CN109402274B - 一种鉴别a型和b型牛源多杀性巴氏杆菌的荧光定量rt-pcr方法 - Google Patents

Abstract

本发明通过RNA‑seq技术获得A型和B型牛源多杀性巴氏杆菌菌株的差异表达基因的方法，以及通过多杀性巴氏杆菌的差异表达基因或其产物检测A型多杀性巴氏杆菌或者鉴别A型和B型牛源多杀性巴氏杆菌的应用。本发明还建立了基于差异表达基因鉴别A型和B型多杀性巴氏杆菌的荧光定量RT‑PCR方法。所述RT‑PCR方法包括对多杀性巴氏杆菌TadD基因进行扩增的步骤。本发明的方法可以高灵敏度、高特异性地检测A型菌株，灵敏度为10fg cDNA/μL，是常规PCR的1000倍，且不与其他种属的细菌反应，具有良好的特异性。本发明的方法通过特异性检测A型牛源多杀性巴氏杆菌和鉴别A型与B型多杀性巴氏杆菌，不仅可以对相关疫病进行鉴别诊断，也可为今后A型疫苗的免疫效力提供有效监测，具有重大的实用价值和应用前景。

Description

一种鉴别A型和B型牛源多杀性巴氏杆菌的荧光定量RT-PCR 方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，通过分析差异表达基因或其表达产物建立区分牛源A型和B型的分子诊断方法，具体涉及一种鉴别A型和B型牛源多杀性巴氏杆菌的荧光定量RT-PCR方法。

背景技术

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)是一种革兰氏阴性杆菌，可以引起牛、猪、兔、鸡等家养动物和野生动物以出血性败血症及呼吸系统疾患为主的疾病。根据最通用的Carter和Heddleston分型系统，多杀性巴氏杆菌可分为5个荚膜血清群(A、B、D、E和F)和16个脂多糖血清型(1-16)。荚膜分群的传统方法主要为间接血凝(IHA)或凝胶扩散(GD法，脂多糖分型主要为凝胶扩散(GD)。然而，传统血清学方法由于存在抗原和高免血清制备费时费力、成本高、敏感性低、许多菌株不可分型或出现交叉反应、结果难以判定等缺点，已经逐渐淡出了诊断实验室。因此，基于DNA的分型方法已经得到了重大发展，如Kamp等以皮肤坏死毒素(tox A)基因为对象，对猪鼻腔和扁桃体擦拭液进行检测；Townsend等以Pm特异性基因kmt1和荚膜生物合成基因hya D-hya C、bcb D、dcb F、ecb J、fcb D建立了Pm多重PCR荚膜血清群分群方法；Harper等建立了用多重PCR鉴定Pm的16个脂多糖血清型，此外，Subaaharan等通过基因序列为Pm设计了一种称为多位点序列分型(MLST)的分型的方法，这些基于基因的分型方法可有效替代繁琐、低效且重复性差的传统血清学方法。

不同的血清型Pm与特定的宿主或疾病相关联，其中牛出血性败血症(Hemorrhagicsepticemia，HS)是一种高死亡率的急性传染病，主要由高致病性的B型菌株引发，目前临床上使用的用于预防牛出血性败血症的多杀性巴氏杆菌疫苗，疫苗株也多为B型多杀性巴氏杆菌，虽然该类疫苗在控制牛源巴氏杆菌病中起到了重要的作用，但是对其他血清型的交叉保护性弱。自2008年我国首次分离出A型Pm以来，A型Pm菌的报道逐渐增多并占主导地位，且目前尚没有针对A型菌株的疫苗，从而导致了A型Pm依然广泛危害着国内牛场，对养牛业造成了巨大经济损失，因此准确快速地鉴定或区分A、B型是预防和控制牛源多杀性巴氏杆菌感染的关键。

迄今为止，以特定基因为分子标识的PCR方法已经成为实验室的主要诊断方法。由于该方法容易因环境污染、气溶胶等原因而出现假阳性的结果，同时实验条件要求较高，因而不利于在生产中大面积推广使用。随着细菌基因组学的迅速发展和完成，细菌转录组学的应用迅速扩大。然而，基于转录组学在牛源A型和B型Pm中寻找新的诊断标记以及建立相应的鉴别方法还未有报道。

