KR20130125586A - Ｖｎｔｒ에 의한 검체의 형질 분류를 위한 키트 및 이를 이용한 ｖｎｔｒ에 의한 검체의 형질 분류 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 VNTR에 의한 검체의 형질 분류를 위한 키트 및 이를 이용한 VNTR에 의한 검체의 형질 분류 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 우리나라 결핵 균주를 가장 잘 분류해 줄 수 있는 12개의 VNTR 좌위(loci) 조합에 대한 프라이머를 포함하는 VNTR에 의한 검체의 형질 분류를 위한 키트 및 이를 이용한 VNTR에 의한 검체의 형질 분류 방법에 관한 것이다.

Description

ＶＮＴＲ에 의한 검체의 형질 분류를 위한 키트 및 이를 이용한 ＶＮＴＲ에 의한 검체의 형질 분류 방법 {VNTR genotyping kit and VNTR genotyping method using the same}
본 발명은 VNTR에 의한 검체의 형질 분류를 위한 키트 및 이를 이용한 VNTR에 의한 검체의 형질 분류 방법에 관한 것이다.
결핵은 결핵환자가 기침할 때 발생 되는 비말 핵에 있는 결핵균의 감염으로 시작되는 전염병이다. 우리나라는 OECD 국가 중 가장 결핵이 많은 나라이며, 2007년도 인구 10만 명당 126명이 결핵환자여서 이웃 나라 일본보다 약 5배의 결핵환자를 가지고 있다. 우리 나라 결핵은 2000년도 이후 좀처럼 줄어드는 속도가 둔화되지 않고 있다.
결핵의 진단은 문진, 임상 증상, X선 검사, 투베르쿨린 반응 검사, 혈액검사 및 세균검사 등으로부터 종합적으로 판단하고 행해지고 있다. 종래는, 환자의 객담 시료 중의 결핵균을 염색하고 현미경으로 관찰한 도말 염색 검사법과 시험관 가운데에서 결핵균을 증식시키는 배양 검사법이 실시되어 왔다. 그러나 도말 염색 검사법으로는 시료 중에 결핵균의 수가 적을 경우 검출할 수 없다. 또한, 배양 검사법으로는 결핵균의 발육이 느리기 때문에 약 8주간 정도의 기간이 필요한 단점등이 있다.
최근에는 유전자를 표적으로 하는 빠르면서도 보다 간편한 방법들이 점차 많이 사용되고, 새롭게 개발되고 있다.
이러한 미생물을 감별하고 분류하기 위한 유전자 분석에는 여러 가지 방법이 있다. 그중, 균종 감별의 근거를 제공할 수 있는 마이코박테리아의 계통분석은 16S rRNA 또는 그 염기서열의 비교를 통하여 이루어졌다. 이는 16S rRNA 유전자가 종간에 매우 보존적이면서도 다양성을 가지고 있다는 사실에 근거한다[Stahl, D. A., 및 J. W. Urbance. The division between fast and slow-growing species corresponds to natural relaionships among the mycobacteria. J. Bacteriol. 172: 116-124(1990); Rogall, T., J. Wolters, T. Flohr 및 E. C. Bottger. Towards a phylogeny and definition of species at the molecular level within the genus Mycobacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 40: 323-30(1990b); Rogall T., T. Flohr, 및 E. C. Bottger. Differentiation of Mycobacterium species by direct sequencing of amplified DNA. J. Gen. Microbiol. 136(Pt 9): 1915-1920(1990a)]. 그러나 16S rRNA 유전자는 일부 종간의 높은 염기서열 유사성을 가지고 있기 때문에 균종 감별에 어느 정도의 한계점을 가지고 있다(Fox, G. E., J. D. Wisotzkey. 및 P. J. Jurtshumk. How close is close: 16S rRNA sequence identity may not be sufficient to guarantee species identity. Int. J. Syst. Bacteriol. 42: 166-170(1992)).
1990년대에 급속도로 분자생물학이 발달함으로써 결핵균의 특정 DNA 부분의 다양성을 가지고 균주를 분류할 수 있는 기술이 개발되었다. IS6110은 그 중에서 대표적으로 결핵 균주를 잘 분류할 수 있는 DNA 부분이며, 결핵균에 특별하게 존재하는 삽입배열(Insertion Sequence, IS)로서 특성상 염색체 내에서 복제, 소실이 가능하므로 결핵균마다 다른 위치에 다른 개수를 가지고 있게 된다. 이러한 특징을 이용하여 균주를 구별하는 방법이 개발되었는데, 1993년도에 개발된 표준화된 IS6110RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)typing은분자 역학분야에서 결핵균을 분류하는데 있어 가장 각광 받고 있다[van Embden JD, Cave MD, Crawford JT et al. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: recommendations for a standard methodology. J ClinMicrobiol 1993;31:406-9.].
