CN111647647A - 一种结核分枝杆菌miru-vntr基因多拷贝数快速检测分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种结核分枝杆菌MIRU‑VNTR基因多拷贝数快速检测分析方法，通过目的基因PCR扩增和测序，以及拷贝数计算即运用EditSeq软件分析测序后的VNTR基因序列，记录重复片段出现的次数。本发明方法相对传统计算结核分枝杆菌VNTR重复次数操作时间短，结果更精确，操作性更强。使用的仪器为PCR和凝胶电泳仪以及电脑分析系统EditSeq开放性软件，其操作技术相对成熟。通过分析VNTR基因序列的拷贝数，可以快速诊断结核分枝杆菌流行病学。本发明通过快速精确分析VNTR的拷贝数，研究结核分枝杆菌流行情况，有利于结核病的临床快速初筛和社区筛查工作。
Description
技术领域
本发明属于微生物基因拷贝数快速计算领域，具体涉及一种结核分枝杆菌MIRU-VNTR基因多拷贝数快速检测分析方法。
背景技术
结核病(tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)感染所引起的一种慢性传染性疾病，临床主要以肺结核多见。大多数感染者由于机体对MTB抗原刺激产生持续性免疫应答，在经历一个较长的潜伏期后，才会最终表现出临床症状。
结核病的早期快速诊断一直是结核病防控和治疗的关键。传统的实验室结核病检测方法都有各自的缺陷，随着近年来核酸扩增技术的发展，分子生物学检测正在临床上得到越来越广泛的应用。
分子流行病学是分子生物学与流行病学研究方法相结合产生的新兴学科，分子流行病学的核心技术是基因分型技术，其发展对于探讨结核分枝杆菌流行规律、传播机制等方面具有重大意义，此外还可区分患者是再感染还是复燃。基于多位点数目可变串联重复序列基因分型(MIRU-VNTR)技术应用于MTB基因分型以来，因具有简便快速、成本低、较好的重复性、易数字化、便于实验室间比较等多个优点，在结核病分子流行病学研究得到广泛应用，可应用于追踪结核病人的感染源、推断结核菌株传播路径以及判断是否为同源暴发等。
MIRU-VNTR分型法因操作简单、成本低廉被美国CDC推选为首选的结核分型方法。利用VNTR分型，我们可以知道某地区菌株“成簇性”大小，即患者被来自同一传染源的菌株所传染。袁薇等利用15位点对我国贵州地区结核分枝杆菌进行流行病学研究，得出成簇率为8.1％，表明该地区菌株多态性较高，仅有8.1％患者是由于本地区传播造成。鉴于其方便、快速以及较高分辨率的优点，VNTR可作为结核分枝杆菌流行病学调查中的初筛工具，不仅可进行基因型确认，还可结合间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)技术，即Spoligotyping法鉴定北京基因型菌株。有学者将spoligotyping技术和VNTR技术分别应用于耐多药结核的基因分型，对比两种分型效果，杜永成等对福建地区耐多药结核进行两次分型，24位点VNTR技术分型所得HGDI为0.999，而Spoligotyping技术分型所得HGDI为0.597，这与Kanglin Wand等人研究结果一致。Kanglin Wand指出Spoligotyping在深入分析我国结核分枝杆菌种群时相较于VNTR鉴别力度不够。但是在2003年Christophe所作研究中，将来自于89个不同地区的116例临床分离株利用两种技术进行分型对比，得到两者结果一致。由于VNTR分型技术与spoligotype分型技术原理类似，均是利用拷贝数的差异作为分型依据，目前大部分学者更倾向于将两者联用以此提高分辨率。
基因拷贝数(copy number)是指某一种基因或某一段特定的DNA序列在单倍体基因组(haploid genome)中出现的数目。基因拷贝数的测定是分子生物学研究常用的技术,例如克隆某些重复序列，测定外源基因在转染培养细胞中和转基因动植物中整合的拷贝数等，都需要对所研究DNA的拷贝数进行测定。但在研究结核杆菌MIRU-VNTR拷贝数的方法主要有以下两种：1、胶片读数法：以50bp的DNA marker为标尺，根据每个待测样品离原地的距离计算每个待测样品的bp数之后，再将每个待测样品的MIRU位点的拷贝数通过待测样品的分子量进行转化。转化的方法根据miru-vntrplus.org官方网站提供的胶片读数方法进行读数，详细的读数方法如图1所示。但是，该方法但是过程繁琐，如果凝胶电泳时，条带扩增不明显，不够亮，结果就无法显示，实验结果易受主观因素影响。2、公式计算法，目前常用公式：重复序列拷贝数＝(PCR产物片段长度-侧翼序列长度)/重复序列长度，但此方法较为繁琐且计算结果并不准确，目前文献中报告结核分枝杆菌侧翼序列的文章较少，且不具有权威性，数值也不精确。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结核分枝杆菌MIRU-VNTR基因多拷贝数快速检测分析方法，利用设计的引物，通过设计的方法提取DNA模板，进行特异PCR扩增目的VNTR基因片段并测序，再通过生物信息学软件EditSeq快速分析计算VNTR基因拷贝数，可准确、快速得到VNTR拷贝数。