发明内容

本发明通过对A型和B型Pm菌株分别进行同等条件下培养，然后进行RNA测序(RNA-seq)并进行转录组分析，最终筛选出A型和B型多杀性巴氏杆菌中差异表达的基因，以及在A型多杀性巴氏杆菌中表达而在B型巴氏杆菌中不表达的基因。并利用在A型多杀性巴氏杆菌中表达而在B型巴氏杆菌中不表达的菌毛装配蛋白TadD作为目标基因，建立了一种可有效鉴别A型和B型两种血清型牛源多杀性巴氏杆菌的荧光定量RT-PCR方法。

第一方面，本发明通过RNA-seq技术获得多杀性巴氏杆菌A型和B型菌株的差异表达基因的方法，所述方法包括步骤：

1)培养多杀性巴氏杆菌A型和B型菌株，制备A型和B型菌株样品；

2)提取细菌RNA；

3)富集mRNA，随机打断RNA，实现mRNA片段化，以mRNA为模板，合成链特异性cDNA文库；

4)对样品进行测序，获得测序原始数据，利用多杀性巴氏杆菌的参考序列进行生物信息分析；

5)对原始测序数据过滤，进行数据质量控制；

6)使用比对软件对测序结果进行比对分析；

7)分析基因表达水平及差异基因表达，筛选出差异表达基因；

8)根据差异表达基因设计引物，通过RT-PCR验证显著差异表达基因。

本发明筛选出的差异表达基因包括，但不限于Flp家族IVb型菌毛蛋白、菌毛装配蛋白TadD、TadG、TadE、CpaF，AraC家族转录调控因子、荚膜多糖转运蛋白、丝氨酸内切蛋白酶DegQ、硫醇还原酶硫氧还原蛋白(TrxR)B型50S核糖体蛋白L31、溶菌酶抑制剂Lvy、膜蛋白FxsA、分子伴侣HtpG、稀有脂蛋白RlpA、间隔环裂解糖基化酶、锌金属蛋白酶HtpX、细胞质肽链内切酶MepM和假定蛋白。

本发明筛选出的差异表达基因及其表达产物可用于制备检测牛源A型多杀性巴氏杆菌或区分A型和B型多杀性巴氏杆菌的生物标志物和诊断试剂。

本发明通过差异表达基因的核酸检测牛源A型多杀性巴氏杆菌或区分A型和B型多杀性巴氏杆菌，包括分子杂交，如分子杂交Southern Blot,Northern Blot，核酸探针，基因芯片；核酸扩增，如PCR，定量PCR。

通过基因工程技术获得差异表达基因的表达产物，如原核表达产物、真核表达产物，或者制备针对差异表达基因的表达产物的抗体，如多克隆抗体或者单克隆抗体，建立基于差异表达基因的表达产物的检测A型多杀性巴氏杆菌或区分A型和B型牛源多杀性巴氏杆菌，如western blot、ELISA的方法。

第二方面,本发明还以菌毛装配蛋白TadD作为目标基因,提供了一种特异性检测牛源A型多杀性巴氏杆菌或鉴别A型和B型多杀性巴氏杆菌的荧光定量RT-PCR方法，所述方法包括对多杀性巴氏杆菌TadD基因进行扩增的步骤。本发明的方法中对TadD基因进行扩增时使用的引物可以扩增80-200bp的片段，100-200bp的片段，或者扩增120-160bp的片段，或者扩增130-150bp的片段。

优选地，引物序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，或者与SEQ ID NO:2和SEQID NO:3的序列有至少85％、90％或者95％的同源性。

本发明中TadD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的荧光定量RT-PCR方法，其具体包括如下步骤：

1)提取待测样品的RNA，

2)经反转录获得待测样品的cDNA；

3)使用本发明的引物或试剂盒配制荧光定量RT-PCR反应体系进行检测。

本发明的方法中，待测样品是从患呼吸道疾病牛病料组织样品分离得到的巴氏杆菌。

在实验室中特异性检测A型多杀性巴氏杆菌或鉴别A型和B型多杀性巴氏杆菌也属于本发明方法的应用范围。

本发明提供了一种用于特异性检测A型多杀性巴氏杆菌或鉴别A型和B型多杀性巴氏杆菌的引物，所述引物是针对TadD基因而设计的。

优选的，本发明的引物序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

本发明中TadD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明提供了一种特异性检测A型多杀性巴氏杆菌或鉴别A型和B型多杀性巴氏杆菌的试剂盒，所述试剂盒包含针对多杀性巴氏杆菌TadD设计的引物。

