CN111662958A - 基于纳米孔测序平台的文库的构建方法、鉴定微生物的方法及应用 - Google Patents

基于纳米孔测序平台的文库的构建方法、鉴定微生物的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因测序领域，具体涉及一种基于纳米孔测序平台的文库的构建方法、鉴定微生物的方法及应用。所提供的基于纳米孔测序平台的文库的构建方法包括：对来自于微生物的靶基因进行富集，以便获得富集产物，所述微生物包括选自细菌、真菌或者病毒中的至少一种；基于富集产物建库，以便获得测序文库。所提供的鉴定微生物的方法包括：基于上述测序文库，利用纳米孔测序平台进行测序，以便获得测序结果；将所述测序结果与参考数据库进行比对，基于比对结果确定待测样本中微生物。通过所提供的方法鉴定微生物，检测时间短，同时可以实现细菌，真菌，病毒的一次性广谱检测。且由于靶基因核酸得到富集，大大降低了检测数据，从而降低了检测成本。

Description

基于纳米孔测序平台的文库的构建方法、鉴定微生物的方法 及应用
技术领域
本发明涉及基因测序领域，具体涉及一种基于纳米孔测序平台的文库的构建方法、鉴 定微生物的方法及应用。
背景技术
细菌，真菌，病毒是引起临床感染的三类病原体。培养作为一种临床细菌和真菌检测 常用的手段，其会受到细菌和真菌生长条件的天然差异的影响，进而导致检测的速度慢， 往往需要2-7天时间；而且一些病原体的生长会受到其他病原菌的影响，从而使得通过培养 检测的敏感度低。另外，不同的细菌或真菌类型，需要的培养手段不同，需要提前预判引 起感染的类型，限制了其应用。
常规PCR方法能够针对标本中的核酸进行检测，无需对细菌与真菌感染类型进行预判， 一次性无差别的对标本中的细菌，真菌，病毒进行检测。但是，常规PCR方法会受到PCR 技术条件的限制，一般仅能同时对标本中的1～15种特定病原体进行诊断。利用抗体对特定 病原体进行特异性检测，也仅能针对特定的病原体。
利用基因测序技术进行病原体诊断是通过基因测序仪对使用一定的核酸提取与测序建 库手段进行处理后的标本进行序列检测，再将所获得的基因序列与数据库比对，进而判断 标本中所含有的真菌或/和细菌的种属信息。检测的全面性(同时检测细菌与真菌)，速度 (从标本到报告时间)，敏感性(从成分复杂的临床标本中检出含量极低的病原体)以及 便捷性(开展检测所需场地环境需求，最低样本数量需求)对于临床检测极为重要。
二代宏基因组测序整体检测周期长，往往需要1～3天时间。检测所需数据量大，检测 成本较高。测序设备与分析设备要求高，占地面积大，为降低单个样本成本，需要凑样检测，仅能在专业检测公司或者大型中心实验室开展。基于纳米孔宏基因组测序分析，具有测序时间短，测序结果优的优势。但是其可以需要大量的测序数据，例如一般5～10Gb/样本，而且试剂成本相比较于二代测序高于5～10倍，因此难以在临床实际中开展。
基于样本中微生物的鉴定手段，还需要进一步改进。
发明内容
本发明至少在一定程度上解决现有技术中存在的问题的至少之一，提供了一种基于纳 米孔测序平台的文库的构建方法、鉴定微生物的方法及应用。
本发明的发明人创造性研究设计了用于微生物鉴定的靶基因位点，例如，分别设计了 针对细菌、针对真菌以及针对病毒的靶基因位点；同时优化了不同靶基因之间的检测实验 流程，实现在一次测序中对样本中的细菌、真菌、病毒等进行同时检测。应用本发明所提 供的靶基因位点，能够借助于纳米孔测序平台，通过靶向富集的方法，提高测序过程中微 生物核酸的比例，将检测所需的数据量减少到10～50Mb/样本，大幅度降低检测成本。
在本发明的第一方面，本发明提供了一种基于纳米孔测序平台的文库的构建方法，包 括：对来自于微生物的靶基因进行富集，以便获得富集产物，所述微生物包括选自细菌、 真菌或者病毒中的至少一种；基于所述富集产物进行建库，以便获得所述测序文库。本发 明提供了一种基于纳米孔测序平台的文库的构建方法，通过对来自于微生物的靶基因进行 富集，对所获得的富集产物进行建库，例如参照纳米孔测序平台的建库流程进行建库，获 得测序文库。所获得的测序文库中仅含有来自于微生物的经过富集的靶基因核酸，通过对 所获得测序文库可以借助于纳米孔测序平台实现快速测序分析，检测时间从样本到结果<12 小时，最快6小时即可以完成，并同时可以实现细菌，真菌，病毒的一次性广谱检测。而 且由于靶基因核酸得到富集，检测所需要的数据量减少到10～50Mb/样本，大幅度降低检测 成本。
根据本发明的实施例，以上所述基于纳米孔测序平台的文库的构建方法可以进一步包 括如下技术特征：
根据本发明的实施例，所述细菌靶基因包括通用细菌靶基因和/或高敏感细菌靶基因， 所述通用细菌靶基因包括选自16s rRNA、rpob、gyrB、hsp60、ISR、23s rRNA中的至少一 种，优选包括表5中所列出的靶区域及其前后500bp的区域；所述高敏感细菌靶基因包括选自表1所示高敏感细菌的靶基因中的至少一种，这些高敏感细菌的靶基因具体为16srRNA、rpob、gyrB、hsp60、ISR、dnaJ、tuf、atpD、rnpB、sodA、inhA、mip、recA、trkA、 femA、gap、katG、mabA、gacA等基因；优选包括表7所列出的靶区域及其前后500bp 的区域。通用细菌靶基因区域特异性强，能够用作不同细菌的检测。表1中所列出的细菌 为临床上重要的高敏感细菌，通过对所列出的靶基因进行检测，可以用作这些高敏感细菌 的检测。
根据本发明的实施例，所述真菌靶基因包括通用真菌靶基因和/或高敏感真菌靶基因， 所述通用真菌靶基因包括选自ITS1-4、LSU(D1/2)、18s rRNA、RPB2中的至少一种，优选包括表6中所列出的靶区域及其前后500bp的区域；所述高敏感真菌靶基因包括选自表 2所示高敏感真菌的靶基因中的至少一种，这些靶基因具体可以为RPB1、RPB2、TEF1、 BenA、CaM、ND6，MCM7，CAL，TUB2，ACT、ND6等基因，优选包括表8所列出的 靶区域及其前后500bp的区域。这些靶基因区域特异性强，能够用作不同细菌的检测。
根据本发明的实施例，所述病毒靶基因包括多重病毒靶基因和/或新冠病毒靶基因，所 述多重病毒靶基因包括选自表3所示病毒靶基因中的至少一种，优选包括表9所列出的靶 区域及其前后200bp的区域；所述新冠病毒靶基因包括选自表4所示靶基因中的至少一种， 优选包括表10所列出的靶区域及其前后200bp的区域。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将通用细菌靶基因的富集产物、通用真 菌靶基因的富集产物、高敏感细菌靶基因的富集产物和高敏感真菌靶基因的富集产物、多 重病毒靶基因的富集产物和新冠病毒靶基因的富集产物按照质量比为20～60：5～15：10～25：10～25：10～25的比例混合，对混合后的产物进行建库，以便获得所述测序文库。
根据本发明的实施例，所述基于纳米孔测序平台的文库的构建方法进一步包括：基于 引物池中的引物对所述来自于微生物的靶基因进行PCR扩增，实现对所述靶基因的富集， 以便获得富集产物，所述引物池包含至少一条引物。
根据本发明的实施例，所述引物池中的引物均满足下列条件：a.引物长度为18-30个碱 基；b.引物的解链温度Tm值为57-64℃；c.引物中GC含量为40-60％；d.引物的3’末端5个碱基的吉布斯自由能ΔG大于等于-9kcal/mol；e.引物自身互补性数值小于8.0，引物3’末端自我互补参数小于3.0；f.引物3’末端连续3个碱基上不存在简并碱基；g.所述引物的扩增产物长度为200～1500个碱基。本文中，所提到的引物自身互补性数值用来表征每条引物自身所有碱基序列之间可能形成互补结构的趋势性；引物3’末端自我互补参数是计算不同引物3’端的所有碱基序列之间形成互补结构的趋势性。具体的趋势性通过数值评估，数值计算逻辑为：形成一对碱基互补时计1分，形成N碱基之间的互补计-0.25分，形成非 互补的碱基计-1分，形成空缺互补(Gap)的碱基时计-2分。更详细的计算方法可以参照 文献Shen,Z.,et al.,MPprimer:a program for reliable multiplex PCR primerdesign.BMC Bioinformatics,2010.11:p.143.中所记载的内容。
