CN117625816A - 分枝杆菌的鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分枝杆菌的鉴定方法。该分枝杆菌的鉴定方法包括如下步骤：采用引物组合物对待测样本进行基因检测，以对待测样本进行分枝杆菌鉴定，引物组合物包括非结核分枝杆菌检测引物对，非结核分枝杆菌检测引物对包括碱基序列如SEQ ID No.33‑SEQ ID No.277、如SEQ ID No.310‑SEQ ID No.554所示的引物。本申请通过使用多重PCR靶向捕获技术和高通量二代测序技术，提供了一种可以快速、准确、高效鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的引物组合及试剂盒，可以覆盖常见的9种结核分枝杆菌和49种非结核分枝杆菌，可以为临床诊断和用药提供更准确、更全面的参考。

Description

分枝杆菌的鉴定方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及分枝杆菌的鉴定方法。
背景技术
分枝杆菌是放线菌的一个属，该属拥有超过190个被认可的物种，包括会导致哺乳动物严重疾病的病原体，例如结核分枝杆菌(MTB)、非结核分枝杆菌(NTM)、麻风分枝杆菌这几类。结核病是由结核分枝杆菌引起的一种疾病，现在仍然是国际上严重的公共卫生问题，尤其是在发展中国家。根据世界卫生组织统计，世界人口的1/3有结核分枝杆菌感染，同时非结核分枝杆菌感染总体也呈上升趋势。结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌均可引起肺部以及其它部位病变，而且临床症状相似，鉴别诊断困难。在缺乏菌种鉴定的情况下，NTM肺病常被误诊为结核病。目前治疗NTM肺病尚无特效药物，不同菌种的治疗方案差别很大，且多数NTM对抗结核药物耐药，治疗效果不佳。常见的能够致病的MTB与NTM共计有几十种，且治疗药物的选择存在较大差异。因此在临床上，快速准确地判定患者是否存在MTB或NTM感染，是何种致病菌引起的感染，对制定有效的治疗方案具有重要意义。
目前，临床上鉴定MTB和NTM的传统方法主要为培养法，根据菌落形态、氧偏好性、烟酸积累、硝酸盐还原酶的活性等表型特征判断，方法简单、试剂价格便宜，易于推广而被沿用至今。但其耗时长、阳性率低、污染大且缺乏可重复性，不能准确区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，不能及时地为临床诊断提供参考。随着分子生物学技术的迅速发展，其他技术方法也开始应用于分枝杆菌的鉴定，例如荧光PCR技术、多色荧光熔解曲线技术、微流控芯片技术、核酸质谱技术、测序技术等，可以弥补传统方法的一些不足，为临床诊断提供更多参考依据。一些研究公开了一种基于培养法的结核分枝杆菌的快速鉴定与分型方法，包括标本预处理、涂片、染色、菌体培养、生化检测等步骤，例如将标本接种到固体培养基中，37摄氏度恒温条件下进行培养，每五天观察一次，连续培养八周，然后菌体在组织磨碎器充分研磨使细胞破裂后，使用BACTEC法，以含14C棕榈酸作碳源底物的7H12培养基，继续在37摄氏度条件下培养。该方法检测准确性较高，但不足之处是检测周期较长，时效性较差。一些研究公开了一种实时荧光PCR检测鸟分枝杆菌的方法，它提供了一组特异引物对，以基因组DNA为模板，进行实时荧光PCR检测，通过扩增结果判断待测细菌是否为鸟分枝杆菌。该方法灵敏度高、特异性好、重复性好，不足之处是检测范围有限，只能针对特定的个别分枝杆菌菌种进行鉴定。一些研究公开了一种基于质谱的结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的鉴定方法，该方法包括选定同源基因和序列、分析菌株的基因序列、设计PCR引物和延伸引物、对检测菌株进行PCR扩增、对PCR扩增后体系进行dNTP消除、单碱基延伸等步骤，通过核酸检测质谱仪进行芯片点样和扫描，基于质谱峰来鉴定菌株。该方法检测准确，可以进行更细致的菌株分型，不足之处是每次检测的样本数量有一定限制，检测菌株分型的覆盖范围有限，另外，基于质谱的方法可能存在离子抑制效应，如果物质不纯、有杂质存在，会降低质谱的灵敏度。一些研究公开了一种基于测序的分枝杆菌鉴定方法。该方法首先设计通用引物，然后通过PCR的方法对待测菌株的chvd基因进行扩增，再进行测序后比对，从而鉴定待测菌株的种属。该方法对分枝杆菌的种属分类鉴定方法简单、鉴定速度快，不足之处是通过单个基因特定序列的测序分析在菌种鉴定的覆盖度上存在局限性，某些菌株可能无法检测到，也可能出现假阴性或假阳性的情况，检测准确性和特异性有待进一步提高。一些研究公开了一种基于多重荧光熔解曲线技术的检测非结核分枝杆菌的检测方法，通过设计得到的特异性引物组合探针组，对多重荧光PCR扩增得到的扩增产物进行熔解曲线分析，获得熔解温度，依据熔解温度能够快速准确的对非结核分枝杆菌进行检测。该检测方法具有特异性强、灵敏度高的特点，不足之处是，检测覆盖度有限，只能针对少数菌种进行鉴定。同时该技术需要区分Tm值差异极小的样品，以鉴别单个碱基的差异，因此，对温度分辨率的要求相当高，如果仪器的分辨率不高，是无法检测的。
综上所述，目前的技术方案对分枝杆菌菌种鉴定，主要存在的问题包括检测周期长、检测覆盖范围有限、不能准确区分各类分枝杆菌等。
发明内容
基于此，本申请提供一种分枝杆菌的鉴定方法。采用该鉴定方法能够有效区别至少49种非结核分枝杆菌。
一种分枝杆菌的鉴定方法，包括如下步骤：采用引物组合物对待测样本进行基因检测，以对所述待测样本进行分枝杆菌鉴定，所述引物组合物包括非结核分枝杆菌检测引物对，非结核分枝杆菌检测引物对包括碱基序列如SEQ IDNo.33-SEQ ID No.277、如SEQ IDNo.310-SEQ ID No.554所示的引物。
上述鉴定方法中涉及的引物组合物能够有效区别至少49种非结核分枝杆菌，可以为临床诊断和用药提供更准确、更全面的参考。