优选的，本发明的试剂盒中，引物序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

进一步的，本发明的试剂盒中还可包含qPCR超混液(也称预混液)、RNase-freeddH₂O、阳性对照和/或阴性对照。所述qPCR超混液是包含qPCR所需要的多种成分的混合液，包括缓冲液、dNTPs、热稳定性DNA聚合酶、Mg²⁺以及荧光染料等。例如Universal SYBR GreenSupermix(BIO-RAD)。当然，也可以将缓冲液、dNTPs、热稳定性DNA聚合酶、Mg²⁺以及荧光染料等分别作为本发明试剂盒的组成部分。所述阳性对照为含A型牛多杀性巴氏杆菌PCR扩增产物片段的质粒；所述阴性对照为ddH₂O。

第四方面，本发明还涉及上述引物或试剂盒在特异性检测A型多杀性巴氏杆菌或鉴别A型和B型多杀性巴氏杆菌的应用。

本发明中，在利用上述引物或试剂盒对A型多杀性巴氏杆菌进行检测或对A型和B型多杀性巴氏杆菌进行鉴别是采用了荧光定量RT-PCR方法。

进一步的，上述荧光定量RT-PCR方法的反应体系为：

进一步的，上述荧光定量RT-PCR的反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性5s，60℃退火30s，共39个循环；每个循环退火结束时，通过终点模式收集荧光信号并进行检测。仪器自动获得扩增产物的熔融曲线。

本发明的引物通过Primer 5.0软件进行设计，引物在TadD的保守区域(TGCGACAGAAATTGCTTCTTGGAAATTATTTAATTGAATTAGATTTTTTATCTGTAATATTTTCGCTTGTGTAGCAAGCTTCGTATTATCATTCAGTAATGGCGTTAAATAAAGTAAAGAAGATTTGCTGTCACCTCGCTGA)进行筛选，引物的设计原则是：扩增产物不形成二级结构；产物长度在80～200bp；或100-200bp，或120-160bp，或130-150bp；引物长度在15～30碱基之间；G+C含量在40％～60％之间；引物自身不形成发卡结构。

本发明通过对牛源A型Pm菌株(Pm1)与B型Pm菌株(448-C45-11)进行转录组测序，分析测序结果并首次筛选到在A型菌株中表达而B型菌株中不表达的基因—TadD。该基因可以作为特异性检测A型Pm菌株的分子标识。

本发明以TadD作为分子标识并设计了针对性引物，利用SYBR Green I荧光染料建立了荧光定量RT-PCR方法。该方法能够特异性的检测出牛源A型Pm，而无法检测出B型Pm。其灵敏度为10fg cDNA/μL，是常规PCR的1000倍。通过对其他种属细菌样本进行扩增，验证了本发明的引物及方法具有良好的特异性。相对于常规PCR方法，其特异性强，灵敏度高，操作简单，无需电泳即可直接观察检测结果，可适用于高通量检测A型Pm菌株以及鉴别A型和B型Pm菌株，对于牛源多杀性巴氏杆菌病的监测具有重要意义。

基于分型技术的病原诊断和鉴定，是制定针对性的防治措施以及制备与流行菌株相对应的疫苗的基础，本发明通过对牛源多杀性巴氏杆菌转录组中的TadD基因进行检测，可以快速鉴定出A型牛源多杀性巴氏杆菌，不仅可以对疫病进行鉴别诊断，也可为今后A型疫苗的免疫效力提供有效监测和检验。

附图说明

图1.排名前十的显著差异基因荧光定量RT-PCR验证结果。

图2.荧光定量RT-PCR检测TadD基因标准品的标准曲线。其中，横坐标对应标准品起始浓度的对数值，即横坐标1-8分别对应标准品的浓度为10fg/μL-100ng/μL；纵坐标为该对应浓度的C_t值。

图3.荧光定量RT-PCR检测TadD基因标准品的扩增曲线。其中，1-8分别代表标准品的浓度为100ng/μL；10ng/μL；1ng/μL；100pg/μL；10pg/μL；1pg/μL；100fg/μL；10fg/μL。

