CN102094077A - 结核分枝杆菌临床分离菌株基因型快速检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属医学检验领域，提供了一种结核分枝杆菌临床分离菌株基因型快速检测试剂盒。该试剂盒含有针对IS6110插入序列设计的检测探针。本发明所涉及的结核杆菌分型的方法，提取样本菌株的DNA，以所述检测探针为引物进行PCR扩增，所的产物与结核分枝杆菌DNA扩增产物一致的，样品中即含有结核分枝杆菌。该方法对目前我国流行的结核分枝杆菌临床分离菌株具有较高的分辨率，同时每个菌株的基因型结果以数字化形式输出，便于不同实验室之间进行比较。另外该方法无需大量设备，操作比较简单，价格也相对低廉。本发明将为探索和研究我国结核病的流行和传播规律提供有力的工具。
Description
技术领域
本发明属医学检验领域，涉及结核分枝杆菌鉴定的方法，具体涉及一种结核分枝杆菌临床分离菌株基因型快速检测试剂盒。
背景技术
结核病是一种长期威胁人类健康的感染性疾病，其病原体是结核分枝杆菌。据世界卫生组织统计，全球三分之一人口感染结核分枝分枝杆菌，其中每年900万新发结核病人，160万人死于结核。中国属于全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数居全球第二位，全国结核杆菌感染人数高达5亿，现有结核病人450万；每年新发病例145万；每年结核病死亡人数13万，并且是全球耐药结核病患者人数最多的国家，结核病控制任务相当艰巨。
通常结核分枝杆菌通过呼吸道感染人体，并在人体内潜伏，有90％的感染者终身不发病，仅有5％在感染后两年内发病(近期外源性感染引起的发病)，另有5％可在其一生中的某个时期发病(内源性复燃引起的发病)。由于很难判断个体发病是由于近期外源性感染还是内源性复燃引起，因此结核病的流行规律至今尚不明确。
结核分枝杆菌菌株基因型分型方法是利用结核分枝杆菌的自身的分子标识快速鉴定菌株基因型，可用于研究结核病爆发流行、传染源的寻找和追踪、鉴别内源性复发和近期外源性感染、耐药菌株的传播和实验室污染等，对于了解结核病的传播模式具有重要的意义。
长期以来，科研工作者一直致力于寻找一种快速简便又准确的结核分枝杆菌临床分离菌株基因型分型方法。从1993年开始，通过标记结核分枝杆菌基因组中IS6110插入序列来鉴定结核分枝杆菌菌株基因型的限制性片段长度多态性分析方法被用于结核分枝杆菌基因型的鉴定，该方法具有良好的分辨率，但是操作复杂，并且在不同的实验室之间不容易进行比较，另外该方法对于低拷贝数的临床分离菌株分辨率比较低[见参考文献1]。Spoligotyping是另外一种成熟的结核分枝杆菌基因型分型技术，该方法是利用了在结核分枝杆菌基因组直接重复区域(direct repeat region)间隔序列多态性对不同菌株进行分型，该方法操作比较简便，但对于我国流行的大量北京基因型菌株分辨率却不尽如人意[见参考文献2]。
1998年，Richard Frothingham和Winifred A.Meeker-O’Connel两位美国科学家首次系统地研究了结核分枝杆菌基因组中存在的可变数目串联重复序列(variable-number tandem repeats，VNTR)，发现在不同的结核分枝杆菌菌株中，特定位点的PCR扩增产物所包含的串联重复序列数目不同，因此能够作为一种可靠的分子标识，用于区分不同的临床菌株，与IS6110-RFLP相比省时省力，并方便不同的实验室进行比较[见参考文献3]。随着对结核分枝杆菌基因组的认识逐渐深入，人们逐渐发现了不同的VNTR位点及组合：Philip Supply等鉴定出了结核分枝杆菌基因组中41个串联重复区域，并将其命名为结核分枝杆菌散在重复单元(MIRU)，其中12个具有较高分辨率的位点组合称为MIRU-12分型方法，该方法得到了美国疾病预防控制中心(CDC)的推广[见参考文献4]。然而，尽管MIRU-12在美国具有比较好的分辨率，但对我国流行的结核分枝杆菌菌株分辨率却远远不及IS6110-RFLP。建立适合我国流行菌株的结核分枝杆菌基因型分型方法，将对探索和研究我国结核病的流行和传播规律提供有力工具，具有重要的意义和价值。
与本发明相关的参考文献如下：
1.Cowan，L.S.，et al.，Variable-number tandem repeat typing of Mycobacteriumtuberculosis isolates with low copy numbers of IS6110by using mycobacterialinterspersed repetitive units.J Clin Microbiol，2002.40(5)：p.1592-602.
