或使用Lab-Aid 824s核酸提取仪(厦门致善生物科技股份有限公司，厦门)提取。

定量

采用SLAN-96s实时荧光PCR仪(厦门致善生物科技股份有限公司，厦门)进行定量。

普通PCR

采用T30 PCR仪(杭州朗基科学仪器有限公司，杭州)进行普通PCR。

电泳

采用Qsep100/400全自动核酸蛋白分析系统(厦门致善生物科技股份有限公司，厦门)进行电泳。

实验方法

针对罗氏固体培养的结核菌(购自珠海市银科医学工程股份有限公司)，首先挑取2接种环菌株转移至500μLTE缓冲液；针对液体培养的结核菌，吸取1mL菌液置于新的EP管中，12 000g离心20min，轻轻倒弃上清液，并加入500μLTE缓冲液。

提取核酸

热裂解法：将菌液用封口膜进行封口，置于恒温加热器中99℃加热20min。然后在14 000g离心20min。上清液含有目的DNA,将上清液转移至新的EP管中，保存于-20℃待用。

仪器提取：按照Lab-Aid 824s核酸提取仪操作说明进行核酸提取。

模板定性定量

gyrB实时荧光PCR体系能够对结核分枝杆菌进行定性和定量(本领域技术人员可以理解的是，可以采用其他靶标对结核分枝杆菌进行定性和定量，但所采用的靶标应该是结核分枝杆菌中比较保守的基因且拷贝数稳定)。MIX_gyrB:1×缓冲液(500mM KCl，100mMTris，50％(V/V)甘油)、Mg²⁺2mM、dNTP 0.2mM、MIRU-gyrB-引物25pmol、IC-引物60pmol、MIRU-gyrB-P 2.5pmol、IC-P 5pmol、suc2 1×10²个拷贝、Taq 2U，加水补至20μL。模板5μL。PCR程序为：95℃10min；95℃10s，(71℃-62℃)15s(每个循环降1℃)，78℃15s，10个循环；95℃10s，61℃26s，78℃15s(55个循环)，同时在61℃退火时进行FAM和HEX通道荧光信号的采集。结核分枝杆菌会在FAM通道产生扩增曲线，并可通过制作标准曲线对其定量，无扩增曲线的标本为其他菌种或浓度不合格，为无效标本，不做进一步检测；有扩增曲线但浓度＜10³个菌/μL的标本为无效标本，不做进一步检测；将浓度＞10⁴个菌/μL的标本进行适当稀释，使其浓度处于10³-10⁴个菌/μL，待检。

MIRU-VNTR PCR扩增

MIX_{MIRU26-Mtub04}：1×缓冲液、Mg²⁺2mM、dNTP 0.3mM、MIRU26-引物4pmol、Mtub04-引物4pmol、Taq 1U，加水补至20μL。

MIX_{Mtub21-VNTR2372}：1×缓冲液、Mg²⁺2mM、dNTP 0.3mM、Mtub21-引物3pmol、VNTR2372-引物7pmol、Taq 1U，加水补至20μL。

MIX_QUB11b-QUB26：1×缓冲液、Mg²⁺3mM、dNTP 0.4mM、QUB11b引物10pmol、QUB26-引物10pmol、Taq 1U，加水补至20μL。

MIX_{MIRU31-MIRU40-QUB18}：1×缓冲液、Mg²⁺3mM、dNTP 0.4mM、MIRU31-引物4pmol、MIRU40-引物4pmol、QUB18-引物10pmol、Taq 1U，加水补至20μL。

模板体积为5μL,终体积为25μL。PCR反应程序为：96℃5min；96℃15s，60℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min。

检测

使用Qsep100/400全自动核酸蛋白分析系统自动判读。

检测原理见图1。

针对Qsep100/400全自动核酸蛋白分析系统，VNTR-9的判读规则如下：

图2是Mtub04-MIRU26判读规则。注：气泡越大代表该长度(拷贝数)的标本出现的概率越高，Mtub04位点的高频拷贝数范围为2-4拷贝(256-386bp)，MIRU26位点的高频拷贝数范围为4-8拷贝(438-660bp)，两位点高频拷贝数出现的范围有较大区分度。根据不同拷贝数标准品的检测结果，Mtub04-MIRU26分组中两个位点的不同拷贝数标本多重PCR检测结果的波动范围不会有交叉，即每一个检测结果均对应一个位点的其中一个拷贝数，均为“唯一结果”，检测结果可直接根据右表进行判读。图中的浓度ng/uL指的是PCR产物的浓度，Qsep100/400全自动核酸蛋白分析系统能够在给出PCR产物的片段长度的同时也给出PCR产物的浓度。

