KR102405988B1 - 결핵균의 유전자형 분류를 위한 miru-vntr 조성물 및 이를 이용한 결핵균 유전자형 분류방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 결핵균의 유전자형 분류를 위한 MIRU(Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit)-VNTR(Variable Number Tandem Repeat) 조성물 및 이를 이용한 결핵균 유전자형 분류방법에 관한 것으로, 구체적으로는 24개 유전자좌(loci) MIRU-VNTR 프라이머 세트를 이용한 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭산물을 얻고, 이의 크기 분석이 가능한 모세관 전기영동(capillary electrophoresis, CE) 기술로 결핵균의 유전자형을 분류하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 결핵균의 유전자형 분류를 위한 MIRU-VNTR(Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit-Variable Number Tandem Repeat) 조성물 및 이를 이용한 결핵균 유전자형 분류방법에 관한 것으로, 구체적으로는 24개 유전자좌(loci) MIRU-VNTR 프라이머 세트를 이용한 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭산물을 얻고, 이의 크기 분석이 가능한 모세관 전기영동(capillary electrophoresis, CE) 기술로 결핵균의 유전자형을 분류하는 방법에 관한 것이다.
결핵은 전세계적으로 발생하는 전염병으로, 많은 나라들이 결핵 발생률을 낮추기 위한 노력을 지속하고 있다. 그럼에도 불구하고 결핵은 아직 전세계 10대 사망원인 중 하나로 꼽히는 전염병 중 하나이며 2018년을 기준 결핵으로 약 150만명이 사망하고 1,000만명이 결핵을 앓고 있다고 보고된다.
우리나라는 대외적으로 결핵 관리가 잘된 나라로 평가되어 왔으나, OECD 국가 중 결핵 발생률 1위, 결핵 사망률 2위를 기록하며 지리적으로 가까운 일본보다 약 5배의 결핵 환자가 존재하며, 국내 결핵 환자가 감소하는 속도가 둔화되고 다제내성결핵환자가 증가하는 추세를 보이고 있다(질병관리본부, 결핵 진료지침 (4판), 2020.).
특히 국내 결핵 환자 중 외국인 결핵 환자의 비율이 증가하고 있고, 대부분의 외국인 결핵 환자는 중국, 베트남 등의 결핵 고위험국가 출신으로 알려져 있다(질병관리본부 국립보건연구원, A study for the molecular typing of Mycobacterium tuberculosis isolated in Korea using IS6110 and MIRU-VNTR, 2015.). 결핵 발생 비중이 높은 국가의 외국인이 우리나라에 장기 체류하기 위해서는 입국 전 결핵 진단서를 제출하는 것을 의무화하고 있지만, 이 방법으로는 활동성 결핵 환자의 검진 이외의 잠복결핵 환자의 이환을 방지할 수 없다는 맹점이 있다(하지민, et al. 국내 외국인 결핵환자의 결핵균 유전형 특성 분석 (2017~2018 년).
외국인 결핵 환자의 출신 국가와 지역에 따라 결핵균의 계통분포가 다르게 나타난다는 보고에 따르면 외국인으로부터 유발되는 대부분의 결핵균은 잠복 결핵이 활성화된 것으로 시사되므로, 정밀한 유전자형 분석을 통해 주변국에서 넘어오는 결핵균의 전파 경로를 파악하고 결핵 확산 방지를 위한 방역 시스템을 구축할 필요가 있다.
결핵균과 같이 공기를 통해 전파되는 전염병은 확산을 방지하기 위하여 전염 경로를 파악하고 차단하는 대책이 필요하다. 이에 DNA 타이핑(typing) 또는 DNA 지문검색법(fingerprinting) 기술은 결핵균의 고유한 유전자형을 분석할 수 있는 방법으로 결핵균의 전염 경로, 동일성(identity) 및 기원(origin)을 파악하기 위해 활용될 수 있다.
결핵균의 대표적인 DNA 타이핑(typing) 방법으로 IS6110 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 및 VNTR(Variable Number of Tandem Repeats) DNA 타이핑(typing) 기술이 알려져 있으며, 기술 개발 초기에 결핵균을 분류하는 방법으로 각광받았던 IS6110 RFLP DNA 타이핑(typing) 기술은 배양된 균을 통한 많은 양의 DNA가 소모되고 IS6110의 카피(copy) 수가 낮은 균주에 대해서는 변별력이 부족하다는 점 등의 단점이 있어 현재에는 VNTR DNA 타이핑(typing) 기술이 선호되는 추세다(질병관리본부 국립보건연구원, A study for the molecular typing of Mycobacterium tuberculosis isolated in Korea using IS6110 and MIRU-VNTR, 2015.).
VNTR(Variable Number of Tandem Repeat, 연쇄반복배열)은 결핵균에서도 발견되었는데, 초기에는 발견된 수가 적었으나, 점점 많은 수의 VNTR이 발견되어(Frothingham R, Meeker-O'Connell WA. Genetic diversity in the Mycobacterium tuberculosis complex based on variable numbers of tandem DNA repeats. Microbiology.1998May;144(Pt5):1189-96.;SupplyP,MazarsE,LesjeanS,VincentV,GicquelB,LochtC.VariablehumanminisatellitelikeregionsintheMycobacteriumtuberculosisgenome.MolMicrobiol.2000May;36(3):762-71.), 각국에서는 각 나라에 알맞은 조합을 찾는데 노력을 기울이고 있다(Sajduda A, Dziadek J, Kotłowski R, Portaels F. Evaluation of multiple genetic markers for typing drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains from Poland. DiagnMicrobiolInfectDis.2006;55:59-64.).
이 방법은 각각의 좌위(locus)의 플랭킹 영역(flanking region)에 대해 특이적인 프라이머(primer)들을 이용하여 다양한 좌위(locus)를 PCR 증폭시킨 후, 그 증폭 산물의 크기를 측정함으로써 결과를 얻는다. 증폭 산물의 크기를 넘버링함으로써 얻어지는 결과는 각각의 좌위(locus)에서 연결되어 반복되어지는 숫자를 나타낸다. 크기는 모세관 시스템(capillary system), 겔 전기영동 또는 비 변성 HPLC를 이용하여 측정할 수 있다. VNTR 타이핑(typing)은 초기 결핵 배양균으로부터의 정제되지 않은 낮은 농도의 DNA 추출물로도 실험이 가능하기 때문에, IS6110 타이핑(typing)에 비하여 빠르게 결과를 얻어낼 수 있을 뿐만 아니라, 모세관 시퀀서(capillary sequencer)를 이용하여 많은 샘플을 동시에 처리할 수 있는 대용량 처리 시스템을 적용할 수 있다. 또한, 실험 결과가 숫자 코드로 기록되기 때문에 실험실 간 또는 국가 간의 결과의 비교 및 상호 교환이 용이하다.
최근 들어, VNTR 타이핑(typing)은 종종 12-MIRU(Mycobacterial Interspersed repetitive unit) 좌위를 이용하기도 하고, 미국에서는 국가 차원의 결핵균 감시체계로 통합되어져 왔다. 제한된 수의 균주를 이용한 실험연구를 통해, 12-MIRU loci VNTR set의 변별력(discriminatory power)은 역학적으로 관계가 없는 균주들에 대해서는 IS6110 RFLP 타이핑(typing)의 변별력에 근접하였고, 반면에 역학적으로 연결된 균주들에 대해서는 안정적인 결과를 나타내었다(Mazars E, Lesjean S, Banuls AL, Gilbert M, Vincent V, Gicquel B, Tibayrenc M, Locht C, SupplyP. High-resolution minisatellite-based typing as a portable approach to global analysis of Mycobacterium tuberculosis molecular epidemiology.ProcNatlAcadSciUSA.2001;98:1901-6.).
MIRU-VNTR(Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit-Variable Number Tandem Repeat) DNA 타이핑(typing) 기술은 개체마다 반복회수가 다른 결핵균의 24개 유전자좌의 반복회수를 확인하여 개체마다 고유한 유전자형을 분석하는 방법이다(RAJWANI, Rahim; SHEHZAD, Sheeba; SIU, Gilman Kit Hang. MIRU-profiler: a rapid tool for determination of 24-loci MIRU-VNTR profiles from assembled genomes of Mycobacterium tuberculosis. PeerJ, 2018, 6: e5090.; COWAN, Lauren Steinlein, et al. Variable-number tandem repeat typing of Mycobacterium tuberculosis isolates with low copy numbers of IS6110 by using mycobacterial interspersed repetitive units. Journal of clinical microbiology, 2002, 40.5: 1592-1602.).
최근 미국의 인구 기반 연구(population-based study)를 보면, 스포리고타이핑(spoligotyping)과 결합하여 일차 스크리닝(screening)으로 12-좌위를 사용하였을 때, 대부분의 환자군에서 충분한 변별력을 보여주었다. 따라서, 이미 미국에서는 결핵균에 대한 앞으로의 유망한 유전자형 분류(genotyping)를 가능하게 할 수 있다는 사실을 입증하였다. 그러나 접촉자 조사와 인구학적 또는 역학적 자료가 환자들 사이의 연관성 유무를 파악할 수 있는 증거를 제시하지 않는 경우들에 있어서는, 여전히 IS6110 타이핑(typing)이 함께 발생한 균주들을 분류하기 위한 추가적인 실험 방법으로 요구된다.
대한민국 공개특허 10-2013-0125586에서는 우리나라 결핵 균주를 가장 잘 분류해 줄 수 있는 12개의 VNTR 좌위(loci) 조합에 대한 프라이머를 포함하는 VNTR에 의한 결핵균의 형질 분류를 위한 키트 및 이를 이용한 VNTR에 의한 결핵균의 형질 분류 방법을 개시하고 있다. 다만, 본 발명의 유전자좌 MIRU-VNTR의 개수와 조합에 있어서 차이가 있다.