2.Skuce，R.A.，et al.，Discrimination of Mycobacterium tuberculosis complexbacteria using novel VNTR-PCR targets.Microbiology，2002.148(Pt 2)：p.519-28.
3.Frothingham，R.and W.A.Meeker-O’Connell，Genetic diversity in theMycobacterium tuberculosis complex based on variable numbers of tandem DNA repeats.Microbiology，1998.144(Pt 5)：p.1189-96.
4.Supply，P.，et al.，Variable human minisatellite-like regions in theMycobacterium tuberculosis genome.Mol Microbiol，2000.36(3)：p.762-71.
5.Zhang，L.，et al.，Highly polymorphic variable-number tandem repeats locifor differentiating Beijing genotype strains of Mycobacterium tuberculosis inShanghai，China.FEMS Microbiol Lett，2008.282(1)：p.22-31.
6.Smittipat，N.and P.Palittapongarnpim，Identification of possible loci ofvariable number of tandem repeats in Mycobacterium tuberculosis.Tuber Lung Dis，2000.80(2)：p.69-74.
7.Smittipat，N.，et al.，Polymorphism of variable-number tandem repeats atmultiple loci in Mycobacterium tuberculosis.J Clin Microbiol，2005.43(10)：p.5034-43.
8.Yokoyama，E.，et al.，Improved differentiation of Mycobacteriumtuberculosis strains，including many Beijing genotype strains，using a newcombination of variable number of tandem repeats loci.Infect Genet Evol，2007.7(4)：p.499-508.
9.Surikova，O.V.，et al.，[见参考文献Differentiation of the Mycobacteriumtuberculosis W-Beijing family strains from the Russian Federation by theVNTR-typing].Mol Gen Mikrobiol Virusol，2005(3)：p.22-9.
10.Kam，K.M.，et al.，Optimization of variable number tandem repeat typingset for differentiating Mycobacterium tuberculosis strains in the Beijing family.FEMS Microbiol Lett，2006.256(2)：p.258-65.
11.Iwamoto，T.，et al.，Hypervariable loci that enhance the discriminatoryability of newly proposed 15-loci and 24-loci variable-number tandem repeat typingmethod on Mycobacterium tuberculosis strains predominated by the Beijing family.FEMS Microbiol Lett，2007.270(1)：p.67-74.
12.Mokrousov，I.，et al.，Analysis of the allelic diversity of themycobacterial interspersed repetitive units in Mycobacterium tuberculosis strainsof the Beijing family：practical implications and evolutionary considerations.JClin Microbiol，2004.42(6)：p.2438-44.
13.Kremer，K.，et al.，Use of variable-number tandem-repeat typing todifferentiate Mycobacterium tuberculosis Beijing family isolates from Hong Kong andcomparison with IS6110 restriction fragment length polymorphism typing andspoligotyping.J Clin Microbiol，2005.43(1)：p.314-20.
14.Le Fleche，P.，et al.，High resolution，on-line identification ofstrains from the Mycobacterium tuberculosis complex based on tandem repeat typing.BMC Microbiol，2002.2：p.37.
15.Nikolayevskyy，V.，et al.，Differentiation of tuberculosis strains ina population with mainly Beijing-family strains.Emerg Infect Dis，2006.12(9)：p.1406-13.
16.Steenken，W.J.，and L.U.Gardner.History of H37 strain of tuberclebacillus.Am.Rev.Tuberc.1946.54：62-66.
17.Parra，C.A.，et al.，Isolation，characterization，and molecular cloningof a specific Mycobacterium tuberculosis antigen gene：identification of aspecies-specific sequence.Infect Immun，1991.59(10)：p.3411-7.
