CN116219040A - 用于检测植物乳杆菌s58的分子标记、引物探针组和检测方法 - Google Patents

用于检测植物乳杆菌s58的分子标记、引物探针组和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于鉴定植物乳杆菌S58的分子标记、引物组、试剂盒，还公开了鉴定植物乳杆菌S58的方法。本发明通过大量的筛选获得了植物乳杆菌S58特异性片段，并将其用于引物组和探针的构建，设计得到植物乳杆菌S58定量引物探针组，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。该引物探针组特异性良好且灵敏度高，能够快速准确地检测样本中是否含有植物乳杆菌S58及其浓度。

Description

用于检测植物乳杆菌S58的分子标记、引物探针组和检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测植物乳杆菌S58的分子标记、引物探针组和检测方法。
背景技术
益生菌是一类由单一或多种微生物组成的活菌，当摄入—定剂量时，能通过改善宿主肠道微生态平衡来促进人体健康。随着近年对益生菌研究的不断深入，益生菌在医学、食品行业以及畜牧等领域都有广泛应用。
中国专利ZL201911131324.8(发明名称：植物乳杆菌S58及其在制备用于缓解肥胖的产品中的应用)中公开了保藏编号为CCTCCNO：M2019595的植物乳杆菌S58，该植物乳杆菌S58从泡菜中分离得到，经证实可用于缓解或预防辛辣食品对消化道的损伤以及肥胖症或肥胖所引起的代谢性疾病，并可将其应用于食品，药品和功能保健制品，有很好的应用前景。因此，针对植物乳杆菌S58的检测也是未来在相关食品，药品和功能保健制品中必要的一环。
此外，鉴于目前业界对菌株水平益生菌功效评价的共识，在开展肠道内益生菌相关研究时，需要给予菌株水平对其进行定性定量分析，定性判断是否活着进入肠道，定量判断是否达到一定剂量。目前基于菌株水平对肠道内益生菌的定性和定量评价相关研究报道仍较匮乏，尚未建立足够的合理有效的评价方法。而传统分离培养方法效率低且无法从外观形态鉴定到菌株水平，因此建立更多对益生菌基于菌株水平的定性定量分析方法尤为重要。
发明内容
本发明针对植物乳杆菌S58，进行目标菌株和参考菌株的Core/pan分析，识别目标菌株的特有基因。通过比对基因核酸序列与参考菌株的基因组，确认特异性；筛查长度大于150bp的基因；遍历目标菌株基因组上固定长度(150bp)的序列片段，比对参考菌株基因组；筛查目标菌株特异序列片段；判断特异序列片段是否位于编码基因区；对查找到的特异序列，进行NCBI比对检查，最终找到了S58特异基因组片段，并以此建立了植物乳杆菌S58的检测方法。
基于此，本发明提供了一种鉴定植物乳杆菌S58的分子标记，所述分子标记位于CP068767基因组序列上，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
本发明还提供了用于扩增上述的分子标记的引物组，包括上、下游引物，其核苷酸序列如下：
上游引物序列如SEQ ID No.1所示：5’-ACGAGTCGGTTAAGAATC-3’，
下游引物序列如SEQ ID No.2所示：5’-GGTTGGAACAATGATAGTG-3’。
优选地，所述的引物组，还包括探针，
所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示：5’-TCGGACTGATCGCCACCATT-3’，
优选探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团；进一步优选所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1。
本发明还提供了一种用于鉴定植物乳杆菌S58的试剂盒，包含上述任一项所述的引物组，还包含PCR扩增或者实时荧光PCR扩增的反应试剂；
优选还包括DNA提取试剂、阳性对照和阴性对照，所述PCR扩增或者实时荧光PCR扩增的反应试剂包括DNA聚合酶和DNA聚合酶缓冲液。
本发明还提供了一种鉴定植物乳杆菌S58的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA；
(2)采用上述的引物组或者上述的试剂盒，对提取的基因组DNA进行PCR扩增；
(3)检测PCR扩增产物中是否含有目的扩增片段，含有目的扩增片段的样品鉴定为植物乳杆菌S58，所述目的扩增片段的大小为97bp；
优选所述PCR扩增的反应体系为：总体积25μl，包括：2×Taq PCR Master Mix12.5μL，10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，ddH2O 9.5μL，DNA 1μL；PCR反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃4min；
