CN103834743A - 结核分枝杆菌基因分型检测引物组及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因分型领域，尤其涉及结核分枝杆菌基因分型检测引物组及其试剂盒。本发明提供的引物组包括用于检测结核杆菌基因组中22个VNTR位点的22个引物对；通过采用本发明提供的引物组对22个结核分枝杆菌的VNTR位点多样性进行检测可达到对结核分枝杆菌分型的目的。实验结果表明，以本发明提供的引物组进行结核分枝杆菌分型的检测，分辨能力高，特异性强，各位点皆显示出了良好的多态性，分型指数可达0.903。
Description
技术领域
本发明涉及基因分型领域，尤其涉及结核分枝杆菌基因分型检测引物组及其试剂盒。
背景技术
结核病(TB)由结核分枝杆菌感染引起，目前仍是危害人类健康的重要传染病之一。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，俗称结核杆菌或结核菌，其易发生形态、菌落、毒力、免疫原性和耐药性等变异。并且，由于结核病具有潜伏感染的特点，传统的流行病学方法并不能很好的揭示其传播规律。目前，研究结核病分子流行病学主要方法是基因分型技术，通过基因分型技术可以对病原菌进行追踪，区分结核病是外源感染还是旧病复发，对实验室的交叉感染进行鉴别，利用基因分型技术还可以对结核病的暴发流行进行预测。
目前常用的结核杆菌基因分型方法主要有IS6110-RFLP法、MLVA法和spoligotyping法。上述方法中，MLVA方法具有特异、敏感、简便、快速、分辨力强、分型效率高和重复性好等特点在目前的结核病分型检测中广泛的使用。MLVA法，即多位点可变数目串联重复序列方法（Multiple Loci VNTR analysis）是基于结核杆菌可变串联重复序列和分枝杆菌散在重复单位的一种方法，MLVA以普通PCR扩增为基础，通过电泳检测确定不同结核分枝杆菌基因组中不同位点串联重复序列（variable-number tandem-repeat，VNTR）数目，并根据VNTR数目的不同对结核分枝杆菌进行分型。其结果通过数字表示，结果可靠有效，适合于所有结核菌分离株。该方法不仅省时省力，所需菌量少，分辨能力强，还有利于在不同实验室之间进行数据比较。为获得更高的分辨率，更多VNTR位点被选择用于结核杆菌的基因分型，多位点的联合使用有助于提高不同结核杆菌谱系的分辨率。
但是，目前对结核分枝杆菌的MLVA检测中采用的位点和引物组仍然存在着稳定性和重复性不佳的问题，分型指数也不高。并且，由于结核杆菌的流行具有地域性特点，不同的VNTR位点及引物组合在研究不同地域或不同来源菌株时表现分辨能力存在差异。因此，通过实验筛选稳定性和重复性以及 分型指数良好，并且适合多地区结核杆菌分型的VNTR位点对地域性流行病学研究十分关键。
发明内容
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供结核分枝杆菌基因分型检测引物组及其试剂盒。本发明提供的引物组在对多地区的结核分枝杆菌分型中表现出良好的稳定性和重复性，且表现出极高的分型指数。
本发明提供了结核分枝杆菌基因分型检测引物组，包括用于检测结核杆菌基因组中22个VNTR位点的22个引物对；其中，
用于检测位点QUB-11b的上游引物序列如SEQ ID NO:1所示；
用于检测位点QUB-11b的下游引物序列如SEQ ID NO:2所示；
用于检测位点MIRU4的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示；
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用于检测位点MIRU27的下游引物序列如SEQ ID NO:44所示。
本发明提供的引物组在检测吉林地区结核分枝杆菌基因分型中的应用。
本发明通过筛选，得到结核分枝杆菌中22个适于检测基因分型的VNTR点，并提供了相应的引物。通过采用本发明提供的引物组对这22个VNTR点多样性进行检测可达到对结核分枝杆菌分型的目的。其中，各VNTR位的名称、对应序列序号和每一拷贝的长度如表1所示：
表1各VNTR位点的名称、对应序列序号和每一拷贝的长度