根据本发明的实施例，所述引物池包括选自下列引物池中的至少一种：通用细菌引物 池，所述通用细菌引物池包括表5所列出的引物；通用真菌引物池，所述通用真菌引物池 包括表6所列出的引物；高敏感细菌引物池，所述高敏感细菌引物池包括表7所列出的引物；高敏感真菌引物池，所述高敏感真菌引物池包括表8所列出的引物；多重病毒引物池，所述多重病毒引物池包括表9所列出的引物；新冠病毒引物池，所述新冠病毒引物池包括表10所列出的引物。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种测序方法，包括：基于本发明第一方面任一 实施例所述的方法获得测序文库；基于所述测序文库，利用纳米孔测序平台进行所述测序。 利用纳米孔测序平台进行测序，相比较于二代测序技术，可以在非专业实验室内就地监测， 通过笔记本电脑与网络云端流程即可以进行检测与数据分析。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种鉴定微生物的方法，包括：基于待测样本核 酸，根据本发明第一方面任一实施例所述的方法获得测序文库；基于所述测序文库，利用 纳米孔测序平台进行测序，以便获得测序结果；将所述测序结果与参考数据库进行比对， 基于比对结果确定所述待测样本中的微生物。所提供的鉴定微生物的方法，可以是对病原 体的鉴定，通过鉴定病原体，可以辅助临床用药。所提供给的鉴定微生物的方法可以用于 鉴定待测样本中的细菌、真菌或者病毒种类，可以用作临床辅助用药，也可以用作其他目 的，例如大数据汇总，商用试剂盒或者商用平台的搭建等非疾病诊断目的。
根据本发明的实施例，以上所述鉴定微生物的方法可以进一步包括如下技术特征：
根据本发明的实施例，所述参考数据库包括下列中的至少一种：通用细菌数据库，所 述通用细菌数据库含有16s rRNA、rpob、gyrB、hsp60、23s rRNA和ISR基因数据；通用 真菌数据库，所述通用真菌数据库含有TS1-4、LSU(D1/2)、18s rRNA和RPB2基因数 据；高敏感细菌数据库，所述高敏感细菌数据库含有表1所示高敏感细菌靶基因数据；高 敏感真菌数据库，所述高敏感真菌数据库含有表2所示高敏感真菌靶基因数据；多重病毒 数据库，所述多重病毒数据库含有表3所示病毒靶基因数据；新冠病毒数据库，所述新冠 病毒数据库含有SARS-CoV-2的基因组数据。
根据本发明的实施例，以上所述鉴定微生物的方法进一步包括：将所述测序结果分别 与所述通用细菌数据库和所述通用真菌数据库进行比对，以便获得第一比对数据和第一未 比对数据；将所述第一未比对数据分别与所述高敏感细菌数据库和所述高敏感真菌数据库 进行比对，以便获得第二比对数据和第二未比对数据；将所述第二未比对数据与所述多重 病毒数据库和所述新冠病毒数据库进行比对，以便获得第三比对数据；基于所述第一比对 数据，确定所述样本中含有的通用细菌和通用真菌，基于所述第二比对数据，确定样本中 含有高敏感细菌和高敏感真菌，基于所述第三比对数据，确定所述样本中含有的病毒。
根据本发明的实施例，所述基于所述第一比对数据，确定所述样本中含有的细菌和真 菌进一步包括：将所述第一比对数据分为第一唯一比对数据和至少一组第一交叉比对数据， 每组第一交叉比对数据含有多条比对序列；将每组第一交叉数据中的部分多条比对序列作 为种子序列，利用组内剩余部分比对序列对所述种子序列进行校正，以便获得校正后种子 序列；将所述校正后种子序列与所述通用细菌数据库和所述通用真菌数据库的最优比对数 据，和所述第一唯一比对数据合并，确定所述样本中含有的通用细菌和通用真菌。
根据本发明的实施例，所述基于所述第二比对数据，确定所述样本含有的高敏感细菌 和高敏感真菌进一步包括：将所述第二比对数据分为第二唯一比对数据和至少一组第二交 叉比对数据，每组第二交叉比对数据含有多条比对序列；将每组第二交叉数据中的部分多 条比对序列作为种子序列，利用组内剩余部分比对序列对所述种子序列进行校正，以便获 得校正后种子序列；将所述校正后种子序列与所述高敏感细菌数据库和所述高敏感真菌数 据库的最优比对结果，和所述第二唯一比对数据合并，确定所述样本中含有的高敏感细菌 和高敏感真菌。
根据本发明的实施例，基于所确定的样本中的通用细菌以及高敏感细菌，合并确定样 本中含有的全部细菌；基于所确定的样本中的通用真菌以及高敏感真菌，合并确定样本中 含有的全部真菌。将所确定的全部细菌或者全部真菌生成细菌清单或者真菌清单。以细菌 清单为例，如果清单中的细菌或者高敏感细菌有交叉，比较交叉细菌在属和种上的一致性。 如果两者在种水平上相同，则确定唯一结果，如果两者在属水平上鉴定结果一致，但种水 平上鉴定结果不一致，则以高敏感细菌的结果作为唯一结果，如果两者鉴定到不同的属， 则将两者结果均作为结果输出。根据本发明的实施例，所述基于所述第三比对数据，确定 所述样本中含有的病毒进一步包括：
将所述第三比对数据中比对到同一基因区域的多条比对序列作为一组，以每组中的部 分比对序列作为种子序列，利用组内其他剩余部分比对序列对所述种子序列进行校正，以 便获得校正后种子序列；
基于所述校正后种子序列与所述多重病毒数据库和所述新冠病毒数据库的最优比对结 果，确定所述样本中含有的病毒；
任选地，进一步包括：基于至少80％以上的所述校正后种子序列与所述多重病毒数据 库和所述新冠病毒数据库之间存在的相同碱基差异，确定所述待测样本中存在的病毒突变 位点。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种鉴定微生物的装置，包括：数据处理单元， 所述数据处理单元基于待测样本核酸的测序结果与参考数据库进行比对，用于确定所述待 测样本中的微生物。根据本发明的实施例，所述鉴定微生物的装置进一步包括：文库构建 单元，所述文库构建单元基于所述待测样本核酸，根据本发明第三方面任一实施例所述的 方法获得测序文库；测序单元，所述测序单元基于所述测序文库，利用纳米孔测序平台进 行测序，以便获得所述测序结果。
根据本发明的实施例，所述鉴定微生物的装置可以进一步包括如下技术特征：
根据本发明的实施例，所述参考数据库包括下列中的至少一种：通用细菌数据库，所 述通用细菌数据库含有16s rRNA、rpob、gyrB、hsp60、23s rRNA和ISR基因数据；通用 真菌数据库，所述通用真菌数据库含有TS1-4、LSU(D1/2)、18s rRNA和RPB2基因数 据；高敏感细菌数据库，所述高敏感细菌数据库含有表1中示出的细菌靶基因数据；高敏 感真菌数据库，所述高敏感真菌数据库含有表2中示出的真菌靶基因数据；多重病毒数据 库，所述多重病毒数据库含有表3所示的病毒靶基因数据；新冠病毒数据库，所述新冠病 毒数据库含有SARS-CoV-2的基因组数据。
根据本发明的实施例，所述数据处理单元进一步包括：将所述测序结果分别与所述通 用细菌数据库和所述通用真菌数据库进行比对，以便获得第一比对数据和第一未比对数据； 将所述第一未比对数据分别与所述高敏感细菌数据库和所述高敏感真菌数据库进行比对， 以便获得第二比对数据和第二未比对数据；将所述第二未比对数据与所述多重病毒数据库 和所述新冠病毒数据库进行比对，以便获得第三比对数据；基于所述第一比对数据，确定 所述样本中含有的通用细菌和通用真菌，基于所述第二比对数据，确定样本中含有高敏感 细菌和高敏感真菌，基于所述第三比对数据，确定所述样本中含有的病毒。所提到的第一 比对数据是指能够与通用细菌数据库和通用真菌数据库比对上的数据，第一未比对数据是 指与通用细菌数据库和通用真菌数据库比对不上的数据。这些比对不上的数据继续与高敏 感细菌数据库和高敏感真菌数据库进行比对，能够比对上的数据作为第二比对数据，比对 不上的数据作为第二未比对数据。这些第二未比对数据继续与多重病毒数据库和新冠病毒 数据库进行比对，能够比对上的数据作为第三比对数据。
根据本发明的实施例，所述基于所述第一比对数据，确定所述样本中含有的细菌和真 菌进一步包括：将所述第一比对数据分为第一唯一比对数据和至少一组第一交叉比对数据， 每组第一交叉比对数据含有多条序列；将每组第一交叉数据中的部分多条序列作为种子序 列，利用组内剩余部分序列对所述种子序列进行校正，以便获得校正后种子序列；将所述 校正后种子序列与所述通用细菌数据库和所述通用真菌数据库的最优比对结果，和所述第 一唯一比对数据合并，确定所述样本中含有的通用细菌和通用真菌。根据本发明的实施例， 可以将每组第一交叉数据中的随机的20％～40％的序列(例如可以为30％)作为种子序列。
根据本发明的实施例，所述基于所述第二比对数据，确定所述样本含有的高敏感细菌 和高敏感真菌进一步包括：
将所述第二比对数据分为第二唯一比对数据和至少一组第二交叉比对数据，每组第二 交叉比对数据含有多条序列；
将每组第二交叉数据中的部分多条序列作为种子序列，利用组内剩余部分序列对所述 种子序列进行校正，以便获得校正后种子序列；
将所述校正后种子序列与所述高敏感细菌数据库和所述高敏感真菌数据库的最优比对 结果，和所述第二唯一比对数据合并，确定所述样本中含有的高敏感细菌和高敏感真菌。 根据本发明的实施例，可以将每组第二交叉数据中的随机的20％～40％的序列(例如可以为 30％)作为种子序列。