在其中一个实施例中，所述非结核分枝杆菌包括：副胞内分枝杆菌、缓黄分枝杆菌、鸟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、龟分枝杆菌、微黄分枝杆菌、胃分枝杆菌、戈登分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、海分枝杆菌、不产色分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、猿分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、土分枝杆菌、蟾分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、新金色分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、母牛分枝杆菌、加那利群岛分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、施氏分枝杆菌、哥伦比亚分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、日内瓦分枝杆菌、奥尔胡斯分枝杆菌、外来分枝杆菌、出众分枝杆菌、利雅得分枝杆菌、玛格丽特分枝杆菌、伤口分枝杆菌、产粘液分枝杆菌、罗讷河口分枝杆菌、蒂莫内分枝杆菌、托斯卡纳分枝杆菌、免疫原分枝杆菌、伊朗分枝杆菌、败血症分枝杆菌、莲建洞分枝杆菌、拟鸟分枝杆菌、奇美拉分枝杆菌、博莱分枝杆菌、鸟分枝杆菌人猪共患亚种、鸟分枝杆菌森林土壤亚种中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述引物组合物还包括结核分枝杆菌检测引物对，所述结核分枝杆菌检测引物对用于检测大羚羊分枝杆菌、结核分枝杆菌、条纹猫鼬分枝杆菌、卡氏分枝杆菌、山羊分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、海豹分枝杆菌、非洲分枝杆菌中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述结核分枝杆菌检测引物对包括碱基序列如SEQ IDNo.1-SEQ ID No.32、如SEQ ID No.278-SEQ ID No.309所示的引物。
在其中一个实施例中，所述引物组合物由碱基序列如SEQ ID No.5-SEQ IDNo.9、SEQ ID No.282-SEQ ID No.286、SEQ ID No.20-SEQ ID No.22、SEQ IDNo.207-SEQ IDNo.299、SEQ ID No.63-SEQ ID No.67、SEQ ID No.340-SEQ IDNo.344、SEQ ID No.93-SEQID No.97、SEQ ID No.370-SEQ ID No.374、SEQ IDNo.53-SEQ ID No.57、SEQ ID No.330-SEQ ID No.334、SEQ ID No.68-SEQ IDNo.72、SEQ ID No.345-SEQ ID No.349、SEQ IDNo.69-SEQ ID No.71、SEQ IDNo.346-SEQ ID No.348、SEQ ID No.78-SEQ ID No.82、SEQID No.355-SEQ IDNo.359、SEQ ID No.122-SEQ ID No.126、SEQ ID No.399-SEQ IDNo.403、SEQ ID No.112-SEQ ID No.116、SEQ ID No.389-SEQ ID No.393、SEQ ID No.137-SEQ ID No.141、SEQ ID No.414-SEQ ID No.418所示的引物构成。
在其中一个实施例中，所述采用引物组合物对待测样本进行基因检测的步骤包括：采用所述引物组合物对所述待测样本进行多重PCR扩增，然后进行测序，分析测序结果，以对所述待测样本进行分枝杆菌鉴定。
在其中一个实施例中，采用所述引物组合物对所述待测样本进行多重PCR扩增的步骤中，反应体系包括：ddH2O 1μL～5μL、Enhancer buffer NB(1N)3.5μL、Enhancerbuffer M 2.5μL、Primer pool 5μL、DNA模板3μL～8μL、IGT-EM808polymerase mixture 10μL，总体积30μL；
及/或，采用所述引物组合物对所述待测样本进行多重PCR扩增的步骤中，反应条件包括：93℃～97℃保持3min～4min；97℃～99℃保持15s～20s、58℃～62℃保持5min～7min、18～22个循环；71℃～73℃保持4min～6min；
及/或，所述引物组合物中，各引物的使用浓度为0.2μM～0.8μM，优选为0.5μM。
在其中一个实施例中，采用所述引物组合物对所述待测样本进行多重PCR扩增的步骤之后，包括如下步骤：对采用所述引物组合物进行PCR扩增得到的多重PCR产物进行接头序列多重PCR反应，以构建多重PCR文库。
在其中一个实施例中，接头序列多重PCR反应的体系包括：所述多重PCR产物10.5μL～14.5μL、Enhancer buffer M 2.5μL、ddH2O 1μL～5μL、5μM的UDI Index 2μL、IGT-EM808聚合酶混合物10μL；
及/或，接头序列多重PCR反应的条件包括：93℃～97℃保持3～4min；97℃～99℃保持15s～20s、56℃～60℃保持1～3min、71℃～73℃保持25s～35s、8～10个循环；71℃～73℃保持4min～6min。
附图说明
图1为本申请鉴定分枝杆菌的流程示意图；
图2为采用本申请引物组合物进行多重PCR扩增建库的示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本申请一实施方式提供一种用于检测分枝杆菌的引物组合物，包括：非结核分枝杆菌检测引物对，非结核分枝杆菌检测引物对包括碱基序列如SEQ IDNo.33-SEQ IDNo.277、如SEQ ID No.310-SEQ ID No.554所示的引物。