优选采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物中是否含有目的条带。
本发明还提供了一种鉴定植物乳杆菌S58的实时荧光PCR方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA；
(2)采用上述的引物组或者上述的试剂盒，对提取的基因组DNA进行实时荧光PCR扩增，根据扩增结果判断待测对象是否为植物乳杆菌S58，如果Ct≤36则判断为植物乳杆菌S58。
本发明还提供了一种植物乳杆菌S58的荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：
(1)制备标准品：将植物乳杆菌S58的保守基因片段SEQ ID No.4所示的序列插入到克隆隆载体中，获得含有保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；
(2)标准曲线绘制；
(3)使用上述的引物组或者上述的试剂盒对待测样品和标准品采用相同的反应体系进行实时荧光PCR扩增；
(4)通过标准曲线和待测样品的Ct值进行植物乳杆菌S58的定量检测。
优选地，所述克隆载体为pGM-T载体。
优选地，实时荧光PCR方法或者荧光定量PCR检测方法，PCR反应体系25μL，包括：2×FastFire qPCRPreMix 12.5μL，10μM上游引物0.5μL，10μM下游引物0.5μL，10μM探针0.5μL，dd H2O 9μL，模板DNA 1μL；反应条件为：98℃1min；98℃5s,65.3℃15s，40个循环。
本发明最后还提供了上述的分子标记，或者上述的引物组，或者上述的试剂盒在鉴定植物乳杆菌S58中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明通过对具有肠道环境耐受能力和益生功能的植物乳杆菌S58进行全基因组测序，将测序结果与NCBI数据库中164株具有完成图的植物乳杆菌全基因组序列信息进行比较分析，找到植物乳杆菌S58的特有基因，并基于特异基因的序列设计特异性引物探针组。将该引物探针组引用于植物乳杆菌S58的检测中，并通过荧光定量PCR反应体系和条件的优化，获得了最低检测量为2.1×102copies/μL的灵敏性、特异性、准确性、重复性和稳定性良好且快速的植物乳杆菌S58检测方法。
附图说明
图1为植物乳杆菌S58基因比对结果图，横坐标为基因比对次数(也就是植物乳杆菌S58中每个基因被多少个其他植物乳杆菌菌株的基因比对上)、纵坐标是基因个数；横坐标为0时所对应的纵坐标值就是植物乳杆菌S58特有的基因个数。
图2为植物乳杆菌S58的标准曲线。
图3为荧光定量PCR方法的灵敏性检测结果图，图中扩增曲线植物乳杆菌S58从左至右的浓度依次为；2.1×109copies/μL，2.1×108copies/μL，2.1×107copies/μL，2.1×106copies/μL，2.1×105copies/μL，2.1×104copies/μL，2.1×103copies/μL，2.1×102copies/μL。
图4为荧光定量PCR方法特异性检测结果图。
图5为荧光定量PCR方法定量检测粪便中植物乳杆菌S58结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步的详细说明，实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明保护范围。
本发明所用到的仪器为Bio-rad CFX96荧光定量PCR仪。
本发明所用的基因组DNA提取试剂盒、qPCR预混液、DNA纯化回收试剂盒、pGM-T克隆试剂盒、DH5α感受态细胞、质粒小提取试剂盒均购自天根生化科技公司，引物探针由Takara公司合成。
本发明中检测的植物乳杆菌S58已经在中国专利ZL 201911131324.8(公告号CN110684701B)中公开，并已保藏，保藏信息如下：
中国典型培养物保藏中心；地址：中国武汉，武汉大学；保藏日期：2019年8月1日；保藏编号：CCTCC NO：M 2019595；分类命名：植物乳杆菌S58(LactobacillusplantarumS58)。
实施例1：一种基于qPCR检测植物乳杆菌S58的引物探针组
引物和探针的设计：
1、菌株特异基因查找
