CN116411053A - Kpc型碳青霉烯酶基因检测试剂盒、组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了KPC型碳青霉烯酶基因检测试剂盒、组合物及其应用。本发明具体地公开了包括特异性扩增KPC型碳青霉烯酶基因的引物对和crRNA的组合物，含有该组合物的试剂盒以及利用该组合物进行核酸检测的方法。本发明采用PCR技术联合CRISPR‑Cas13a技术检测KPC型碳青霉烯酶基因的方法，通过设计、构建、筛选，最终提供一段用于检测KPC型碳青霉烯酶基因的靶向该序列的特异性crRNA，本发明提供的方法简便、快速、具有较高的灵敏度和特异性。可用于临床快速鉴定产碳青霉烯酶菌株，从而对患者进行合理的抗生素治疗，以缩短治疗周期。有着非常重要的临床应用前景和开发价值。

Description

KPC型碳青霉烯酶基因检测试剂盒、组合物及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及KPC型碳青霉烯酶基因检测试剂盒、组合物及其应用。
背景技术
碳青霉烯类抗菌药物是一类广谱β-内酰胺类抗菌药物，因其抗菌谱广、抗菌作用强，已经成为治疗严重细菌感染最主要的抗菌药物之一，被认为是20世纪80年代以来治疗耐多药革兰阴性杆菌感染的最后一道防线。近年来随着临床上广谱抗菌药物的不当和过度使用等不合理用药情况的增多，导致了对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率也随之加速上升。目前对碳青霉烯类抗菌药物产生耐药的主要菌群是肠杆菌科细菌，其耐药产生的主要机制为产生了一种可水解碳青霉烯类抗菌药物的水解酶，即碳青霉烯酶(Carbapenemase)。根据Ambler分类方法可将其分为三类(A、B和D类)，A类酶包括KPC、GES、SME等，B类酶包括NDM、IMP、VIM等，D类酶包括OXA-48等。虽然种类较多，但在全球范围内主要流行以下5种碳青霉烯酶：KPC(Klebsiella Pneumoniae Car-bapenemase，KPC)、NDM(New Delhi Metallo-β-Lactamases，NDM)、VIM(Verona integron-encoded Metallo-β-Lactamases，VIM)、IMP(Imipenem-resistant Pseudomonas)、OXA-48(Oxacillin-hydrolysing carbapenemase)。KPC型碳青霉烯酶是我国较为流行的一种碳青霉烯酶，其次为NDM型碳青霉烯酶。
目前实验室常用的碳青霉烯酶表型检测方法包括：改良Hodge试验、针对B组碳青霉烯酶的亚胺培南EDTA双纸片协同试验、CLSI推荐的Carba-NP确证试验以及碳青霉烯失活法(CIM)试验，但以上检测方法不仅无法得知具体的碳青霉烯酶基因型，并且检测过程需要耗时24-96h。常用的碳青霉烯酶基因型检测方法包括：传统的PCR法、荧光定量PCR法、全基因组测序等，但这些检测方法需要依赖大型仪器设备，导致其检测成本十分高昂，严重限制其使用和推广。
近年来，基因编辑技术发展迅速，不同亚型的CRISPR-Cas的基因编辑系统拓展了临床检测、基础研究和生物医学领域方面的应用。CRISPR-Cas系统分为两大类，Cas13a是第二大类VI型系统中的效应蛋白，具有RNA介导的RNA酶切活性，它能够特异性靶向切割单链RNA，并在切割后仍保持活性，继续切割其他非靶标RNA，这种特性被称为“附带切割”。利用Cas13a的这种附带切割活性，将其运用于分子诊断检测中，通过在检测体系内加入含有报告基团的单链RNA探针，当Cas13a识别到靶序列的存在时，就会转入一种酶促“激活”状态，进而切割单链RNA探针释放荧光报告基团，发出荧光信号，实现检测靶标序列的目的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何精准、灵敏、简便、快速地检测KPC型碳青霉烯酶基因。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于检测KPC型碳青霉烯酶基因的组合物，所述组合物包括特异性扩增KPC型碳青霉烯酶基因的引物对和crRNA，所述crRNA的序列由用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向KPC型碳青霉烯酶基因靶点序列的向导序列组成，所述向导序列可为SEQ ID No.1。