本申请涉及的上述引物组合物能够有效区别至少49种非结核分枝杆菌，可以为临床诊断和用药提供更准确、更全面的参考。
其中，非结核分枝杆菌包括：副胞内分枝杆菌、缓黄分枝杆菌、鸟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、龟分枝杆菌、微黄分枝杆菌、胃分枝杆菌、戈登分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、海分枝杆菌、不产色分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、猿分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、土分枝杆菌、蟾分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、新金色分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、母牛分枝杆菌、加那利群岛分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、施氏分枝杆菌、哥伦比亚分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、日内瓦分枝杆菌、奥尔胡斯分枝杆菌、外来分枝杆菌、出众分枝杆菌、利雅得分枝杆菌、玛格丽特分枝杆菌、伤口分枝杆菌、产粘液分枝杆菌、罗讷河口分枝杆菌、蒂莫内分枝杆菌、托斯卡纳分枝杆菌、免疫原分枝杆菌、伊朗分枝杆菌、败血症分枝杆菌、莲建洞分枝杆菌、拟鸟分枝杆菌、奇美拉分枝杆菌、博莱分枝杆菌、鸟分枝杆菌人猪共患亚种、鸟分枝杆菌森林土壤亚种中的至少一种。
具体地，非结核分枝杆菌包括：脓肿分枝杆菌、奥尔胡斯分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、鸟分枝杆菌、鸟分枝杆菌人猪共患亚种、拟鸟分枝杆菌、鸟分枝杆菌森林土壤亚种、博莱分枝杆菌、罗讷河口分枝杆菌、加那利群岛分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、龟分枝杆菌、奇美拉分枝杆菌、哥伦比亚分枝杆菌、出众分枝杆菌、微黄分枝杆菌、偶发分枝杆菌、胃分枝杆菌、日内瓦分枝杆菌、戈登分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、免疫原分枝杆菌、胞内分枝杆菌、伊朗分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、缓黄分枝杆菌、玛格丽特分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、海分枝杆菌、产粘液分枝杆菌、新金色分枝杆菌、不产色分枝杆菌、副胞内分枝杆菌、外来分枝杆菌、利雅得分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、败血症分枝杆菌、施氏分枝杆菌、猿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、土分枝杆菌、蒂莫内分枝杆菌、托斯卡纳分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、母牛分枝杆菌、伤口分枝杆菌、蟾分枝杆菌、莲建洞分枝杆菌中的至少一种。
在其中一些实施例中，上述引物组合物还包括结核分枝杆菌检测引物对，所述结核分枝杆菌检测引物对用于检测大羚羊分枝杆菌、结核分枝杆菌、条纹猫鼬分枝杆菌、卡氏分枝杆菌、山羊分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、海豹分枝杆菌、非洲分枝杆菌中的至少一种。
在其中一些实施例中，结核分枝杆菌检测引物对包括碱基序列如SEQ IDNo.1-SEQID No.32、如SEQ ID No.278-SEQ ID No.309所示的引物。
在其中一些实施例中，上述引物组合物由碱基序列如SEQ ID No.5-SEQ IDNo.9、SEQ ID No.282-SEQ ID No.286、SEQ ID No.20-SEQ ID No.22、SEQ IDNo.207-SEQ IDNo.299、SEQ ID No.63-SEQ ID No.67、SEQ ID No.340-SEQ IDNo.344、SEQ ID No.93-SEQID No.97、SEQ ID No.370-SEQ ID No.374、SEQ IDNo.53-SEQ ID No.57、SEQ ID No.330-SEQ ID No.334、SEQ ID No.68-SEQ IDNo.72、SEQ ID No.345-SEQ ID No.349、SEQ IDNo.69-SEQ ID No.71、SEQ IDNo.346-SEQ ID No.348、SEQ ID No.78-SEQ ID No.82、SEQID No.355-SEQ IDNo.359、SEQ ID No.122-SEQ ID No.126、SEQ ID No.399-SEQ IDNo.403、SEQ ID No.112-SEQ ID No.116、SEQ ID No.389-SEQ ID No.393、SEQ ID No.137-SEQ ID No.141、SEQ ID No.414-SEQ ID No.418所示的引物构成。
本申请提供了一种可以快速、准确、高效鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的引物组合物，可以覆盖常见的9种结核分枝杆菌和49种非结核分枝杆菌，能够应用于鉴定各类分枝杆菌，可以为临床诊断和用药提供更准确、更全面的参考。