图4.Pm TadD基因标准品常规PCR扩增结果。其中，1-8分别代表标准品的浓度为100ng/μL；10ng/μL；1ng/μL；100pg/μL；10pg/μL；1pg/μL；100fg/μL；10fg/μL。

图5.荧光定量RT-PCR检测不同种群的牛源细菌。其中，1：Pm1，2-13：大肠杆菌、短芽孢杆菌、溶血曼氏杆菌、粪链球菌、无乳链球菌、金黄葡萄球菌、隐秘杆菌、448-C45-11、392、393、394及阴性对照。

图6.A型和B型Pm菌株多重PCR检测结果。其中，1：Pm1；2：Pm2；3：Pm3；4：Pm4；5：406；6：1672-C46-14；7：P2225；8：阴性对照；9：M1404；10：448-C45-11；11：1668-C45-9；12：572；13：573；14：阴性对照。

图7.荧光定量RT-PCR检测12株Pm菌株的扩增曲线。1-5：Pm1、Pm2、Pm3、Pm4、P2225；6-12：1672-C46-14、406、M1404、448-C45-11、1668-C45-9、572、573。

具体实施方式

下面结合实施例详细介绍本发明，本发明的优点将会随着描述而更为清楚。应理解，本发明要求保护的范围不受所述具体实施方式的限制，本发明提供的具体实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制，本领域技术人员参照说明书的描述对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，这些无需创造性劳动的改进和替换也应落入本发明所附权利要求书的保护范围之内。

一、实验材料

1、菌株(表1和表2)

表1本发明所用的Pm菌株

表2本发明所用的其它菌株

2、主要试剂

RNeasy Mini Kit、QIAquick PCR Purification Kit均购自QIANGEN公司，FastQuant RT Super Mix FastQuant cDNA第一链合成预混试剂、DNA marker DL2000、DNAmarker DL15000、PCR相关试剂购自天根生化科技公司实施例1A型Pm菌株特异性分子标识的鉴定

一、研究方法

1、细菌培养与样品准备

菌株Pm1与448-C45-11保存于-80℃(用含30％左右甘油的TSB保存)，用接种环挑取保存的菌液划线于TSA平板，37℃过夜培养；次日挑取单个菌落接种于10mL TSB培养基，37℃，220rpm振荡培养12～16h。用1.5mL离心管收集培养好的菌液，13000×g离心5min，之后用PBS重悬菌体再次离心，去除上清后将收集的菌体液氮速冻后保存于-80℃。以上操作均在无菌操作台进行。A、B型菌株分别保存于3个1.5mL离心管，总共6个样品。

2、RNA提取与质量检测

样品RNA提取与检测由南京诺唯赞生物科技有限公司完成：(1)利用培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒(中国，天根；产品号:DP430)提取总RNA；(2)利用Nano Drop 2000初步检测RNA的浓度和纯度；(3)利用Agilent 2100评估RNA的完整性；(4)使用Qubit 3.0荧光仪对RNA浓度进行精确测量。

3、测序文库构建

样品检测合格后，通过细菌核糖体分离试剂盒去除rRNA来富集mRNA，采用加热的方式将mRNA随机打断从而实现mRNA的片段化。以mRNA为模板，用六碱基随机引物(randomhexamers)合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs(dUTP、dATP、dGTP和dCTP)和酶合成二链cDNA，随后利用VAHTSTM DNA Clean Beads纯化双链cDNA。之后用UDG酶降解含有U的cDNA链，最后进行PCR富集，用VAHTSTM DNA Clean Beads纯化PCR产物，得到最终的链特异性cDNA文库。文库构建完成后先使用Qubit 3.0对浓度进行初步测定，随后使用Agilent 2100Bioanalyzer对文库插入片段进行检测，该项符合预期后使用ABI Step One Plus Real-Time PCR system对文库有效浓度进行准确定量。

4、测序及数据分析

文库检测合格后，使用Illumina公司的Hiseq 2000平台对样品进行高通量测序。获得测序原始数据，利用从NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库下载的多杀性巴氏杆菌的参考序列(登录号：NC_016808.1)，进行生物信息分析。