本发明提供一种结核分枝杆菌MIRU-VNTR基因多拷贝数快速检测分析方法，利用引物，分别扩增MIRU-20位点、MIRU-40位点、Mtub-04位点和Mtub-21位点，具体方法为：
1)提取DNA模板；
2)PCR扩增；
3)PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测，测序；
4)使用EditSeq软件，输入测序结果，利用查找功能查找测序结果中所有VNTR重复序列，获得VNTR重复次数。
步骤1)中提取DNA模板具体为：
将待检测结核分枝杆菌灭活样品从-80℃冰箱取出，常温融化，经高压灭菌锅121℃45min高温灭活，13000转/min离心10mim后的上清，即得DNA模板，可直接用作DNA模板进行PCR扩增；
和/或，将待检测结核分枝杆菌灭活样品从-80℃冰箱取出，常温融化，经高压灭菌锅121℃45min高温灭活，13000转/min离心10mim后，沉淀使用提取试剂盒，得到DNA模板。
本发明利用样本经121℃高温灭活后，灭活后的样本DNA经过13000转/min离心残留在上清中，无需加入试剂盒提取MTB DNA，获得的DNA模板可以直接进行PCR扩增，提取方法简单高效，进一步提高检测速度。
步骤2)中所述PCR扩增，条件为：98℃变性10sec、50℃退火30sec、72℃延伸1min，这3个步骤40个循环，最后72℃5min。
步骤2)中所述PCR扩增，扩增MIRU-20位点、MIRU-40位点、Mtub-04位点和Mtub-21位点。
扩增上述位点所用引物分别为：
MIRU-20F:5’-TCGGAGAGATGCCCTTCGAGTTAG-3’；如SEQ ID No.1所示；
MIRU-20R:5’-GGAGACCGCGACCAGGTACTTGTA-3’；如SEQ ID No.2所示；
MIRU-40F:5’-CCCGCCTTCGAAACGTCGCT-3’；如SEQ ID No.4所示；
MIRU-40R:5’-TGGACATAGGCGACCAGGCGAATA-3’；如SEQ ID No.5所示；
Mtub-04F:5’-GTCCAGGTTGCAAGAGATGG-3’；如SEQ ID No.7所示；
Mtub-04R:5’-GGCATCCTCAACAACGGTAG-3’；如SEQ ID No.8所示；
Mtub-21F:5’-AGATCCCAGTTGTCGTCGTC-3’；如SEQ ID No.10所示；
Mtub-21R:5’-CAACATCGCCTGGTTCTGTA-3’，如SEQ ID No.11所示。
将PCR扩增产物放置4℃冰箱保存备用。
步骤4)具体为：打开EditSeq软件，将VNTR目的基因测序结果输入，点击Ctrl+F，将对应VNTR重复序列输入对话框内，再点击Find Next，直至找出所有VNTR重复序列，直接获得VNTR重复次数，即获得基因拷贝数。
MIRU-20位点的重复序列长度的大小为77bp，重复单元序列为：
GAGCGGCGCCAATGAGCCGCGCCGGCGACGATGCAGTGGGGGTACCGCCCGCTTGCGGGGGACGAAGCGATGACGAG；如SEQ ID No.3所示；
MIRU-40位点的重复序列长度的大小为54bp；重复单元序列为：
TGCAGAGCGAAGCGATGAGGAGGAGCAGGGCAATGCGGCCTAGCCCGGCGACGA；如SEQ ID No.6所示；
Mtub-04位点的重复序列长度的大小为51bp；重复单元序列为：
CGAACGGCGCAGTTGGCACCAGCCGGTGAGCGAGCGCGCGTAGCGGGGGAG；如SEQ ID No.9所示；
Mtub-21位点的重复序列长度的大小为57bp，重复单元序列为：