本申请中基因组目标区域确定和引物设计的大致过程如下：从NCBI数据库获取目标菌种的基因组信息，然后将目标菌种的基因组序列与NCBI数据库其他物种的基因组序列进行比对分析，通过特定算法，找到目标菌种高度特异性的DNA序列。基于引物设计软件，针对多个目标DNA序列设计多重PCR引物。引物初步设计后，再通过引物质控软件对引物进行标准流程的质控，主要对引物的Tm值、GC含量、发夹结构、引物二聚体以及非特异扩增等方面进行评分，在实验前即可对引物的扩增效果初步评估。
本申请中，菌种特异性DNA序列的选择，针对每个菌种的基因组信息找到特异性的DNA序列，通过这些特异性的片段进行物种区分。由于本申请所关注的分枝杆菌种类较多，如果要将它们从样本中进行鉴定区分，就涉及大量的目标序列，且对序列的特异性要求较高，需尽量避免假阳性的情况。另外，因为菌种间存在同源序列，且每个菌种的菌株较多，会对本申请的序列选择造成干扰，或出现无法覆盖的情况，提升了设计难度。为了保证检测的特异性和覆盖度，本申请利用特有的算法，基于NCBI数据库已有的菌种基因组信息，通过生物信息学的多种比对分析，针对每个菌种的基因组DNA，选择和设计了多条特异性的目标DNA序列。在检测时，本申请首先针对这些目标DNA序列设计相应的引物，通过PCR的方式进行扩增，然后对这些DNA片段进行二代测序，与参考基因组进行比对分析，当测序获得的目标序列中至少有一个与参考序列的覆盖度和匹配度均达到100％时，判定为该菌种。同时，本申请还可以通过该菌种多个DNA片段间的组合分析，确定菌种信息，增加了检测的准确性。
本申请的多重PCR引物设计中，由于分枝杆菌鉴定所包括的特异性DNA序列数量较多，如果要通过PCR的方式实现相关检测位点的全覆盖，就需要设计几百对引物。而在一个PCR反应体系中包含的引物越多，对引物序列及反应条件的要求就越苛刻。因为在同一个反应体系中，可能出现引物二聚体、发夹结构，使得引物不能很好的与DNA模板结合，需要兼顾不同引物的Tm值、GC含量，使PCR反应条件尽可能保持一致，同时还需要考虑引物的扩增特异性等。另外，多重PCR技术在实际应用中，由于参考基因组本身的特殊性质，极个别位点会出现难覆盖或扩增效率低的情况。引物设计的困难包括以下几个方面：
(1)引物长度、扩增产物长度、Tm值、GC含量等参数选择的问题。由于多重PCR在同一个反应体系中包含很多对引物，而PCR反应条件是统一的，这就对引物对之间的协同性提出了较高的要求。在相同的反应条件下，为了保证每对引物的扩增效率，就需要使所选择的候选引物的参数尽量保持一致，从而提高了引物设计的难度，且引物数量越多难度越大。本申请针对这个问题，在候选引物设计的过程中，尝试用各种算法去评估各条引物的参数，并进行综合打分，最终获得候选引物组合。
(2)引物出现发夹结构、引物二聚体的问题。由于多重PCR引物数量众多，当引物序列选择不当的时候，可能出现引物发夹结构和引物二聚体，影响扩增效率，且引物数量越多，出现发夹结构和引物二聚体的几率越大。针对这些问题，本申请会对候选引物一一进行分析，通过特定的软件和算法，优化各种参数，对引物序列进行综合分析，预测反应体系是否存在引物发夹结构和引物二聚体，例如会对2条引物序列进行渐进式的单碱基重叠分析并进行打分等，从而最大限度的提升多重PCR扩增效率。
(3)引物特异性问题。多重PCR中引物如果出现非特异性扩增，会导致检测不够准确。为了保证引物特异性，本方案基于一套专业的算法，针对反应体系中每一对引物所扩增片段的特异性进行判定，例如该算法不允许在引物3’端的最后一个碱基发生错配，确保每对引物的扩增产物是唯一的，从而提高检测准确性。当出现可能的非特异性扩增时，本申请会重新设计引物进行替换，直至所有引物均为特异性扩增。
(4)所设计的引物可能出现扩增效率较低、无法覆盖目标位点的问题。本申请通过分析实测数据中目标位点的测序深度可以快速判断该位点引物的扩增效率。当发现同一目标位点在多个样本中的测序深度均接近0时，表明该位点的引物扩增效果差。本申请就需要设计新引物进行原有引物的替换和测试，解决位点未覆盖的问题。
(5)所设计的引物可能出现样本偏好性的问题。样本偏好性问题是指同一个目标位点在不同样本中的测序深度存在差异。例如目标位点在某个样本中的测序深度为0，但在其他样本中的测序深度正常。引发样本偏好性的原因可能是个别样本中引物退火结合的DNA序列存在多态性或者突变，导致引物结合效率降低，引发脱靶，最终导致目标位点的测序深度接近0。针对该问题，本申请将对引物进行优化，采用多个样本进行文库构建和测序，筛选出偏好性的位点，通过重新设计引物进行更换和验证，解决样本偏好性问题。
本申请一实施方式还提供一种分枝杆菌检测试剂盒，包括上述引物组合物。
在其中一些实施例种，引物组合物中，各引物的使用浓度为0.2～0.8μM，优选为0.5μM。
在其中一些实施例中，上述检测试剂盒还包括：PCR反应缓冲液、PCR聚合酶、dNTP、盐溶液、测序接头中的至少一种。
本申请提供了一种可以快速、准确、高效鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的检测试剂盒，可以覆盖常见的9种结核分枝杆菌和49种非结核分枝杆菌，能够应用于鉴定各类分枝杆菌，可以为临床诊断和用药提供更准确、更全面的参考。
本申请一实施方式还提供一种分枝杆菌的鉴定方法，包括如下步骤：采用引物组合物对待测样本进行基因检测，以对待测样本进行分枝杆菌鉴定，引物组合物包括结核分枝杆菌检测引物对，结核分枝杆菌检测引物对用于检测大羚羊分枝杆菌、结核分枝杆菌、条纹猫鼬分枝杆菌、卡氏分枝杆菌、山羊分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、海豹分枝杆菌、非洲分枝杆菌中的至少一种。
其中，结核分枝杆菌检测引物对的具体描述详见上文，此处不再赘述。
在其中一些实施例中，引物组合物还包括非结核分枝杆菌检测引物对，所述非结核分枝杆菌检测引物对用于检测非结核分枝杆菌。非结核分枝杆菌检测引物对和非结核分枝杆菌的具体描述详见上文，此处不再赘述。