对植物乳杆菌S58进行全基因组测序，通过与NCBI数据库中164株具有全基因组序列的植物乳杆菌进行比对分析，164个参考菌株上共有484447个编码基因，加上S58菌株上的2828个基因共有487275个编码基因。首先使用基因聚类软件CD-hit对编码基因进行聚类分析，从聚类结果中识别出S58菌株与其它菌株都不能聚类到一起的结果，作为候选的S58菌株特有基因。其次根据长度要求，过滤出长度大于150bp的基因。最后把满足长度要求的基因与NCBI的NT数据库(非冗余基因组序列数据库)进行比对，确认与所有非S58菌株都比对不上的基因，得到2条S58菌株特有的基因序列(图1)，基因序列长度分别为423bp和1164bp。
2、菌株特异基因组片段查找
首先，以50bp为步长，遍历S58菌株基因组上所有长度为150bp的序列片段，比对所有参考菌株基因组序列。筛查S58菌株上没有任何比对结果的序列片段，并把位置具有重叠的序列片段进行合并，合并后的序列作为候选的特异序列片段。其次把候选序列片段与NCBI的NT数据库(非冗余基因组序列数据库)进行比对，确认与所有非S58菌株都比对不上的序列片段。经过序列片段比对和结果筛查，在S58菌株基因组上，共发现6个长度大于150bp的候选特异序列片段。经过与NCBI的NT数据库比对，有1个序列片段比对到更多的其它菌株基因组上，剩下的5个序列片段只能比对到S58菌株基因组上，也即结果得到5个S58菌株的特异序列片段，5个序列片段长度由短到长分别是248bp、679bp、1238bp、1420bp、1945bp。结合S58菌株上基因的位置信息发现，特异基因的分析结果得到的2个S58菌株特异基因正好位于这里找到的5个特异序列片段中。由表2可知，5个序列片段长度由短到长分别是248bp、679bp、1238bp、1420bp、1945bp。以序列片段在基因组出现的起始位点排序，第三个特异序列片段包含一个编码基因(JMO19_10610)，此基因功能未知，第五个特异序列片段包含一个编码基因(JMO19_11120)，功能描述为“DUF262 domain-containing protein”。
对查找到的特异序列，进行NCBI比对检查，使用Primer Premier 5.0等软件设计引物探针。最终确定在CP068767基因组序列上设计引物探针，特异序列片段起始位点位于第2135593个碱基，终止位点位于第2137537个碱基，全长1945bp，特异序列如SEQ ID NO.5所示：
5’-CTTCACATCCTTTCTATAATCCTAATTGGCTAACAATCGCACGAGCGATGCGCTGGTGACCAATTTGGTTGGGATGCAAGCCATCAACTGTTAGGCTACTACCATTTAGCCACGGATAAATTCCAATTACAGCACCCAATTCAATGTACTGTACATTGTACTTTGCACACACAGTTTTAATTGCTTGAATATAATCAGTTTGGGTTGCTCCCTGACCGTTCTCGGCGTTCTTGCCACTAGCCATGTCACTACGATAAGTTGGCGTTATAAATACCAGTTGCGTGGTCGGTAACTTAGCGAAAGCCTGCTTGATCAGGTAATCGATAGCACCATAGAAACTAGTGGTCTTGGTGTCGCCAAGACCACCAAGTGGCATATTAGCACCCCAGTCATTGGTTCCACCCTGAATAAATAAATAATCCAAATCCGGTTGGAACTTGCTAATCCGTTCGCAGAATGAATCTGAACGGTCACTTGCTTGCGTTAACCGCGTACTGCCGATAGTATCGCGAGTTGCCTCAACATTGCAGCTATGACGGCTTAAATCACTGCTAAGATAGTCAATGTAGTTCCGCTTGATCCCACCTATATAAATACCAAACGAGTCGGTTAAGAATCCCATCTTAATTGTTTCAACATCGGACTGATCGCCACCATTGATTATTTGATAAGGACCCGCACTATCATTGTTCCAACCATCATCTGACCCAGCCGTCATCAAAGTTACGATCTGATTGGGCGTGTGCAATTGCCAATTATCAGCCCCATCAGGTGGAACAAAAGCGCCGTTGTGATTGAGCTGAATTGTACTTGATTGCTGTTCTTCCTCAATACAGAAATGGATTTGTGAATACCCTCGGTTACGATCCATGTGTAAGTTAACCAACGCCGTGACAGGTTCTGTCTGCCCGCTAGGCAAGTAGTAATAGTATTCAACCCCTTGGATTGGATAAAGGTCATTAACTCCATCATGCAAAGCCAGATGTGGCGCTGATGTTCGTAGGCTGGCAATCCCACTACCAGCGGTTTCTGGCAAATAGTAAGCCACAGCTTGTTGTACCGTTGTAGCTGCTTTAATGTCGGACAGTGGTAATACCGTAAAATGTTGGGTTCGTGACCTATCACTGGCTTTGACTTCGACTTCGTTAGCCCAAGTCATCCCGTCCAATGAGGACATGCGCCACGTTGAATATGACGCAAAACCATCAGCGAAGCAGTACAACTGGTTGTCTACGACTACCAGTGACGGGCCTTCACATTGCTGAGTAAATGGAATGTCGGTGACATATTCAAAATGACCGGTCACGTTAGCACCCCGATAAAGTTGAATCTTGGGTGCATAATCTGCCTGGCCATAATGATATTCATCTTTCATCGCTAACCACCAGGAACCGTTAAACTTAACCATGGTATTATCGATATTAGTTGCAATCCCAGTTGGGTTAGTATAGTCCAAGGCGGACCAAGCTGTGAACGTCATTAAATTTGGATCAAACTGACACCAATAGCCCTTGTAATCCGCCTGCGAATCCCAAATTTCATAGCTACCAGCGGATGCCAATAAATAAACATTATCGCCATCAACCACCCATTCAGGGGCCCAGTTATTCGTCCCTGCTTCAATTCTTGGTAAAACCAAATGGTGAAAATTAACGAGATCAGTCGTCCAGTAGACACCCCAGGTATAAGCCACCCAGAACTTGCCTGCAAAGTAAGCAACGCTTGGATCACGCACATTGGTGCCAGTTCCAGCCAGTACAGTCTTATTAATTGGTCGGAAAGTTAAATAATCATTAGTCCAATACAGATCTAAACTATTAAAATTAGCGCCGCCAAAAGACGAAACCAGCGCTTTTACTGGGTAGGTTTGCCCCATCGAAACGCCACTATTGCTAGATTGTAAGTTCGCAATAATTTCCTTAATGGCATCGGTATCAGCACCCCG-3’。
上游引物序列如SEQ ID No.1所示：5’-ACGAGTCGGTTAAGAATC-3’；
下游引物序列如SEQ ID No.2所示：5’-GGTTGGAACAATGATAGTG-3’；
探针序列如SEQ ID No.3所示：5’FAM-TCGGACTGATCGCCACCATT-3’BHQ1。
表1：NCBI上用于比对分析的164株植物乳杆菌列表
Figure BDA0004037021180000061
/>
Figure BDA0004037021180000071
说明：Strain：菌株名；Assembly：菌株序列访问ID。
表2：特异序列片段结果列表
Figure BDA0004037021180000072
说明：Seq_ID：序列所在的基因组序列ID，Region_Start：特异序列片段起始位置，Region_end：特异序列片段终止位置，Region_Length：特异序列片段的长度，ID：基因ID，Start：基因的起始位置，End：基因的终止位置，Strand：基因的方向，Product：基因的功能描述。
利用上述引物探针组扩增出的序列如SEQ ID No.4所示：
5’-ACGAGTCGGTTAAGAATCCCATCTTAATTGTTTCAACATCGGACTGATCGCCACCATTGATTATTTGATAAGGACCCGCACTATCATTGTTCCAACC-3’。
实施例2：基于荧光定量PCR的检测植物乳杆菌S58的方法
(1)使用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取植物乳杆菌S58基因组DNA。
(2)用实施例1所述的引物探针组、天根公司的qPCR预混液进行荧光定量PCR扩增，反应体系25μL，包括：2×FastFire qPCR PreMix(Probe)12.5μL，10μM上游引物(SEQ IDNo.1)1μL，10μM下游引物(SEQ ID No.2)1μL，10μM探针0.5μL，ddH2O 9μL，模板DNA 1μL。反应条件为：98℃1min；98℃5s,60℃15s，40个循环。
荧光定量PCR反应条件的优化：
通过对反应体系中引物探针浓度、和退火温度实验结果的比较，选择反应灵敏度高、本底荧光信号低，具有典型S型扩增荧光信号曲线、扩增效率接近1的反应体系。优化得到的反应体系为：2×FastFire qPCR PreMix(Probe)12.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，探针0.5μL，dd H2O 10μL，模板DNA 1μL；优化得到的反应条件为：98℃1min；98℃5s,65.3℃15s，40个循环。
本发明的检测植物乳杆菌S58方法的建立：
1、植物乳杆菌S58荧光定量PCR标准曲线的构建
(1)构建含有植物乳杆菌S58特异序列的质粒