| VNTR位点名称 | 每一拷贝片段大小 |
| MIRU4 | 77 |
| MIRU31 | 53 |
| MIRU26 | 51 |
| MIRU24 | 54 |
| MIRU40 | 54 |
| MIRU23 | 53 |
| MIRU10 | 53 |
| MIRU39 | 53 |
| ETR A | 75 |
[0055]
| ETR C | 58 |
| Mtub21 | 57 |
| MIRU2 | 53 |
| QUB-11b | 69 |
| QUB-26 | 111 |
| QUB-3336 | 59 |
| QUB-1895 | 57 |
| Mtub34 | 54 |
| Mtub30 | 58 |
| MIRU27 | 52 |
| MIRU16 | 53 |
| MIRU20 | 53 |
| Mtub4 | 51 |
本发明还提供了一种用于检测结核分枝杆菌基因分型的试剂盒包括本发明提供的结核分枝杆菌基因分型检测引物组。
作为优选，本发明提供的用于检测结核分枝杆菌基因分型的试剂盒中还包括Taq酶、PCR缓冲液和DNA分子量标准。
优选的，PCR缓冲液中包括：Tris-HCl、KCl、MgCl2和dNTP。
本发明提供了一种检测结核分枝杆菌基因分型的方法，包括以下步骤：
步骤1：提取结核分枝杆菌基因组DNA；
步骤2：以结核分枝杆菌基因组DNA为模板，分别以本发明提供的结核分枝杆菌基因分型检测引物组中的22个引物对为引物，经PCR反应获得结核杆菌基因组中22个VNTR位点的PCR产物；
步骤3：取22个VNTR位点的PCR产物，分别以毛细管电泳检测产物长度；
步骤4：根据产物长度换算VNTR位点的拷贝数，各VNTR位点的拷贝数一致的判断为相同的基因分型；
其中，VNTR位点的拷贝数=PCR产物大小/VNTR位点每个拷贝的长度。
在本发明的实施例中，对位点MIRU4、MIRU10、MIRU31、MIRU39、MIRU26、MIRU2、MIRU24、MIRU16、MIRU40、MIRU20、MIRU23和MIRU27的PCR反应条件为：
在本发明的实施例中，对位点ETR A、QUB-18、ETR B、ETR C、QUB-11a和QUB-26的PCR反应条件为：
在本发明的实施例中，对位点QUB-3232、QUB-3336、QUB-1895、QUB-4156和QUB-2163的PCR反应条件为：
在本发明的实施例中，对位点Mtub34、Mtub29、Mtub39、Mtub30、Mtub21和Mtub4的PCR反应条件为：
作为优选，PCR反应体系为：
作为优选，本发明提供的结核分枝杆菌基因分型检测方法中，毛细管电泳的条件为：加样体积5μL，电压100V～240V，频率为50/60Hz；电泳温度10℃～30℃；电泳湿度：10%～75%；电泳时间450s，进样时间10s。
作为优选，PCR产物长度分析采用生工捷瑞测序软件。
本发明提供了结核分枝杆菌基因分型检测引物组，包括用于检测结核杆菌基因组中22个VNTR位点的22个引物对；通过采用本发明提供的引物组对22个结核分枝杆菌的VNTR位点多样性进行检测可达到对结核分枝杆菌分型的目的。实验结果表明，以本发明提供的引物组进行结核分枝杆菌分型的检测，分辨能力高，特异性强，各位点皆显示出了良好的多态性，分型指数可达0.903。
具体实施方式
本发明提供了结核分枝杆菌基因分型检测引物组及其试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明实施例中所采用的结核分枝杆菌标准菌株为H37Rv、M.bovis和BCG均购自北京中原经贸公司（ATCC菌种保存中心中国代理）及自己采集取得。菌株编号及以现有技术鉴定的分型结果如表2所示：
表2本发明实施例所采用的待测菌株编号及分型
| 基因型 | 菌株编号 | 基因型 | 菌株编号 | 基因型 | 菌株编号 |
| 牛基因型 | Tuber1 | 牛基因型 | Tuber17 | 牛基因型 | Tuber33 |
| 牛基因型 | Tuber2 | 牛基因型 | Tuber18 | 牛基因型 | Tuber34 |
| 牛基因型 | Tuber3 | 牛基因型 | Tuber19 | 牛基因型 | Tuber35 |