根据本发明的实施例，所述基于所述第三比对数据，确定所述样本中含有的病毒进一 步包括：将所述第三比对数据中比对到同一基因区域的多条序列划为一组，以每组中的部 分序列作为种子序列，利用组内剩余部分序列对所述种子序列进行校正，以便获得校正后 种子序列；基于所述校正后种子序列与所述多重病毒数据库和所述新冠病毒数据库的最优 比对结果，确定所述样本中含有的病毒。根据本发明的实施例，可以将每组中的随机的 20％～40％的序列(例如可以为30％)作为种子序列。
根据本发明的实施例，进一步包括：基于至少80％以上的所述校正后种子序列与所述 多重病毒数据库和所述新冠病毒数据库之间存在的相同碱基差异，确定所述待测样本病毒 的突变位点。
在本发明的第五方面，本发明提供了一种试剂盒，包括引物池，所述引物池包括选自 下列中的至少之一：通用细菌引物池，所述通用细菌引物池包括表5所列出的引物；通用真菌引物池，所述通用真菌引物池包括表6所列出的引物；高敏感细菌引物池，所述高敏 感细菌引物池包括表7所列出的引物；高敏感真菌引物池，所述高敏感真菌引物池包括表 8所列出的引物；多重病毒引物池，所述多重病毒引物池包括表9所列出的引物；新冠病 毒引物池，所述新冠病毒引物池包括表10所列出的引物。
本发明所取得的有益效果为：应用本发明所提供的测序方法，能够快速获得样本中的 微生物信息，例如其可以实现当天对样本中的病毒出具检测结果。而且检测灵敏度高：检 测低丰度的病毒、细菌、真菌，助力早期诊断，提示早期感染风险。检测范围广，例如可 以应用于新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测，还可以检测其他病毒引起的合并感染，辅助快速确定诊疗方案。更可进一步可一次检测细菌、真菌、非典型病原菌、病毒的检测方案。应用该方法鉴定微生物，可以同时实现细菌、真菌、病毒等的检测，信息更加全面，例如 可以同时实现病毒检测和病毒突变情况监测，为疫情监测提供可进行诠释和采取行动的快速、实时的流行病学信息。另外，所提供的方法借助于纳米孔测序平台进行测序，并进行 微生物的鉴定，简易便携，适合在医院和CDC等实验室开展，测序数据可进行云分析，在 资源有限的环境中，可以被快速建立并监控疫情。
附图说明
图1是根据本发明的实施例提供的鉴定微生物的装置的结构示意图。
图2是根据本发明的实施例提供的编号C1的新冠感染患者携带病毒基因组上突变分析 结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是，所描述的实施例是示例性的，旨在用 于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。同时，对本文中的一些术语进行解释和说 明，以方便本领域技术人员理解，需要说明的是，这些解释和说明不应看做是对本发明保 护范围的限制。
本文中所提到的术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述方便的目的，而不 能理解为指示或暗示相对重要性，也不能专门用于指示或者暗示先后顺序。在本发明的描 述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。本文 中，“通用细菌”是指一些常见细菌，这些细菌通常可以结合一些靶基因的情况就可以进 行区分。这些靶基因进行筛选，最终确定为16s rRNA、rpob、gyrB、hsp60、ISR、23rRNA 中的至少一种。相应地，通用细菌数据库，是指能够用作这些通用细菌鉴定的参考数据库， 根据本发明的实施例，这些通用细菌库含有这些通用细菌靶基因的数据。同样地，通用细 菌引物池是指能够用于这些通用细菌扩增或者鉴定的引物。
本文中，“高敏感细菌”是指在临床上常见的一些致病细菌，用于表征或者鉴别这些 细菌的靶基因通常各有不同，但是又常常会导致一些临床上的疾病，因此专门对这些细菌 上的靶基因进行了研究，找到能够表征这些细菌的靶基因，用作这些细菌的鉴定。需要说 明的是，通用细菌或者高敏感细菌并不刻意区分，可能存在交叉，即某些细菌可能既属于 通用细菌，也属于高敏感细菌。当鉴定出来的通用细菌和高敏感细菌在属水平上一致，但 是在种水平上不一致时，以高敏感细菌的鉴定结果作为标准。相应地，高敏感细菌数据库， 是指能够用作这些高敏感细菌鉴定的参考数据库，根据本发明的实施例，这些高敏感细菌 库含有这些高敏感细菌靶基因的数据。同样地，高敏感细菌引物池是指能够用于这些高敏 感细菌扩增或者鉴定的引物。
本文中，“通用真菌”是指在一些常见真菌，这些真菌通常可以结合一些靶基因的情 况就可以进行区分。这些靶基因进行筛选，最终确定为ITS1-4、LSU(D1/2)、18s rRNA、RPB2中的至少一种。相应地，通用真菌数据库，是指能够用作这些通用真菌鉴定的参考数据库，根据本发明的实施例，这些真菌细菌库含有这些通用真菌靶基因的数据。同样地， 通用真菌引物池是指能够用于这些通用真菌扩增或者鉴定的引物。
本文中，“高敏感真菌”是指在临床上常见的一些致病真菌，用于表征或者鉴别这些 真菌的靶基因通常各有不同，但是又常常会导致一些临床上的疾病，因此专门对这些真菌 上的靶基因进行了研究，找到能够表征这些真菌的靶基因，用作这些真菌的鉴定。需要说 明的是，通用真菌或者高敏感真菌并不刻意区分，可能存在交叉，即某些细菌可能既属于 通用真菌，也属于高敏感真菌。当鉴定出来的通用真菌和高敏感真菌在属水平上一致，但 是在种水平上不一致时，以高敏感真菌的鉴定结果作为标准。相应地，高敏感真菌数据库， 是指能够用作这些高敏感真菌鉴定的参考数据库，根据本发明的实施例，这些高敏感真菌 数据库含有这些高敏感真菌靶基因的数据。同样地，高敏感细菌引物池是指能够用于这些 高敏感真菌扩增或者鉴定的引物。
本文中，当提到“多重病毒”是指包含至少一种以上病毒。相应地，“多重病毒靶基因”是指存在于这些病毒上的靶基因。本文中，新冠病毒是指SARS-CoV-2病毒。相应地， 多重病毒数据库，是指能够用作这些病毒鉴定的参考数据库，根据本发明的实施例，多重 病毒数据库含有这些病毒靶基因的数据。同样地，多重病毒引物池是指能够用于这些病毒 扩增或者鉴定的引物。
本发明提供了一种测序方法，包括：对来自于微生物的靶基因进行富集，以便获得富 集产物，所述微生物包括选自细菌、真菌或者病毒中的至少一种；基于所述富集产物进行 建库，以便获得所述测序文库；基于所述测序文库，利用纳米孔测序平台进行所述测序。通过对来自于微生物的靶基因进行富集，对所获得的富集产物依照纳米孔测序平台的建库流程进行建库，获得测序文库。所获得的测序文库中仅含有来自于微生物的经过富集的靶基因核酸，通过对所获得测序文库可以借助于纳米孔测序平台实现快速测序分析，检测时间从样本到结果<12小时，最快6小时即可以完成，并同时可以实现细菌，真菌，病毒检 测一次性广谱检测。而且由于靶基因核酸得到富集，检测所需要的数据量减少到10～50mb/ 样本，大幅度减低检测成本。利用纳米孔测序平台进行测序，相比较于二代测序技术，可 以在非专业实验室内就地监测，通过笔记本电脑与网络云端流程即可以进行检测与数据分 析。
根据本发明的实施例，这些靶基因可以为选自16s rRNA、rpob、gyrB、hsp60、23srRNA、 ISR中的至少一种。这些靶基因可以用作细菌的检测区域，通过将这些检测区域的测序数 据与参考数据库进行比对，确定细菌的具体种类。根据本发明的实施例，这些靶基因还可 以为表1所述高敏感细菌的靶基因中的至少一种。这些细菌作为临床上重要的高敏感细菌， 通过对相应的靶基因进行检测，可以确定相应细菌的具体种类。
表1高敏感细菌及其靶基因
Figure BDA0002455994330000081
Figure BDA0002455994330000091
Figure BDA0002455994330000101
根据本发明的实施例，这些靶基因可以为选自ITS1-4、LSU(D1/2)、18s rRNA和RPB2 中的至少一种。这些靶基因可以用作真菌的检测区域，通过将这些检测区域的测序数据与 参考数据库进行比对，确定真菌的具体种类。根据本发明的实施例，这些靶基因还可以为 表2所述真菌的靶基因。这些细菌作为临床上重要的高敏感真菌，通过对这些真菌的靶基 因进行检测，可以确定相应真菌的具体种类。
表2高敏感真菌及其靶基因
Figure BDA0002455994330000102
Figure BDA0002455994330000111
根据本发明的实施例，所述病毒靶基因包括多重病毒靶基因和/或新冠病毒靶基因，所 述多重病毒靶基因包括选自表3所示病毒靶基因中的至少一种；所述新冠病毒靶基因包括 选自表4所示靶基因中的至少一种。
表3多重病毒及其靶基因
病毒名称 靶基因
博卡病毒 NP1、VP1-2
鼻病毒 VP4/VP2、5’UTR
人偏肺病毒 N gene、F gene、glycoprotein G、N gene
呼吸道合胞病毒 N gene、P gene
冠状病毒 1a、1b