在其中一些实施例中，采用引物组合物对待测样本进行基因检测的步骤包括：采用上述引物组合物对待测样本进行多重PCR扩增，然后进行测序，分析测序结果，以对待测样本进行分枝杆菌鉴定。
在其中一些实施例中，采用上述引物组合物对待测样本进行多重PCR扩增的步骤中，反应体系包括：ddH2O 1μL～5μL、Enhancer buffer NB(1N)3.5μL、Enhancer buffer M2.5μL、Primer pool 5μL、DNA模板3μL～8μL、IGT-EM808polymerase mixture 10μL，总体积30μL。
在其中一些实施例中，采用引物组合物对待测样本进行多重PCR扩增的步骤中，反应条件包括：93℃～97℃保持3min～4min；97℃～99℃保持15s～20s、58℃～62℃保持5min～7min、18～22个循环；71℃～73℃保持4min～6min。
在其中一些实施例中，引物组合物中，各引物的使用浓度为0.2μM～0.8μM，优选为0.5μM。
在其中一些实施例中，采用上述引物组合物对待测样本进行多重PCR扩增的步骤之后，包括如下步骤：对采用上述引物组合物进行PCR扩增得到的多重PCR产物进行接头序列多重PCR反应，以构建多重PCR文库。
在其中一些实施例中，接头序列多重PCR反应体系包括：多重PCR产物10.5～14.5μL、Enhancer buffer M 2.5μL、ddH2O 1μL～5μL、5μM的UDI Index2μL、IGT-EM808聚合酶混合物10μL。
在其中一些实施例中，接头序列多重PCR反应的条件包括：93℃～97℃保持3min～4min；97℃～99℃保持15s～20s、56℃～60℃保持1～3min、71℃～73℃保持25s～35s、8～10个循环；71℃～73℃保持4min～6min。
在其中一些实施例中，待测样本例如可以为痰液、肺泡灌洗液、血液、组织、细菌培养物等。
在其中一些实施例中，测序为二代测序。具体地，将建好的测序文库在MGISEQ测序仪上进行上机测序，测序策略有多种选择，可以为PE75、PE100或PE150等，并产生测序数据。每个样本的原始测序数据量为300Mb碱基。
在其中一些实施例中，分析测序结果的步骤包括：将测序得到的目标DNA序列与参考序列进行比对分析，计算覆盖度和匹配度，确定目标菌种。具体地，对下机原始测序数据首先进行数据过滤，去掉低质量的数据，然后进行序列比对、reads统计、覆盖度和匹配度分析等，最终鉴定出目标菌种。当测序得到的目标序列中至少有一个与参考序列的覆盖度和匹配度均达到100％时，判定为该菌种。
本申请在数据均一性方面，对于测序下机数据，本申请希望能得到均一性较好的数据，以保证检测结果更加稳定可靠。而文库数据均一性高的基础是所有扩增产物得到均衡扩增。如何使多重PCR扩增反应达到均衡扩增的效果，是一项技术难题。在这方面，本申请主要通过以下两种策略来达到均衡扩增的目标。
(1)优化PCR反应体系。对反应体系中的试剂成分进行优化，使PCR扩增的均一性达到最佳状态，对模板中GC含量在20％～80％范围内都可以实现有效扩增。
(2)利用深度学习算法，调整引物浓度。根据实测数据中每个扩增产物的测序深度，使用深度学习的算法，得到每对引物的调整量，然后重新制备引物，进行文库构建和测序，分析扩增产物测序深度的变化，评估引物用量优化的效果，直到文库均一性的指标达到要求。
本申请的技术方案的整体流程图见图1。本申请的引物组合物用于多重PCR扩增建库的示意图如图2。
本申请中，在分枝杆菌鉴定方面，为了保证每个菌种及菌株的检测覆盖度和特异性，本申请设计了277对引物，基于多重PCR的方法，对目标基因组特异性DNA序列进行扩增，再利用二代测序技术对目标序列进行测序分析，使本方案可以对9个MTB和49个NTM菌种进行检测覆盖，并可对样本中的MTB和NTM进行鉴定区分。因为本方案是基于PCR和测序技术进行检测，2-3天就能完成检测，检测周期比传统培养法缩短很多。
再者，本申请针对菌种特异性DNA序列进行的引物设计，检测特异性好。本申请所检测的分枝杆菌种类较多，覆盖度高，包含9个结核分枝杆菌和49个非结核分枝杆菌。本申请考虑了每个菌种的不同菌株SNP位点的情况，在引物设计方面进行了各种优化，尽量选择特异性和保守的目标DNA序列，避开菌株基因组SNP区域，尽可能覆盖NCBI数据库中涉及的多个菌株，可以更全面、更准确地鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌。本申请是基于PCR和测序技术进行检测，检测灵敏度较高，2-3天就能完成检测，检测周期比传统培养法缩短很多。本申请对于结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的检测覆盖度更高，可以检测更多菌株，可以有效区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，检测时间短，特异性好。
本申请可同时检测的结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌数量多，共计达到58种，覆盖常见的分枝杆菌种类。本申请选择和设计了特异性的DNA序列，并针对这些序列设计了特异性的引物，基于PCR和测序，可在单个样本中对本方法所涉及的结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行鉴定和区分。本申请针对每个菌种基因组DNA，选择和设计了多个特异性的目标DNA序列，在检测时，首先针对这些目标DNA序列设计相应的引物，通过PCR的方式进行扩增，然后对这些DNA片段进行二代测序，与参考基因组进行比对分析，当测序获得的目标序列中至少有一个与参考序列的覆盖度和匹配度均达到100％时，则判定为该菌种。同时，当待测菌株出现部分区域DNA变异时，还可以通过该菌株多个DNA片段间的组合分析及序列相似度进行评估，确定菌种信息，增加了检测的准确性。本申请考虑了每个菌种的不同菌株SNP位点的情况，在引物设计方面进行了各种优化，尽量选择特异性和保守的目标DNA序列，避开菌株基因组SNP区域，尽可能覆盖NCBI数据库中涉及的多个菌株，可以更全面、更准确地鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌。本申请鉴定菌种所选取的菌种特异性DNA序列，是基于目标菌种全基因组序列进行的分析，并不局限在某个特定的基因区域(例如16S rRNA基因序列)，方法更加灵活，适用性和可覆盖范围更广。