상기 내용을 바탕으로 본 발명은 대한민국 내 결핵균의 24개 유전자좌 MIRU-VNTR를 증폭하기 위한 프라이머 쌍과 반응 시약을 포함하는 조성물을 제공하고, 중합효소 연쇄 반응 검출방법 및 24개 유전자좌 MIRU-VNTR 증폭 산물의 증폭크기를 분석하는 모세관 전기영동 분류방법을 이용하여 결핵균의 전파 경로를 파악하고 결핵 확산 방지를 위한 방역 시스템을 구축에 대응하고자 한다.
본 발명의 목적은 결핵균의 유전자형 분류를 위한 MIRU-VNTR(Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit-Variable Number Tandem Repeat) 조성물 및 이를 이용한 결핵균의 유전자형 분류 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 24개 유전자좌 MIRU-VNTR 프라이머 세트 및 이를 포함하는 것을 특징으로 하는 결핵균의 유전자형 분류를 위한 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 결핵균의 유전자형 분석를 위한 키트를 제공한다.
본 발명은 결핵균 유전자형 분류방법을 제공한다.
본 발명의 조성물 또는 방법을 사용하여 결핵균의 유전자형을 빠르고 쉽게 분석할 수 있다. 이를 통해 결핵균의 발병 및 전파 경로의 지속적인 모니터링을 하여 주변국으로부터 유입되는 결핵 환자를 관리하고 효율적인 방역 시스템을 구축하는 데 이바지할 수 있다.
도 1은 Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv의 아가로즈 겔 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 Set 5의 증폭산물에 대한 모세관 전기영동 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3a는 Mycobacterium tuberculosis strain 40건의 유전자형 분석 결과 전체를 나타낸 도이다.
도 3b는 Mycobacterium tuberculosis strain 40건의 유전자형 분석 결과 중 베이징(Beijing) 유전자형을 확대한 도이다.
도 3c는 Mycobacterium tuberculosis strain 40건의 유전자형 분석 결과 중 카메룬(Cameroon) 유전자형을 확대한 도이다.
도 3d는 Mycobacterium tuberculosis strain 40건의 유전자형 분석 결과 중 할렘(Haarlem) 유전자형을 확대한 도이다.
도 3e는 Mycobacterium tuberculosis strain 40건의 유전자형 분석 결과 중 터키(Turkey) 유전자형을 확대한 도이다.
도 3f는 Mycobacterium tuberculosis strain 40건의 유전자형 분석 결과 중 EAI(East African-Indian) 유전자형을 확대한 도이다.
도 2는 Set 5의 증폭산물에 대한 모세관 전기영동 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3a는 Mycobacterium tuberculosis strain 40건의 유전자형 분석 결과 전체를 나타낸 도이다.
도 3b는 Mycobacterium tuberculosis strain 40건의 유전자형 분석 결과 중 베이징(Beijing) 유전자형을 확대한 도이다.
도 3c는 Mycobacterium tuberculosis strain 40건의 유전자형 분석 결과 중 카메룬(Cameroon) 유전자형을 확대한 도이다.
도 3d는 Mycobacterium tuberculosis strain 40건의 유전자형 분석 결과 중 할렘(Haarlem) 유전자형을 확대한 도이다.
도 3e는 Mycobacterium tuberculosis strain 40건의 유전자형 분석 결과 중 터키(Turkey) 유전자형을 확대한 도이다.
도 3f는 Mycobacterium tuberculosis strain 40건의 유전자형 분석 결과 중 EAI(East African-Indian) 유전자형을 확대한 도이다.
이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명은 MIRU40, Mtub39, QUB11b,QUB11b QUB26, MIRU04, Mtub34, Mtub29, ETRB, ETRC, MIRU10, MIRU16, MIRU23, QUB4156, MIRU24, MIRU39, Mtub04, Mtub30, Mtub21, MIRU02, MIRU20, MIRU27, MIRU26, MIRU31 및 ETRA로 구성되는 24개의 유전자좌 중 어느 하나 이상을 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 MIRU-VNTR에 의한 결핵균의 유전자형 분류를 위한 조성물을 제공한다(표 1).
상기 유전자좌를 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트는 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 한다(표 1):
좌위 세트 중 하나의 좌위가 MIRU40 인 경우 서열번호 1, 서열 번호 2;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 Mtub39 인 경우 서열번호 3, 서열 번호 4;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 QUB11b 인 경우 서열번호 5, 서열번호 6;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 QUB26 인 경우 서열번호 7, 서열번호 8;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 MIRU04 인 경우 서열번호 9, 서열번호 10;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 Mtub34 인 경우 서열번호 11, 서열번호 12;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 Mtub29 인 경우 서열번호 13, 서열번호 14;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 ETRB 인 경우 서열번호 15, 서열번호 16;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 ETRC 인 경우 서열번호 17, 서열번호 18;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 MIRU10 인 경우 서열번호 19, 서열번호 20;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 MIRU16 인 경우 서열번호 21, 서열번호 22;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 MIRU23 인 경우 서열번호 23, 서열번호 24;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 QUB4156 인 경우 서열번호 25, 서열번호 26;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 MIRU24 인 경우 서열번호 27, 서열번호 28;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 MIRU39 인 경우 서열번호 29, 서열번호 30;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 Mtub04 인 경우 서열번호 31, 서열번호 32;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 Mtub30 인 경우 서열번호 33, 서열번호 34;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 Mtub21 인 경우 서열번호 35, 서열번호 36;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 MIRU02 인 경우 서열번호 37, 서열번호 38;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 MIRU20 인 경우 서열번호 39, 서열번호 40;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 MIRU27 인 경우 서열번호 41, 서열번호 42;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 MIRU26 인 경우 서열번호 43, 서열번호 44;
좌위 세트 중 하나의 좌위가 MIRU31 인 경우 서열번호 45, 서열번호 46; 및
좌위 세트 중 하나의 좌위가 ETRA 인 경우 서열번호 47, 서열번호 48.
상기 증폭은 상기 24개의 유전자좌를 하나 이상 또는 특정 조합으로 증폭하는 것을 특징으로 한다.
상기 특정 조합은 하기의 조합으로 구성되는 것을 특징으로 한다(표 1):
1) 세트(set) 1: MIRU40, Mtub39, QUB11b 및 QUB26;
2) 세트(set) 2: MIRU04, Mtub34, Mtub29 및 ETRB;
3) 세트(set) 3: ETRC, MIRU10, MIRU16 및 MIRU23;
4) 세트(set) 4: QUB4156, MIRU24, MIRU39 및 Mtub04;
5) 세트(set) 5: Mtub30, Mtub21, MIRU02 및 MIRU20; 및
6) 세트(set) 6: MIRU27, MIRU26, MIRU31 및 ETRA.
상기 프라이머 세트는 각 정방향(forward) 염기서열 5‘ 말단에 형광 염료를 포함하는 것을 특징으로 한다(표 1).
상기 정방향(forward) 염기서열은 서열번호 1 내지 48 중 홀수인 것을 특징으로 한다(표 1):
서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 및 47.
상기 1) 내지 6)의 세트(set)는 이들 각각의 4개의 유전자좌가 각기 다른 형광 염료로 표지되어 동시에 다중 분석이 가능하도록 설계되어 있는 것을 특징으로 한다.
상기 형광 염료는 FAM(6-carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro -6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), PETⓡ, 텍사스 레드(texas red), SFC-Nⓡ, 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl ), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluore scein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dim ethoxyfluorescein), ROX(6-Carb oxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein ), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-r hodamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 형광 염료이다.
또한, 본 발명은 제1항 내지 제7항 중 어느 항의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 MIRU-VNTR에 의한 결핵균의 유전자형 분류를 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)으로부터 DNA 조각을 수득하는 단계; 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭산물을 얻는 단계; 및 모세관 전기영동(capillary electrophoresis, CE)으로 증폭산물의 크기를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 MIRU-VNTR에 의한 결핵균의 유전자형을 분류하는 방법을 제공한다.
상기 중합효소 연쇄반응은 하기의 조건으로 진행하는 것을 특징으로 한다:
a) 전-변성(pre-denaturation) 과정: 95℃에서 15분간
b) 변성(denaturation) 과정: 95℃에서 1분간,
c) 어닐링(annealing) 과정: 59℃에서 1분간,
d) 연장(extension) 과정: 72℃에서 1.5분간 40회 반복 및
e) 후-연장(post-extension) 과정: 72℃에서 10분간.
상기 모세관 전기영동은 증폭산물의 크기에 따라 다른 속도로 이동하여 검출부에 도달한 DNA 절편의 형광이 방출하는 파장을 순차적으로 감지하는 것을 특징으로 한다.
상기 결핵균의 유전자형을 분류하는 방법은 MIRU-VNTR plus 데이터베이스(database)를 통해 분류하는 것을 특징으로 한다.
이하에서는 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 아래 실시예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실험예 1. 결핵균의 24개 유전자좌 특이적인 프라이머 제작
결핵균의 24개 유전자좌 특이적인 프라이머를 설계하기 위하여 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스(database)의 결핵 균주 염기서열(sequence)을 수집하고 이론적 검출률을 평가하였다.
설계된 24개 프라이머 세트는 사용의 편의성을 위해 4개 유전자좌의 동시 다중 진단이 가능하도록 설계되었고, 4개 유전자좌가 한 세트로 총 6개 세트로 구성된다(표 1).
설계된 프라이머와 수집된 유전자좌 염기서열의 상동성이 100% 일치하는 것을 확인하였다(표 2 내지 5).