GGCGCGCATCGTCACCGGGCGTCGTCTGATTGCCCGGTTCCTCCTCGCGCCGCAAAC，如SEQ IDNo.12所示。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：其中相对于易产生主观误差或者操作误差的胶片读书法，该方法但是过程简单快捷，由计算机操作，不会出现拷贝数测算错误的情况；而相对于传统公式计算法，因为目前文献中报告结核分枝杆菌侧翼序列的文章较少，且不具有权威性，数值也不精确，其所计算结果的参考价值意义不大；使用的仪器为PCR和凝胶电泳仪以及电脑分析系统EditSeq开放性软件，其操作技术相对成熟，无需大型昂贵的检测仪器，只需普通的PCR仪及琼脂糖电泳等普通试剂即可进行实验。而该系统软件EditSeq却能更快更精确的计算出序列拷贝数，可通过计算机自动识别所需要的基因片段，通过PCR扩增及测序即可完成一个样本的检测，3小时内可获得精确的实验结果，因此可以快速分析结核分枝杆菌的耐药情况，能够得到基因型特点以便用来进行流行病学研究，有利于结核病的临床快速初筛和社区筛查工作。而且，本发明DNA提取方法为：灭活后直接震荡离心取上清液即得，无需加入试剂盒提取MTB DNA，获得的DNA模板可以直接进行PCR扩增，提取方法简单高效，进一步提高检测速度。
本发明通过生物信息学分析，在41个已发现的VNTR的上下游寻找引物，选取MIRU-20位点、MIRU-40位点、Mtub-04位点和Mtub-21位点这4个VNTR作为检测位点，通过目的基因PCR扩增和测序，以及拷贝数计算即运用EditSeq软件分析测序后的VNTR基因序列，记录重复片段出现的次数。可准确、快速得到VNTR拷贝数。从而避免复杂的计算步骤，既可以省去很多不必要的时间，也可以得到更加准确的VNTR基因拷贝数，便于结核分枝杆菌的检测及分析。建立了一种快速、准确且低成本检测结核分枝杆菌MIRU-VNTR基因多拷贝数的方法。
附图说明
图1为胶片读数法的详细的读数方法；
图2为样本进行PCR荧光反应测量DNA含量结果，图中21为沉淀加核酸提取液获得模板DNA含量结果，21-s为第一次振荡离心后的上清DNA含量结果；
图3为样本编号21-26位点Mtub-21在人结核分枝杆菌中PCR目的基因条带扩增的结果，maker左边是上清液DNA扩增结果，右边是提取的沉淀中DNA扩增结果；用来标记DNA长度的maker是D2000，长度范围在100-2000bp；N代表阴参，DNA模板是水，查看产物是否被污染；
图4为样本编号31、34、36、45、48、49、52位点MIRU-40在人结核分枝杆菌中PCR目的基因条带扩增的结果；用来标记DNA长度的maker是D500，长度范围在100-500bp，Neg代表阴参，DNA模板是水，查看产物是否被污染，Pos是阳参,其条带长度的确定参考图1；
图5为样本编号30-37位点Mtub-04在人结核分枝杆菌中PCR目的基因条带扩增的结果；用来标记DNA长度的maker是D2000，长度范围在100-2000bp，Neg代表阴参，DNA模板是水，查看产物是否被污染；
图6为样本编号21-29位点MIRU-20在人结核分枝杆菌中PCR目的基因条带扩增的结果；用来标记DNA长度的maker是D2000，长度范围在100-2000bp，N代表阴参，DNA模板是水，查看产物是否被污染；
图7为样本编号21-29位点Mtub-21在人结核分枝杆菌中PCR目的基因条带扩增的结果；用来标记DNA长度的maker是D2000，长度范围在100-2000bp，Neg代表阴参，DNA模板是水，查看产物是否被污染；
图8为由测序软件EditSeq测定样本编号49Mtub-21位点拷贝数的简单操作过程示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施实例对本发明进行解说，本实施实例在本发明方案为前提下进行操作，但本发明覆盖的权利范围不仅限于下述操作实例。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种结核分枝杆菌MIRU-VNTR基因多拷贝数快速检测分析方法：
1、菌株来源
实验所需的248株结核分枝杆菌样本均来自于安庆市疾病预防控制中心；
2、VNTR位点选择
共选择4个VNTR为点，利用数据库专业网站及软件DNAMAN软件：用于核酸序列分析；Primer Premier 5.0软件：引物设计；NCBI：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，用于核酸及蛋白序列的比对、分析及基因序列上传等，设计好的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具体引物及核心序列的重复单元大小参见表1：
表1 4个位点引物序列及长度
注:F表示上游引物；R表示下游引物。
3、结核分枝杆菌DNA模板的制备：