以下为具体实施例。
实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。
实施例1：引物组合物和检测试剂盒
1、菌种鉴定相关引物组合物
本实施例通过相关算法，选定了菌种鉴定相关的特异性DNA序列，并利用引物设计软件，设计了277对多重PCR引物，具体序列如SEQ ID No.1-SEQ IDNo.544所示。
该引物组合物可以对9种结核分枝杆菌和49种非结核分枝杆菌进行检测鉴定。
9种结核分枝杆菌：大羚羊分枝杆菌、结核分枝杆菌、条纹猫鼬分枝杆菌、卡氏分枝杆菌、山羊分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、海豹分枝杆菌、非洲分枝杆菌。
49种非结核分枝杆菌：副胞内分枝杆菌、缓黄分枝杆菌、鸟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、龟分枝杆菌、微黄分枝杆菌、胃分枝杆菌、戈登分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、海分枝杆菌、不产色分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、猿分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、土分枝杆菌、蟾分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、新金色分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、母牛分枝杆菌、加那利群岛分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、施氏分枝杆菌、哥伦比亚分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、日内瓦分枝杆菌、奥尔胡斯分枝杆菌、外来分枝杆菌、出众分枝杆菌、利雅得分枝杆菌、玛格丽特分枝杆菌、伤口分枝杆菌、产粘液分枝杆菌、罗讷河口分枝杆菌、蒂莫内分枝杆菌、托斯卡纳分枝杆菌、免疫原分枝杆菌、伊朗分枝杆菌、败血症分枝杆菌、莲建洞分枝杆菌、拟鸟分枝杆菌、奇美拉分枝杆菌、博莱分枝杆菌、鸟分枝杆菌人猪共患亚种、鸟分枝杆菌森林土壤亚种。
2、检测试剂盒
基于上述引物组合序列信息，进行商业化的引物合成，然后结合PCR和建库测序相关试剂，共同组成检测试剂盒。试剂盒的组成包括：
1)上述引物组合物，各引物的使用浓度为0.5μM；
2)Enhancer buffer NB(1N)：主要是盐溶液；
3)Enhancer buffer M：有机小分子，增强高GC区域扩增；
4)UDI Index(5μM)：测序接头；
5)IGT-EM808 polymerase mixture：PCR聚合酶，dNTP和反应缓冲液预混液。
实施例2：结核分枝杆菌鉴定
1、试剂
1)DNA提取试剂盒：购买自天根生化科技有限公司的DNA提取试剂盒，货号为NG550。
2)IGT-EM808 polymerase mixture，Enhancer buffer NB(1N)，Enhancer bufferM，UDI Index(5μM)：购买自艾吉泰康生物科技公司。
3)Agencourt AMPure XP kit：包括磁珠和YF buffer B，购买自贝克曼库尔特有限公司(Beckman)。
4)DynaMag Side磁力架：购买自赛默飞世尔科技公司(Life Technologies)。
2、样本DNA提取
本实施例所用样本为10个分枝杆菌菌液样本，所包含菌株分别为：结核分枝杆菌(H37Rv)、牛分枝杆菌(CCUG 37460)、耻垢分枝杆菌(CPCC 203649)、海分枝杆菌(CCUG20998T)、胞内分枝杆菌(CCUG 28005T)、龟分枝杆菌(CCUG 47445T)、胃分枝杆菌(ATCC15754)、蟾分枝杆菌(ATCC 19250)、苏尔加分枝杆菌(ATCC 35799)、溃疡分枝杆菌(ATCC33728)。
通过天根DNA提取试剂盒，分别从这些菌液样本中提取DNA，并使用3.0Fluorometer(Qubit dsDNA HS Assay Kit)检测DNA浓度，得到质量合格的DNA。
3、多重PCR扩增和文库构建
利用上述引物组合以及提取的DNA，进行多重PCR扩增。
1)第1轮多重PCR反应
第1轮多重PCR反应体系如下：
表1多重PCR反应体系
多重PCR反应条件如下：
2)磁珠纯化产物
a)提前用无水乙醇和Nuclease-Free Water配制80％乙醇，并置于室温备用。
b)提前从4℃冰箱中取出纯化磁珠，混匀并置于室温平衡30min；将已经平衡至室温的纯化磁珠，涡旋混匀后备用。
c)在30μL PCR产物中加入0.9倍体积的磁珠(27μL)，吸打或涡旋混匀，室温静置5min。
d)瞬时离心，将PCR管置于磁力架上3min，待溶液澄清。
e)彻底移除上清，将PCR管从磁力架取下，向管内加入50μL YF buffer B，吸打混匀，室温静置5min。
f)瞬时离心，将PCR管置于DynaMag-96 Side磁力架上3min。
g)保持PCR管在磁力架上，小心移弃上清，向PCR管内加入180μL 80％乙醇溶液，静置30s。
h)保持PCR管在磁力架上，移弃上清，再次向PCR管内加入180μL 80％乙醇溶液，静置30s,移弃上清。