본 출원인은 우리나라 균주 및 인접 아시아 국가 균주로 IS6110RFLP를실시하여 우리나라 균의 특성과 인접국가의 균주의 특성을 분석하여 발표하였다[박영길, 강희윤, 임장근등. 2004년도 경기도 보건소 결핵환자로부터 분리된 결핵균 DNA 지문분석. 결핵및호흡기질환. 2006;60:290-296.].우리나라는 IS6110copy수가 10개인 것이 가장 많았으며, 중국은 18~20 개, 필리핀은 13개, 태국, 베트남 등 동남아시아 국가는 1개인 균주가 많은 것으로 나타났다. 이후에도 IS6110RFLP방법은 우리나라 결핵균 분류에 이용되었다. 경기도에서 분리된 결핵균의 특성과 학교 집단 결핵균의 특성에 대하여 꾸준히 분석하고 발표하였다[박영길, 강희윤, 임장근등. 2004년도 경기도 보건소 결핵환자로부터 분리된 결핵균 DNA 지문분석. 결핵및호흡기질환. 2006;60:290-296.;김상재, 배길한, 박영길 등. Transmission of Mycobacterium tuberculosis among high school students in Korea.2001;5:824-830.]. 하지만, 이 방법은 기술적인 숙련도가 요구되고, 노동 집약적이며, 충분한 양의 DNA를 분리하기 위해서는 수 주 간 배양된 균주가 필요하다. 그리고 복잡한 밴드 양상을 해석하고 실험실 간의 결과를 상호 교환하는데 있어 어려움이 많다. 게다가, IS6110copy수가 낮은(6개 미만) 균주에 대해서는 불충분한 변별력을 갖고 있다.
다음으로 VNTR(Variable Number of Tandem Repeat) 및 STR(Short Tandem Repeat)분석법을 꼽을 수 있다. 이는 염색체 속의 DNA 염기서열이 일정한 반복 구조를 갖고 있다는 점에 착안한 것으로, 염기서열의 반복 구조는 개인별로 적게는 1회에서 많게는 수십회까지 나타난다. 즉 DNA의 특정 부위의 VNTR과 STR 부위의 단위 반복의 횟수 차이에 의한 증폭된 DNA 단편의 길이의 차이가 발생하는 것을 이용한다.
VNTR(Variable Number of Tandem Repeat, 연쇄반복배열)은 결핵균에서도 발견되었는데, 초기에는 발견된 수가 적었으나, 점점 많은 수의 VNTR이 발견되어[Frothingham R, Meeker-O'Connell WA. Genetic diversity in the Mycobacterium tuberculosis complex based on variable numbers of tandem DNA repeats. Microbiology .1998 May ;144( Pt5 ):1189-96.;SupplyP,MazarsE,LesjeanS,VincentV,GicquelB,LochtC.Variablehumanminisatellite-likeregionsintheMycobacteriumtuberculosisgenome.MolMicrobiol.2000May;36(3):762-71.],각국에서는 각 나라에 알맞은 조합을 찾는데 노력을 기울이고 있다[Sajduda A, Dziadek J, Kotłowski R, Portaels F. Evaluation of multiple genetic markers for typing drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains from Poland. DiagnMicrobiolInfectDis .2006;55:59-64.].
이 방법은 각각의 좌위(locus)의 플랭킹 영역(flanking region)에 대해 특이적인 프라이머(primer)들을 이용하여 다양한 좌위(locus)를 PCR 증폭시킨 후, 그 증폭 산물의 크기를 측정함으로써 결과를 얻는다. 증폭 산물의 크기를 넘버링함으로써 얻어지는 결과는 각각의 좌위(locus)에서 연결되어 반복되어지는 숫자를 나타낸다. 크기는 capillary system, 겔 전기영동, 또는 비 변성 HPLC를 이용하여 측정할 수 있다. VNTR typing은 초기 결핵 배양균으로부터의 정제되지 않은 낮은 농도의 DNA 추출물로도 실험이 가능하기 때문에, IS6110typing에 비하여 빠르게 결과를 얻어낼 수 있을 뿐만 아니라, capillary sequencer를 이용하여 많은샘플을 동시에 처리할 수 있는 대용량 처리 시스템을 적용할 수 있다. 또한, 실험 결과가 숫자 코드로 기록되기 때문에 실험실 간 또는 국가 간의 결과의 비교 및 상호 교환이 용이하다.
최근 들어, VNTR typing은 종종 12-MIRU(Mycobacterial Interspersed repetitive unit) 좌위를 이용하기도 하고, 미국에서는 국가 차원의 결핵균 감시체계로 통합되어져 왔다. 제한된 수의 균주를 이용한 실험연구를 통해, 12-MIRU loci VNTR set의 변별력(discriminatory power)은 역학적으로 관계가 없는 균주들에 대해서는 IS6110RFLPtyping의 변별력에 근접하였고, 반면에 역학적으로 연결된 균주들에 대해서는 안정적인 결과를 나타내었다[Mazars E, Lesjean S, Banuls AL, Gilbert M, Vincent V, Gicquel B, Tibayrenc M, Locht C, Supply P. High-resolution minisatellite-based typing as a portable approach to global analysis of Mycobacterium tuberculosis molecular epidemiology.ProcNatlAcadSciUSA.2001;98:1901-6.]. 최근 미국의 인구 기반 연구(population-based study)를 보면, spoligotyping과 결합하여 일차 스크리닝(screening)으로 12-좌위를 사용하였을 때, 대부분의 환자군에서 충분한 변별력을 보여주었다. 따라서,이미 미국에서는 결핵균에 대한 앞으로의 유망한 유전자형 분류(genotyping)를 가능하게 할 수 있다는 사실을 입증하였다. 그러나 접촉자 조사와 인구학적 또는 역학적 자료가 환자들 사이의 연관성 유무를 파악할 수 있는 증거를 제시하지 않는 경우들에 있어서는, 여전히 IS6110typing이 함께 발생한 균주들을 분류하기 위한 추가적인 실험 방법으로 요구된다.