发明内容
本发明的目的是建立适合我国流行菌株的结核分枝杆菌临床分离菌株基因型快速检测试剂盒以及结核分枝杆菌基因型分型方法。
本发明的另一个目的是提供上述试剂盒的应用。
本发明提供了一种结核分枝杆菌检测试剂盒，该试剂盒含有针对IS6110插入序列设计的检测探针。
上述试剂盒可以含有序列如SEQ ID NO 33-36所示的探针。
该试剂盒还包括序列如SEQ ID NO 37-39所示的探针。
Mtb 1 atagggaatgctcggcaac SEQ ID NO 33
Mtb 2 caacatcgacgcagtaccc SEQ ID NO 34
IS6110-P1 tcaggtcgagtacgccttct SEQ ID NO 35
IS6110-P2 ggtcgcagagatccgcggtc SEQ ID NO 36
RD105_P1 ggagtcgttgagggtgttcatcagctcagtc SEQ ID NO 37
RD105_P2 cgccaaggccgcatagtcacggtcg SEQ ID NO 38
RD105_P3 ggttgcccactggtcgatatggtggactt SEQ ID NO 39
该试剂盒还包括序列如SEQ ID NO 1-14所示的探针。
该试剂盒还包括序列如SEQ ID NO 15-32所示的探针。
探针序列SEQ ID NO 1-32如下：
上述试剂盒可以用于检测结核分枝杆菌。较好地，可以用于检测北京型结核分枝杆菌。还可以用于结核分枝杆菌的分型。
所述的试剂盒的应用方法是：提取样本菌株的DNA，以所述的针对IS6110插入序列设计的检测探针为引物进行PCR扩增，所的产物与结核分枝杆菌DNA扩增产物一致的，样品中即含有结核分枝杆菌。
本发明的试剂盒还可以包括缓冲液、标准样品和使用说明等。
具体而言，本发明筛选了对我国临床分离菌株具有较高分辨率的VNTR序列，针对IS6110插入序列，选取片段大小适中的位点，合成这些位点的特异性引物，通过琼脂糖凝胶电泳判断PCR产物片段的长度，进而计算该位点重复序列的数值，每个菌株的每个位点以一个数字化的结果表示，通过计算H-G指数计算其分辨率，然后将这些VNTR位点组合的分辨率与金标准IS6110-RFLP进行比较，本发明中，选用上海、山东和四川的临床分离菌株进行了验证。结果显示，7位点VNTR组合的分辨率达0.9953，略低于IS6110-RFLP(0.9980)，而16位点VNTR组合的分辨率则高于IS6110-RFLP(0.9983)[见参考文献5]。
制备试剂盒的具体方法包括：
1)位点筛选：选择并验证对我国的结核分枝杆菌临床分离菌株具有较高分辨率的7位点和16位点筛选方法；
2)针对各位点提供具有较好扩增效果的PCR引物；
3)对于每个位点扩增的PCR反应条件进行了优化，提供方便高效的扩增条件；
4)统一PCR产物检测方法，提供进行标准的琼脂糖凝胶电泳的方法和条件；
5)统一菌株基因型的判断标准，提供不同位点不同重复数大小的标准电泳图，准确地进行对照、判断和读数；
6)提供快速判定菌株是否为北京基因型的方法；
7)提供了快速鉴定菌株是否为结核分枝杆菌的方法。
也可以通过人工合成的方法制备本发明的试剂盒中所含有引物。
本发明实现对VNTR3820位点的扩增与鉴定。VNTR3820位点最早于2000年通过同源性分析的方法发现[见参考文献6]，是位于结核分枝杆菌标准菌株H37Rv基因组中3820389位置的一段间隔重复序列，其重复单元大小为57个碱基。该位点在不同国家和地区具有不同的分辨率，在泰国的报道为0.642[见参考文献7]；在日本的研究为0.817[见参考文献8]，在上海市崇明岛2003到2005年收集的所有菌株的研究中，分辨率高达0.8674[见参考文献5]，是目前使用的位点中分辨率最高的。
本发明实现了对Qub11b位点的扩增与鉴定。Qub11b位点是通过生物信息学的方法发现的，于2002年首次报道[见参考文献2]，是位于结核分枝杆菌H37Rv基因组中2163740至2164086位置的一段间隔重复序列，其重复单元大小为69个碱基，该位点的分辨率在不同国家的临床分离菌株中有很大差别，其中在俄罗斯的分辨率为0.21[见参考文献9]，在香港的研究中分辨率为0.669[见参考文献10]，而在日本的分辨率为0.7716[见参考文献11]，对上海市崇明岛的菌株研究中，其分辨率为0.6888[见参考文献5]。