i)盖上管盖，瞬时离心，将残留乙醇离心至管底，将PCR管置于磁力架上，小心使用10μL移液器移弃底部残留的乙醇，注意不要吸到磁珠。
j)保持PCR管在磁力架上，室温静置3～5min，晾干磁珠，使残留的乙醇彻底挥发。
k)加入24μL Nuclease-Free Water，将PCR管从磁力架上取下，吸打或涡旋混匀，室温静置2min。
l)瞬时离心，将PCR管置于磁力架上2min，待溶液澄清。
m)用移液器吸取13.5μL上清液，转移到新的PCR管中，管内上清液为多重PCR产物，做好标记，准备下一步反应。
3)第2轮接头序列多重PCR反应
表2接头序列多重PCR反应体系
Reagent Volume(μL)
PCR product mixture 13.5
Enhancer buffer M 2.5
ddH2O 2
UDI Index(5μM) 2
IGT-EM808polymerase mixture 10
PCR product mixture为上一步纯化后的多重PCR产物。
接头序列多重PCR反应条件如下：
4)第2轮磁珠纯化
a)提前用无水乙醇和Nuclease-Free Water配制80％乙醇，并置于室温备用。
b)提前从4℃冰箱中取出纯化磁珠，混匀并置于室温平衡30min；将已经平衡至室温的纯化磁珠，涡旋混匀后备用。
c)在30μL接头序列多重PCR反应体系中加入0.9倍体积的磁珠(27μL)，吸打或涡旋混匀，室温静置5min。
d)瞬时离心，将PCR管置于磁力架上3min，待溶液澄清。
e)彻底移除上清，将PCR管从磁力架取下，向管内加入50μL YF buffer B，吸打混匀，室温静置5min。
f)瞬时离心，将PCR管置于DynaMag-96Side磁力架上3min。
g)保持PCR管在磁力架上，小心移弃上清，向PCR管内加入180μL 80％
乙醇溶液，静置30s。
h)保持PCR管在磁力架上，移弃上清，再次向PCR管内加入180μL 80％
乙醇溶液，静置30s,移弃上清。
i)盖上管盖，瞬时离心，将残留乙醇离心至管底，将PCR管置于磁力架上，小心使用10μL移液器移弃底部残留的乙醇，注意不要吸到磁珠。
j)保持PCR管在磁力架上，室温静置3～5min，晾干磁珠，使残留的乙醇彻底挥发。
k)加入24μL Nuclease-Free Water，将PCR管从磁力架上取下，吸打或涡旋混匀，室温静置2min。
l)瞬时离心，将PCR管置于磁力架上2min，待溶液澄清。
m)用移液器吸取20μL上清液，转移到新的PCR管中，管内上清液为制备好的多重PCR文库。
5)文库定量
取1μL文库使用3.0Fluorometer(Qubit dsDNA HS Assay Kit)进行文库浓度测定，记录文库浓度为55ng/μl。
6)文库质检
取1μL文库样本使用Qsep100全自动核酸蛋白分析系统进行文库片段长度和纯度测量，文库的靶片段分布区间在230bp-350bp之间。
4、上机测序
将建好的测序文库在MGISEQ测序仪上进行上机测序，测序策略为PE150，并产生测序数据。原始测序数据量为1Gb碱基。
5、生物信息分析
对下机原始测序数据首先进行数据过滤，去掉低质量的数据，然后进行序列比对、reads统计，覆盖度分析等，并进一步做菌种鉴定。
6、检测结果
本实施例对10个分枝杆菌菌液样本进行了菌种鉴定。
样本信息如下表3，样本菌株鉴定的相关统计结果详见表4。
表3样本信息
样本编号 物种名称
Sample_1 结核分枝杆菌
Sample_2 牛分枝杆菌
Sample_3 耻垢分枝杆菌
Sample_4 海分枝杆菌
Sample_5 胞内分枝杆菌
Sample_6 龟分枝杆菌
Sample_7 胃分枝杆菌
Sample_8 蟾分枝杆菌
Sample_9 苏尔加分枝杆菌
Sample_10 溃疡分枝杆菌
从表4可以看出，针对这些分枝杆菌的特异性目标序列至少有一个能被相关引物扩增且能被测序仪检测到，与对应参考基因组序列进行比对分析后发现，覆盖度和匹配度均能达到100％(如下表所示)，菌种鉴定结果与已知的样本信息一致，表明这些样本中存在的分枝杆菌均可被本方法准确鉴定到。(当覆盖度和匹配度为0时，说明该引物对本次实验所涉及的菌株不适用，但并不代表引物无效，因为同一物种不同菌株的基因组序列存在一些差异，我们在设计引物时，参考了多个菌株的基因组信息，以此提高目标菌株的检测覆盖度，该引物可适用于该物种的其他菌株。)
表4样本菌株鉴定的相关统计结果
本实施例对1个分枝杆菌菌液混合样本进行了菌种鉴定，该样本由5种分枝杆菌菌液样本等比例混合而成。
样本信息如下表5，样本菌株鉴定的相关统计结果详见表6。
表5混合样本信息
从表6可以看出，针对这些分枝杆菌的特异性目标序列至少有一个能被相关引物扩增且能被测序仪检测到，与对应参考基因组序列进行比对分析后发现，覆盖度和匹配度均能达到100％，菌种鉴定结果与已知的样本信息一致，表明该样本中存在的分枝杆菌均可被本方法同时检测到。
表6混合样本菌株鉴定的相关统计结果
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (11)

1.一种分枝杆菌的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：采用引物组合物对待测样本进行基因检测，以对所述待测样本进行分枝杆菌鉴定，所述引物组合物包括非结核分枝杆菌检测引物对，所述非结核分枝杆菌检测引物对包括碱基序列如SEQ ID No.33-SEQ IDNo.277、如SEQ ID No.310-SEQ ID No.554所示的引物。