기존과 다른 여러 가지 VNTR loci의 세트를 사용할 경우, 12-MIRU loci 시스템과 비교하였을 때, 서로 관련이 없는 균주들에 대한 변별력을 더 높일 수 있다고 보고되고 있다[Kremer K, Arnold C, Cataldi A, GutiMC, Haas WH, Panaiotov S, Skuce RA, Supply P, van der Zanden AG, van Soolingen D.Discriminatory power and reproducibility of novel DNA typing methods for Mycobacterium tuberculosis complex strains.JClinMicrobiol .2005;43:5628-38.]. 그러나 실험에 사용된 균주는 발생 지역이 한정되었거나,M.bovis만을 대상으로 한 경우, 또는 이미 밝혀진 결핵균의 계통 중 하나 또는 두 가지 정도만을 대표하는 경우로 한정되어졌다. 실험에 사용된 각각의 VNTR loci에 대한 전반적인 기술적 강력함과 재현성은 평가되지 않았다. 또한, 이 연구들은 특정하게 선택하지 않은 인구 기초 샘플(population-based sample)을 사용하지 않았고, 접촉자 추적조사 자료도 이용할 수 없기 때문에, 인구에 기초한 수준(population-based level)에서 진행되는 결핵균 전파연구를 위한 다양한 VNTR 세트의 예측도를 밝힐 수 없었다.
최근 국제적인 공동 연구를 통하여 29 VNTR loci의 해상도(resolution), 안정성 및 기술적인 응용가능성들이 비교되었다. 이 연구는 초기의 12 loci와 함께 지금까지 밝혀진 대부분의 좌위를 대상으로 하였다. 세계의 주요 계통들을 대표할 수 있는 균주와 역학적으로 연결된 균주를 포함한 824개의 결핵균주를 대상으로 한 VNTR typing 결과, 24개의 가장 최적의 VNTR loci를 선정하였다. 반복실험을 통하여, 일차적 역학 조사를 위한 높은 변별력을 갖는 15 좌위(loci)를 선정하였고, 선정된 15 VNTR 좌위(loci)를 이용한 typing은 M. tuberculosis complex를 대상으로 한 유전형분석(genotyping)의 새로운 국제적 표준방법으로 제시되었다. 특히, 24개 좌위까지 확대하여 실시되는 유전형분석은 계통 발생 연구에 유용하다.
그러나 우리나라 균주를 대상으로 실시한 발표 논문과 결핵연구원에서 실시한 선행 실험으로 볼 때 Supply 24 좌위(locus)가 완벽하지 않음을 발견할 수 있다. 즉,Shapmuta 등의 보고에 의하면, 우리나라 균주를 대상으로 24 좌위(locus) VNTR을 실시하였을 때, allelic diversity(h value)가 0.5 이상인 것은 MIRU-40, Mtub-21, VNTR-4156, Mtub-04, QUB-26, QUB-11b 등 6개가 있었다. 윤 등의 보고에 따르면, 16개의 좌위(locus)로 VNTR을 실시한 경우 HGDI가 0.5가 넘는 것은 MIRU-10, MIRU-16, MIRU-26, MIRU-27, MIRU-31, MIRU-39, MIRU-40 ETR-F 등이었다. MIRU 12로 실험한 결과에서는 allelic diversity(h value)가 0.5가 넘는 좌위(locus)는 MIRU-26, MIRU-31, MIRU-39 등이있었다[Shamputa IC, Lee J, Allix-BC et al.Genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis isolates from a tertiary care tuberculosis hospital in South Korea. JClinMicrobiol .2010;48:387-94.].결핵연구원이 JATA(Japan Anti-Tuberculosis Association) 12 좌위(locus)를 이용하여 VNTR typing을 실시한 결과 h value가 0.5 이상인좌위(locus)는 Supply 24 loci에는 포함되지 않는 QUB-15, VNTR-2372, VNTR-3336, VNTR-4156 등이 있었다(미발표).
이와 같이 좌위(locus)의 선택에 따라 실험에 따라 결과가 다른 이유는 실험 대상의 선정 방법에 따라 일부 실험의 대상이 편향되었기 때문일 수 있다. 이는, 아직까지도 우리나라 결핵 균주를 가장 잘 분류해 줄 수 있는 VNTR 좌위(locus) 조합이 없기 때문이다. 따라서, 우리나라 결핵균주를 가장 잘 분류해 줄 수 있는 적합한 VNTR loci 조합의 발굴이 필요하다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 우리나라 결핵 균주를 가장 잘 분류해 줄 수 있는 VNTR 좌위(loci) 조합을 포함하는 VNTR에 의한 검체의 형질 분류를 위한 키트 및 상기 VNTR에 의한 검체의 형질 분류를 위한 키트를 이용한 검체의 형질 분류 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위해 MIRU-26, MIRU-31, QUB-26, QUB-11a, QUB-11b, Mtub-04, Mtub-21, VNTR-3336, VNTR-4156, VNTR-3232, VNTR-4120 및 VNTR-3820으로 구성되는 12개의 DNA 좌위를 동시 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 VNTR에 의한 검체의 형질 분류를 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 VNTR에 의한 검체의 형질 분류를 위한 키트에 있어서, 상기 DNA 좌위를 검출하기 위한 프라이머 세트가 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 한다.