①提取植物乳杆菌S58基因组DNA；
②使用实施例1所述的引物(SEQ ID No.1、SEQ ID No.2)进行普通PCR反应扩增特异序列，反应体系为25μL，包括：2×Taq PCR Master Mix12.5μL，10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，dd H2O 9.5μL，DNA 1μL。反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃4min；4℃∞；
③2.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，切胶。使用通用型DNA纯化回收试剂盒(天根)回收目的片段，目的片段大小为97bp。用pGM-T克隆试剂盒，将扩增的目的基因克隆至pGM-T载体，转化至大肠杆菌DH5α菌株，筛选阳性克隆并进行PCR鉴定，鉴定为阳性的菌落送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证，将测序验证正确的单克隆菌扩大培养；
④使用质粒小提取试剂盒(天根)对菌液进行质粒提取与纯化，使用Nanodrop超微量分光光度计测定质粒浓度，质量浓度为71.8ng/μL，DNA长度为3112bp，质粒拷贝数＝(6.02×1023)×(71.8ng/μL×10-9)/(3112×660)＝2.1×1010copies/μL。
(2)荧光定量PCR标准曲线的构建
用ddH2O将获得的定量标准质粒进行10倍倍比稀释，浓度为2.1×109copies/μL，2.1×108copies/μL，2.1×107copies/μL，2.1×106copies/μL，2.1×105copies/μL，2.1×104copies/μL，2.1×103copies/μL，2.1×102copies/μL，每个稀释度做三个重复。绘制标准曲线(如图1)，结果显示，本检测方法具有良好的线性关系，以DNA拷贝数的对数值(lg[DNA])为x轴，Ct值为y轴作图，得到标准曲线(图2)回归方程y＝-3.3475x+44.611，标准曲线的相关系数(R2)达到0.9964，其中斜率k＝-3.3475，故扩增效率E＝10-1/k-1＝98.94％。根据建立的标准曲线，荧光定量PCR在2.1×102-2.1×109copies/μL的稀释度范围内呈现良好的线性关系。
(3)方法灵敏度检测
用dd H2O将定量标准质粒进行10倍倍比稀释，浓度分别为2.1×109copies/μL，2.1×108copies/μL，2.1×107copies/μL，2.1×106copies/μL，2.1×105copies/μL，2.1×104copies/μL，2.1×103copies/μL，2.1×102copies/μL，用最优化的体系和反应条件对本方法进行灵敏度检测，每个浓度三个平行，记录Ct值，扩增结果如表3和图3，从结果可以看出，该方法检出限为2.1×102copies/μL。最终实验结果Ct值的标准偏差SD介于0.10～1.17之间，相对标准偏差RSD介于0.31％～3.69％之间，误差较小可忽略不计，证明建立的实时荧光定量PCR方法的DNA浓度定量精确度较好。
表3不同浓度标准质粒的Ct值
Figure BDA0004037021180000091
(4)方法特异性检测
使用实施例1中的用于检测植物乳杆菌S58的引物探针组(SEQ ID No.1、SEQIDNo.2、SEQ ID No.3)，选择实验室保藏的74株其它乳杆菌和16株植物乳杆菌种内株进行qPCR扩增，所得扩增结果如表4和图4，74株其它乳杆菌与16株植物乳杆菌扩增结果均为阴性，植物乳杆菌S58对应的6个平行反应Ct值为20.86；21.44；21.09；21.34；21.27；21.43。这表明本发明所设计的用于检测植物乳杆菌S58的引物探针组对S58菌株检测具有良好的特异性。
表4植物乳杆菌S58特异性验证结果
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实施例3：运用本发明提供的引物探针组定量检测粪便样品中植物乳杆菌S58
收集灌胃植物乳杆菌S58后大鼠的粪便，提取粪便DNA后使用本发明提供的引物探针组，按照实施例2中的反应条件进行qPCR扩增，所得扩增结果如图5，3个平行反应Ct值为26.78；24.91；27.88，取平均值带入标准曲线计算得出粪便中植物乳杆菌S58浓度为2.1×105.4＝5.27×105copies/uL。
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Claims (10)