腺病毒 hexon gene
副流感 H gene
甲型流感病毒 M gene，H gene
乙型流感病毒 M gene、HA、na、NS
丙型流感病毒 M gene
肠病毒 VP1
疱疹病毒 glycoprotein G
风疹病毒 E1
表4新冠病毒靶基因
Figure BDA0002455994330000112
Figure BDA0002455994330000121
根据本发明的实施例，所述基于纳米孔测序平台的文库的构建方法进一步包括：基于 引物池中的引物对所述来自于微生物的靶基因进行PCR扩增，实现对所述靶基因的富集， 以便获得富集产物，所述引物池包含至少一条引物。
根据本发明的实施例，所述引物池包括选自下列引物池中的至少一种：通用细菌引物 池，所述通用细菌引物池包括表5所列出的引物；通用真菌引物池，所述通用真菌引物池 包括表6所列出的引物；高敏感细菌引物池，所述高敏感细菌引物池包括表7所列出的引物；高敏感真菌引物池，所述高敏感真菌引物池包括表8所列出的引物；多重病毒引物池，所述多重病毒引物池包括表9所列出的引物；新冠病毒引物池，所述新冠病毒引物池包括表10所列出的引物。
根据本发明的实施例，将通用细菌靶基因的富集产物、通用真菌靶基因的富集产物、 高敏感细菌和高敏感真菌靶基因的富集产物、多重病毒靶基因的富集产物和新冠病毒靶基 因的富集产物按照质量比为20～60：5～15：10～25：10～25：10～25的比例混合，对混合后的 产物进行建库，以便获得所述测序文库。根据本发明的优选实施例，将这些富集产物按照 30～50：6～10：12～20：12～20：12～20的比例混合。
本发明还提供了一种鉴定微生物的装置，如图1所示，包括：文库构建单元，所述文库构建单元基于所述待测样本核酸，根据上述方法获得测序文库；测序单元，所述测序单元基于所述测序文库，利用纳米孔测序平台进行测序，以便获得所述测序结果；数据处理单元，所述数据处理单元基于待测样本核酸的测序结果与参考数据库进行比对，用于确定所述待测样本中的微生物。根据本发明的实施例，所述测序单元可以和所述文库构建单元相连，所述数据处理单元可以和所述测序单元相连。在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成 一体；可以是机械连接，也可以是电连接或彼此可通讯；可以是直接相连，也可以通过中 间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确 的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的 具体含义。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施 例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的， 按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注 明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1靶基因设计数据库构建
从NCBI等现有数据库中，下载通用细菌靶基因数据。过滤去除其中非完整基因序列， 不属于目的靶基因的错误命名序列等。获得高质量的细菌16s rRNA(核糖体16s rRNA亚 基)，与真菌ITS(内部转录间隔区)。
同时，从EnsemblBacteria数据库中下载44493个高质量的细菌，真菌完整基因组数据。 通过对所有基因组注释信息的分析，参照文章的方法，从基因组数据库里提取获得了用于 细菌鉴定的：rpob(细菌Rna聚合酶β亚基),gyrB(促旋酶B亚基),hsp60(热休克蛋白60),ISR(核糖体16s rRNA/23s rRNA基因间隔区)，atpD，dnaJ，tuf，sodA，rnpB，inhA，IS900，katG，RecA，fumC，icd，mdh,purA；以及适用于真菌鉴定的LSU，ITS1-4，LSU(D1/2)，18s rRNA，RPB1/2，TEF1，Bena(β-tulbulin)，CaM(calmodulin)，cyp51A，ND6，MCM7， CAL，TUB2，ACT等数据库。
最后根据基因长度，基因名称，基因完整度对所获得的数据库进行过滤与优化，获得 针对每个靶基因的高质量的数据库。
实施例2靶基因保守型与特异性区域分析方案
使用实施例1所构建的数据库，使用自行撰写、整合的分析流程，针对每个靶标的数据 进行保守性与特异性分析。
首先使用ClustalW/ClustalX等软件对序列进行多序列比对，并通过自行撰写的统计流程 计算出每个比对位点的保守性数据。每个靶位点都进行三个层面的分析：
层面一，针对单个靶位点全部数据的分析，获得“比对分析文件1”。
层面二，根据数据库里每一条数据来源的物种信息，以每个物种的属和种名称，将数 据库里所有序列以物种种属名称进行抽平，相同的物种只保留不超过5条序列，获得靶基因 抽平数据库，并使用该数据库的全部数据进行分析，获得“比对分析文件2”。
层面三，根据表1和表2里的重要病原菌信息，将每个靶基因数据数据库拆分为独立的 临床重要细菌数据库(共计60个属)和临床重要真菌数据库(共计15个属)，分别针对每 个独立数据库进行分析，获得“比对分析文件3”。
综合比对分析文件1，2，3的数据，评估每个靶基因在全部细菌或真菌水平，在临床重 要病原菌属中的保守性，特异性，保守区域与特异性区域等统计数据。用于后续新引物的 设计。
实施例3通用细菌靶向基因与扩增引物设计
根据上述针对不同靶标基因的分析结果，对所有细菌靶标进行统计与分类。
首先，统计分析比对分析文件1以及比对分析文件2中展现出保守性的数据，确定靶基 因上是否存在保守区域。如果存在，可以将该靶基因用于细菌的引物设计。其中保守性区 域的判定标准为：
连续>15个碱基的保守度均超过80％；
或长度介于15-25碱基的区域中，其中大于90％碱基的保守度超过85％；
或>25个碱基的连续区域，其中大于80％碱基的保守度超过85％。
根据每个靶基因的保守性分析，将细菌靶基因的应用范围进行划分，获得“靶基因评 估文件”。最终确定的通用细菌靶基因：16s rRNA、rpob、gyrB、hsp60、ISR、23s rRNA。
针对“靶基因评估文件”获得的保守区域位点进行保守频率与可变模式的分析，分别 获得“位点频率文件”和“可变模式文件”。“位点频率文件”记录了每个保守区中每个 碱基位点上A,T,C,G和缺失的确切概率。以此文件为基础，计算出每个区域上可能出现的最大概率序列以及其他可能出现的排列组合类型。“可变模式文件”记录了每个保守区上， 不同位点可变碱基之间的相互关系。
根据纳米孔测序方法可兼容的核酸长度与上述“位点频率文件”和“可变模式文件” 的结果，对靶基因上各可用于引物设计的区域进行GC含量，TM值，引物长度，扩增产物长度，序列3端最后5位碱基的GC含量，连续>3个相同碱基区域数量进行计算。综合考虑一下因素，进行每个引物位点序列，简并和引物间组合的确定：1.尽可能最大限度的提高数据的分辨能力；引物扩增产物200-1500碱基，最优800bp；2.减少保守区域突变引起的扩增效率降低风险；根据“位点频率文件”结果，采用类似“叠瓦”结构设计针对单个位点的 多个引物，提高引物对于不同类型微生物的扩增效率；3.考虑尽可能提高引物的特异性。 根据“可变模式文件”的结果，优化选择出现频率最高的可变组合，设计特异性的引物， 与通用简并引物混合形成全新的引物池，提高引物的扩增效率。4.考虑不同引物之间的兼 容性，根据“位点频率文件”将每个引物的GC等关键指标固定在一定范围内。提高引物扩 增的均一性。通过该过程，完成了对16s rRNA，rpob,gyrB,hsp60,ISR基因上引物的设计与 测试，获得“通用细菌引物池”。
所设计的通用细菌引物池中各引物的均满足下列条件：
.所述引物长度为18-30个碱基；
b.所述引物的解链温度Tm值为57-64℃；
c.所述引物中GC含量为40-60％；
d.所述引物的3’末端5个碱基的吉布斯自由能ΔG大于等于-9kcal/mol；
e.所述引物自身互补性数值小于8.0，引物3’末端自我互补参数小于3.0；
f.所述引物3’末端连续3个碱基上不存在简并碱基；
g.所述引物的扩增产物长度为300～1500个碱基。
具体来说，所设计的引物分别如下：
表5通用细菌引物池
Figure BDA0002455994330000141
Figure BDA0002455994330000151
实施例4通用真菌靶向基因及扩增引物设计
采用与实施例3相同的方法，对通用型真菌靶基因以及基因上适用于引物扩增的区域进 行详细分析。最终确定ITS1-4，LSU(D1/2)两个靶向位点，并对位点上的引物进行了重新设 计，获得“通用真菌引物池”。