图3是QUB11b-QUB26判读规则。注：气泡越大代表该长度(拷贝数)的标本出现的概率越高，QUB11b位点的高频拷贝数范围为2-7拷贝(174-580bp)，QUB26位点的高频拷贝数范围为5-9拷贝(655-1400bp)，两位点高频拷贝数出现的范围有较大区分度。根据不同拷贝数标准品的检测结果，QUB11b-QUB26分组中两个位点的不同拷贝数标本多重PCR检测结果在431-529bp(QUB11b-6&QUB26-3：QUB11b位点的6拷贝和QUB26位点的3拷贝均落在该范围，下面类似的结果使用相同的表示方法)范围会有交叉，可能需要人工判读或单重PCR检测；其余范围内每一个检测结果均对应一个位点的其中一个拷贝数，均为“唯一结果”，检测结果可直接根据右表进行判读。

图4是Mtub21-VNTR2372判读规则。注：气泡越大代表该长度(拷贝数)的标本出现的概率越高，Mtub21位点的高频拷贝数范围为0.5-4拷贝(140-395bp)，VNTR2372位点的高频拷贝数范围为1-4拷贝(216-424bp)，两位点高频拷贝数出现的范围基本重合，重合的范围在450bp以内。根据不同拷贝数标准品的检测结果，Mtub21-VNTR2372分组中两个位点的不同拷贝数标本多重PCR检测结果的波动范围不会有交叉，即每一个检测结果均对应一个位点的其中一个拷贝数，均为“唯一结果”，检测结果可直接根据右表进行判读。

图5是MIRU31-MIRU40-QUB18判读规则。注：气泡越大代表该长度(拷贝数)的标本出现的概率越高，MIRU31位点的高频拷贝数范围为2-4拷贝(246-382bp)，MIRU40位点的高频拷贝数范围为2-4拷贝(331-458bp)，QUB18位点的高频拷贝数范围为4-10拷贝(521-1290bp)，MIRU31和MIRU40位点高频拷贝数出现的范围部分重合，重合的范围在450bp以内。根据不同拷贝数标准品的检测结果，MIRU31-MIRU40-QUB18分组中三个位点的不同拷贝数标本多重PCR检测结果在358-382bp(MIRU31-4&QUB18-2)、383-415bp(MIRU40-3&QUB18-2)和521-570bp(MIRU40-6&QUB18-4)范围会有交叉，可能需要人工判读或单重PCR检测；其余范围内每一个检测结果均对应一个位点的其中一个拷贝数，均为“唯一结果”，检测结果可直接根据右表进行判读。

针对Qsep100/400全自动核酸蛋白分析系统，VNTR-9的判读逻辑

图6是VNTR-9的判读逻辑图。注：唯一结果：所得结果在判读规则表中只对应一个位点的一种拷贝数。

针对Qsep100/400全自动核酸蛋白分析系统，HV-3的判断规则

图7是VNTR3820判读规则。图8是VNTR4120判读规则。图9是QUB3232判读规则。

实验结果

实验结果见图10。

梯度稀释的结核分枝杆菌标准株H37Rv制作标准曲线(个菌/μL)(图10A和B)，R²＞0.99，扩增效率＞0.9；该体系检测46种常见的非结核分枝杆菌和结核分枝杆菌标准株H37Rv，H37Rv扩增信号良好(图10C)，非结核分枝杆菌无扩增信号(图10C)，内控信号良好(图10D)。

GyrB扩增曲线信号良好，标准曲线线性关系良好。结核分枝杆菌会在FAM通道产生扩增曲线(定性)并能够通过标准曲线从而对结核分枝杆菌进行定量，如图10所示。GyrB实时荧光PCR体系实现了一步即可对标本进行定性和定量，与传统的电泳或培养方案相比更加稳定、简便。

图11的结果表明，不同位点、不同拷贝数的扩增子均能够区分并且Qsep100/400全自动核酸蛋白分析系统能够直接给出位点和拷贝数。4个PCR反应即可得出VNTR-9的拷贝数,检测速度快，通量高，对长片段的分辨率高。该体系检测范围为10³-10⁴个菌/μL，人工操作步骤仅为配液和加模板，结果判读和整理均由仪器和软件完成，与传统方法相比，既大大节约了人力成本又提高了准确性。

实施例2-

本实施例涉及到DNA分子量标志物的选择。VNTR-9DNA分子量标志物共计18条指示带，HV-3DNA分子量标志物共计16条指示带。各指示带均为不同MIRU位点的PCR产物，胶回收纯化后按照一定比例进行混合。位点、拷贝数、碱基数、PCR产物添加质量如下表所示：

VNTR-9 DNA分子量标志物

HV-3 DNA分子量标志物

实施例3-

中国地域覆盖广，如果想要得到适合各省通用的VNTR检测方案且能够得到各个位点准确的拷贝数，就目前来说中国市场上只出现一款单重PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳检测的试剂盒(康为世纪，北京，中国)。中国是结核病负担比较严重的国家，每年的发病人数以百万计，而电泳是一个十分繁杂的操作，且结果读取也需要人工进行。虽然MIRU-VNTR分辨率高，但是其复杂的人工操作限制了其在中国的应用。