1)将待检测结核分枝杆菌灭活样品从-80℃冰箱取出，常温融化；
2)生物安全柜打开电源，紫外灯照射20min给操作台周围环境灭菌；
3)使用结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂盒(PCR荧光法)(艾康生物技术(杭州)有限公司)，目的：检测结核杆菌DNA是否提取出来，以及DNA的量。
4)样本处理：直接取经高压灭菌锅121℃45min高温灭活的结核分枝杆菌培养物样本200μL，其中，结核分枝杆菌的培养依照中国防痨协会制定的《结核病诊断细菌学检验规程》进行，灭活后13000转/min离心10mim后上清存储在-80℃冰箱备用，即得DNA模板，可直接用于PCR扩增；离心后沉淀中加50μL核酸提取液，振荡混匀后干浴10min然后12000转/min离心10min，取上清供PCR扩增，用于对比。
5)测量所提取DNA的量：PCR荧光法
试剂配制：每人份反应体系配制如下：TB反应液需2000rpm离心10sec
| 组分 | TB反应混合液 | Taq酶 | 总体积 |
| 体积 | 35.6μL | 0.4μL | 36μL |
加样：往上述分装有36μL反应液中加入4μL样品处理上清液，总体积40μL，同样方法准备阳性对照和阴性对照各一个，转移至PCR检测区。
PCR扩增及荧光检测：按照以下程序进行PCR扩增：荧光选择FAM荧光。
表2荧光定量PCR反应扩增体系
其结果鉴定依据：CT值无数据为阴性，CT≦38.0为阳性，CT>38.0为实验灰度区，需重做，结果CT<40为阳性，否则为阴性。结果用LightCycler软件处理，挑选出结果好的DNA样品备用。
样本第一次振荡离心后的上清和沉淀中加核酸提取液后的上清供均进行PCR荧光反应，同样的实验方法以及步骤，测定存在MTB DNA。对比结果发现第一次振荡离心获得上清液中DNA的量和沉淀中加核酸提取液后的量差不多，也呈现阳性(见图2，图中21为沉淀加核酸提取液获得模板DNA含量结果，21-s为第一次振荡离心后的上清DNA含量结果)，第一次振荡离心电泳结果上清DNA条带比沉淀DNA条带更清晰明亮(图3)，本发明样本经121℃高温灭活后，DNA进入溶液中，灭活后的样本经过13000转/min离心残留在上清中。
本发明采用直接灭菌后震荡离心的方法获得DNA模板，此方法不仅省了DNA提取的步骤，更节约试剂成本以及实验时间，可以直接取灭活上清DNA留作实验的DNA模板。
4、PCR扩增
以上述制备的待测菌株的基因组DNA为模板，采用表3中的4对引物对分别进行PCR扩增。使用PCR扩增试剂盒(TaKaRa RR001B)按照表3反应体系和条件进行扩增，温度和时间经过长期实验摸索出最佳温度以及时间，可根据不同目的条带需要进行调整。分别得到待测菌株在MIRU-20、MIRU-40、Mtub-21、Mtub-04这4个位点的PCR扩增产物。
表3 PCR反应扩增体系
| DNA模板 | 5μl |
| forward primer(引物) | 1μl |
| Reverse primer(引物) | 1μl |
| 10×Ex Taq Buffer(融化) | 5μl |
| dNTP Mixture(常温融化) | 4μl |
| TaKaRa Ex Taq | 0.25μl |
| ddH<sub>2</sub>O | 33.75μl |
| Total | 50μl |
其反应条件为98℃变性10sec，50℃退火30sec、72℃延伸1min、3步40个循环，最后72℃5min后，将PCR扩增产物拿出放置4℃冰箱保存备用。
5、产物琼脂糖凝胶电泳
1)胶体制作：根据欲分离DNA片段大小配置2％的胶，即取50ml 1×TAE，1g琼脂粉至烧瓶中，放入微波炉加热混合溶解，冷却至60℃，再加5μl 4S Red Plus(购自：生工生物工程(上海)股份有限公司，A606695-0600),轻轻晃动至颜色均匀分散。
2)根据点样数量选择11孔或25孔规格的梳子，插入要制备的模具中。一般是制作胶体规格为6×6cm的小胶或12×6cm的长胶。将温热的琼脂糖溶液从一角轻轻倒入模具，等待半小时，即可小心拔出，胶体制作完成。
3)点样：将凝胶放入水平电泳槽(HE-120)，向槽内加入电泳缓冲液1×TAE，其量刚好没过凝胶1～2mm。先用移液器吸取1μl染色剂6×Loading Buffer(Takara9156)，分开点在胶带纸上，再按照排样顺序分别吸取PCR扩增产物5μl加入滴有1μl Loading Buffer的点滴中，用枪来回慢慢抽吸10次，充分混合后，吸取5μl加入胶孔中点样，其中使用的DNAMarker是D2000(Tiangen)或D500(Takara)。图4和图7为4个位点部分样品扩增结果，均采用第一次振荡离心后的上清DNA扩增。