本发明实现了对Qub26位点的扩增与鉴定。Qub26位点与qub11b位点同时被报道[见参考文献2]，是位于结核分枝杆菌H37Rv基因组中4052968至4053547位置的一段间隔重复序列，其重复单元大小为111个碱基，该位点的分辨率在不同国家的临床分离菌株中有很大差别，其中在俄罗斯的分辨率为0.78[见参考文献9](，在香港的研究中分辨率为0.3144，而在日本的分辨率为0.215[见参考文献11]，我们对上海市崇明岛的菌株研究中，其分辨率为0.6295[见参考文献5]。
本发明实现了对MIRU26位点的扩增与鉴定。MIRU26位点是结核分枝杆菌41个微卫星序列中的一个，同时也是MIRU-12方法中分辨率较高的一个位点，由supply在2000年报道[见参考文献4]。MIRU26位点是位于结核分枝杆菌H37Rv基因组中2996000位置的一段间隔重复序列，其重复单元大小为48个碱基，该位点的分辨率在不同国家的临床分离菌株中有很大差别，其中在南非的分辨率为0.25[见参考文献12]，俄罗斯的分辨率为0.49[见参考文献12]，而在日本的分辨率为0.3830[见参考文献11，12]，我们对上海市崇明岛的菌株研究中，其分辨率为0.6139[见参考文献5]。
本发明实现了对Qub18位点的扩增与鉴定。Qub18位点与qub11b位点、qub26位点同时被报道[见参考文献2]，是位于结核分枝杆菌H37Rv基因组中1982885至1983324位置的一段间隔重复序列，其重复单元大小为78个碱基，该位点的分辨率在不同地区的研究中有很大差别，其中在俄罗斯的分辨率为0.74[见参考文献9]，在香港的研究中分辨率为0.74[见参考文献13]，而在日本的分辨率为0.629[见参考文献8]，我们对上海市崇明岛的菌株研究中，其分辨率为0.6072[见参考文献5]。
本发明实现了对Mtub21位点的扩增与鉴定。Mtub21位点是2002年被首次报道的[见参考文献14]，是位于结核分枝杆菌H37Rv基因组中1955580位置的一段间隔重复序列，其重复单元大小为57个碱基，该位点的分辨率在不同国家的临床分离菌株中有很大差别，其中在俄罗斯的分辨率为0.105[见参考文献15]，在泰国的研究中分辨率为0.694[见参考文献7]，而在日本的分辨率为0.537[见参考文献8]，我们对上海市崇明岛的菌株研究中，其分辨率为0.5444[见参考文献5]。
本发明实现了对Qub11a位点的扩增与鉴定。Qub11a位点于2002年首次报道[见参考文献2]，是位于结核分枝杆菌H37Rv基因组中2163333至2163531位置的一段间隔重复序列，其重复单元大小为69个碱基，该位点的分辨率在不同国家的临床分离菌株中有很大差别，其中在俄罗斯的分辨率为0.177[见参考文献15]，在香港的研究中分辨率为0.5136[见参考文献10]，而在日本的分辨率为0.6854[见参考文献11]，我们对上海市崇明岛的菌株研究中，其分辨率为0.5383[见参考文献5]。
作为本发明的一个优选方案，本发明以结核分枝杆菌H37Rv菌株为标准菌株，在操作过程中进行质量控制。H37菌株是1905年分离出来的一个临床菌株，由于其在豚鼠模型中的毒力作用而引起人们的重视，1934年H37菌株分离出有毒株的Rv和无毒株Ra，现保存于美国Trudeau研究所和美国标准菌株收藏所(American Type Culture Collection(ATCC))[见参考文献16]。目前H37Rv和H37Ra菌株被全球实验室广泛用做标准菌株，也是进行分枝杆菌培养、药物敏感性检测等操作的对照菌株；另外H37Rv的全基因序列测定已于1998年完成。因此本发明将该菌株用做标准菌株，进行质量控制。
作为本发明方法的一个优选实施方案，试剂盒中使用检测IS6110序列和Mtp40序列的两对引物进行扩增，判断待测菌株是否属于结核分枝杆菌。Mtp40蛋白是1991年报道的结核分枝杆菌特异蛋白[见参考文献16]，而IS6110序列则是结核分枝杆菌复合群所特有的插入序列，利用这两对引物不但能够区别非结核分枝杆菌和结核分枝杆菌复合群，还能够鉴定出结核分枝杆菌和符合群中的其他菌种(主要是牛分枝杆菌)。
本发明方法的另外一个优选实施方案是使用各位点特异的引物，对相应的位点进行多聚酶链反应(PCR)。同时尽量统一不同位点的扩增条件，简化操作。
作为本发明的一个优选实施方案，对于PCR产物的鉴定采用琼脂糖凝胶的方法。琼脂糖凝胶电泳在分子生物学实验室应用非常广泛，是一种简便快速的PCR产物测定方法。为了克服该方法准确度不够的缺点，我们在试剂盒中提供了所有位点不同重复数目PCR产物与标准DNA Marker相对位置的标准化电泳图，以保证不同实验室的操作者都能够对电泳结果进行正确读数。