데이터베이스(Database) 내에서 설계된 각 24개 유전자좌 MIRU-VNTR 특이적인 프라이머는 형광을 이용한 모세관 전기영동기술에 적용할 수 있도록 정방향 프라이머 염기서열의 5' 말단에 형광물질 FAM, HEX, NED 또는 PET가 결합되어 있다(표 1).
| Set | 5' - motif | Primer | Sequence (5'-3') | 서열번호 | 구입처 | MIRU-VNTR loci |
| 1 | FAM | Forward | CGGTGATCTCGGAGAAATCCTAT | 1 | 에스에프씨(주) | MIRU40 |
| - | Reverse | AATCAGATACGCTGGCGCC | 2 | ㈜마크로젠 | ||
| HEX | Forward | CGTCGCAGTCAATCACGGT | 3 | 에스에프씨(주) | Mtub39 | |
| Reverse | CCCGTAGGCGGCGTAGAG | 4 | ㈜마크로젠 | |||
| PET | Forward | GTGACGCCTAATACGAATGTGCTAA | 5 | ThermoFisher scientific | QUB11b | |
| - | Reverse | AACACGGGGTACCTAAACCTCG | 6 | ㈜마크로젠 | ||
| SFCN | Forward | GCTGTTATGGTGCGAGTCACG | 7 | 에스에프씨(주) | QUB26 | |
| - | Reverse | CTCGGTGCGCACCAATTC | 8 | ㈜마크로젠 | ||
| 2 | FAM | Forward | ACGAGCGACCCGAGCAG | 9 | 에스에프씨(주) | MIRU04 |
| - | Reverse | TGGCCTCAAAGCCCTCCTT | 10 | ㈜마크로젠 | ||
| HEX | Forward | GCCTTCGAAGTAATCGGCG | 11 | 에스에프씨(주) | Mtub34 | |
| - | Reverse | CCTGTGTCGGCAACGCCTA | 12 | ㈜마크로젠 | ||
| PET | Forward | AGCCGGGAGTTATCACCAGAC | 13 | ThermoFisher scientific | Mtub29 | |
| - | Reverse | CCAGTAACTCCATGATCATGTCGA | 14 | ㈜마크로젠 | ||
| SFCN | Forward | GCCTACATCGAGCTGCATCAG | 15 | 에스에프씨(주) | ETRB | |
| - | Reverse | ACCAGTGCGATTGGCATTG | 16 | ㈜마크로젠 | ||
| 3 | FAM | Forward | ATTCGGACTTCAATGCGTTGTT | 17 | 에스에프씨(주) | ETRC |
| - | Reverse | ACAAACACCTGAAGAGGCACAG | 18 | ㈜마크로젠 | ||
| HEX | Forward | CTCACCAGCGTCAGGCCAT | 19 | 에스에프씨(주) | MIRU10 | |
| - | Reverse | CGGTCACCATGTCGCTGTT | 20 | ㈜마크로젠 | ||
| PET | Forward | GCGACCAGATCCAGCATTTC | 21 | ThermoFisher scientific | MIRU16 | |
| - | Reverse | TGATGGTGTGCTGGCTGTTATT | 22 | ㈜마크로젠 | ||
| SFCN | Forward | TCCAACGCTCACCAGGATC | 23 | 에스에프씨(주) | MIRU23 | |
| - | Reverse | TAGGTCAGGTCGGTATGGCATA | 24 | ㈜마크로젠 | ||
| 4 | FAM | Forward | CCGAGGTCTCGACGTCGAT | 25 | 에스에프씨(주) | QUB4156 |
| - | Reverse | AGGGTCATGGCGACCAGAC | 26 | ㈜마크로젠 | ||
| HEX | Forward | CCGCTGGTCAGCTTCGATG | 27 | 에스에프씨(주) | MIRU24 | |
| - | Reverse | CCACAGCTGCTCCTCGACA | 28 | ㈜마크로젠 | ||
| PET | Forward | GTCCATCTGCTGCTGGCTACC | 29 | ThermoFisher scientific | MIRU39 | |
| - | Reverse | ATCGTCTGCAGTAGCGTCGA | 30 | ㈜마크로젠 | ||
| SFCN | Forward | GTCGAGTTGCTGCGCCA | 31 | 에스에프씨(주) | Mtub04 | |
| - | Reverse | AACTCGACCACAACCCCGT | 32 | ㈜마크로젠 | ||
| 5 | FAM | Forward | ACATCATCGCTGTGGTCGC | 33 | 에스에프씨(주) | Mtub30 |
| - | Reverse | TCCTTGACGAGGTCAAGGCTT | 34 | ㈜마크로젠 | ||
| HEX | Forward | GATCAAACCGCGCGGATC | 35 | 에스에프씨(주) | Mtub21 | |
| - | Reverse | CCGGCAGTCGCTCCAAC | 36 | ㈜마크로젠 | ||
| PET | Forward | CACCGTGCTCTGTGTCAACAAC | 37 | ThermoFisher scientific | MIRU02 | |
| - | Reverse | CATCGAATCCCGTGCGAT | 38 | ㈜마크로젠 | ||
| SFCN | Forward | GTCCGCTTTGCGCACGA | 39 | 에스에프씨(주) | MIRU20 | |
| - | Reverse | ACGCTGCCGTCGCAATAG | 40 | ㈜마크로젠 | ||
| 6 | FAM | Forward | TTCACCGGGCAACGCATAG | 41 | 에스에프씨(주) | MIRU27 |
| - | Reverse | CGCCGTACCGTGAGATCAC | 42 | ㈜마크로젠 | ||
| HEX | Forward | GCGCCTGTGCACACGTG | 43 | 에스에프씨(주) | MIRU26 | |
| - | Reverse | TCACTCGAGTCCAGGTCGG | 44 | ㈜마크로젠 | ||
| PET | Forward | GTTGCGAATTGCAGTCTCGATAG | 45 | ThermoFisher scientific | MIRU31 | |
| - | Reverse | TCGACGGATACCACCGCAG | 46 | ㈜마크로젠 | ||
| SFCN | Forward | GAGGCTGCCGGACACGT | 47 | 에스에프씨(주) | ETRA | |
| - | Reverse | TCACCTTCTTATCGGGTGGTTATAGT | 48 | ㈜마크로젠 |
| No. | Reference | % Identity | |||||
| MIRU40 | Mtub39 | QUB11b | |||||
| Forward | Reverse | Forward | Reverse | Forward | Reverse | ||
| 1 | AE000516 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 2 | AP012340 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 3 | CP002992 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 4 | CP010873 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 5 | CP012090 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 6 | CP017593 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 7 | CP017595 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 8 | CP017597 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 9 | CP017598 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 10 | CP019610 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 11 | CP019613 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 12 | CP022577 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 13 | CP022578 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 14 | HE663067 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 15 | NC_000962 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 16 | NC_008769 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 17 | NC_012207 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| No. | Reference | % Identity | |||||
| QUB26 | MIRU04 | Mtub34 | |||||
| Forward | Reverse | Forward | Reverse | Forward | Reverse | ||
| 1 | AE000516 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 2 | AP012340 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 3 | CP002992 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 4 | CP010873 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 5 | CP012090 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 6 | CP017593 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 7 | CP017595 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 8 | CP017597 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 9 | CP017598 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 10 | CP019610 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 11 | CP019613 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 12 | CP022577 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 13 | CP022578 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 14 | HE663067 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 15 | NC_000962 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 16 | NC_008769 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 17 | NC_012207 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| No. | Reference | % Identity | |||||
| Mtub29 | ETRB | ETRC | |||||
| Forward | Reverse | Forward | Reverse | Forward | Reverse | ||
| 1 | AE000516 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 2 | AP012340 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 3 | CP002992 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 4 | CP010873 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 5 | CP012090 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 6 | CP017593 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 7 | CP017595 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 8 | CP017597 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 9 | CP017598 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 10 | CP019610 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 11 | CP019613 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 12 | CP022577 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 13 | CP022578 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 14 | HE663067 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 15 | NC_000962 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 16 | NC_008769 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 17 | NC_012207 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| No. | Reference | % Identity | |||||
| MIRU10 | MIRU16 | MIRU23 | |||||
| Forward | Reverse | Forward | Reverse | Forward | Reverse | ||
| 1 | AE000516 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 2 | AP012340 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 3 | CP002992 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 4 | CP010873 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 5 | CP012090 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 6 | CP017593 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 7 | CP017595 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 8 | CP017597 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 9 | CP017598 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 10 | CP019610 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 11 | CP019613 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 12 | CP022577 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 13 | CP022578 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 14 | HE663067 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 15 | NC_000962 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 16 | NC_008769 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 17 | NC_012207 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| No. | Reference | % Identity | |||||
| QUB4156 | MIRU24 | MIRU39 | |||||
| Forward | Reverse | Forward | Reverse | Forward | Reverse | ||
| 1 | AE000516 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 2 | AP012340 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 3 | CP002992 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 4 | CP010873 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 5 | CP012090 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 6 | CP017593 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 7 | CP017595 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 8 | CP017597 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 9 | CP017598 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 10 | CP019610 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 11 | CP019613 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 12 | CP022577 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 13 | CP022578 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 14 | HE663067 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 15 | NC_000962 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 16 | NC_008769 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 17 | NC_012207 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| No. | Reference | % Identity | |||||
| Mtub04 | Mtub30 | Mtub21 | |||||
| Forward | Reverse | Forward | Reverse | Forward | Reverse | ||
| 1 | AE000516 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 2 | AP012340 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 3 | CP002992 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 4 | CP010873 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 5 | CP012090 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 6 | CP017593 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 7 | CP017595 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 8 | CP017597 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 9 | CP017598 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 10 | CP019610 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 11 | CP019613 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 12 | CP022577 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 13 | CP022578 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 14 | HE663067 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 15 | NC_000962 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 16 | NC_008769 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 17 | NC_012207 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| No. | Reference | % Identity | |||||
| MIRU02 | MIRU20 | MIRU27 | |||||
| Forward | Reverse | Forward | Reverse | Forward | Reverse | ||
| 1 | AE000516 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 2 | AP012340 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 3 | CP002992 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 4 | CP010873 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 5 | CP012090 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 6 | CP017593 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 7 | CP017595 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 8 | CP017597 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 9 | CP017598 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 10 | CP019610 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 11 | CP019613 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 12 | CP022577 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 13 | CP022578 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 14 | HE663067 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 15 | NC_000962 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 16 | NC_008769 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 17 | NC_012207 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| No. | Reference | % Identity | |||||
| MIRU26 | MIRU31 | ETRA | |||||
| Forward | Reverse | Forward | Reverse | Forward | Reverse | ||
| 1 | AE000516 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 2 | AP012340 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 3 | CP002992 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 4 | CP010873 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 5 | CP012090 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 6 | CP017593 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 7 | CP017595 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 8 | CP017597 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 9 | CP017598 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 10 | CP019610 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 11 | CP019613 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 12 | CP022577 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 13 | CP022578 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 14 | HE663067 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 15 | NC_000962 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 16 | NC_008769 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 17 | NC_012207 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
실험예 2. 참조(Reference) 시스템
참조(Reference) 시스템의 실험 단계는 중합효소 연쇄 반응법을 통한 PCR 산물 증폭 단계와 아가로즈 겔 또는 모세관 전기영동법을 통한 결과분석 단계로 구성되어 있다. 시스템의 멀티플렉스 프리믹스(multiplex premix) 조성물은 표 3에 나타내었으며, 자세한 시험 방법은 하기 실험예 2-1 및 2-2에 기재하였다.