所提供的通用真菌引物池中的引物如下所示：
表6通用真菌引物池
Figure BDA0002455994330000161
实施例5高敏感细菌与真菌靶向基因及扩增引物的组合
有一些靶基因在所有细菌或真菌并不存在通用的保守区，不能用于全部的细菌或真菌 的检测，属于非通用型靶基因。针对这类靶基因，根据“比对分析文件3”的内容，采用与 实施例3相同的方法，对表1所列出的高敏感细菌，表2所列出的高敏感真菌逐个进行了引物 的设计。这些非通用靶基因虽然在全部细菌或者真菌中不保守，但在特定的属内，存在高 度的保守性，所以基于此属水平设计的引物可以特异性扩增该属的细菌/真菌。以此，在检 测方案中增添该引物，可提高对该属细菌/真菌的鉴别敏感性。此外，相比通用靶基因，非 通用基因在近缘细菌/真菌之间的基因序列差异度更大，通过测序结果可以更好的对细菌/ 真菌进行鉴定，可提高方法对细菌/真菌的鉴定分辨能力。采用实施例3中引物搭配选择方 法，最终设计一套高敏感细菌引物池和一套高敏感真菌引物池。
所设计的高敏感细菌真菌引物池如下表7所示：
表7高敏感细菌引物池
Figure BDA0002455994330000162
Figure BDA0002455994330000171
Figure BDA0002455994330000181
Figure BDA0002455994330000191
Figure BDA0002455994330000201
Figure BDA0002455994330000211
Figure BDA0002455994330000221
Figure BDA0002455994330000231
表8高敏感真菌引物池
Figure BDA0002455994330000232
Figure BDA0002455994330000241
实施例6多重细菌，真菌靶基因扩增方法与扩增引物组合方法
为实现多个细菌与真菌的检测，兼顾高敏感性与鉴定范围的广泛性，需要选择可在一 个扩增反应中使用的引物组合以及合适的扩增方法。通过上述发明内容，共计设计了3套独 立扩增的引物池：通用细菌引物池，通用真菌引物池，高敏感细菌/真菌引物池。
为了提高效率，可以将多个不同标本的扩增产物混合后进行测序文库构建与测序可以 降低成本。因此，所有引物池扩增产物的两端都需要携带上特定24个碱基的“标签序列”。 不同的标本携带的标签序列不同，相同的标本内不同的引物池携带的标签序列相同。通过 标签序列将每一条测序数据归属到具体标本。
可以采用扩增的方式将标签序列引入到靶向基因两端。分别利用通用细菌引物池和通 用真菌引物池以及高敏感细菌/真菌引物池中引物对靶基因进行扩增，以确保扩增的敏感性 与标签序列引入的高效性。分别获得通用细菌靶基因富集产物，通用真菌靶基因富集产物， 以及高敏感细菌/真菌靶基因富集产物。
实施例7病毒靶向扩增引物的设计
从NCBI等现有数据库中，下载需要检测的病毒完整参考基因组，使用实施例2里的方案， 分析病毒基因组上相对保守与可变区域。同时，参考目前NCBI PubMed数据库里已发表的 针对每一类病毒进行PCR鉴定，以及已获得FDA批准的病毒核酸检测试剂盒中选择的病毒 基因。综合分析后，选择用于每类病毒的鉴定的一个或者多个靶基因。接着从NCBI数据库 中将每类病毒的靶基因中含有的非完整基因序列过滤去除，同时过滤去除不属于目的靶基 因的错误命名序列等，获得高质量的多重病毒数据库。
另外，采用实施例3中所提到的方法，设计适用于纳米孔测序等单分子测序平台的扩增 引物，获得“多重病毒引物池”。
所提供的多重病毒引物池中各引物如下表所示：
表9多重病毒引物池
Figure BDA0002455994330000251
Figure BDA0002455994330000261
Figure BDA0002455994330000271
实施例8新型冠状病毒2019-nCoV(SARS-CoV-2)高敏感，高覆盖度引物设计
从GISAID数据库中，下载已经公开的新型冠状病毒2019-nCoV基因组数据，使用实施例 2里的方案，确认现有病毒基因组上保守区域。针对保守区域同时针对基因组上ORF1a/b中 rdrp，S,ORF3a，E，M，ORF6，ORF7a，ORF8，N基因9个基因，设计“新冠病毒引物池”全面覆盖病毒基因组上9094bp的基因区域，100％覆盖病毒基因组上毒力相关的S，E，M基因。
表10新冠病毒引物池
Figure BDA0002455994330000281
Figure BDA0002455994330000291
实施例9多重病毒靶基因扩增方法与扩增引物组合方法
“多重病毒引物池”与“新冠病毒引物池”选择相同的方法分别进行扩增，详细流程包 括反转录—cDna扩增，具体如下：
1、反转录
1.1变性体系配置：
成分 体积(ul)
Random 6mers 1
dNTP Mixture 1
核酸样本 8
总体积 10
变性程序：65℃孵育5分钟，冰上迅速冷却(可将PCR程序设置为4℃)。
1.2反转录体系配置：
成分 体积(ul)
上述变性产物 10
Rnase Inhibitor 0.5
5X PrimeScriptⅡBuffer 4
PrimeScript II RTase 1
Rnase Free dH2O 4.5
总体积 20
反转录程序：
Figure BDA0002455994330000292
Figure BDA0002455994330000301
1.3使用磁珠对扩增产物进行纯化
2、cDna扩增
2.1第一轮扩增体系配置：
Figure BDA0002455994330000302
2.2第一轮扩增PCR程序：
Figure BDA0002455994330000303
2.3使用磁珠对扩增产物进行纯化。
2.4、第二轮扩增体系配置：
Figure BDA0002455994330000304
2.5第二轮扩增体系程序：
Figure BDA0002455994330000305
Figure BDA0002455994330000311
实施例10扩增产物的混合建库与测序
为确保利用通用细菌引物池，通用真菌引物池，高敏感性细菌/真菌引物池，病毒引物 池，新型冠状病毒引物池进行PCR扩增所获得的富集产物能通过一次测序进行全面检测。 根据样本数量，选择五个引物池扩增所得到的富集产物按照如下表11比例进行混合，获得 混合产物。混合产物采用Oxfordnanopore technologies公司的连接测序试剂盒SQK-LSK109 进行文库构建，并使用Oxfordnanopore technologies公司MinION，GridION或者PromethION 等测序仪测序。
表11富集产物混合方案
Figure BDA0002455994330000312
实施例11标本中常见11类呼吸道病毒与新型冠状病毒同时检测
选择45份临床疑似新型冠状病毒感染的咽拭子标本提取核酸，使用上述实施例中所提供 的“新冠病毒引物池”对45份标本进行扩增，使用“多重病毒引物池”对16份标本进行扩增， 每个样本上添加不同的标签序列。扩增产物浓度，样本的混合量如下表12显示：
表12样本混合量
Figure BDA0002455994330000313
Figure BDA0002455994330000321
将扩增产物利用适用于纳米孔测序平台的建库试剂盒进行建库，然后利用纳米孔测序平 台进行测序分析，测序结果与已经获得cFDA批准的新冠病毒2019-nCoV检测试剂盒作为 参照对象，进行盲样比对，结果如下表13：
表13比对结果
Figure BDA0002455994330000331
以荧光定量试剂盒诊断结果为参考，使用公式PCR与测序双阳性/(PCR与测序双阳性 +PCR阳性但测序阴性)×100％检测计算敏感性为100％；使用公式PCR与测序双阴性/(PCR 与测序双阴性+PCR阳性但测序阴性)×100％计算阴性预测值为100％。
因为荧光定量PCR方法出现PCR阴性但测序阳性的情况较少。所以通过上述两个指标 说明本次申请的纳米孔测序诊断方案在检测敏感度上不弱于目前的荧光定量PCR方法。
突变分析能力试验
对45份标本中含有的病毒基因组基因分析。将样本中比对到各个靶区域的片段进行分 组，随机选取每组内的30条数据作为校正“种子序列”，每次随机选择分组内的其他50条序列使用Medaka software(version 0.10.1)对每一条“种子序列”进行数据准确性校正。 校正后的30条“种子序列”再与病毒的标准参考基因组进行比较。当超过80％的“种子序 列”与参考基因组序列之间均存在相同的碱基差异时，被测样本携带病毒的该基因位点被 认为发生突变。
采用上述流程，在本次检测的45份标本中，在编号C1的感染者携带新冠病毒基因组 上发现了单碱基突变。如图2显示，该患者携带病毒的基因组上22097个碱基位点由原来的G碱基突变为了A碱基。