本发明针对我国临床分离菌株具有较高分辨率的VNTR序列，设计了一种结核分枝杆菌临床分离菌株基因型快速检测试剂盒。本发明所涉及的结核杆菌分型的方法，是采用对我国临床分离菌株具有较高分辨率的VNTR位点，利用PCR方法扩增目的片段，通过读取目的片段的重复单元数目区分不同的临床分离菌株基因型。该方法对目前我国流行的结核分枝杆菌临床分离菌株具有较高的分辨率，同时每个菌株的基因型结果以数字化形式输出，便于不同实验室之间进行比较。另外该方法无需大量设备，操作比较简单，价格也相对低廉。
本发明可通过基因型分型来掌握结核病的传播规律，寻找导致结核病流行的危险因素，并对结核病控制措施进行评估，将对探索和研究我国结核病的流行和传播规律提供有力工具。
附图说明
图1：结核分枝杆菌鉴定结果示意图。
图2：北京基因型菌株鉴定结果示意图。
具体实施方式
实施例1.结核分枝杆菌的鉴定
1.模板DNA制备(煮沸法)
(1)从固体培养基上刮取1-2接种环结核分枝杆菌H37Rv菌株，，重悬于100uL TE中，80℃灭活30分钟。
(2)灭活后的菌株拿出P3实验室进行如下操作：
100℃煮沸1分钟，立即置冰上2分钟，12000r/min离心10分钟后，取上清置于另一无菌EP管中，-20℃保存。该上清液即用于PCR扩增的模板DNA。
2.鉴定临床分离菌株是否为结核分枝杆菌
根据序列分析，我们设计了2对引物，用以鉴别临床分离菌株是否分枝杆菌，这两对引物是：Mtb 1/Mtb 2和IS6110-P1/IS6110-P2，将这两对引物放在同一个反应体系中，当待鉴定菌株为结核分枝杆菌时，预计将扩增出850bp和361bp两个条带。
(1)PCR扩增：每个PCR管内反应体系的体积为20ul，内含1ulDNA模板和19ul结核分枝杆菌鉴定PCR反应混和液(含结核分枝杆菌鉴定的特异性引物(Mtb 1/Mtb 2、IS6110-P1/IS6110-P2、dNTP、Taq酶、镁离子及相应的缓冲液系统)。
(2)PCR反应按以下条件对靶标序列进行扩增：
94℃ 5分钟
72℃ 7分钟
(3)扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测
制备1％琼脂糖凝胶电泳(将1克琼脂糖加入的100ml电泳缓冲液中(TAE)，取5ul扩增产物加到上样孔中，150V电泳45分钟；
结果：电泳后在琼脂糖电泳地胶上出现了850和361bp两条带，与人型结核分枝杆菌的预期带型一致，说明模板DNA是人型结核分枝杆菌。(见图1)
实施例2结核分枝杆菌亚株的鉴定
结核分枝杆菌的北京型的鉴定是通过三条引物的PCR反应进行的(RD105-P1/RD195-P2/RD105-P3)，即在同一个反应体系中加入3条不同的引物，根据扩增产物的大小判断所检测菌株的基因型。对于北京型的结核分枝杆菌，其扩增产物为781bp，如果扩增出1495bp的产物，则说明该结核分枝杆菌为非北京型。
(1)PCR扩增：每个PCR反应体系的体积为20ul：内含1ulDNA模板和19ul结核杆菌北京株鉴定PCR反应混和液(含鉴定结核杆菌北京株的特异性引物(RD105-P1/RD195-P2/RD105-P3)、dNTP、Taq酶、镁离子及相应的缓冲液系统)。
(2)PCR反应按以下条件对靶序列进行扩增：
94℃ 5分钟
72℃ 7分钟
(3)扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测
制备1％琼脂糖凝胶电泳，(将1克琼脂糖加入的100ml电泳缓冲液中(TAE)，取5ul扩增产物加到上样孔中)，150V电泳45分钟；
结果：扩增产物为1495bp，与结核分枝杆菌分型中的非北京株的预期结果一致，说明该菌株为非北京基因型菌株。(见图2)
实施例3进行7位点VNTR分型
(1)PCR扩增：每个PCR反应体系的体积为20ul：内含1ulDNA模板和19ul结核杆菌北京株鉴定PCR反应混和液(含鉴定结核杆菌各位点的特异性引物(VNTR3820、Qub11b、Qub18、Qub11a、MIRU26、Qub26和Mtub21)、dNTP、Taq酶、镁离子及相应的缓冲液系统)。(2)PCR反应按以下条件对相应的靶序列进行扩增：
a.VNTR3820：94℃ 5分钟
72℃ 7分钟
b.Qub11b，Qub11a，Qub18，Mtub21，Miru26，Qub26
94℃ 5分钟
72℃ 7分钟
(3)扩增产物的琼脂糖凝胶电泳：
用1％琼脂糖凝胶电泳，电压150V，电泳时间90-120分钟。
根据各临床菌株扩增条带与Marker相对位置，利用凝胶分析软件读出每个条带的大小。利用各VNTR位点重复单元读数表及VNTR各位点重复单元电泳图，计算出各菌株在该位点的重复单元数。
菌株H37Rv的检测结果如下：