| 牛基因型 | Tuber4 | 牛基因型 | Tuber20 | 牛基因型 | Tuber36 |
| 牛基因型 | Tuber5 | 牛基因型 | Tuber21 | 牛基因型 | Tuber37 |
[0083]
| 人基因型 | Tuber6 | 牛基因型 | Tuber22 | 牛基因型 | Tuber38 |
| 牛基因型 | Tuber7 | 人基因型 | Tuber23 | 牛基因型 | Tuber39 |
| 牛基因型 | Tuber8 | 牛基因型 | Tuber24 | 牛基因型 | Tuber40 |
| 牛基因型 | Tuber9 | 人基因型 | Tuber25 | 牛基因型 | Tuber41 |
| 牛基因型 | Tuber10 | 牛基因型 | Tuber26 | 牛基因型 | Tuber42 |
| 牛基因型 | Tuber11 | 牛基因型 | Tuber27 | 牛基因型 | Tuber43 |
| 牛基因型 | Tuber12 | 牛基因型 | Tuber28 | 人基因型 | Tuber44 |
| 牛基因型 | Tuber13 | 牛基因型 | Tuber29 | 牛基因型 | Tuber45 |
| 牛基因型 | Tuber14 | 牛基因型 | Tuber30 | 牛基因型 | Tuber46 |
| 人基因型 | Tuber15 | 牛基因型 | Tuber31 | 牛基因型 | Tuber47 |
| 牛基因型 | Tuber16 | 牛基因型 | Tuber32 | 牛基因型 | Tuber48 |
本发明实施例中采用的其它材料或试剂为普通市售品。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：结核分枝杆菌基因组DNA的提取
取待测的48株结核分枝杆菌，每个菌株挑取2～3个菌落，分别放入离心管中，加入200μL TE缓冲液并加入SDS使其终浓度为1%，于85℃～90℃煮10min后，按照Takara公司的细菌DNA提取试剂盒进行操作，分别提取的结核分枝杆菌基因组DNA。所得基因组DNA在检测前于-20℃保存备用。
实施例2：待测菌株不同VNTR位点PCR扩增
以本发明提供的结核分枝杆菌基因分型检测引物组中的22对引物，分别对48株待测菌株中的VNTR位点进行PCR扩增：
扩增体系为：
对位点MIRU4、MIRU10、MIRU31、MIRU39、MIRU26、MIRU2、 MIRU24、MIRU16、MIRU40、MIRU20、MIRU23和MIRU27的PCR反应条件为：
对位点ETR A、QUB-18、ETR B、ETR C、QUB-11a和QUB-26的PCR反应条件为：
对位点QUB-3232、QUB-3336、QUB-1895、QUB-4156和QUB-2163的PCR反应条件为：
对位点Mtub34、Mtub29、Mtub39、Mtub30、Mtub21和Mtub4的PCR反应条件为：
经PCR扩增，获得48个菌株的中22个VNTR位点的PCR产物。
实施例3：PCR产物的电泳及片段拷贝数鉴定
48个菌株中各VNTR位点的PCR产物经毛细管电泳检测，确定PCR产物片段大小。
毛细管电泳条件如下：
加样体积5μL，电压：100V～240V，50/60Hz；工作温度：10℃～30℃；工作湿度：10%～75%。使用卡夹分别为QX DNA Screening Cartridge和QX DNA High Resolution Cartridge。
运行程序：使用系统软件自带程序，检测时间450s，进样时间10s。
根据产物长度换算VNTR位点的拷贝数，各VNTR位点的拷贝数一致的判断为相同的基因分型；
其中，VNTR位点的拷贝数=PCR产物大小/VNTR位点每个拷贝的长度。计算结果如表3所示：
表3 48株结核分枝杆菌的VNTR位点拷贝数
如表3所示：根据各VNTR位点拷贝数的不同，可将待测的48株结核分枝杆菌菌分为12个基因型，与预期完全相符，证明本发明提供的鉴定方法的准确性可达100%。
实施例4：本发明所采用的VNTR位点多样性分析
根据PCR扩增产物长度和重复拷贝片段长度计算各个VNTR位点的拷贝数，利用Mazars等人报道的公式分析VNTR位点的多样性。公式中xi为第i个等位基因在某个MIRU位点出现的频率，N为实验菌株总数。