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述非结核分枝杆菌包括：副胞内分枝杆菌、缓黄分枝杆菌、鸟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、龟分枝杆菌、微黄分枝杆菌、胃分枝杆菌、戈登分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、海分枝杆菌、不产色分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、猿分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、土分枝杆菌、蟾分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、新金色分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、母牛分枝杆菌、加那利群岛分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、施氏分枝杆菌、哥伦比亚分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、日内瓦分枝杆菌、奥尔胡斯分枝杆菌、外来分枝杆菌、出众分枝杆菌、利雅得分枝杆菌、玛格丽特分枝杆菌、伤口分枝杆菌、产粘液分枝杆菌、罗讷河口分枝杆菌、蒂莫内分枝杆菌、托斯卡纳分枝杆菌、免疫原分枝杆菌、伊朗分枝杆菌、败血症分枝杆菌、莲建洞分枝杆菌、拟鸟分枝杆菌、奇美拉分枝杆菌、博莱分枝杆菌、鸟分枝杆菌人猪共患亚种、鸟分枝杆菌森林土壤亚种中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述引物组合物还包括结核分枝杆菌检测引物对，所述结核分枝杆菌检测引物对用于检测大羚羊分枝杆菌、结核分枝杆菌、条纹猫鼬分枝杆菌、卡氏分枝杆菌、山羊分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、海豹分枝杆菌、非洲分枝杆菌中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述结核分枝杆菌检测引物对包括碱基序列如SEQ ID No.1-SEQ ID No.32、如SEQ ID No.278-SEQ IDNo.309所示的引物。
5.根据权利要求1-4任一项所述的鉴定方法，其特征在于，所述引物组合物由碱基序列如SEQ ID No.5-SEQ ID No.9、SEQ ID No.282-SEQ ID No.286、SEQ ID No.20-SEQ IDNo.22、SEQ ID No.207-SEQ ID No.299、SEQ ID No.63-SEQ IDNo.67、SEQ ID No.340-SEQID No.344、SEQ ID No.93-SEQ ID No.97、SEQ IDNo.370-SEQ ID No.374、SEQ ID No.53-SEQ ID No.57、SEQ ID No.330-SEQ IDNo.334、SEQ ID No.68-SEQ ID No.72、SEQ IDNo.345-SEQ ID No.349、SEQ IDNo.69-SEQ ID No.71、SEQ ID No.346-SEQ ID No.348、SEQID No.78-SEQ IDNo.82、SEQ ID No.355-SEQ ID No.359、SEQ ID No.122-SEQ ID No.126、SEQ IDNo.399-SEQ ID No.403、SEQ ID No.112-SEQ ID No.116、SEQ ID No.389-SEQIDNo.393、SEQ ID No.137-SEQ ID No.141、SEQ ID No.414-SEQ ID No.418所示的引物构成。
6.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述采用引物组合物对待测样本进行基因检测的步骤包括：采用所述引物组合物对所述待测样本进行多重PCR扩增，然后进行测序，分析测序结果，以对所述待测样本进行分枝杆菌鉴定。
7.根据权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于，采用所述引物组合物对所述待测样本进行多重PCR扩增的步骤中，反应体系包括：ddH2O 1μL～5μL、Enhancer buffer NB(1N)3.5μL、Enhancer buffer M 2.5μL、Primer pool 5μL、DNA模板3μL～8μL、IGT-EM808polymerase mixture 10μL，总体积30μL。
8.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于，采用所述引物组合物对所述待测样本进行多重PCR扩增的步骤中，反应条件包括：93℃～97℃保持3min～4min；97℃～99℃保持15s～20s、58℃～62℃保持5min～7min、18～22个循环；71℃～73℃保持4min～6min。
9.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，所述引物组合物中，各引物的使用浓度为0.2μM～0.8μM，优选为0.5μM。
10.根据权利要求6-8任一项所述的鉴定方法，其特征在于，采用所述引物组合物对所述待测样本进行多重PCR扩增的步骤之后，包括如下步骤：对采用所述引物组合物进行PCR扩增得到的多重PCR产物进行接头序列多重PCR反应，以构建多重PCR文库。
11.根据权利要求10所述的鉴定方法，其特征在于，接头序列多重PCR反应的体系包括：所述多重PCR产物10.5μL～14.5μL、Enhancer buffer M 2.5μL、ddH2O 1μL～5μL、5μM的UDIIndex 2μL、IGT-EM808聚合酶混合物10μL；
及/或，接头序列多重PCR反应的条件包括：93℃～97℃保持3～4min；97℃～99℃保持15s～20s、56℃～60℃保持1～3min、71℃～73℃保持25s～35s、8～10个循环；71℃～73℃保持4min～6min。
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