5、数据质量控制

将原始测序数据过滤，测序数据过滤的步骤如下：

(1)去除含接头(adapter)的reads；

(2)去除含N(即无法识别的碱基)比例大于5％的reads；

(3)去除低质量reads。

过滤后数据叫做clean reads，用于后续分析。

6、基因比对分析

参考基因组和基因模型注释文件直接从NCBI网站下载。使用比对软件bowtie 2建立参考基因组索引，并且使用软件TopHat2将配对末端clean reads与参考基因组对齐。然后，对比对结果进行质量评估，完成第二次数据质控工作。

Tophat2分析流程如下：(1)将测序序列与转录组进行比对；(2)将测序序列与基因组外显子进行比对；(3)将测序序列分段比对到基因组外显子上。统计与基因组能够比对上的比对率以及Reads在染色体上的分布后，可在整体上了解样品间的差异。

7、基因表达及基因差异表达分析

基于Tophat2的比对结果，通过HTSeq将比对基因组的Reads进一步定位到基因上，然后统计每个基因比对上的Reads数来估算基因表达水平。基因表达计算方法为：FPKM(expected number of Fragments Per Kilobase of transcript sequence perMillions base pairs sequenced)，即每百万fragments中来自某一基因每千碱基长度的fragments数目。FPKM是对数据中量化基因表达的一种方法，它不仅考虑了测序深度，对其作了归一化，而且对基因长度也作了归一化，使得不同长度的基因在不同测序深度下得到的基因表达水平估计值具有了可比性，目前最为广泛应用。本发明在相同条件下体外培养A型、B型多杀性巴氏杆菌菌株并进行转录组学分析，我们利用DEGseq软件包中的MARS方法对两种血清型菌株进行差异表达分析，选取|log2Ratio|≥1且qvalue≤0.05的基因在不同菌株间为显著差异基因。

8、RNA-seq结果验证

基于转录组测序结果，挑取了排名前十的显著差异基因进行RT-PCR验证，引物设计如表3：

表3排名前十的显著差异基因及引物

荧光定量RT-PCR反应体系如下：

荧光定量RT-PCR程序参照RealUniversal彩色荧光定量预混试剂(SYBR Green)说明书进行操作：95℃预变性15min；95℃变性10s，60℃退火/延伸30s，共40个循环；55℃2h熔融曲线分析。程序完成后保存结果于电脑中。

二、实验结果

1、转录组质量控制及基因组比对

在Illumina测序之后，从6个cDNA文库中总共产生了105820702个原始测序数(Rawreads)。在后续分析中，6个样品的所有测序数据均符合质量控制要求。总计获得105705770个clean reads。在每个库中的Raw reads中，clean reads的百分比在93.77％到96.72％之间。Raw reads中Phred质量值>30的clean reads在86.47到92.16％之间。6个样品中cleanreads的平均GC含量为43.73％，且Q20和Q30均大于85.00％，说明测序质量很高。

随后，将clean reads与多杀性巴氏杆菌参考基因组(Pasteurella multocida36950,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_016808)比对。大部分clean reads分布在外显子区域，其次是基因间区域。在内含子区没有分布clean reads，测序质量如表4所示。所有后续分析都基于唯一映射的读取。

表4测序质量

2、基因表达水平分析

测序得到的reads不仅与基因的真实表达水平成比例，还与基因长度和测序深度有关。因此要将reads先换算成RPKM值，用RPKM来表示基因的表达量，最后将基因的名称、位置等信息注释。以Pm36950全基因组为参考序列(登录号：NC_016808.1)用于RNA-Seq比对。结果表明，大约有2000个基因分别在荚膜A群与B群多杀性巴氏杆菌中表达，其中显著差异基因有810个，相对于A群，B群有304个基因上调，506个基因下调。通过对两株细菌的RPKM绝对值为差异倍数进行比较，分析了两株细菌表达差异位于前十(top10)的基因，具体概况如表5所示。并且筛选出在A型菌株中表达而在B型菌株中不表达的部分显著差异基因。

表5排名前十的显著差异基因

而在810个显著差异基因中，我们筛选出在A型中表达而在B型中不表达的59个基因，其中8个菌毛相关基因(表中编号2、3、6、8、10、11、14、15)适合建立区分A、B型牛源多杀性巴氏杆菌分子诊断方法，包括本发明所述的菌毛装配蛋白编码基因TadD。如表6所示:

表6在Pm1(A型)中表达而在448-C45-11(B型)中不表达的全部基因

本研究以Pm36950全基因组为参考序列(登录号：NC_016808.1)用于RNA-Seq比对，其中共有大约有2000个基因分别在荚膜A群与B群多杀性巴氏杆菌中表达，其中显著差异基因有810个，相对于A群，B群有304个基因上调，506个基因下调。而在810个显著差异基因中，我们筛选出在A群中表达而在B群中不表达的59个基因(表6)，其中“*”标红的为菌毛相关基因。

3、RNA-seq结果的荧光定量RT-PCR的验证

为验证转录组测序结果，以多杀性巴氏杆菌16S RNA为内参基因，筛选了排名前十的显著差异基因进行荧光定量RT-PCR试验，运用2^–ΔΔCt计算差异基因的相对表达量。结果如图2，排名前十的差异基因与RNA-seq结果一致，相对表达量都为显著差异。

实施例2荧光定量RT-PCR方法的建立

一、研究方法

1、cDNA样品的准备

所有菌株的RNA用RNeasy Mini Kit(QIAGEN,Germany；产品号：74106)提取，并用FastKing RT Kit(天根，中国；产品号：KR106)进行反转录获得cDNA，用显微分光光度计测得样品OD值并将样品稀释至100μg/μL保存于-20℃。

2、引物设计与荧光定量RT-PCR条件

基于RNA-seq结果，在荚膜血清A型Pm菌株表达而在B型菌株不表达的基因TadD被筛选出来。根据NCBI核酸数据库中牛源Pm 36950菌株的全基因组序列，在相关计算机软件的辅助下，通过优化参数选择，综合考虑PCR产物的大小、扩增位置、引物的二级结构等因素，本发明的发明人最终从众多的引物组中筛选出扩增效果最好的引物对，上游引物TadD-F为5’-TGCGACAGAAATTGCTTCTTGG-3’(SEQ ID NO:2)；下游引物TadD-R为5’-TCAGCGAGGTGACAGCAAAT-3’(SEQ ID NO:3)；扩增区域为TadD基因的394-535bp。

荧光定量RT-PCR体系包括：2×Universal SYBR Green Supermix(BIO-RAD，产品号：172-5124)10μL、cDNA 0.8μL、上下游引物各0.6μL并用RNase-Free水补足至20μL。

荧光定量RT-PCR程序为：95℃预变性2min；95℃变性5s，60℃退火30s，总共39个循环；在每个循环退火结束时，通过终点模式收集荧光信号并进行检测。仪器自动获得扩增产物的熔融曲线。所有反应均使用7500型实时荧光定量PCR仪进行检测。

3、荧光定量RT-PCR的敏感性、特异性及重复性试验

将Pm1的cDNA样品进行10倍系列稀释，获得浓度为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL的样品，以此为模板，进行荧光定量RT-PCR试验，确定该检测的最低拷贝数。同时，以同样浓度的稀释样品为模板进行常规PCR扩增，比较荧光定量RT-PCR和常规PCR的敏感性。

分别提取牛源大肠杆菌、短芽孢杆菌、溶血曼氏杆菌、粪链球菌、无乳链球菌、金黄葡萄球菌及隐秘杆菌RNA并反转录得到cDNA，以此为模板，以Pm1cDNA为阳性对照进行荧光定量RT-PCR检测，以检验其特异性。

将同一批次的标准品，选100ng/μL、1ng/μL和1pg/μL三个稀释度的标准cDNA为模版连续扩增三次，通过比较C_t值测定批内重复性。将相同样品在3块不同板内扩增测定批间重复性。

4、荧光定量RT-PCR与多重PCR的符合性试验

提取本发明中所有Pm A、B型菌株的DNA，参照世界卫生动物组织(OIE)使用的多重PCR方法(OIE(2012).Haemorrhagic septicaemia,Chapter 2.4.11[M].TerrestrialManual.pp.732-745.Office International Des Epizooties(OIE),Paris,France.)，进行多重PCR检测。用本发明中所有A、B型Pm菌株的cDNA为模板，进行荧光定量RT-PCR试验，统计两种方法的实验结果，计算荧光定量RT-PCR与多重PCR的符合率。