좌위 세트 중 하나의 좌위가 MIRU-26 인 경우 서열번호 1, 서열 번호 2 ;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 MIRU-31 인 경우 서열번호 3, 서열 번호 4 ;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 QUB-26 인 경우 서열번호 5, 서열번호 6 ;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 QUB-11a 인 경우 서열번호 7, 서열번호 8 ;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 QUB-11b 인 경우 서열번호 9, 서열번호 10 ;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 Mtub-04 인 경우 서열번호 11, 서열번호 12 ;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 Mtub-21 인 경우 서열번호 13, 서열번호 14 ;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 VNTR-3336 인 경우 서열번호 15, 서열번호 16 ;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 VNTR-4156 인 경우 서열번호 17, 서열번호 18 ;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 VNTR-3232 인 경우 서열번호 19, 서열번호 20 ;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 VNTR-4120 인 경우 서열번호 21, 서열번호 22 ; 및
좌위 세트 중 하나의 좌위가 VNTR-3820 인 경우 서열번호 23, 서열번호 24
본 발명의 VNTR에 의한 검체의 형질 분류를 위한 키트에 있어서, 상기 DNA 좌위를 검출하기 위한 프라이머 세트가 FAM, VIC, NED 및 PET 로 구성된 그룹에서 선택되는 형광 염료를 포함하는 것을 특징으로 한다.
구체적으로 상기 형광 염료가 포함된 각각의 자위의 프라이머 세트는 다음 표 1과 같다.
Locus Primer sequence (5'-3')
MIRU-26 TAGGTCTACCGTCGAAATCTGTGAC
(VIC)CATAGGCGACCAGGCGAATAG
MIRU-31 ACTGATTGGCTTCATACGGCTTTA
(NED)GTGCCGACGTGGTCTTGAT
QUB-26 (NED)GTGCCGGCCAGGTCCTTCC
CACCGCGTGTTTGACCCGAAC
QUB-11a CGTGATGTTGATCGGGATGT
(PET)ACCCTGGAGTCTGGCATC
QUB-11b CCGATGTAGCCCGTGAAGA
(PET)AGGGTCTGATTGGCTACTCA
Mtub-04 CTTGGCCGGCATCAAGCGCATTATT
(PET)GGCAGCAGAGCCCGGGATTCTTC
Mtub-21 (VIC)AGACGTCAGATCCCAGTT
ACCCGACAACAAGCCCA
VNTR-3336 (PET)ATCCCCGCGGTACCCATC
GCCAGCGGTGTCGACTATCC
VNTR-4156 (NED)ACCGCAAGGCTGATGATCC
GTGCATCTCGTCGACTTCC
VNTR-3232 CCCCAGCCTTACGACTGA
(FAM)GTCGGGCTTGGTGAAGG
VNTR-4120 (PET)GTTCACCGGAGCCAACC
GAGGTGGTTTCGTGGTCG
VNTR-3820 TGCGCGGTGAATGAGACG
(PET)ACCTTCATCCTTGGCGAC
본 발명의 VNTR에 의한 검체의 형질 분류를 위한 키트에 있어서, 상기검체는 미생물, 기생충, 동물 또는 식물인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 VNTR에 의한 검체의 형질 분류를 위한 키트에 있어서, 상기 미생물이 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 검체로부터 DNA 조각을 수득하는 단계; 상기 DNA 조각을 PCR 반응에 의해 증폭시키는 단계; 및 증폭된 상기 DNA 조각을 검출하는 단계로 구성되는 VNTR에 의한 결핵 균주 분류 방법에 있어서, 상기 DNA 조각을 PCR 반응에 의해 증폭시키는 단계에서 상기 검체의 형질 분류를 위한 키트를 사용하는 것을 특징으로 하는 VNTR에 의한 검체의 형질 분류 방법을 제공한다.
본 발명의 VNTR에 의한 검체의 형질 분류 방법에 있어서, 상기 미생물이 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 VNTR에 의한 검체의 형질 분류 방법에 있어서,상기 증폭된 DNA 조각을 검출하는 단계에서는 겔 전기영동, 띠 전기영동, 등전포커싱 전기영동, 모세관 전기영동, 모세관 띠 전기영동, 모세관 겔 전기영동, 비변압성 크로마토그래피로 구성된 군으로부터 선택되는 방법을 사용하는 것이 가능하다.
본 발명에 의한 VNTR에 의한 검체의 형질 분류를 위한 키트 및 이를 이용한 VNTR에 의한 검체의 형질 분류 방법은 우리나라 결핵 균주에 적합한 새로운 VNTR 좌위(loci) 조합을 포함함으로써, 우리나라 결핵 균주를 보다 정확하게 분류할 수 있다.
도 1 은 본 발명의 일 실시예에 의한 프라이머 키트를 이용하여 Mtub 21 좌위(loci)에 대한 PCR 산물을 전기영동한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 의한 프라이머 키트 및 capillary sequencer를 이용하여 증폭된 4개의 PCR 산물의 조각의 크기를 동시에 측정한 예시이다.
이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 아래 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
< 실시예 1-1>33개 VNTR loci 선정
Supply 24, JATA 15, 기타 VNTR loci 등을 포함한 다음 표 2의 36 개의 loci 를 선정하였다. 이중 32개 loci의 프라이머는 capillary sequencer에 적용하기 위해 서로 다른 파장을 갖는 4개의 형광 염료(FAM, VIC, NED, PET)로 표지하였다.
좌위(loci)
1 MIRU-2
2 MIRU-4
3 MIRU-10
4 MIRU-16
5 MIRU-20
6 MIRU-23
7 MIRU-24
8 MIRU-26
9 MIRU-27
10 MIRU-31
11 MIRU-39
12 MIRU-40
13 ETR-A
14 ETR-B
15 ETR-C
16 QUB11a
17 QUB11b
18 QUB15
19 QUB26
23 Mtub 04
24 Mtub 21
25 Mtub 24
26 Mtub 29
27 Mtub 30
28 Mtub 34
29 Mtub39
31 V2372
32 V3232
33 V3336
34 V3820
35 V4120
36 V4156
< 실시예 1-2> 균주 선정
본 실험에서는 우리나라 결핵 균주를 분별하기 위해 유용한 VNTR 좌위(loci)를 선정하기 위해 먼저 균주를 선정하였다. 우리 나라 결핵균주 대표성을 확보하기 위하여, 전국 보건소에서 분리된 결핵균주 2400 균주 중 유의수준 5% 이하에서 추정 오차 5 %를 가정하여, 최소 추출 표본수인 307개 균주를 맹검무작위법(blind randomization)으로 선정하였다.