分析结果如表4所示：
表4 48株结核杆菌各VNTR位点的多态性
各VNTR位点上重复序列的多态性反映了该位点的多样性，同时在一定程度上反映了特定地区菌株的多样性。我们使用公式对22个位点的多态性进行了分析，h值越大表示遗传意义上的多态性越好，参照Sola的定义，h≥0.6表示多态性较高，0.3＜h＜0.6表示中度多态性，h≤0.3表示多态性较低，统计分析结果表明22个位点中，位点QUB11b显示了高度多态性，多态性为0.718。位点ETRA、MIRU4、MIRU23、MIRU31、MIRU39、MIRU40、QUB26、Mtub4、Mtub21为中等多态性，多态性从MIRU31和MIRU39的0.394到ETRA得0.579不等。位点MIRU2、Mtub30和Mtub34多态性较低分别为0.241、0.212和0.037。位点ETRC、MIRU10、MIRU16、MIRU20、MIRU24、MIRU26、MIRU27、QUB1895和QUB3336没有显示多态性，只有一个重复拷贝数出现。
实施例5：不同VNTR位点组合的分辨能力评价
采用Hunter-Gaston（Hunter-Gaston discriminatory index,HGDI）指数评价不同VNTR位点组合对结核杆菌菌株分辨能力，公式如下:
其中，N为实验菌株总数，S代表菌株不同MLVA基因型的数目，nj带包代表第j个基因型的菌株数。
采用上述公式分别计算本发明提供的结核分枝杆菌基因分型检测引物组所对应的22个VNTR位点、或其他VNTR位点组合的分辨能力。结果如表5所示：
表5不同位点组合分辨能力比较
结果显示：表5第2行所示22个具有多态性的MIRU位点可将48株分离菌分为分为12个基因型，分型指数为0.903；表5第3行所示6个具有多态性的MIRU位点可将48株分离菌分为分为11个基因型，分型指数为0.890；而表5第4行所示4个Mtub位点可将48株分离菌分为分为9个基因型，分型指数为0.857。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.结核分枝杆菌基因分型检测引物组，其特征在于，包括用于检测结核杆菌基因组中22个VNTR位点的22个引物对；其中，
用于检测位点QUB-11b的上游引物序列如SEQ ID NO:1所示；
用于检测位点QUB-11b的下游引物序列如SEQ ID NO:2所示；
用于检测位点MIRU4的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示；
用于检测位点MIRU4的下游引物序列如SEQ ID NO:4所示；
用于检测位点MIRU26的上游引物序列如SEQ ID NO:5所示；
用于检测位点MIRU26的下游引物序列如SEQ ID NO:6所示；
用于检测位点MIRU40的上游引物序列如SEQ ID NO:7所示；
用于检测位点MIRU40的下游引物序列如SEQ ID NO:8所示；
用于检测位点MIRU10的上游引物序列如SEQ ID NO:9所示；
用于检测位点MIRU10的下游引物序列如SEQ ID NO:10所示；
用于检测位点MIRU31的上游引物序列如SEQ ID NO:11所示；
用于检测位点MIRU31的下游引物序列如SEQ ID NO:12所示；
用于检测位点Mtub04的上游引物序列如SEQ ID NO:13所示；
用于检测位点Mtub04的下游引物序列如SEQ ID NO:14所示；
用于检测位点ETR C的上游引物序列如SEQ ID NO:15所示；
用于检测位点ETR C的下游引物序列如SEQ ID NO:16所示；
用于检测位点ETR A的上游引物序列如SEQ ID NO:17所示；
用于检测位点ETR A的下游引物序列如SEQ ID NO:18所示；
用于检测位点Mtub30的上游引物序列如SEQ ID NO:19所示；
用于检测位点Mtub30的下游引物序列如SEQ ID NO:20所示；
用于检测位点Mtub21的上游引物序列如SEQ ID NO:21所示；
用于检测位点Mtub21的下游引物序列如SEQ ID NO:22所示；
用于检测位点QUB-26的上游引物序列如SEQ ID NO:23所示；