与上述试剂盒相比，本发明有以下几个优势(比较见图14)：首先，本发明中一线分型位点使用多重PCR进行扩增，将9个PCR反应减少至4个PCR反应，提高了检测通量；其次，本发明使用实时荧光PCR体系对标本进行定性、定量，优选出扩增效率最稳定的最佳标本浓度范围，提高了检测结果的稳定性和准确性；第三，在将PCR产物检测使用Qsep100/400全自动核酸蛋白分析系统完成的情况下，则能够进一步降低人工的操作，结果可由软件进行判读。本发明的方法对人员的要求较低，仅需对工作人员进行简单的操作培训，这无疑促进了该本发明的方法在中国的执行和推广。

参考文献

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6.Merritt AJ,Keehner T,O'Reilly LC et al.Multiplex amplified nominaltandem-repeat analysis(MANTRA),a rapid method for genotyping Mycobacteriumtuberculosis by use of multiplex PCR and a microfluidic laboratory chip.JClin Microbiol 2010；48:3758-61.

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10.US 7592135B2,High resolution typing system for pathogenicmycobacterium tuberculosum.

11.WO 2004/009837A2,A high resolution typing system for pathogenicmycobacterium tuberculosum.

12.CN 110257535 A，结核分枝杆菌(Mtb)MLVA基因分型试剂盒。

序列表

<110> 厦门大学

<120> 结核分枝杆菌的分子分型方法

<130> IDC200358

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caagagatgg ctgaggagtt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccgactctcc ggcatcctca 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acacgtgtcg gcggataggt ctac 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acagcatgat cagccggccg aa 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgacgccgac gctagacgtc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gccagcacgg ccgtctgttc 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acctccgttc cgataatc 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aaccagcttt cagcctcc 18

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgtaaggggg atgcgggaaa 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgtcgaagtg aatggtggca t 21

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggtccttccc gatacacg 18

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

acccgaacgc tcagctgtc 19

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cttcggcgtc gaagagagcc tcatc 25

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ctgaccgatg gcaatatcgc cc 22

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

caacaagacg cagatcaaga tcgcc 25

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tctaatcagg tctttctctc acgc 24

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gctacggaag gaatactcag cg 22

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aacaatggcg tcttctaccg gg 22

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tgcgcggtga atgagacg 18

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

accttcatcc ttggcgac 18

<210> 21

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ccggagccaa ccccacc 17

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

atcccgaggt ggtttcgt 18

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gccccagcct tacgactgac 20

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

aaactggacg gaacggccaa g 21

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

cgacgtggtg atgacacaac taca 24

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gcaccgttga ccccgtcttc tt 22

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

tggtttagtc accgttgctg tttt 24

<210> 28

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ccaaaacccg agagcgaata tcgctatgg 29

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

tctgcacggc gtcggcgtgt cggt 24

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

cgctgccgat ataggtcaca gc 22

Claims

1.一种结核分枝杆菌的分型方法在制备用于对结核分枝杆菌进行分型的试剂盒中的用途，所述方法包括：

提取标本中结核分枝杆菌的核酸；

确定结核分枝杆菌的核酸中VNTR位点的拷贝数；以及

其中通过基于9个VNTR位点的多重PCR分组检测方案确定各VNTR位点的拷贝数，所述分组检测方案为：MIRU26-Mtub04为第一组；Mtub21-VNTR2372为第二组；QUB11b-QUB26为第三组；MIRU31-MIRU40-QUB18为第四组。

2.根据权利要求1所述的用途，其中在确定结核分枝杆菌的核酸中VNTR位点的拷贝数之前对标本进行预处理，以确定和/或调整标本中结核分枝杆菌的浓度。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中通过PCR确定结核分枝杆菌的核酸中VNTR位点的拷贝数。

4.根据权利要求3所述的用途，其中使用琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳检测PCR产物。

5.根据权利要求4所述的用途，其中在Qsep100/400全自动核酸蛋白分析系统中，针对9个VNTR位点的DNA分子量标志物在100-2000bp范围内设置指示带的数量，在450bp以下每隔1/2-1个重复单元设置一条指示带，在450-1000bp范围内每隔1-2个重复单元设置一条指示带，在1000-2000bp每隔3-5个或4-6个或3-8个或3个或4个或5个或6个或7个或8个重复单元设置一条指示带。

6.根据权利要求1或2所述的用途，其中进一步包括确定结核分枝杆菌的核酸中另外三个VNTR位点的拷贝数，所述三个VNTR位点选自VNTR3820、VNTR4120和QUB3232。

7.根据权利要求6所述的用途，其中在Qsep100/400全自动核酸蛋白分析系统中，针对另外三个VNTR位点的DNA分子量标志物在300-2000bp范围内设置指示带的数量，在1000bp以下每隔1个重复单元的长度设置一条指示带，在1000-2000bp间隔2-4个或2-6个或2个或3个或4个或5个或6个重复单元设置一条指示带。

8.根据权利要求1或2所述的用途，其中所使用的引物包括：