< 실시예 1-3> 균주로부터 DNA 의 분리
상기 선정된 307개균주에 대해서 DNA를 분리하였다. 먼저, TE buffer(10 mMTris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) 400 ㎕를 담은 1.5 ml microtube에 Lowenstein-Jensen 배지에 배양한 결핵균 2 loop를 채취하여 넣고 균을 잘 풀은 다음, 80℃로 20분간 가열 살균시켰다. lysozyme을 1 mg/ml 되게 첨가하고, 37℃에서 하루 동안 반응시킨 후, 10% SDS(sodium dodecyl sulfate)를 70 ㎕ 첨가하고, 10 mg/ml proteinase K를 5㎕ 첨가하여 65℃에서 10분간 반응시켰다. 5M NaCl 100 ㎕와 N-acetyl-N, N, N-trimethyl ammonium bromide 100 ㎕를 첨가한 후, 다시 65℃에서 10분간 반응시켰다. Chloroform-isoamyl alcohol(24:1) 750㎕을 첨가하여 10초간 잘 섞어준 후, 12,000 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 그리고 상층액을 채취하여 새로운 tube에 넣고 Isopropanol 450㎕ 첨가, -20℃ 에 30분간 방치한 후 12,000 rpm으로 15 분간 원심분리한 후 상층액은 버렸다. DNA 침천물은 70% 에탄올로 세척하고 건조한 후, 0.1 ⅹ TE buffer 25㎕에 녹여 사용하였다.
< 실시예 1-4> VNTR typing
각각의 VNTR 좌위의 반복 수(repeat number)는 PCR 산물을 전기영동하거나, capillary sequencer를 이용하여 fragment의 사이즈를 측정하여 확인할 수 있다.
본 실험에서 각각의 VNTR 좌위의 반복 수(repeat number)는 각각의 자위(locus)에 적합한 아래 표 3의 프라이머 세트(primer set)를 이용하여 PCR을 실시하여 계산하였다.
Lucus Priemr sequence (5'-3')
MIRU-2
 GACTTGCAGCAATGGACCAACT
(FAM)TACTCGGACGCCGGCTCAAAAT
MIRU-4 (FAM)GCGCGAGAGCCCGAACTGC
GCGCAGCAGAAACGTCAGC
MIRU-10 GTTCTTGACCAACTGCAGTCGTCC
(FAM)GCCACCTTGGTGATCAGCTACCT
MIRU-16 TCGGTGATCGGGTCCAGTCCAAGTA
(VIC)CCCGTCGTGCAGCCCTGGTAC
MIRU-20 (FAM)TCGGAGAGATGCCCTTCGAGTTAG
GGAGACCGCGACCAGGTACTTGTA
MIRU-23 (VIC)CTGTCGATGGCCGCAACAAAACG
AGCTCAACGGGTTCGCCCTTTTGTC
MIRU-24 CGACCAAGATGTGCAGGAATACAT
(VIC)GGGCGAGTTGAGCTCACAGAA
MIRU-27 TCGAAAGCCTCTGCGTGCCAGTAA
(NED)GCGATGTGAGCGTGCCACTCAA
MIRU-39 CGCATCGACAAACTGGAGCCAAAC
(NED)CGGAAACGTCTACGCCCCACACAT
MIRU-40 (NED)GGGTTGCTGGATGACAACGTGT
GGGTGATCTCGGCGAAATCAGATA
ETR-A (NED)AAATCGGTCCCATCACCTTCTTAT
CGAAGCCTGGGGTGCCCGCGATTT
ETR-B (VIC)GCGAACACCAGGACAGCATCATG
GGCATGCCGGTGATCGAGTGG
ETR-C (VIC)GTGAGTCGCTGCAGAACCTGCAG
GGCGTCTTGACCTCCACGAGTG
ETR-F CTCGGTGATGGTCCGGCCGGTCAC
GGAAGTGCTCGACAACGCCATGCC
QUB-15 (PET)GCCAGCCGTAACCCGACCAG
GGGCCGGAAATTCGCAGTGG
Mtub-24 (PET)TGTGTCACCTGACGATTTCAAGG
TGGCCGGCAAATAATGGATGC
Mtub-29 (FAM)GCCAGCCGCCGTGCATAAACCT
AGCCACCCGGTGTGCCTTGTATGAC
Mtub-30 CGTCGTCGCCGAGCTGGATT
(PET)CACCGGGGCTGGCAGCTAAG
Mtub-34 (NED)GGTGCGCACCTGCTCCAGATAA
GGCTCTCATTGCTGGAGGGTTGTAC
Mtub-39 (VIC)CGGTGGAGGCGATGAACGTCTTC
TAGAGCGGCACGGGGGAAAGCTTAG
VNTR-2372 (PET)ACCTCCGTTCCGATAATC
CAGCTTTCAGCCTCCACA
MIRU-26 TAGGTCTACCGTCGAAATCTGTGAC
(VIC)CATAGGCGACCAGGCGAATAG
MIRU-31 ACTGATTGGCTTCATACGGCTTTA
(NED)GTGCCGACGTGGTCTTGAT
QUB-26 (NED)GTGCCGGCCAGGTCCTTCC
CACCGCGTGTTTGACCCGAAC
QUB-11a CGTGATGTTGATCGGGATGT
(PET)ACCCTGGAGTCTGGCATC
QUB-11b CCGATGTAGCCCGTGAAGA
(PET)AGGGTCTGATTGGCTACTCA
Mtub-04 CTTGGCCGGCATCAAGCGCATTATT
(PET)GGCAGCAGAGCCCGGGATTCTTC
Mtub-21 (VIC)AGACGTCAGATCCCAGTT
ACCCGACAACAAGCCCA
VNTR-3336 (PET)ATCCCCGCGGTACCCATC
GCCAGCGGTGTCGACTATCC
VNTR-4156 (NED)ACCGCAAGGCTGATGATCC