用于检测位点QUB-26的下游引物序列如SEQ ID NO:24所示；
用于检测位点MIRU23的上游引物序列如SEQ ID NO:25所示；
用于检测位点MIRU23的下游引物序列如SEQ ID NO:26所示；
用于检测位点MIRU39的上游引物序列如SEQ ID NO:27所示；
用于检测位点MIRU39的下游引物序列如SEQ ID NO:28所示；
用于检测位点MIRU24的上游引物序列如SEQ ID NO:29所示；
用于检测位点MIRU24的下游引物序列如SEQ ID NO:30所示；
用于检测位点Mtub34的上游引物序列如SEQ ID NO:31所示；
用于检测位点Mtub34的下游引物序列如SEQ ID NO:32所示；
用于检测位点QUB-1895的上游引物序列如SEQ ID NO:33所示；
用于检测位点QUB-1895的下游引物序列如SEQ ID NO:34所示；
用于检测位点QUB-3336的上游引物序列如SEQ ID NO:35所示；
用于检测位点QUB-3336的下游引物序列如SEQ ID NO:36所示；
用于检测位点MIRU2的上游引物序列如SEQ ID NO:37所示；
用于检测位点MIRU2的下游引物序列如SEQ ID NO:38所示；
用于检测位点MIRU16的上游引物序列如SEQ ID NO:39所示；
用于检测位点MIRU16的下游引物序列如SEQ ID NO:40所示；
用于检测位点MIRU20的上游引物序列如SEQ ID NO:41所示；
用于检测位点MIRU20的下游引物序列如SEQ ID NO:42所示；
用于检测位点MIRU27的上游引物序列如SEQ ID NO:43所示；
用于检测位点MIRU27的下游引物序列如SEQ ID NO:44所示。
2.如权利要求1所述的引物组在检测吉林地区结核分枝杆菌基因分型中的应用。
3.一种用于检测结核分枝杆菌基因分型的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括Taq酶、PCR缓冲液和DNA分子量标准。
5.一种检测结核分枝杆菌基因分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：提取结核分枝杆菌基因组DNA；
步骤2：以所述结核分枝杆菌基因组DNA为模板，分别以权利要求1所述的22个引物对为引物，经PCR反应获得结核杆菌基因组中所述22个VNTR位点的PCR产物；
步骤3：取所述22个VNTR位点的PCR产物，分别以毛细管电泳检测产物长度；
步骤4：根据所述产物长度换算VNTR位点的拷贝数，各VNTR位点的拷贝数一致的判断为相同的基因分型；
其中，所述VNTR位点的拷贝数=PCR产物大小/VNTR位点每个拷贝的长度。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，对位点MIRU4、MIRU10、MIRU31、MIRU39、MIRU26、MIRU2、MIRU24、MIRU16、MIRU40、MIRU20、MIRU23和MIRU27的所述PCR反应条件为：
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，对位点ETR A、QUB-18、ETR B、ETR C、QUB-11a和QUB-26的所述PCR反应条件为：
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，对位点QUB-3232、QUB-3336、QUB-1895、QUB-4156和QUB-2163的所述PCR反应条件为：
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，对位点Mtub34、Mtub29、Mtub39、Mtub30、Mtub21和Mtub4的所述PCR反应条件为：
10.根据权利要求5～9任一项所述的方法，其特征在于，所述毛细管电泳的条件为：加样体积5μL，电压100V～240V，频率为50/60Hz；电泳温度10℃～30℃；电泳湿度：10%～75%；电泳时间450s，进样时间10s。
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