4)电泳：设置电泳仪(DYY-7C)电压以及时间为100V,60min胶图最清晰明亮；
5)照相:电泳结束后，打开电脑以及凝胶成像仪(protein simple FlourChemFC3)，选择2，UV模式，将胶块放入仪器中间，调整曝光率等使图片清晰，结果保存图片，最后将有实验结果的样品放入收集袋集中送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
6、VNTR重复次数的确定：
打开EditSeq软件，将VNTR目的基因测序结果输入，点击Ctrl+F，将对应VNTR重复序列输入对话框内，再点击Find Next，直至找出所有VNTR重复序列，直接获得VNTR重复次数。
由测序软件EditSeq测定拷贝数的简单操作过程示意图，具体如图8，可以直接计算出来有几个重复单元，就对应几个拷贝数。样本编号为49-52测序序列，其DNA序列如序列表如SEQ ID No.13、如SEQ ID No.14、如SEQ ID No.15、如SEQ ID No.16所示；本发明4个位点基因部分样本重复次数即拷贝数见下表：
表4样本中4个位点拷贝数汇总表
| ID | Mtub21拷贝数 | Mtub04拷贝数 | MIRU40拷贝数 | MIRU20拷贝数 |
| 24 | 0 | - | - | 2 |
| 35 | 4 | 4 | 3 | 2 |
| 36 | 3 | 4 | 3 | 2 |
| 37 | - | 4 | 3 | - |
| 49 | 2 | - | - | - |
| 50 | - | 5 | - | 2 |
| 51 | - | 1 | - | - |
| 52 | 2 | 5 | 3 | - |
与现有技术比较：
第一种，胶片读数法，从菌种培养到提取结核分枝杆菌DNA后，同样的方法经过PCR扩增后，得出来的凝胶电泳图片由于受到实验因素，人为操作，试剂，实验环境等因素，造成各种实验误差，实验得出来的胶片质量不一致，易出现条带模糊，或者DNAmaker点的不标准，无法衡量条带准确的长度，也就很难通过图1中的表格识别相对应的基因拷贝数。
而第二种方法，虽然可以定量分析基因序列拷贝数，但每个基因侧翼序列无法从各个数据库引用到具有权威性的序列长度，报道过结核杆菌侧翼序列的文献，其长度并不一致，可信度不高。
SEQUENCE LISTING
<110> 皖南医学院
<120>一种结核分枝杆菌MIRU-VNTR基因多拷贝数快速检测分析方法
<130> 1
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> MIRU-20 上游引物
<400> 1
5'-tcggagagat gcccttcgag ttag-3' 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> miru-20 下游引物
<400> 2
5'-ggagaccgcg accaggtact tgta-3' 24
<210> 3
<211> 77
<212> DNA
<213> MIRU-20 重复单元序列
<400> 3
gagcggcgcc aatgagccgc gccggcgacg atgcagtggg ggtaccgccc gcttgcgggg 60
gacgaagcga tgacgag 77
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> MIRU-40 上游引物
<400> 4
5'-cccgccttcg aaacgtcgct-3' 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> MIRU-40 下游引物
<400> 5
5'-tggacatagg cgaccaggcg aata-3' 24
<210> 6
<211> 54
<212> DNA
<213> MIRU-40 重复单元序列
<400> 6
tgcagagcga agcgatgagg aggagcaggg caatgcggcc tagcccggcg acga 54
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Mtub-04 上游引物
<400> 7
5'-gtccaggttg caagagatgg-3' 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Mtub-04 下游引物