GTGCATCTCGTCGACTTCC
VNTR-3232 CCCCAGCCTTACGACTGA
(FAM)GTCGGGCTTGGTGAAGG
VNTR-4120 (PET)GTTCACCGGAGCCAACC
GAGGTGGTTTCGTGGTCG
VNTR-3820 TGCGCGGTGAATGAGACG
(PET)ACCTTCATCCTTGGCGAC
PCR 은 Ex Taq과 GC PCR buffer I을 이용하며, PCR mixture는 2×GC PCR buffer I, 0.5 U Ex Taq, 2.5 mMdNTPs, 그리고 각각의 프라이머 쌍 0.5μM 을 포함하며, 1 ng의 템플레이트 DNA를 첨가하였다. 이때, PCR의 pre-denaturation 과정은 94℃ 에서 5분간, denaturation 과정은 94℃ 에서 30초간, annealing 과정은 57℃ ~ 63℃ 에서 30초간, extension 과정은 72℃ 에서 1 분간 35회 반복, 그리고 post-extension 과정은 72℃에서 10분간 반응시키는 조건에서 수행하였다.
도 1은 Mtub-21 좌위에 대한 전기 영동을 실시한 결과를, 도 2는 4개 프라이머 쌍을 이용한 PCR 증폭산물의 fragment size를 capillary sequencer를 이용하여 측정한 결과를 나타낸다.
< 실시예 1-5> 각각의 자위에 대한 Allelic diversity , discriminatory power 비교
상기 33개 각각의 좌위에 대한 allelic diversity(h)는 다음 공식을 이용하여 계산하였으며, 그 결과는 다음 표 4와 같다.
h =1-∑ x i 2
상기 식에서, x i 은 해당하는 좌위에 대한 i allele의 빈도 수를 나타낸다.
분석 방법의 분별력을 나타내는 Hunter-Gaston discriminatory index(HGDI) 는 VNTR loci의 조합들을 평가하고 RFLP와 VNTR method의 효율성을 평가하기 위한 지표로 쓰이기 위하여 계산된다[Hunter PR, Gaston MA.Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity.JClinMicrobiol . 1988 Nov ;26(11):2465-6.].
Alias h value
1 MIRU-2 0.045
2 MIRU-4 0.125
3 MIRU-10 0.330
4 MIRU-16 0.188
5 MIRU-20 0.076
6 MIRU-23 0.108
7 MIRU-24 0
8 MIRU-26 0.636
9 MIRU-27 0.130
10 MIRU-31 0.665
11 MIRU-39 0.433
12 MIRU-40 0.509
13 ETR-A 0.358
14 ETR-B 0.150
15 ETR-C 0.094
16 QUB11a 0.608
17 QUB11b 0.801
18 QUB15 0.531
19 QUB26 0.661
23 Mtub 04 0.688
24 Mtub 21 0.680
25 Mtub 24 0.313
26 Mtub 29 0.136
27 Mtub 30 0.330
28 Mtub 34 0.051
29 Mtub39 0.517
31 V2372 0.435
32 V3232 0.898
33 V3336 0.820
34 V3820 0.895
35 V4120 0.870
36 V4156 0.652
상기 표 4에서 균주 변별 능력인 Allelic diversity가 0.6 이상으로 측정된 다음 표 5와 같은 12개의 좌위(loci)를 선택하고, 각각의 자위(loci)에 대한 프라이머를 포함하는 키트를 제조하였다.
Locus Primer sequence (5'-3') 서열번호
MIRU-26
 TAGGTCTACCGTCGAAATCTGTGAC 서열번호 1
CATAGGCGACCAGGCGAATAG 서열번호 2
MIRU-31
 ACTGATTGGCTTCATACGGCTTTA 서열번호 3
GTGCCGACGTGGTCTTGAT 서열번호 4
QUB-26
 GTGCCGGCCAGGTCCTTCC 서열번호 5
CACCGCGTGTTTGACCCGAAC 서열번호 6
QUB-11a
 CGTGATGTTGATCGGGATGT 서열번호 7
ACCCTGGAGTCTGGCATC 서열번호 8
QUB-11b
 CCGATGTAGCCCGTGAAGA 서열번호 9
AGGGTCTGATTGGCTACTCA 서열번호 10
Mtub-04
 CTTGGCCGGCATCAAGCGCATTATT 서열번호 11
GCAGCAGAGCCCGGGATTCTTC 서열번호 12
Mtub-21
 GACGTCAGATCCCAGTT 서열번호 13
ACCCGACAACAAGCCCA 서열번호 14
VNTR-3336
 ATCCCCGCGGTACCCATC 서열번호 15
GCCAGCGGTGTCGACTATCC 서열번호 16
VNTR-4156
 CCGCAAGGCTGATGATCC 서열번호 17
GTGCATCTCGTCGACTTCC 서열번호 18
VNTR-3232
 CCCCAGCCTTACGACTGA 서열번호 19
GTCGGGCTTGGTGAAGG 서열번호 20
VNTR-4120
 TTCACCGGAGCCAACC 서열번호 21
GAGGTGGTTTCGTGGTCG 서열번호 22
VNTR-3820
 TGCGCGGTGAATGAGACG 서열번호 23
ACCTTCATCCTTGGCGAC 서열번호 24
< 비교예 1> RFLP( restriction fragment length polymorphism )
본 발명에 의하여 만들어진 12개의 좌위(loci)의 결핵균 분리 성능을 비교하기 위해, 종래 알려진 방법인 RFLP(restriction fragment length polymorphism)를 실시하였다.