실험예 2-1. 참조 시스템의 중합효소 연쇄반응법
중합효소 연쇄반응법은 MgCl2, H20, 10X Buffer(QIAGEN), 5X Q solution(QIAGEN), dNTP(ROCHE), Hotstart DNA polymerase(QIAGEN), 각각의 프라이머 세트 및 2 ng의 주형 DNA를 첨가하여 수행하였다. 여기서, 각 멀티플렉스의 조성은 표 6에 나타내었다.
중합효소 연쇄반응(PCR)의 전-변성(pre-denaturation) 과정은 94℃에서 15분간, 변성(denaturation) 과정은 94℃에서 1분간, 어닐링(annealing) 과정은 59℃에서 1분간, 연장(extension) 과정은 72℃에서 1.5분간 40회 반복 및 후-연장(post-extension) 과정은 72℃에서 10분간 반응시키는 조건에서 수행하였다.
| Mix | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Loci | 4-26-40 | 10-16-31 | 0424-0577-2165 | 2401-3690-4156 | 2163b-1955-4052 | 2-23-39 | 20-24-27 | 2347-2461-3171 |
| H2O | 7.5 | 8.3 | 8.7 | 7.5 | 8.7 | 7.9 | 8.7 | 8.3 |
| 10X Buffer | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 5X Q solution | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
| 25mM MgCl2 | 1.2 | 0.4 | 0 | 1.2 | 0 | 0.8 | 0 | 0.4 |
| 5 mM dNTP | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 |
| Each Primer | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 |
| Hotstart DNA pol. | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.08 |
| Total | 18 | 18 | 18 | 18 | 18 | 18 | 18 | 18 |
실험예 2-2. 참조 시스템의 전기영동법
중합효소 연쇄반응법으로 생산된 증폭산물의 반복 횟수는 전기영동의 원리로 산출되며, 본 발명에서는 Applied Biosystems™사의 3500 Series Genetic Analyzers 장비를 사용하였다. 형광이 결합된 DNA 증폭산물은 그 크기에 따라 다른 속도로 이동하므로 검출부에 도달한 DNA 절편의 형광이 방출하는 파장을 순차적으로 감지함으로써 DNA 절편의 크기별로 형광의 종류와 양을 분석하였다.
Genetic Analyzers 분류를 위한 반응액 조성은 8개 Mix에서 증폭된 각각의 PCR 증폭산물 1μL 와 Formamide (Applied Biosystems™ HiDi™) 10 μL 및 1200(GeneScan™ 1200 LIZ™ dye Size Standard, Applied Biosystems™) 0.2μL가 혼합된 반응액을 분석한다.
Genetic Analyzers 분석 장비를 통해 산출된 결과는 소프트웨어 GeneMapper version 4.1을 사용하여 시각화하였으며, 24개 유전자좌의 반복 횟수의 조합에 따라 MIRU-VNTRplus (https://www.miruvntr plus.org/MIRU/miruinfo.faces) 데이터베이스(database)를 통해 유전자 계통을 판별하였다.
실험예 3. 결핵균주(
Mycobacterium tuberculosis
strain) H37Rv에 대한 24개 유전자좌 MIRU-VNTR 분석
24개 유전자좌가 알려진 결핵균주(Mycobacterium tuberculosis strain) H37Rv(ATCC 25618™)를 이용하여 결핵균 유전자형 분석을 수행하였다.
중합효소 연쇄 반응에서 6세트 모두에서 증폭이 확인되었고(도 1), 모세관 전기영동법과 GeneMapper version 4.1을 사용하여 24개 유전자좌의 크기(size)를 분석하였다(도 2, 표 7).
| M. tuberculosis H37Rv |
Loci | MIRU 02 | Mtub 04 |
ETRC | MIRU 04 | MIRU 40 | MIRU 10 | MIRU 16 | Mtub 21 |
MIRU 20 | QUB 2163b |
ETRA | Mtub 29 |
| Size(bp) | 606 | 660 | 466 | 383 | 410 | 706 | 861 | 316 | 707 | 706 | 359 | 704 | |
| Allele | 2 | 2 | 4 | 3s | 1 | 3 | 2 | 2 | 2 | 5 | 3 | 4 | |
| Loci | Mtub 30 |
ETRB | MIRU 23 | MIRU 24 | MIRU 26 | MIRU 27 | Mtub 34 |
MIRU 31 | Mtub 39 |
QUB 26 |
QUB 4156 |
MIRU 39 | |
| Size(bp) | 442 | 610 | 583 | 539 | 433 | 560 | 461 | 720 | 440 | 795 | 430 | 753 | |
| Allele | 2 | 3 | 6 | 1 | 2 | 3 | 3 | 3 | 5 | 5 | 2 | 2 |
24개 유전자좌의 분석된 결과는 MIRU-VNTR plus (https://www.miruvntr plus.org/MIRU/miruinfo. faces) 데이터베이스(database)를 통해 결핵균주(Mycobacterium tuberculosis strain) H37Rv 유전자형으로 분류되었다(도 3a).
실험예 4. 결핵균 유전자형 분석능 비교
국립마산병원 결핵검체은행으로부터 제공받은 결핵균 양성 핵산 40개를 이용하여 본 발명 시스템과 참조(Reference) 시스템과의 비교 평가를 수행하였다.
본 발명 시스템을 통해 산출된 결핵균의 40건의 24개 유전자좌 MIRU-VNTR plus 데이터베이스를 통해 분석하고 유전자형을 판별한 결과, 결핵균 양성 40건 중 24건은 Beijing, 7건은 Cameroon, 6건은 EAI(East African-Indian), 2건은 Turkey, 1건은 Haarlem 유전자형으로 분류되었다(도 3b 내지 3f, 표 8 내지 11).
유전자형의 판별은 산출된 24 MIRU-VNTR loci의 조합을 통해 분류되었으며, 각 조합에 대한 결과는 MIRU-VNTRplus 데이터베이스(database)를 통해 확인되었다.
본 발명 시스템을 이용한 24 MIRU-VNTR 좌(loci) 분석 결과 결핵균 양성 40건의 24개의 좌(locus)에서 100% 검출률을 나타냈으며, 참조(Reference) 시스템을 이용한 분석 결과 결핵균4의 Mtub04, 결핵균7의 ETRB, 결핵균20의 QUB26 좌(locus)가 검출되지 않았다. 이에 참조 시스템의 24 MIRU-VNTR 좌(loci) 중에서 Mtub04, ETRB 및 QUB26은 97.5%의 검출률을 나타내었고, 이를 제외한 나머지 21개의 좌에서 100% 검출률을 나타내었다(표 12).
두 가지 타이핑(typing) 방법의 유전자형 분석능을 비교하였을 때, 본 발명 시스템의 24 MIRU-VNTR 좌(loci) 검출률이 참조(Reference) 시스템보다 우수한 것을 확인하였으며, 참조(Reference) 시스템에서 검출되지 않은 좌(locus) 항목에 대하여 시퀀싱 분석을 수행한 결과 본 발명 시스템의 결과와 일치하는 것을 확인하였다.