其中图2中，最上方一条序列为新型冠状病毒标准参考序列，下方30条为校正后的“种子序列”，经过校正后的种子序列与病毒参考序列在该位点存在差异，提示该位点存 在基因突变。
实施例12血流系统中真菌感染的快速鉴定
重症移植科病区A患者和B患者两人。A患者和B患者均表现为临床真菌抗原阳性，临床诊断：社区获得性肺炎，重症(肺孢子菌感染)，临床表现为免疫性缺失的感染症状。 使用针对肺孢子菌药物进行治疗后效果不明显，A患者于5月6日送血培养检测血流感染 情况，同一份血液送检本发明所提供的引物和方法进行检测。5月12日血培养结果报告阳 性，再通过纯化培养后于5月13日通过质谱分析鉴定为马尔尼菲蓝状菌，共计花费一周时 间进行鉴定；而使用本发明所提供的方法在测序8小时后，于5月7日获得标本鉴定结果， 从真菌检测数据中得到8条正确比对到马尔尼菲蓝状菌的测序数据，并以此最终确定为马 尔尼菲蓝状菌引起的真菌性血流感染，共计花费1天时间。类似情况，B患者于5月28日 凌晨2点送检血液培养，29日上午10点血培养报告阳性，再通过纯化培养于30日上午10 点报告为马尔尼菲蓝状菌引起的血流感染，共计花费近3天时间；而使用本发明所提供的 方法，由于患者血流感染情况严重，血液中马尔尼菲蓝状菌的比例较高，在测序10分钟后 既可以从血液中检出超过50条比对到马尔尼菲蓝状菌的测序数据，并在28日当天予以报 告临床，共计花费12小时。
血培养是目前临床最为常用，也是被认为检验金标准的血液感染诊断方案。上述所展 示的两个临床案例，分别为严重感染与初期感染的情况。无论是何种临床情况，通过本发 明所提供的方案均与血培养检测的结果一致，同时大幅度缩减了检测所需的时间。
以上所描述的详细内容仅作为两个临床案例，用于说明本发明的效果。采用与上述相 同的方法，发明人通过对一千多例临床案例进行分析，比较分析了培养与通过本发明所提 供的引物和方法进行检测的结果，通过比较发现：采用本发明所提供的引物和方法进行检 测，其检测准确率远高于培养的检测结果；而且采用本发明所提供的引物和方法进行检测， 所用到的检测时间更短，尤其是针对真菌的检测，时间上更表现出明显缩短的优势。
实施例13呼吸系统中结核分枝杆菌感染的快速鉴定
由于结核分枝杆菌生长极为缓慢，需要近一个月的时间培养鉴定，因此以往在临床诊 断上，往往采用GeneXpert核酸检测方法(WHO推荐金标准)，T-SPOT抗原检测方法或者抗酸染色方法进行鉴定。而这些方法需要1-8小时可以对结核分枝杆菌进行鉴定。但受其技术限制，其只能针对性的对结核分枝杆菌一种病原体进行检测，因此在临床使用中，往往需要临床医生通过临床症状进行预先判断或对多种病原体进行逐一筛查。这整个过程耗时费力，且容易受到医生经验等主观因素影响。采用本发明所提供的引物和方法对呼吸内科收治的500余份呼吸系统感染患者的痰液或者肺泡灌洗液标本进行全部细菌与真菌的检测分析，在其中34个患者的标本中鉴定到结核分枝杆菌感染(表14)。
针对这34个患者，其中有27人同时使用金标准的GeneXpert核酸检测方法进行了复 检，结果显示27人均为结核分枝杆菌阳性，与采用本发明所提供的引物和方法所获得的结 果100％吻合。
表14结核分枝杆菌检测吻合性
Figure BDA0002455994330000341
Figure BDA0002455994330000351
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、 或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包 含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针 对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个 或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术 人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和 组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的， 不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例 进行变化、修改、替换和变型。

Claims (12)

1.一种基于纳米孔测序平台的文库的构建方法，其特征在于，包括：
对来自于微生物的靶基因进行富集，以便获得富集产物，所述微生物包括选自细菌、真菌或者病毒中的至少一种；
基于所述富集产物进行建库，以便获得所述测序文库；
任选地，所述微生物为真菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细菌靶基因包括通用细菌靶基因和/或高敏感细菌靶基因，
所述通用细菌靶基因包括选自16s rRNA、rpob、gyrB、hsp60、ISR、23s rRNA中的至少一种，优选包括表5中所列出的靶区域及其前后500bp的区域；
所述高敏感细菌靶基因包括选自表1所示高敏感细菌上靶基因中的至少一种，优选包括表7所列出的靶区域及其前后500bp的区域。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述真菌靶基因包括通用真菌靶基因和/或高敏感真菌靶基因，
所述通用真菌靶基因包括选自ITS1-4、LSU(D1/2)、18s rRNA、RPB2中的至少一种，优选包括表6中所列出的靶区域及其前后500bp的区域；
所述高敏感真菌靶基因包括选自表2所示高敏感真菌上靶基因中的至少一种，优选包括表8所列出的靶区域及其前后500bp的区域。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒靶基因包括多重病毒靶基因和/或新冠病毒靶基因，
所述多重病毒靶基因包括选自表3所示病毒靶基因中的至少一种，优选包括表9所列出的靶区域及其前后200bp的区域；
所述新冠病毒靶基因包括选自表4所示靶基因中的至少一种，优选包括表10所列出的靶区域及其前后200bp的区域。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，进一步包括：
将通用细菌靶基因富集产物、通用真菌靶基因富集产物、高敏感细菌和高敏感真菌靶基因富集产物、多重病毒靶基因富集产物和新冠病毒靶基因富集产物按照质量比为20～60：5～15：10～25：10～25：10～25的比例混合，对混合后的产物进行建库，以便获得所述测序文库。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：
基于引物池中的引物对所述来自于微生物的靶基因进行PCR扩增，实现对所述靶基因的富集，以便获得富集产物，所述引物池包含至少一条引物；
任选地，所述引物池中的引物均满足下列条件：
a.所述引物长度为18-30个碱基；
b.所述引物的解链温度Tm值为57-64℃；
c.所述引物中GC含量为40-60％；
d.所述引物的3’末端5个碱基的吉布斯自由能ΔG大于等于-9kcal/mol；
e.所述引物自身互补性数值小于8.0，引物3’末端自我互补参数小于3.0；
f.所述引物3’末端连续3个碱基上不存在简并碱基；
g.所述引物的扩增产物长度为200～1500个碱基；
优选地，所述引物池包括选自下列引物池中的至少一种：
通用细菌引物池，所述通用细菌引物池包括表5所列出的引物；
通用真菌引物池，所述通用真菌引物池包括表6所列出的引物；
高敏感细菌引物池，所述高敏感细菌引物池包括表7所列出的引物；
高敏感真菌引物池，所述高敏感真菌引物池包括表8所列出的引物；
多重病毒引物池，所述多重病毒引物池包括表9所列出的引物；
新冠病毒引物池，所述新冠病毒引物池包括表10所列出的引物。
7.一种测序方法，其特征在于，包括：
基于权利要求1～6中任一项所述的方法获得测序文库；
基于所述测序文库，利用纳米孔测序平台进行测序。
8.一种鉴定微生物的方法，其特征在于，包括：
基于待测样本核酸，根据权利要求1～6中任一项所述的方法获得测序文库；
基于所述测序文库，利用纳米孔测序平台进行测序，以便获得测序结果；
将所述测序结果与参考数据库进行比对，基于比对结果确定所述待测样本中的微生物；
任选地，所述参考数据库包括下列中的至少一种：
通用细菌数据库，所述通用细菌数据库含有16s rRNA、rpob、gyrB、hsp60、23s rRNA和ISR基因数据；
通用真菌数据库，所述通用真菌数据库含有TS1-4、LSU(D1/2)、18s rRNA和RPB2基因数据；
高敏感细菌数据库，所述高敏感细菌数据库含有表1所示高敏感细菌靶基因数据；