<400> 8
5'-ggcatcctca acaacggtag-3' 20
<210> 9
<211> 51
<212> DNA
<213> Mtub-04 重复单元序列
<400> 9
cgaacggcgc agttggcacc agccggtgag cgagcgcgcg tagcggggga g 51
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Mtub-21 上游引物
<400> 10
5'-agatcccagt tgtcgtcgtc-3' 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Mtub-21 下游引物
<400> 11
5'-caacatcgcc tggttctgta-3' 20
<210> 12
<211> 57
<212> DNA
<213> Mtub-21 重复单元序列
<400> 12
ggcgcgcatc gtcaccgggc gtcgtctgat tgcccggttc ctcctcgcgc cgcaaac 57
<210> 13
<211> 275
<212> DNA
<213> 样本49对应位点Mtub-21测序结果
<400> 13
cgaatgtcgt cgtcggtgcg ggccaccagc ccaccctagt ctgattgccc ggttcctcct 60
cgcgccgcaa acggcgcgca tcgtcaccgg gcgtcgtctg attgcccggt tcctcctcgc 120
gccgcaaacg gcgcgcatcg tcaccgggcg tcgtctgatt gcccggttcc tcctcgcgcc 180
gcaaaccaag ccggctggtg ctgtgctatt ggcgtcggaa cagacggccg tgctggctac 240
agaaccaggc gatgttggtc atagctgttt cctga 275
<210> 14
<211> 388
<212> DNA
<213> 样本50对应位点MIRU-20测序结果
<400> 14
ccgtgaagga tcggtcggtt cgtgtagaga atatctatag tgacttttgc gggactgtgg 60
gccgggtcta caccaggggc tcgaagccgc attggccgaa gcaagcggag gtgcaagtgc 120
cgacatgagc ggcgccaatg agccgcgccg gcgacgatgc agtgggggta ccgcccgctt 180
gcgggggacg aagcgatgac gaggagcggc gccaatgagc cgcgccggcg acgatgcagt 240
gggggtaccg cccgcttgcg ggggacgaag cgatgacgag gagcggcgcc aatgagcacc 300
gacatacccg ccaccgttag tgcggagacc gtgacgtcct ggtcggatga cgtcgatgta 360
acggtgattg gtcatagctg tttcctga 388
<210> 15
<211> 230
<212> DNA
<213> 样本51对应位点Mtub-04测序结果
<400> 15
gggggtcgaa atggctgagg agttggcggt gttgcgtgcc aaccagcgcc gcgaggtcgc 60
ggtggtgccg aagagcaccg ccctggtcgt ctggaaaccg cgccggtgag cgagcgcgcg 120
tagcggggga gcgaacggcg cagttggcac cagccggtga gcgagcgcgc gtagcggggg 180
agttagggtc cgctaccgtt gttgaggatg ccgtcatagc tgtttcctga 230
<210> 16
<211> 321
<212> DNA
<213> 样本52对应位点MIRU-40测序结果
<400> 16
ggcggaccca aggcgcgcca tcgtcaccct ggcgccgggc agcaaggccg atcgacctgt 60
tcggggcacc ggcctagccc ggcgacgatg cagagcgaag cgatgaggag gagcagggca 120