| 본 발명 시스템 |
Loci | MIRU 02 | Mtub 04 |
ETRC | MIRU 04 | MIRU 40 | MIRU 10 | MIRU 16 | Mtub 21 |
MIRU 20 | QUB 11b |
ETRA | Mtub 29 |
유전자형 |
| Allele | ||||||||||||||
| 결핵균1 | 2 | 2 | 5 | 2 | 3 | 3 | 3 | 4 | 2 | 2 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균2 | 2 | 3 | 4 | 2 | 2 | 3 | 3 | 5 | 2 | 5 | 4 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균3 | 2 | 4 | 4 | 1 | 3 | 3 | 3 | 5 | 2 | 6 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균4 | 2 | 2 | 4 | 2 | 3 | 3 | 3 | 4 | 2 | 2 | 4 | 5 | Beijinig | |
| 결핵균5 | 2 | 2 | 4 | 6 | 3 | 4 | 2 | 5 | 2 | 2 | 7 | 3 | EAI | |
| 결핵균6 | 2 | 4 | 4 | 2 | 3 | 3 | 2 | 4 | 1 | 4 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균7 | 2 | 3 | 4 | 2 | 4 | 3 | 4 | 4 | 2 | 7 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균8 | 2 | 3 | 4 | 2 | 2 | 3 | 3 | 5 | 2 | 5 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균9 | 2 | 1 | 4 | 2 | 3 | 3 | 2 | 3 | 2 | 4 | 4 | 4 | Cameroon | |
| 결핵균10 | 2 | 1 | 4 | 2 | 3 | 3 | 2 | 3 | 2 | 4 | 4 | 4 | Cameroon | |
| 결핵균11 | 2 | 2 | 4 | 6 | 3 | 4 | 2 | 5 | 2 | 1 | 6 | 3 | EAI | |
| 결핵균12 | 2 | 2 | 4 | 6 | 3 | 4 | 2 | 5 | 2 | 1 | 6 | 3 | EAI | |
| 결핵균13 | 2 | 1 | 4 | 2 | 3 | 3 | 2 | 3 | 2 | 4 | 4 | 4 | Cameroon | |
| 결핵균14 | 3 | 2 | 4 | 6 | 3 | 4 | 2 | 5 | 2 | 2 | 7 | 3 | EAI | |
| 결핵균15 | 2 | 1 | 4 | 5 | 2 | 4 | 3 | 10 | 2 | 8 | 4 | 3 | EAI | |
| 결핵균16 | 2 | 1 | 4 | 2 | 2 | 3 | 3 | 3 | 2 | 4 | 4 | 4 | Cameroon | |
| 결핵균17 | 2 | 2 | 4 | 6 | 3 | 4 | 2 | 5 | 2 | 1 | 6 | 3 | EAI | |
| 결핵균18 | 2 | 2 | 4 | 2 | 3 | 3 | 3 | 3 | 2 | 2 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균19 | 2 | 3 | 4 | 2 | 3 | 3 | 3 | 4 | 2 | 7 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균20 | 2 | 4 | 4 | 2 | 3 | 3 | 2 | 4 | 1 | 4 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균21 | 2 | 3 | 4 | 2 | 2 | 3 | 3 | 5 | 2 | 4 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균22 | 2 | 3 | 4 | 2 | 2 | 3 | 3 | 5 | 2 | 5 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균23 | 2 | 2 | 4 | 2 | 2 | 3 | 3 | 3 | 2 | 3 | 3 | 4 | Cameroon | |
| 결핵균24 | 2 | 4 | 4 | 2 | 3 | 3 | 3 | 5 | 2 | 5 | 3 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균25 | 2 | 4 | 4 | 2 | 3 | 3 | 3 | 5 | 2 | 5 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균26 | 2 | 2 | 4 | 1 | 2 | 5 | 1 | 3 | 2 | 2 | 3 | 4 | Turkey | |
| 결핵균27 | 2 | 4 | 4 | 2 | 3 | 3 | 3 | 4 | 2 | 3 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균28 | 2 | 4 | 4 | 1 | 3 | 3 | 3 | 5 | 2 | 6 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균29 | 2 | 2 | 4 | 2 | 3 | 3 | 3 | 5 | 2 | 6 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균30 | 2 | 2 | 4 | 2 | 3 | 3 | 3 | 4 | 2 | 2 | 4 | 6 | Beijinig | |
| 결핵균31 | 2 | 4 | 4 | 1 | 3 | 3 | 3 | 5 | 2 | 6 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균32 | 2 | 3 | 4 | 2 | 2 | 3 | 5 | 6 | 2 | 5 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균33 | 2 | 2 | 4 | 1 | 2 | 5 | 1 | 3 | 2 | 2 | 3 | 4 | Turkey | |
| 결핵균34 | 2 | 4 | 3 | 2 | 4 | 4 | 3 | 3 | 2 | 3 | 3 | 4 | Haarlem | |
| 결핵균35 | 2 | 3 | 4 | 2 | 3 | 3 | 3 | 4 | 2 | 7 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균36 | 2 | 2 | 4 | 2 | 3 | 2 | 3 | 3 | 2 | 4 | 3 | 4 | Cameroon | |
| 결핵균37 | 2 | 4 | 4 | 2 | 3 | 3 | 4 | 4 | 2 | 7 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균38 | 2 | 2 | 5 | 2 | 3 | 3 | 3 | 4 | 2 | 2 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균39 | 2 | 2 | 4 | 2 | 3 | 3 | 3 | 4 | 2 | 2 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균40 | 2 | 1 | 4 | 2 | 3 | 3 | 3 | 2 | 2 | 2 | 4 | 4 | Cameroon | |
| 본 발명 시스템 |
Loci | Mtub 30 |
ETRB | MIRU 23 | MIRU 24 | MIRU 26 | MIRU 27 | Mtub 34 |
MIRU 31 | Mtub 39 |
QUB 26 |
QUB 4156 |
MIRU 39 | 유전자형 |
| Allele | ||||||||||||||
| 결핵균1 | 4 | 2 | 5 | 1 | 3 | 3 | 3 | 5 | 3 | 3 | 3 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균2 | 4 | 2 | 5 | 1 | 7 | 3 | 3 | 6 | 3 | 9 | 3 | 2 | Beijinig | |
| 결핵균3 | 4 | 2 | 5 | 1 | 7 | 3 | 3 | 5 | 3 | 8 | 2 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균4 | 4 | 3 | 7 | 1 | 3 | 3 | 3 | 5 | 3 | 8 | 3 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균5 | 2 | 4 | 5 | 2 | 2 | 2 | 3 | 5 | 4 | 6 | 1 | 3 | EAI | |
| 결핵균6 | 4 | 2 | 5 | 1 | 6 | 2 | 3 | 5 | 3 | 8 | 4 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균7 | 2 | 2 | 5 | 1 | 8 | 3 | 3 | 5 | 2 | 2 | 4 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균8 | 4 | 2 | 5 | 1 | 7 | 3 | 3 | 4 | 3 | 9 | 3 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균9 | 2 | 2 | 5 | 1 | 3 | 3 | 3 | 3 | 2 | 6 | 2 | 2 | Cameroon | |
| 결핵균10 | 2 | 2 | 5 | 1 | 3 | 3 | 3 | 3 | 2 | 6 | 2 | 2 | Cameroon | |
| 결핵균11 | 2 | 3 | 6 | 2 | 2 | 3 | 3 | 5 | 4 | 6 | 1 | 3 | EAI | |
| 결핵균12 | 2 | 3 | 6 | 2 | 2 | 3 | 3 | 5 | 4 | 6 | 1 | 3 | EAI | |
| 결핵균13 | 2 | 2 | 5 | 1 | 3 | 3 | 3 | 3 | 2 | 6 | 2 | 2 | Cameroon | |
| 결핵균14 | 2 | 4 | 6 | 2 | 2 | 3 | 3 | 4 | 4 | 6 | 1 | 3 | EAI | |
| 결핵균15 | 2 | 6 | 6 | 2 | 2 | 3 | 3 | 4 | 2 | 7 | 1 | 3 | EAI | |
| 결핵균16 | 2 | 2 | 5 | 1 | 3 | 3 | 3 | 3 | 2 | 6 | 2 | 2 | Cameroon | |
| 결핵균17 | 2 | 3 | 6 | 2 | 2 | 3 | 3 | 5 | 4 | 6 | 1 | 3 | EAI | |
| 결핵균18 | 4 | 2 | 5 | 1 | 3 | 3 | 3 | 5 | 3 | 9 | 3 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균19 | 4 | 2 | 5 | 1 | 3 | 3 | 3 | 5 | 5 | 8 | 4 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균20 | 4 | 2 | 5 | 1 | 6 | 2 | 3 | 5 | 3 | 8 | 4 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균21 | 4 | 2 | 5 | 1 | 7 | 3 | 3 | 6 | 3 | 9 | 3 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균22 | 4 | 2 | 5 | 1 | 7 | 3 | 3 | 4 | 3 | 9 | 3 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균23 | 2 | 2 | 5 | 1 | 4 | 3 | 3 | 3 | 2 | 6 | 2 | 2 | Cameroon | |
| 결핵균24 | 4 | 2 | 5 | 1 | 7 | 3 | 3 | 5 | 3 | 8 | 2 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균25 | 4 | 3 | 5 | 1 | 7 | 3 | 3 | 5 | 3 | 8 | 2 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균26 | 4 | 2 | 5 | 1 | 1 | 3 | 3 | 3 | 3 | 9 | 3 | 2 | Turkey | |
| 결핵균27 | 2 | 2 | 5 | 1 | 7 | 3 | 3 | 2 | 3 | 8 | 3 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균28 | 4 | 2 | 5 | 1 | 7 | 3 | 3 | 5 | 3 | 8 | 2 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균29 | 4 | 2 | 5 | 1 | 6 | 3 | 3 | 5 | 3 | 8 | 2 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균30 | 4 | 2 | 5 | 1 | 5 | 3 | 3 | 5 | 3 | 8 | 3 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균31 | 4 | 2 | 5 | 1 | 6 | 3 | 3 | 5 | 3 | 8 | 2 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균32 | 4 | 2 | 5 | 1 | 7 | 3 | 3 | 4 | 3 | 8 | 3 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균33 | 4 | 2 | 5 | 1 | 1 | 3 | 3 | 3 | 3 | 9 | 3 | 2 | Turkey | |
| 결핵균34 | 4 | 2 | 5 | 1 | 5 | 3 | 3 | 3 | 3 | 6 | 3 | 2 | Haarlem | |
| 결핵균35 | 4 | 2 | 5 | 1 | 3 | 3 | 3 | 5 | 5 | 8 | 4 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균36 | 2 | 1 | 5 | 1 | 5 | 3 | 3 | 3 | 5 | 8 | 2 | 2 | Cameroon | |
| 결핵균37 | 4 | 2 | 5 | 1 | 7 | 3 | 3 | 5 | 3 | 2 | 4 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균38 | 4 | 2 | 5 | 1 | 3 | 3 | 3 | 5 | 3 | 3 | 3 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균39 | 4 | 2 | 5 | 1 | 5 | 3 | 3 | 5 | 3 | 8 | 3 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균40 | 2 | 2 | 5 | 1 | 4 | 3 | 3 | 3 | 2 | 6 | 2 | 2 | Cameroon | |
| 참조 시스템 |
Loci | MIRU 02 | Mtub 04 |
ETRC | MIRU 04 | MIRU 40 | MIRU 10 | MIRU 16 | Mtub 21 |
MIRU 20 | QUB 11b |
ETRA | Mtub 29 |
유전자형 |
| Allele | ||||||||||||||