二、实验结果

1、荧光定量RT-PCR的敏感性、特异性及重复性试验

敏感性：将10倍倍比稀释的标准品(100ng/μL～10fg/μL)作为模板，进行荧光定量RT-PCR检测，结果显示该方法能够最低检测到10fg/μL，标准曲线在100ng/μL～10fg/μL呈现较好的线性关系(图3)，标准曲线的相关系数为R²为0.996，计算得扩增效率E＝0.968。常规PCR方法的最低检测限为10pg/μL，荧光定量RT-PCR的方法敏感性比常规PCR高1000倍，其敏感性试验的扩增动力曲线及常规PCR检测分别见图4和图5。

特异性：以大肠杆菌、短芽孢杆菌、溶血曼氏杆菌、粪链球菌、无乳链球菌、金黄葡萄球菌、隐秘杆菌及不同血清型Pm(A型：Pm1；B型：448-C45-11；D型：392；E型：393；F型：394)的cDNA样品为模板进行荧光定量RT-PCR特异性检测，同时设无模板阴性对照。结果表明，仅Pm1样品检出阳性，其他菌株样品和未加模板对照的检测结果均为阴性(图6)。

重复性：将同一批次的标准品选100ng/μL、100pg/μL和100fg/μL三个稀释度的标准cDNA模版连续扩增三次，测定批内重复性。将相同样品在3块不同板内扩增测定批间重复性。批内重复的变异系数为0.48-0.74％；批间重复的变异系数为3.76-5.89％(表7)，表明所建立的方法具有良好的重复性和稳定性。

表7批内和批间重复性试验

2、荧光定量RT-PCR与多重PCR的符合性试验

本实验共有7株A型Pm菌株，分别为Pm1、Pm2、Pm3、Pm4、1672-C46-14、406及P2225；5株B型Pm菌株，分别为M1404、448-C45-11、1668-C45-9、572及573。参照OIE的三重PCR方法检测所有A、B型菌株，结果如图6，除1672-C46-14未检出外，其余全部符合。用荧光定量RT-PCR检测这些菌株的cDNA，结果如图7所示，B型菌株全检测为阴性；A型菌株只有406未被检出，荧光定量RT-PCR与多重PCR的符合率为90.09％(10/11)。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种鉴别A型和B型牛源多杀性巴氏杆菌的荧光定量RT-PCR方法

<130> 2018.11.1

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 774

<212> DNA

<213> Pasteurella multocida

<400> 1

ttaccgagtt acaccttttg atacatgtgt agtttttttc aatgcattaa ttaaatcatc 60

tggtgaagta tttaaacgct ctttaacaat gatatctttt gcataatcaa gatcaccatt 120

tttaactaaa gcaaaaacaa gattatgaat caatcgagaa ttcttaacgc catttaaata 180

ttgtggcaac agtaaagaaa cagcattatt aaaatcgcca ttaataatat ttagcatggc 240

taaattatta atagcaacat tatcattaat aaagaactct cttgctttat tgatatcatt 300

tcgggcattc accaaattcc cattttgcgc ataagcgata cctcttaaat tatatacttc 360

tccttcatta ggtgatttta ataagagttc atttgcgaca gaaattgctt cttggaaatt 420

atttaattga attagatttt ttatctgtaa tattttcgct tgtgtagcaa gcttcgtatt 480

atcattcagt aatggcgtta aataaagtaa agaagatttg ctgtcacctc gctgatagta 540

tgtcttcgct aatttatagc gtattgaagg atcttctttg gctttcaaca catcgcgata 600

cagtgaaatg agtgccgaat aattttgcgt actttcatat aaagtctctt ttgccgttat 660

tgtttcagat gacatacttt tctgtgtcat gccttgctga gaatgggtag aacaaccaac 720

gacagataaa gctaaactaa caaaaacgat tttcttggta aatttaaaaa acat 774

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

tgcgacagaa attgcttctt gg 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

tcagcgaggt gacagcaaat 20

Claims (3)

1.检测多杀性巴氏杆菌TadD基因的试剂在制备区分牛源A型和B型多杀性巴氏杆菌的试剂盒中的用途，该TadD基因在A型多杀性巴氏杆菌中表达而在B型巴氏杆菌中不表达。

2.权利要求1所述的用途，其特征在于，针对TadD基因设计引物，所述引物在TadD基因上可以扩增80-200bp的片段，100-200bp的片段，或者扩增120-160bp的片段，或者扩增130-150bp的片段。

3.权利要求2所述的用途，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO:2和SEQID NO:3所示。

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