atgcggccta gcccggcgac gatgcagagc gaagcgatga ggaggagcag ggcaatgcgg 180
cctagcccgg cgacgatgca gagcgaagcg atgaggagga gcagggcaat gcggcctagc 240
ccggcgacga gagcgtgaga gaaagacctg attagacatg gcaattcgca agtacaagcc 300
cacgtcatag ctgtttcctg a 321
Claims (10)
1.一种结核分枝杆菌MIRU-VNTR基因多拷贝数快速检测分析方法，其特征在于，具体方法为：
1)提取DNA模板；
2)PCR扩增；
3)PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测，测序；
4)使用EditSeq软件，输入测序结果，利用查找功能查找测序结果中所有VNTR重复序列，获得VNTR重复次数。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中提取DNA模板具体为：
将待检测结核分枝杆菌灭活样品从-80℃冰箱取出，常温融化，经高压灭菌锅121℃45min高温灭活，13000转/min离心10mim后的上清，即得DNA模板。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中提取DNA模板具体为：将待检测结核分枝杆菌灭活样品从-80℃冰箱取出，常温融化，经高压灭菌锅121℃45min高温灭活，13000转/min离心10mim后，沉淀使用提取试剂盒，得到DNA模板。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述PCR扩增，分别扩增MIRU-20位点、MIRU-40位点、Mtub-04位点和Mtub-21位点，扩增上述位点所用引物分别为：
MIRU-20 F:5’-TCGGAGAGATGCCCTTCGAGTTAG-3’；如SEQ ID No.1所示；
MIRU-20 R:5’-GGAGACCGCGACCAGGTACTTGTA-3’；如SEQ ID No.2所示；
MIRU-40 F:5’-CCCGCCTTCGAAACGTCGCT-3’；如SEQ ID No.4所示；
MIRU-40 R:5’-TGGACATAGGCGACCAGGCGAATA-3’；如SEQ ID No.5所示；
Mtub-04 F:5’-GTCCAGGTTGCAAGAGATGG-3’；如SEQ ID No.7所示；
Mtub-04 R:5’-GGCATCCTCAACAACGGTAG-3’；如SEQ ID No.8所示；
Mtub-21 F:5’-AGATCCCAGTTGTCGTCGTC-3’；如SEQ ID No.10所示；
Mtub-21 R:5’-CAACATCGCCTGGTTCTGTA-3’，如SEQ ID No.11所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述PCR扩增，条件为：98℃变性10sec、50℃退火30sec、72℃延伸1min，这3个步骤40个循环，最后72℃5min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)具体为：打开EditSeq软件，将VNTR目的基因测序结果输入，点击Ctrl+F，将对应VNTR重复序列输入对话框内，再点击FindNext，直至找出所有VNTR重复序列，直接获得VNTR重复次数，即获得基因拷贝数。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，MIRU-20位点的重复序列长度的大小为77bp，重复单元序列如SEQ ID No.3所示。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，MIRU-40位点的重复序列长度的大小为54bp；重复单元序列如SEQ ID No.6所示。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，Mtub-04位点的重复序列长度的大小为51bp；重复单元序列如SEQ ID No.9所示。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，Mtub-21位点的重复序列长度的大小为57bp，重复单元序列如SEQ ID No.12所示。
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