是否结核分枝杆菌：是
是否北京基因型菌株：否
7位点VNTR读数：
VNTR3820：3
Qub11b：5
Qub18：5
Qub11a：2
MIRU26：3
Qub26：5
Mtub21：2
因此该菌株的输出结果为：3552352
序列表
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>artificial
<400>1
tgcgcggtga atgagacg 18
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>artificial
<400>2
accttcatcc ttggcgac 18
<210>3
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<212>DNA
<213>artificial
<400>3
cgtaaggggg atgcgggaaa tagg 24
<210>4
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<212>DNA
<213>artificial
<400>4
cgaagtgaat ggtggcat 18
<210>5
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<213>artificial
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atcgtcagct gcggaatagt 20
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<400>6
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cggtcaagtt cagcaccttc tacatc 26
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gcgtccgtac ttccggttca g 21
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cgggtccagt ccaagtacct caat 24
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gatcctcctg attgccctga ccta 24
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atagggaatg ctcggcaac 19
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Claims (9)
1.一种结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有针对IS6110插入序列设计的检测探针。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测探针由序列如SEQID NO 33、SEQ ID NO 34、SEQ ID NO 35和SEQ ID NO 36所示的四种探针组成。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括序列如SEQ IDNO 37、SEQ ID NO 38和SEQ ID NO 39所示的三种探针。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括序列如SEQ IDNO 1-14所示的探针。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括序列如SEQ IDNO 15-32所示的探针。
6.权利要求1所述的试剂盒的应用，其特征在于，将其用于检测结核分枝杆菌。
7.权利要求3所述的试剂盒的应用，其特征在于，将其用于检测北京型结核分枝杆菌。
8.权利要求5或者4所述的试剂盒的应用，其特征在于，将其用于结核分枝杆菌的分型。
9.权利要求1所述的试剂盒的应用方法，其特征在于，提取样本菌株的DNA，以所述的针对IS6110插入序列设计的检测探针为引物，进行PCR扩增，所得产物与结核分枝杆菌DNA扩增产物一致的，样品中即含有结核分枝杆菌。
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