1.鉴定植物乳杆菌S58的分子标记，其特征在于：所述分子标记位于CP068767基因组序列上，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
2.用于扩增权利要求1所述的分子标记的引物组，其特征在于：包括上、下游引物，其核苷酸序列如下：
上游引物序列如SEQ ID No.1所示：5’-ACGAGTCGGTTAAGAATC-3’，
下游引物序列如SEQ ID No.2所示：5’-GGTTGGAACAATGATAGTG-3’。
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于：还包括探针，
所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示：5’-TCGGACTGATCGCCACCATT-3’，优选探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团；进一步优选所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1。
4.一种用于鉴定植物乳杆菌S58的试剂盒，其特征在于：包含权利要求2或3所述的引物组，还包含PCR扩增或者实时荧光PCR扩增的反应试剂；
优选还包括DNA提取试剂、阳性对照和阴性对照，所述PCR扩增或者实时荧光PCR扩增的反应试剂包括DNA聚合酶和DNA聚合酶缓冲液。
5.一种鉴定植物乳杆菌S58的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA；
(2)采用权利要求2所述的引物组或者权利要求4所述的试剂盒，对提取的基因组DNA进行PCR扩增；
(3)检测PCR扩增产物中是否含有目的扩增片段，含有目的扩增片段的样品鉴定为植物乳杆菌S58，所述目的扩增片段的大小为97bp；
优选所述PCR扩增的反应体系为：总体积25μl，包括：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，ddH2O9.5μL，DNA1μL；PCR反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃4min；
优选采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物中是否含有目的条带。
6.一种鉴定植物乳杆菌S58的实时荧光PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA；
(2)采用权利要求3所述的引物组或者权利要求4所述的试剂盒，对提取的基因组DNA进行实时荧光PCR扩增，根据扩增结果判断待测对象是否为植物乳杆菌S58，如果Ct≤36则判断为植物乳杆菌S58。
7.一种植物乳杆菌S58的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备标准品：将植物乳杆菌S58的保守基因片段SEQ ID No.4所示的序列插入到克隆隆载体中，获得含有保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；
(2)标准曲线绘制；
(3)使用权利要求3所述的引物组或者权利要求4所述的试剂盒对待测样品和标准品采用相同的反应体系进行实时荧光PCR扩增；
(4)通过标准曲线和待测样品的Ct值进行植物乳杆菌S58的定量检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述克隆载体为pGM-T载体。
9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：实时荧光PCR方法或者荧光定量PCR检测方法，PCR反应体系25μL，包括：2×FastFireqPCRPreMix12.5μL，10μM上游引物0.5μL，10μM下游引物0.5μL，10μM探针0.5μL，ddH2O9μL，模板DNA1μL；反应条件为：98℃1min；98℃5s,65.3℃15s，40个循环。
10.权利要求1所述的分子标记，或者权利要求2或3所述的引物组，或者权利要求4所述的试剂盒在鉴定植物乳杆菌S58中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117512152A (zh) * 2023-12-08 2024-02-06 华中农业大学 一种快速检测植物乳杆菌Liang的分子标记组合、引物组合及其检测方法
CN117512152B (zh) * 2023-12-08 2024-05-28 华中农业大学 一种快速检测植物乳杆菌Liang的分子标记组合、引物组合及其检测方法

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