상기 실시예 1-3 에서 분리된 결핵균 DNA는 제한효소 PvuII로 절단한 후 16시간 동안 전기영동을 실시하였다.
Agarose gel 상에 있는 DNA 조각은 N+Hybond membrane(GE Healthcare)으로 진공 펌프를 이용하여 전이된다. IS6110 probe를 만들기 위해서, INS-1(5'-CGT GAG GGC ATC GAG GTG GC-3')와INS-2(5'-GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA-3')을 이용하여 PCR을 실시하고, 그 산물은 245 bp이었다. PCR 산물에 화학발광제(chemiluminiscence)를 라벨링(labeling)하고 N+ 나일론 막에 있는 염색체 DNA와 42℃ 에서 교잡반응을 실시한 후, 반응액으로 1분간 처리하여 X-ray 필름에 감광시켜 IS6110 밴드를 확인하였다.
< 비교예 2> 다른 좌위 조합을 이용한 VNTR 분석 및 변별력 비교
본 실시예에서는 307개 균주에 대하여 종래 알려진 supply-15, supply-24 좌위 조합을 이용하여 VNTR 분석을 수행하였다.
< 실험예 1> 균주 변별력 비교
상기 실시예 및 비교예 1 내지 2 에서 클러스터를 조사하기 위하여, 모든 데이터를 컴퓨터에 저장하고,BioNumerics ver.5.1 Software(Applied Maths, Kortrijk, Belgium)를 사용하여 genotyping 결과를 분석하였다.
RFLP 결과의 경우유사성계수(similarity coefficient)는 band based Dice로, dendrogram type은 UPGMA로 설정하여 유사도를 비교하고, VNTR 결과의 경우 유사성계수는pearson correlation으로, dendrogram type은 complete linkage로 설정하여 유사도를 비교하였으며, 그 결과를 표 6 에 나타내었다.
Typing
method		 전체균주 types의 수 unique types의 수 clusters의 수 clustered islates 의 수 (%) cluster 중 최대 isolaters 의 수 HGDI
실시예 KIT-12* 300 294 6 13(4.2) 3 0.9998
비교예 1 Is6110-RFLP 279 256 23 51(16.6) 6 0.9992
비교예 2 Supply-15 263 241 22 66(21.5) 8 0.9981
비교예 3 Supply-24 275 256 19 51(16.6) 6 0.9988
비교예 4 JATA-15
(Qub-18제외)		 284 268 16 39(12.7) 5 0.9993
본 발명의 실시예에 의한 12개의 좌위를 사용하는 경우 HGDI는 0.9998이고, 비교예 1 내지 4의 RFLP의 HGDI는 0.9992, Supply - 15는 0.9981, Supply - 24는 0.9988, JATA - 15는 0.9993으로 나타나, 본 발명의 실시예에 의한 12개의 VNTR loci를 이용한 KIT -12의 균주 변별력이 가장 높게 나타남을 알 수 있었다.
allelic diversity > 0.6인 본 발명의 실시예에 의한 12개의 VNTR loci 조합(KIT-12*)을 이용하여 분석을 실시한 결과 3개의 균주로 이루어진 1종류의 cluster, 2개의 균주로 이루어진 5종류의 cluster와 294개의 유니크한 VNTR type을 확인하였다(총 300개의 균주 type). 이 중 1종류의 cluster만이 32개의 VNTR loci 모두를 이용한 cluster 분석에서 cluster로 확인되었고, 이 때 307개의 균주는 306개의 VNTR type으로 확인되었다.
비교예의 경우 RFLP typing 결과를 분석한 결과, 2개의 균주로 이루어진 21종류의 cluster와 3개 균주로 이루어진 1종류의 cluster, 6개의 균주로 이루어진 1종류의 cluster와 256 종류의 유니크한 RFLP type을 확인하였다(총 279개의 균주 type).
Supply-15 VNTR 분석 결과에서 2개의 균주로 이루어진 11종류의 cluster와 3개의 균주로 이루어진 7종류의 cluster, 그리고 4개, 5개, 6개, 8개 균주로 이루어진 cluster가 각각 1종류씩 확인되었고, 241개의 유니크한 VNTR type을 확인하였다(총 263개의 균주 type).
Supply-24 VNTR분석 결과에서는 2개의 균주로 이루어진 13종류의 cluster, 3개와 4개 균주로 이루어진 cluster가 각각 2종류씩, 그리고 5개, 6개 균주로 이루어진 cluster가 각각 1종류씩 확인되었고, 256개의 유니크한 VNTR type을 확인하였다(총 275개의 균주 type).
JATA-15 VNTR에 대한 결과에서 2개의 균주로 이루어진 13종류의 cluster와 4개 균주로 이루어진 2종류의 cluster, 5개 균주로 이루어진 1종류의 cluster가 확인되었고, 268개의 유니크한 VNTR type을 확인하였다(총 284개의 균주 type).