| 결핵균1 | 2 | 2 | 5 | 2 | 3 | 3 | 3 | 4 | 2 | 2 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균2 | 2 | 3 | 4 | 2 | 2 | 3 | 3 | 5 | 2 | 5 | 4 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균3 | 2 | 4 | 4 | 1 | 3 | 3 | 3 | 5 | 2 | 6 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균4 | 2 | - | 4 | 2 | 3 | 3 | 3 | 4 | 2 | 2 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균5 | 2 | 2 | 4 | 6 | 3 | 4 | 2 | 5 | 2 | 2 | 7 | 3 | EAI | |
| 결핵균6 | 2 | 4 | 4 | 2 | 3 | 3 | 2 | 4 | 1 | 4 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균7 | 2 | 3 | 4 | 2 | 4 | 3 | 4 | 4 | 2 | 7 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균8 | 2 | 3 | 4 | 2 | 2 | 3 | 3 | 5 | 2 | 5 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균9 | 2 | 1 | 4 | 2 | 3 | 3 | 2 | 3 | 2 | 4 | 4 | 4 | Cameroon | |
| 결핵균10 | 2 | 1 | 4 | 2 | 3 | 3 | 2 | 3 | 2 | 4 | 4 | 4 | Cameroon | |
| 결핵균11 | 2 | 2 | 4 | 6 | 3 | 4 | 2 | 5 | 2 | 1 | 6 | 3 | EAI | |
| 결핵균12 | 2 | 2 | 4 | 6 | 3 | 4 | 2 | 5 | 2 | 1 | 6 | 3 | EAI | |
| 결핵균13 | 2 | 1 | 4 | 2 | 3 | 3 | 2 | 3 | 2 | 4 | 4 | 4 | Cameroon | |
| 결핵균14 | 3 | 2 | 4 | 6 | 3 | 4 | 2 | 5 | 2 | 2 | 7 | 3 | EAI | |
| 결핵균15 | 2 | 1 | 4 | 5 | 2 | 4 | 3 | 10 | 2 | 8 | 4 | 3 | EAI | |
| 결핵균16 | 2 | 1 | 4 | 2 | 2 | 3 | 3 | 3 | 2 | 4 | 4 | 4 | Cameroon | |
| 결핵균17 | 2 | 2 | 4 | 6 | 3 | 4 | 2 | 5 | 2 | 1 | 6 | 3 | EAI | |
| 결핵균18 | 2 | 2 | 4 | 2 | 3 | 3 | 3 | 3 | 2 | 2 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균19 | 2 | 3 | 4 | 2 | 3 | 3 | 3 | 4 | 2 | 7 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균20 | 2 | 4 | 4 | 2 | 3 | 3 | 2 | 4 | 1 | 4 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균21 | 2 | 3 | 4 | 2 | 2 | 3 | 3 | 5 | 2 | 4 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균22 | 2 | 3 | 4 | 2 | 2 | 3 | 3 | 5 | 2 | 5 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균23 | 2 | 2 | 4 | 2 | 2 | 3 | 3 | 3 | 2 | 3 | 3 | 4 | Cameroon | |
| 결핵균24 | 2 | 4 | 4 | 2 | 3 | 3 | 3 | 5 | 2 | 5 | 3 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균25 | 2 | 4 | 4 | 2 | 3 | 3 | 3 | 5 | 2 | 5 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균26 | 2 | 2 | 4 | 1 | 2 | 5 | 1 | 3 | 2 | 2 | 3 | 4 | Turkey | |
| 결핵균27 | 2 | 4 | 4 | 2 | 3 | 3 | 3 | 4 | 2 | 3 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균28 | 2 | 4 | 4 | 1 | 3 | 3 | 3 | 5 | 2 | 6 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균29 | 2 | 2 | 4 | 2 | 3 | 3 | 3 | 5 | 2 | 6 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균30 | 2 | 2 | 4 | 2 | 3 | 3 | 3 | 4 | 2 | 2 | 4 | 6 | Beijinig | |
| 결핵균31 | 2 | 4 | 4 | 1 | 3 | 3 | 3 | 5 | 2 | 6 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균32 | 2 | 3 | 4 | 2 | 2 | 3 | 5 | 6 | 2 | 5 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균33 | 2 | 2 | 4 | 1 | 2 | 5 | 1 | 3 | 2 | 2 | 3 | 4 | Turkey | |
| 결핵균34 | 2 | 4 | 3 | 2 | 4 | 4 | 3 | 3 | 2 | 3 | 3 | 4 | Haarlem | |
| 결핵균35 | 2 | 3 | 4 | 2 | 3 | 3 | 3 | 4 | 2 | 7 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균36 | 2 | 2 | 4 | 2 | 3 | 2 | 3 | 3 | 2 | 4 | 3 | 4 | Cameroon | |
| 결핵균37 | 2 | 4 | 4 | 2 | 3 | 3 | 4 | 4 | 2 | 7 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균38 | 2 | 2 | 5 | 2 | 3 | 3 | 3 | 4 | 2 | 2 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균39 | 2 | 2 | 4 | 2 | 3 | 3 | 3 | 4 | 2 | 2 | 4 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균40 | 2 | 1 | 4 | 2 | 3 | 3 | 3 | 2 | 2 | 2 | 4 | 4 | Cameroon | |
| 참조 시스템 |
Loci | Mtub 30 |
ETRB | MIRU 23 | MIRU 24 | MIRU 26 | MIRU 27 | Mtub 34 |
MIRU 31 | Mtub 39 |
QUB 26 |
QUB 4156 |
MIRU 39 | 유전자형 |
| Allele | ||||||||||||||
| 결핵균1 | 4 | 2 | 5 | 1 | 3 | 3 | 3 | 5 | 3 | 3 | 3 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균2 | 4 | 2 | 5 | 1 | 7 | 3 | 3 | 6 | 3 | 9 | 3 | 2 | Beijinig | |
| 결핵균3 | 4 | 2 | 5 | 1 | 7 | 3 | 3 | 5 | 3 | 8 | 2 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균4 | 4 | 2 | 7 | 1 | 3 | 3 | 3 | 5 | 3 | 8 | 3 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균5 | 2 | 4 | 5 | 2 | 2 | 2 | 3 | 5 | 4 | 6 | 1 | 3 | EAI | |
| 결핵균6 | 4 | 2 | 5 | 1 | 6 | 2 | 3 | 5 | 3 | 8 | 4 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균7 | 2 | - | 5 | 1 | 8 | 3 | 3 | 5 | 2 | 2 | 4 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균8 | 4 | 2 | 5 | 1 | 7 | 3 | 3 | 4 | 3 | 9 | 3 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균9 | 2 | 2 | 5 | 1 | 3 | 3 | 3 | 3 | 2 | 6 | 2 | 2 | Cameroon | |
| 결핵균10 | 2 | 2 | 5 | 1 | 3 | 3 | 3 | 3 | 2 | 6 | 2 | 2 | Cameroon | |
| 결핵균11 | 2 | 3 | 6 | 2 | 2 | 3 | 3 | 5 | 4 | 6 | 1 | 3 | EAI | |
| 결핵균12 | 2 | 3 | 6 | 2 | 2 | 3 | 3 | 5 | 4 | 6 | 1 | 3 | EAI | |
| 결핵균13 | 2 | 2 | 5 | 1 | 3 | 3 | 3 | 3 | 2 | 6 | 2 | 2 | Cameroon | |
| 결핵균14 | 2 | 4 | 6 | 2 | 2 | 3 | 3 | 4 | 4 | 6 | 1 | 3 | EAI | |
| 결핵균15 | 2 | 6 | 6 | 2 | 2 | 3 | 3 | 4 | 2 | 7 | 1 | 3 | EAI | |
| 결핵균16 | 2 | 2 | 5 | 1 | 3 | 3 | 3 | 3 | 2 | 6 | 2 | 2 | Cameroon | |
| 결핵균17 | 2 | 3 | 6 | 2 | 2 | 3 | 3 | 5 | 4 | 6 | 1 | 3 | EAI | |
| 결핵균18 | 4 | 2 | 5 | 1 | 3 | 3 | 3 | 5 | 3 | 9 | 3 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균19 | 4 | 2 | 5 | 1 | 3 | 3 | 3 | 5 | 5 | 8 | 4 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균20 | 4 | 2 | 5 | 1 | 6 | 2 | 3 | 5 | 3 | - | 4 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균21 | 4 | 2 | 5 | 1 | 7 | 3 | 3 | 6 | 3 | 9 | 3 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균22 | 4 | 2 | 5 | 1 | 7 | 3 | 3 | 4 | 3 | 9 | 3 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균23 | 2 | 2 | 5 | 1 | 4 | 3 | 3 | 3 | 2 | 6 | 2 | 2 | Cameroon | |
| 결핵균24 | 4 | 2 | 5 | 1 | 7 | 3 | 3 | 5 | 3 | 8 | 2 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균25 | 4 | 3 | 5 | 1 | 7 | 3 | 3 | 5 | 3 | 8 | 2 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균26 | 4 | 2 | 5 | 1 | 1 | 3 | 3 | 3 | 3 | 10 | 3 | 2 | Turkey | |
| 결핵균27 | 2 | 2 | 5 | 1 | 7 | 3 | 3 | 2 | 3 | 8 | 3 | 4 | Beijinig | |
| 결핵균28 | 4 | 2 | 5 | 1 | 7 | 3 | 3 | 5 | 3 | 8 | 2 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균29 | 4 | 2 | 5 | 1 | 6 | 3 | 3 | 5 | 3 | 8 | 2 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균30 | 4 | 2 | 5 | 1 | 5 | 3 | 3 | 5 | 3 | 8 | 3 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균31 | 4 | 2 | 5 | 1 | 6 | 3 | 3 | 5 | 3 | 8 | 2 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균32 | 4 | 2 | 5 | 1 | 7 | 3 | 3 | 4 | 3 | 8 | 3 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균33 | 4 | 2 | 5 | 1 | 1 | 3 | 3 | 3 | 3 | 10 | 3 | 2 | Turkey | |
| 결핵균34 | 4 | 2 | 5 | 1 | 5 | 3 | 3 | 3 | 3 | 6 | 3 | 2 | Haarlem | |
| 결핵균35 | 4 | 2 | 5 | 1 | 3 | 3 | 3 | 5 | 5 | 8 | 4 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균36 | 2 | 1 | 5 | 1 | 5 | 3 | 3 | 3 | 5 | 8 | 2 | 2 | Cameroon | |
| 결핵균37 | 4 | 2 | 5 | 1 | 7 | 3 | 3 | 5 | 3 | 2 | 4 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균38 | 4 | 2 | 5 | 1 | 3 | 3 | 3 | 5 | 3 | 3 | 3 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균39 | 4 | 2 | 5 | 1 | 5 | 3 | 3 | 5 | 3 | 8 | 3 | 3 | Beijinig | |
| 결핵균40 | 2 | 2 | 5 | 1 | 4 | 3 | 3 | 3 | 2 | 6 | 2 | 2 | Cameroon | |
| 시스템 | Loci | MIRU 02 | Mtub 04 |
ETRC | MIRU 04 | MIRU 40 | MIRU 10 | MIRU 16 | Mtub 21 |
MIRU 20 | QUB 11b |
ETRA | Mtub 29 |
| 본 발명 시스템 | 검출 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 |
| 검출률 (%) |
100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | |
| 참조(Reference) 시스템 |
검출 | 40/40 | 39/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 |
| 검출률 (%) |
100% | 97.5% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | |
| 시스템 | Loci | Mtub 30 |
ETRB | MIRU 23 | MIRU 24 | MIRU 26 | MIRU 27 | Mtub 34 |
MIRU 31 | Mtub 39 |
QUB 26 |