高敏感真菌数据库，所述高敏感真菌数据库含有表2所示高敏感真菌靶基因数据；
多重病毒数据库，所述多重病毒数据库含有表3所示病毒靶基因数据；
新冠病毒数据库，所述新冠病毒数据库含有SARS-CoV-2病毒的基因组数据。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，进一步包括：
将所述测序结果分别与所述通用细菌数据库和所述通用真菌数据库进行比对，以便获得第一比对数据和第一未比对数据；
将所述第一未比对数据分别与所述高敏感细菌数据库和所述高敏感真菌数据库进行比对，以便获得第二比对数据和第二未比对数据；
将所述第二未比对数据与所述多重病毒数据库和所述新冠病毒数据库进行比对，以便获得第三比对数据；
基于所述第一比对数据，确定所述样本中含有的通用细菌和通用真菌，基于所述第二比对数据，确定样本中含有高敏感细菌和高敏感真菌，基于所述第三比对数据，确定所述样本中含有的病毒；
任选地，
所述基于所述第一比对数据，确定所述样本中含有的细菌和真菌进一步包括：
将所述第一比对数据分为第一唯一比对数据和至少一组第一交叉比对数据，每组第一交叉比对数据含有多条序列；
将每组第一交叉数据中的部分多条序列作为种子序列，利用组内剩余部分序列对所述种子序列进行校正，以便获得校正后种子序列；
将所述校正后种子序列与所述通用细菌数据库和所述通用真菌数据库的最优比对数据，和所述第一唯一比对数据合并，确定所述样本中含有的通用细菌和通用真菌；
任选地，
所述基于所述第二比对数据，确定所述样本含有的高敏感细菌和高敏感真菌进一步包括：
将所述第二比对数据分为第二唯一比对数据和至少一组第二交叉比对数据，每组第二交叉比对数据含有多条序列；
将每组第二交叉数据中的部分多条序列作为种子序列，利用组内剩余部分序列对所述种子序列进行校正，以便获得校正后种子序列；
将所述校正后种子序列与所述高敏感细菌数据库和所述高敏感真菌数据库的最优比对结果，和所述第二唯一比对数据合并，确定所述样本中含有的高敏感细菌和高敏感真菌；
任选地，
所述基于所述第三比对数据，确定所述样本中含有的病毒进一步包括：
将所述第三比对数据中比对到同一基因区域的多条序列划为一组，以每组中的部分序列作为种子序列，利用组内剩余部分序列对所述种子序列进行校正，以便获得校正后种子序列；
基于所述校正后种子序列与所述多重病毒数据库和所述新冠病毒数据库的最优比对结果，确定所述样本中含有的病毒；
任选地，进一步包括：基于至少80％以上的所述校正后种子序列与所述多重病毒数据库和所述新冠病毒数据库之间存在的相同碱基差异，确定所述待测样本中存在的病毒突变位点。
10.一种鉴定微生物的装置，其特征在于，包括：
数据处理单元，所述数据处理单元基于待测样本核酸的测序结果与参考数据库进行比对，用于确定所述待测样本中的微生物；
任选地，进一步包括：
文库构建单元，所述文库构建单元基于所述待测样本核酸，根据权利要求1～8中任一项所述的方法获得测序文库；
测序单元，所述测序单元基于所述测序文库，利用纳米孔测序平台进行测序，以便获得所述测序结果；
任选地，所述参考数据库包括下列中的至少一种：
通用细菌数据库，所述通用细菌数据库含有16s rRNA、rpob、gyrB、hsp60、23s rRNA和ISR基因数据；
通用真菌数据库，所述通用真菌数据库含有TS1-4、LSU(D1/2)、18s rRNA和RPB2基因数据；
高敏感细菌数据库，所述高敏感细菌数据库含有表1所示高敏感细菌靶基因数据；
高敏感真菌数据库，所述高敏感真菌数据库含有表2所示高敏感真菌靶基因数据；
多重病毒数据库，所述多重病毒数据库含有表3所示病毒靶基因数据；
新冠病毒数据库，所述新冠病毒数据库含有SARS-CoV-2病毒的基因组数据。
11.根据权利要求10所述的装置，其特征在于，所述数据处理单元进一步包括：
将所述测序结果分别与所述通用细菌数据库和所述通用真菌数据库进行比对，以便获得第一比对数据和第一未比对数据；
将所述第一未比对数据分别与所述高敏感细菌数据库和所述高敏感真菌数据库进行比对，以便获得第二比对数据和第二未比对数据；
将所述第二未比对数据与所述多重病毒数据库和所述新冠病毒数据库进行比对，以便获得第三比对数据；
基于所述第一比对数据，确定所述样本中含有的通用细菌和通用真菌，基于所述第二比对数据，确定样本中含有高敏感细菌和高敏感真菌，基于所述第三比对数据，确定所述样本中含有的病毒；
任选地，
所述基于所述第一比对数据，确定所述样本中含有的细菌和真菌进一步包括：
将所述第一比对数据分为第一唯一比对数据和至少一组第一交叉比对数据，每组第一交叉比对数据含有多条序列；
将每组第一交叉数据中的部分多条序列作为种子序列，利用组内剩余部分序列对所述种子序列进行校正，以便获得校正后种子序列；
将所述校正后种子序列与所述通用细菌数据库和所述通用真菌数据库的最优比对结果，和所述第一唯一比对数据合并，确定所述样本中含有的通用细菌和通用真菌；
任选地，所述基于所述第二比对数据，确定所述样本含有的高敏感细菌和高敏感真菌进一步包括：
将所述第二比对数据分为第二唯一比对数据和至少一组第二交叉比对数据，每组第二交叉比对数据含有多条序列；
将每组第二交叉数据中的部分多条序列作为种子序列，利用组内剩余部分序列对所述种子序列进行校正，以便获得校正后种子序列；
将所述校正后种子序列与所述高敏感细菌数据库和所述高敏感真菌数据库的最优比对结果，和所述第二唯一比对数据合并，确定所述样本中含有的高敏感细菌和高敏感真菌；
任选地，所述基于所述第三比对数据，确定所述样本中含有的病毒进一步包括：
将所述第三比对数据中比对到同一基因区域的多条序列划为一组，以每组中的部分序列作为种子序列，利用组内剩余部分序列对所述种子序列进行校正，以便获得校正后种子序列；
基于所述校正后种子序列与所述多重病毒数据库和所述新冠病毒数据库的最优比对结果，确定所述样本中含有的病毒；
任选地，进一步包括：基于至少80％以上的所述校正后种子序列与所述多重病毒数据库和所述新冠病毒数据库之间存在的相同碱基差异，确定所述待测样本中存在的病毒突变位点。
12.一种试剂盒，其特征在于，包括引物池，所述引物池包括选自下列中的至少之一：
通用细菌引物池，所述通用细菌引物池包括表5所列出的引物；
通用真菌引物池，所述通用真菌引物池包括表6所列出的引物；
高敏感细菌引物池，所述高敏感细菌引物池包括表7所列出的引物；
高敏感真菌引物池，所述高敏感真菌引物池包括表8所列出的引物；
多重病毒引物池，所述多重病毒引物池包括表9所列出的引物；
新冠病毒引物池，所述新冠病毒引物池包括表10所列出的引物。
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Consortium OPATHY Arastehfar A Westerdijk Fungal Biodiversity Institute, 3584 CT, Utrecht, The Netherlands Institute for Biodiversity and Ecosystem Dynamics (IBED), University of Amsterdam, 1012 WX, Amsterdam, The Netherlands Boekhout T Institute for Biodiversity and Ecosystem Dynamics (IBED), University of Amsterdam, 1012 WX, Amsterdam, The Netherlands Butler G School of Biomedical and Biomolecular Science and UCD Conway Institute of Biomolecular and Biomedical Research, Conway Institute, University College Dublin, Belfield, Dublin, Ireland De Cesare G Buda MRC Centre for Medical Mycology at University of Aberdeen, Institute of Medical Sciences, Foresterhill, Aberdeen, UK Dolk E QVQ Holding BV, Yalelaan 1, 3584 CL Utrecht, The Netherlands Gabaldón T Bioinformatics and Genomics Programme, Centre for Genomic Regulation (CRG), Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), Dr. Aiguader 88, 08003 Barcelona, Spain