<110> korean national tuberculosis association <120> VNTR gentyping kit and VNTR genotyping method using the same <160> 24 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MIRU-26F <400> 1 taggtctacc gtcgaaatct gtgac 25 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MIRU-26R <400> 2 cataggcgac caggcgaata g 21 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MIRU-31F <400> 3 actgattggc ttcatacggc ttta 24 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MIRU-31R <400> 4 gtgccgacgt ggtcttgat 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> QUB-26F <400> 5 gtgccggcca ggtccttcc 19 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> QUB-26R <400> 6 caccgcgtgt ttgacccgaa c 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> QUB-11aF <400> 7 cgtgatgttg atcgggatgt 20 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> QUB-11aR <400> 8 accctggagt ctggcatc 18 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> QUB-11bF <400> 9 ccgatgtagc ccgtgaaga 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> QUB-11bR <400> 10 agggtctgat tggctactca 20 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mtub-04F <400> 11 cttggccggc atcaagcgca ttatt 25 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mtub-04R <400> 12 ggcagcagag cccgggattc ttc 23 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mtub-21F <400> 13 agacgtcaga tcccagtt 18 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mtub-21R <400> 14 acccgacaac aagccca 17 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VNTR-3336F <400> 15 atccccgcgg tacccatc 18 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VNTR-3336R <400> 16 gccagcggtg tcgactatcc 20 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VNTR-4156F <400> 17 accgcaaggc tgatgatcc 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VNTR-4156R <400> 18 gtgcatctcg tcgacttcc 19 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VNTR-3232F <400> 19 ccccagcctt acgactga 18 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VNTR-3232R <400> 20 gtcgggcttg gtgaagg 17 <210> 21 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VNTR-4120F <400> 21 gttcaccgga gccaacc 17 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VNTR-4120R <400> 22 gaggtggttt cgtggtcg 18 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VNTR-3820F <400> 23 tgcgcggtga atgagacg 18 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VNTR-3820R <400> 24 accttcatcc ttggcgac 18

Claims (8)

  1. MIRU-26, MIRU-31, QUB-26, QUB-11a, QUB-11b, Mtub-04, Mtub-21, VNTR-3336, VNTR-4156, VNTR-3232, VNTR-4120 및 VNTR-3820으로 구성되는 12개의 DNA 좌위를 동시 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 VNTR에 의한 검체의 형질 분류를 위한 키트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 DNA 좌위를 검출하기 위한 프라이머 세트가 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 VNTR에 의한 검체의 형질 분류를 위한 키트.

    좌위 세트 중 하나의 좌위가 MIRU-26 인 경우 서열번호 1, 서열 번호 2 ;
    좌위 세트 중 하나의 좌위가 MIRU-31 인 경우 서열번호 3, 서열 번호 4 ;
    좌위 세트 중 하나의 좌위가 QUB-26 인 경우 서열번호 5, 서열번호 6 ;
    좌위 세트 중 하나의 좌위가 QUB-11a 인 경우 서열번호 7, 서열번호 8 ;
    좌위 세트 중 하나의 좌위가 QUB-11b 인 경우 서열번호 9, 서열번호 10 ;
    좌위 세트 중 하나의 좌위가 Mtub-04 인 경우 서열번호 11, 서열번호 12 ;
    좌위 세트 중 하나의 좌위가 Mtub-21 인 경우 서열번호 13, 서열번호 14 ;
    좌위 세트 중 하나의 좌위가 VNTR-3336 인 경우 서열번호 15, 서열번호 16 ;
    좌위 세트 중 하나의 좌위가 VNTR-4156 인 경우 서열번호 17, 서열번호 18 ;
    좌위 세트 중 하나의 좌위가 VNTR-3232 인 경우 서열번호 19, 서열번호 20 ;
    좌위 세트 중 하나의 좌위가 VNTR-4120 인 경우 서열번호 21, 서열번호 22 ; 및
    좌위 세트 중 하나의 좌위가 VNTR-3820 인 경우 서열번호 23, 서열번호 24
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 DNA 좌위를 검출하기 위한 프라이머 세트가 FAM, VIC, NED 및 PET로 구성된 그룹에서 선택되는 형광 염료를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 VNTR에 의한 검체의 형질 분류를 위한 키트.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 DNA 좌위를 검출하기 위한 프라이머 세트가 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 VNTR에 의한 검체의 형질 분류를 위한 키트.
    Figure pat00001
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 검체는 미생물, 기생충, 동물 또는 식물인 것을 특징으로 하는 VNTR에 의한 검체의 형질 분류를 위한 키트.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 미생물이 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)인 것을 특징으로 하는 VNTR에 의한 검체의 형질 분류를 위한 키트.
  7. 검체로부터 DNA 조각을 수득하는 단계;
    상기 DNA 조각을 PCR 반응에 의해 증폭시키는 단계; 및
    증폭된 상기 DNA 조각을 검출하는 단계로 구성되는 VNTR에 의한 결핵 균주 분류 방법에 있어서,
    상기 PCR 반응에 사용되는 프라이머 세트가 서열 목록 염기 서열 1 내지 24로 구성되는 것을 특징으로 하는 VNTR에 의한 검체의 형질 분류 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 미생물이 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)인 것을 특징으로 하는 VNTR에 의한 검체의 형질 분류 방법.

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111647647A (zh) * 2020-06-03 2020-09-11 皖南医学院 一种结核分枝杆菌miru-vntr基因多拷贝数快速检测分析方法
KR102405988B1 (ko) * 2021-06-30 2022-06-08 주식회사 코젠바이오텍 결핵균의 유전자형 분류를 위한 miru-vntr 조성물 및 이를 이용한 결핵균 유전자형 분류방법

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