QUB 4156 |
MIRU 39 |
| 본 발명 시스템 | 검출 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 |
| 검출률 (%) |
100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | |
| 참조(Reference) 시스템 |
검출 | 40/40 | 39/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 40/40 | 39/40 | 40/40 | 40/40 |
| 검출률 (%) |
100% | 97.5% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 97.5% | 100% | 100% |
결핵균의 유전자형 분류를 위한 결핵균 유전자형 분류방법
실시예 1-1. 중합효소 연쇄반응법
중합효소 연쇄반응법은 PowerAmp™2X Premix Ⅳ(Kogene biotech, Cat. No. T0009), 각각의 프라이머 세트 및 2 ng의 주형 DNA를 첨가하여 수행하였다. 여기서, 각 프라이머 세트의 농도는 표 13에 나타내었다.
중합효소 연쇄반응(PCR)의 전-변성(pre-denaturation) 과정은 95℃에서 15분간, 변성(denaturation) 과정은 95℃에서 1분간, 어닐링(annealing) 과정은 59℃에서 1분간, 연장(extension) 과정은 72℃에서 1.5분간 40회 반복 및 후-연장(post-extension) 과정은 72℃에서 10분간 반응시키는 조건에서 수행하였다.
| Set | No. | MIRU-VNTR loci | Final concentration (nM) |
| 1 | 1 | MIRU40 | 250 nM |
| 2 | Mtub39 | 250 nM | |
| 3 | QUB2163b | 250 nM | |
| 4 | QUB26 | 250 nM | |
| 2 | 5 | MIRU04 | 200 nM |
| 6 | Mtub34 | 150 nM | |
| 7 | Mtub29 | 250 nM | |
| 8 | ETRB | 150 nM | |
| 3 | 9 | ETRC | 250 nM |
| 10 | MIRU10 | 200 nM | |
| 11 | MIRU16 | 250 nM | |
| 12 | MIRU23 | 200 nM | |
| 4 | 13 | QUB4156 | 100 nM |
| 14 | MIRU24 | 150 nM | |
| 15 | MIRU39 | 250 nM | |
| 16 | Mtub04 | 250 nM | |
| 5 | 17 | Mtub30 | 350 nM |
| 18 | Mtub21 | 150 nM | |
| 19 | MIRU02 | 200 nM | |
| 20 | MIRU20 | 500 nM | |
| 6 | 21 | MIRU27 | 300 nM |
| 22 | MIRU26 | 200 nM | |
| 23 | MIRU31 | 600 nM | |
| 24 | ETRA | 250 nM |
실시예 1-2. 모세관 전기영동법
중합효소 연쇄반응법으로 생산된 증폭산물의 반복 횟수는 전기영동의 원리로 산출되며, 본 발명에서는 Applied Biosystems™사의 3500 Series Genetic Analyzers 장비를 사용하였다. 형광이 결합된 DNA 증폭산물은 그 크기에 따라 다른 속도로 이동하므로 검출부에 도달한 DNA 절편의 형광이 방출하는 파장을 순차적으로 감지함으로써 DNA 절편의 크기별로 형광의 종류와 양을 분석하였다.
Genetic Analyzers 분류를 위한 반응액 조성은 6개 세트에서 증폭된 각각의 PCR 증폭산물 1μL 와 Formamide (Applied Biosystems™ HiDi™) 9 μL 및 MapMarker® 1500(Dy632 Labeled 50-1500bp, BioVentures, Inc.) 0.5μL가 혼합된 반응액을 분석한다.
Genetic Analyzers 분석 장비를 통해 산출된 결과는 소프트웨어 GeneMapper version 4.1을 사용하여 시각화하였으며, 24개 유전자좌의 반복 횟수의 조합에 따라 MIRU-VNTRplus (https://www.miruvntr plus.org/MIRU/miruinfo.faces) 데이터베이스(database)를 통해 유전자 계통을 판별하였다.
<110> KoGene BioTech Co., LTD.
<120> MIRU-VNTR compositions for analysing Mycobacterium tuberculosis
genotype and method for classifying Mycobacterium tuberculosis
genotype using the same
<130> 2021P-06-013
<160> 48
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIRU40-Forward
<400> 1
cggtgatctc ggagaaatcc tat 23
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIRU40-Reverse
<400> 2
aatcagatac gctggcgcc 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mtub39-Forward
<400> 3
cgtcgcagtc aatcacggt 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mtub39-Reverse
<400> 4
cccgtaggcg gcgtagag 18
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> QUB11b-Forward
<400> 5
gtgacgccta atacgaatgt gctaa 25
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> QUB11b-Reverse
<400> 6
aacacggggt acctaaacct cg 22
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> QUB26-Forward
<400> 7
gctgttatgg tgcgagtcac g 21
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> QUB26-Reverse
<400> 8
ctcggtgcgc accaattc 18
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIRU04-Forward
<400> 9
acgagcgacc cgagcag 17
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIRU04-Reverse
<400> 10
tggcctcaaa gccctcctt 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mtub34-Forward
<400> 11
gccttcgaag taatcggcg 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mtub34-Reverse
<400> 12
cctgtgtcgg caacgccta 19
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mtub29-Forward
<400> 13
agccgggagt tatcaccaga c 21
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mtub29-Reverse
<400> 14
ccagtaactc catgatcatg tcga 24
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ETRB-Forward
<400> 15
gcctacatcg agctgcatca g 21
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ETRB-Reverse
<400> 16
accagtgcga ttggcattg 19
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ETRC-Forward
<400> 17
attcggactt caatgcgttg tt 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ETRC-Reverse
<400> 18
acaaacacct gaagaggcac ag 22
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIRU10-Forward
<400> 19
ctcaccagcg tcaggccat 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIRU10-Reverse
<400> 20
cggtcaccat gtcgctgtt 19
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIRU16-Forward
<400> 21
gcgaccagat ccagcatttc 20
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIRU16-Reverse
<400> 22
tgatggtgtg ctggctgtta tt 22
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIRU23-Forward
<400> 23
tccaacgctc accaggatc 19
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIRU23-Reverse
<400> 24
taggtcaggt cggtatggca ta 22
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> QUB4156-Forward
<400> 25
ccgaggtctc gacgtcgat 19
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> QUB4156-Reverse
<400> 26
agggtcatgg cgaccagac 19
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIRU24-Forward
<400> 27
ccgctggtca gcttcgatg 19
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIRU24-Reverse
<400> 28
ccacagctgc tcctcgaca 19
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIRU39-Forward
<400> 29
gtccatctgc tgctggctac c 21
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIRU39-Reverse
<400> 30
atcgtctgca gtagcgtcga 20
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mtub04-Forward
<400> 31
gtcgagttgc tgcgcca 17
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mtub04-Reverse
<400> 32
aactcgacca caaccccgt 19
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mtub30-Forward
<400> 33
acatcatcgc tgtggtcgc 19
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mtub30-Reverse
<400> 34
tccttgacga ggtcaaggct t 21
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mtub21-Forward
<400> 35
gatcaaaccg cgcggatc 18
<210> 36
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mtub21-Reverse
<400> 36
ccggcagtcg ctccaac 17
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIRU02-Forward
<400> 37
caccgtgctc tgtgtcaaca ac 22
<210> 38
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIRU02-Reverse
<400> 38
catcgaatcc cgtgcgat 18
<210> 39
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIRU20-Forward
<400> 39
gtccgctttg cgcacga 17
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIRU20-Reverse
<400> 40
acgctgccgt cgcaatag 18
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIRU27-Forward
<400> 41
ttcaccgggc aacgcatag 19
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIRU27-Reverse
<400> 42
cgccgtaccg tgagatcac 19
<210> 43
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIRU26-Forward
<400> 43
gcgcctgtgc acacgtg 17
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIRU26-Reverse
<400> 44
tcactcgagt ccaggtcgg 19
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIRU31-Forward
<400> 45
gttgcgaatt gcagtctcga tag 23
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIRU31-Reverse
<400> 46
tcgacggata ccaccgcag 19
<210> 47
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ETRA-Forward
<400> 47
gaggctgccg gacacgt 17
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ETRA-Reverse
<400> 48
tcaccttctt atcgggtggt tatagt 26
Claims (13)
- 하기 1) 내지 6)의 유전자좌 세트(set)를 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 MIRU-VNTR(Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit-Variable Number Tandem Repeat)에 의한 결핵균의 유전자형 분류를 위한 조성물.