Universitat Pompeu Fabra (UPF), 08003 Barcelona, Spain Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA), Passeig Lluís Companys 23, 08010 Barcelona, Spain Hafez A Universitat Pompeu Fabra (UPF), 08003 Barcelona, Spain Biotechvana, Calle/Catedrático Agustín Escardino No. 9, Scientific Park Universitat de València, 46980 Paterna, Valencia, Spain Faculty of Computers and Information, Menia University, Egypt Hube B Department of Microbial Pathogenicity Mechanisms, Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology, Hans Knoell Institute (HKI), Jena, Germany; Friedrich Schiller University, Jena, Germany Hagen F Hovhannisyan H Bioinformatics and Genomics Programme, Centre for Genomic Regulation (CRG), Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), Dr. Aiguader 88, 08003 Barcelona, Spain Universitat Pompeu Fabra (UPF), 08003 Barcelona, Spain Iracane E School of Biomedical and Biomolecular Science and UCD Conway Institute of Biomolecular and Biomedical Research, Conway Institute, University College Dublin, Belfield, Dublin, Ireland Kostrzewa M Bruker Daltonik GmbH, Fahrenheitstr. 4, 28359 Bremen, Germany Lackner M Division of Hygiene and Medical Microbiology, Medical University of Innsbruck, Schöpfstrasse 41, 6020 Innsbruck, Austria Lass-Flörl C Division of Hygiene and Medical Microbiology, Medical University of Innsbruck, Schöpfstrasse 41, 6020 Innsbruck, Austria Llorens C Biotechvana, Calle/Catedrático Agustín Escardino No. 9, Scientific Park Universitat de València, 46980 Paterna, Valencia, Spain Mixão V Bioinformatics and Genomics Programme, Centre for Genomic Regulation (CRG), Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), Dr. Aiguader 88, 08003 Barcelona, Spain Universitat Pompeu Fabra (UPF), 08003 Barcelona, Spain Munro C MRC Centre for Medical Mycology at University of Aberdeen, Institute of Medical Sciences, Foresterhill, Aberdeen, UK Oliveira-Pacheco J School of Biomedical and Biomolecular Science and UCD Conway Institute of Biomolecular and Biomedical Research, Conway Institute, University College Dublin, Belfield, Dublin, Ireland Pekmezovic M Department of Microbial Pathogenicity Mechanisms, Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology, Hans Knoell Institute (HKI), Jena, Germany; Friedrich Schiller University, Jena, Germany Pérez-Hansen A Division of Hygiene and Medical Microbiology, Medical University of Innsbruck, Schöpfstrasse 41, 6020 Innsbruck, Austria Sanchez A Rodriguez Laboratory Bacteriology Research, Department Clinical Chemistry, Microbiology & Immunology, Faculty of Medicine & Health Sciences, Ghent University, Flanders, Belgium; Medical Research Building II, 1st Floor, Ghent University Hospital, Entrance 38, Heymanslaan 10, 9000 Gent, Belgium Sauer FM Institute for Biodiversity and Ecosystem Dynamics (IBED), University of Amsterdam, 1012 WX, Amsterdam, The Netherlands QVQ Holding BV, Yalelaan 1, 3584 CL Utrecht, The Netherlands Sparbier K Bruker Daltonik GmbH, Fahrenheitstr. 4, 28359 Bremen, Germany Stavrou AA Institute for Biodiversity and Ecosystem Dynamics (IBED), University of Amsterdam, 1012 WX, Amsterdam, The Netherlands Vaneechoutte M Laboratory Bacteriology Research, Department Clinical Chemistry, Microbiology & Immunology, Faculty of Medicine & Health Sciences, Ghent University, Flanders, Belgium; Medical Research Building II, 1st Floor, Ghent University Hospital, Entrance 38, Heymanslaan 10, 9000 Gent, Belgium Vatanshenassan M Institute for Biodiversity and Ecosystem Dynamics (IBED), University of Amsterdam, 1012 WX, Amsterdam, The Netherlands Bruker Daltonik GmbH, Fahrenheitstr. 4, 28359 Bremen, Germany et al. Recent trends in molecular diagnostics of yeast infections: from PCR to NGS
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