1) 유전자좌 세트(set) 1: MIRU40, Mtub39, QUB11및 QUB26;
2) 유전자좌 세트(set) 2: MIRU04, Mtub34, Mtub29 및 ETRB;
3) 유전자좌 세트(set) 3: ETRC, MIRU10, MIRU16 및 MIRU23;
4) 유전자좌 세트(set) 4: QUB4156, MIRU24, MIRU39 및 Mtub04;
5) 유전자좌 세트(set) 5: Mtub30, Mtub21, MIRU02 및 MIRU20; 및
6) 유전자좌 세트(set) 6: MIRU27, MIRU26, MIRU31 및 ETRA. - 제1항에 있어서,
상기 유전자좌 세트를 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트는 다음과 같이 구성되는 것을 특징으로 하는 MIRU-VNTR에 의한 결핵균의 유전자형 분류를 위한 조성물:
프라미어 세트 중 하나의 좌위가 MIRU40 인 경우 서열번호 1, 서열 번호 2;
프라미어 세트 중 하나의 좌위가 Mtub39 인 경우 서열번호 3, 서열 번호 4;
프라미어 세트 중 하나의 좌위가 QUB11인 경우 서열번호 5, 서열번호 6;
프라미어 세트 중 하나의 좌위가 QUB26 인 경우 서열번호 7, 서열번호 8;
프라미어 세트 중 하나의 좌위가 MIRU04 인 경우 서열번호 9, 서열번호 10;
프라미어 세트 중 하나의 좌위가 Mtub34 인 경우 서열번호 11, 서열번호 12;
프라미어 세트 중 하나의 좌위가 Mtub29 인 경우 서열번호 13, 서열번호 14;
프라미어 세트 중 하나의 좌위가 ETRB 인 경우 서열번호 15, 서열번호 16;
프라미어 세트 중 하나의 좌위가 ETRC 인 경우 서열번호 17, 서열번호 18;
프라미어 세트 중 하나의 좌위가 MIRU10 인 경우 서열번호 19, 서열번호 20;
프라미어 세트 중 하나의 좌위가 MIRU16 인 경우 서열번호 21, 서열번호 22;
프라미어 세트 중 하나의 좌위가 MIRU23 인 경우 서열번호 23, 서열번호 24;
프라미어 세트 중 하나의 좌위가 QUB4156 인 경우 서열번호 25, 서열번호 26;
프라미어 세트 중 하나의 좌위가 MIRU24 인 경우 서열번호 27, 서열번호 28;
프라미어 세트 중 하나의 좌위가 MIRU39 인 경우 서열번호 29, 서열번호 30;
프라미어 세트 중 하나의 좌위가 Mtub04 인 경우 서열번호 31, 서열번호 32;
프라미어 세트 중 하나의 좌위가 Mtub30 인 경우 서열번호 33, 서열번호 34;
프라미어 세트 중 하나의 좌위가 Mtub21 인 경우 서열번호 35, 서열번호 36;
프라미어 세트 중 하나의 좌위가 MIRU02 인 경우 서열번호 37, 서열번호 38;
프라미어 세트 중 하나의 좌위가 MIRU20 인 경우 서열번호 39, 서열번호 40;
프라미어 세트 중 하나의 좌위가 MIRU27 인 경우 서열번호 41, 서열번호 42;
프라미어 세트 중 하나의 좌위가 MIRU26 인 경우 서열번호 43, 서열번호 44;
프라미어 세트 중 하나의 좌위가 MIRU31 인 경우 서열번호 45, 서열번호 46; 및
프라미어 세트 중 하나의 좌위가 ETRA 인 경우 서열번호 47, 서열번호 48. - 삭제
- 삭제
- 제2항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 각 정방향(forward) 염기서열 5‘ 말단에 형광 염료를 포함하는 것을 특징으로 하는 MIRU-VNTR에 의한 결핵균의 유전자형 분류를 위한 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 정방향(forward) 염기서열은 서열번호 1 내지 48 중 홀수인 것을 특징으로 하는 MIRU-VNTR에 의한 결핵균의 유전자형 분류를 위한 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 1) 내지 6)의 유전자좌 세트(set)는 이들 각각의 4개의 유전자좌가 각기 다른 형광 염료로 표지되어 동시에 다중 분석이 가능하도록 설계되어 있는 것을 특징으로 하는 MIRU-VNTR에 의한 결핵균의 유전자형 분류를 위한 조성물. - 제5항 또는 제7항에 있어서,
상기 형광 염료는 FAM(6-carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro -6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), PETⓡ , 텍사스 레드(texas red), SFC-Nⓡ, 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl ), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Di methoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein ), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rho damine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 형광 염료를 포함하는 것을 특징으로 하는 MIRU-VNTR에 의한 결핵균의 유전자형 분류를 위한 조성물. - 제1항, 제2항 및 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 MIRU-VNTR에 의한 결핵균의 유전자형 분류를 위한 키트.
- 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)으로부터 DNA 조각을 수득하는 단계;
제1항의 조성물을 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭산물을 얻는 단계; 및
모세관 전기영동(capillary electrophoresis, CE)으로 증폭산물의 크기를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 MIRU-VNTR에 의한 결핵균의 유전자형을 분류하는 방법. - 제10항에 있어서,
상기 중합효소 연쇄반응은 하기의 조건으로 진행하는 것을 특징으로 하는 MIRU-VNTR에 의한 결핵균의 유전자형을 분류하는 방법:
a) 전-변성(pre-denaturation) 과정: 95℃에서 15분간
b) 변성(denaturation) 과정: 95℃에서 1분간,
c) 어닐링(annealing) 과정: 59℃에서 1분간,
d) 연장(extension) 과정: 72℃에서 1.5분간 40회 반복 및
e) 후-연장(post-extension) 과정: 72℃에서 10분간. - 제10항에 있어서,
상기 모세관 전기영동은 증폭산물의 크기에 따라 다른 속도로 이동하여 검출부에 도달한 DNA 절편의 형광이 방출하는 파장을 순차적으로 감지하는 것을 특징으로 하는 MIRU-VNTR에 의한 결핵균의 유전자형을 분류하는 방법. - 제10항에 있어서,
상기 결핵균의 유전자형을 분류하는 방법은 MIRU-VNTR plus 데이터베이스(database)를 통해 분류하는 것을 특징으로 하는 MIRU-VNTR에 의한 결핵균의 유전자형을 분류하는 방법.
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|---|---|---|---|
| KR1020210085318A KR102405988B1 (ko) | 2021-06-30 | 2021-06-30 | 결핵균의 유전자형 분류를 위한 miru-vntr 조성물 및 이를 이용한 결핵균 유전자형 분류방법 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020210085318A KR102405988B1 (ko) | 2021-06-30 | 2021-06-30 | 결핵균의 유전자형 분류를 위한 miru-vntr 조성물 및 이를 이용한 결핵균 유전자형 분류방법 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102405988B1 true KR102405988B1 (ko) | 2022-06-08 |
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| KR1020210085318A KR102405988B1 (ko) | 2021-06-30 | 2021-06-30 | 결핵균의 유전자형 분류를 위한 miru-vntr 조성물 및 이를 이용한 결핵균 유전자형 분류방법 |
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|---|---|
| KR (1) | KR102405988B1 (ko) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009125228A1 (en) * | 2008-04-09 | 2009-10-15 | Health Protection Agency | Rapid detection of mycobacteria |
| KR20130125586A (ko) * | 2012-05-09 | 2013-11-19 | 사단법인대한결핵협회 | Ｖｎｔｒ에 의한 검체의 형질 분류를 위한 키트 및 이를 이용한 ｖｎｔｒ에 의한 검체의 형질 분류 방법 |
| CN103834743A (zh) * | 2014-03-25 | 2014-06-04 | 中华人民共和国吉林出入境检验检疫局 | 结核分枝杆菌基因分型检测引物组及其试剂盒 |
-
2021
- 2021-06-30 KR KR1020210085318A patent/KR102405988B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009125228A1 (en) * | 2008-04-09 | 2009-10-15 | Health Protection Agency | Rapid detection of mycobacteria |
| KR20130125586A (ko) * | 2012-05-09 | 2013-11-19 | 사단법인대한결핵협회 | Ｖｎｔｒ에 의한 검체의 형질 분류를 위한 키트 및 이를 이용한 ｖｎｔｒ에 의한 검체의 형질 분류 방법 |
| CN103834743A (zh) * | 2014-03-25 | 2014-06-04 | 中华人民共和国吉林出入境检验检疫局 | 结核分枝杆菌基因分型检测引物组及其试剂盒 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| PLOS ONE , 2017, 12(10): E0186088. [DOI.ORG/10.1371/JOURNAL.PONE.0186088] * |
| Rondroarivelo Rasoahanitralisoa et al., PLOS ONE, 12(10):e0186088, 2017.* * |
| Xin-Ling Pan et al., Emerging Microbes & Infections, 6, 2017.* * |
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