所述KPC型碳青霉烯酶基因靶点的核苷酸序列为SEQ ID No.5，位于KPC型碳青霉烯酶基因组(GenBank ID：NG049253.1)第324-351位。
上述组合物中，所述crRNA的核苷酸序列可为SEQ ID No.2。
其中，SEQ ID No.2的第1-38位为用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列；SEQ IDNo.2的第39-66位为靶向KPC型碳青霉烯酶基因靶点序列(SEQ ID No.5)的向导序列。
上述组合物中，所述引物对由引物KPC-F3和引物KPC-R3组成，所述引物KPC-F3为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子；所述引物KPC-R3为SEQ ID No.4所示的单链DNA分子。
本发明还提供了用于检测KPC型碳青霉烯酶基因的试剂盒，所述试剂盒包括所述用于检测KPC型碳青霉烯酶基因的组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括Cas13a蛋白。
上述试剂盒中，所述Cas13a蛋白可独立存在或与本发明所述的crRNA以复合物的形式存在。
进一步地，所述Cas13a蛋白可为LwCas13a蛋白。
进一步地，所述试剂盒还包括报告RNA。
所述报告RNA为具有信号报告功能的RNA分子，当所述RNA分子被降解时，能够报告阳性信号并被检测到。
在本发明的一个实施例中，所述报告RNA为RNaseAlertTM QC系统v2(InvitrogenTM公司产品，货号4479769)。
进一步地，所述试剂盒还可包括T7转录酶、NTP(如NTP Mix)、RNA酶抑制剂、无RNA酶水、PCR扩增缓冲液中的一种或多种。
在本发明的一个实施例中，所述PCR扩增缓冲液为北京博迈德基因技术有限公司产品，货号为MT211-02。
进一步地，所述试剂盒还包括记载有本文中所述检测KPC型碳青霉烯酶基因的方法的可读性载体。所述可读性载体可为关于实践本发明方法的试剂盒说明书(例如印刷形式的说明书)或在其上已记录了信息的计算机可读的介质(例如软盘、CD等)。
所述试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者可以全部或部分预组合成试剂混合物。
本文所述的crRNA或所述的crRNA与Cas13a蛋白的复合物也在本发明的保护范围内。
本发明还提供了一种检测KPC型碳青霉烯酶基因的方法，所述方法包括如下步骤：
A1)提取待测样本DNA；
A2)以所述DNA为模板，利用所述引物KPC-F3和引物KPC-R3进行PCR扩增，得到扩增产物；
A3)利用CRISPR-Cas13a检测体系进行检测；
所述CRISPR-Cas13a检测体系包括所述crRNA。
上述方法中，所述CRISPR-Cas13a检测体系还包括Cas13a蛋白和/或转录酶。
进一步地，所述CRISPR-Cas13a检测体系还包括报告RNA、NTP(如NTP Mix)、T7转录酶、RNA酶抑制剂、无RNA酶水和转录及CRISPR-Cas13a检测反应缓冲液；
进一步地，步骤A2)中，进行所述PCR扩增的反应条件可为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃30s，72℃45s，循环35次；72℃延伸10min。
进一步地，步骤A3)所述利用CRISPR-Cas13a检测体系进行检测的方法如下：
①配制含有如下组分的转录和CRISPR-Cas13a检测体系：步骤A2)所得PCR扩增产物、Cas13a蛋白、crRNA、报告RNA、NTP、T7转录酶、RNA酶抑制剂、无RNA酶水、转录及CRISPR-Cas13a检测反应缓冲液；②进行反应；③检测阳性信号。
进一步地，步骤②中，所述反应的条件可为：37℃，步骤③中所述检测阳性信号可为：每2min检测一次所述阳性信号，共检测30次。
进一步地，所述方法还包括根据阳性信号的有无判定所述待测样本中是否含有KPC型碳青霉烯酶基因，和/或，根据阳性信号的强弱判定所述待测样本中KPC型碳青霉烯酶基因的浓度。
所述根据阳性信号的有无判定所述待测样本中是否含有KPC型碳青霉烯酶基因为：如果有阳性信号，则判定所述待测样本中含有或者候选含有KPC型碳青霉烯酶基因；如果无阳性信号，则判定所述待测样本中不含有或者候选不含有KPC型碳青霉烯酶基因。
所述根据阳性信号的强弱判定所述待测样本中KPC型碳青霉烯酶基因的浓度为：阳性信号越强，表示所述待测样本中含有的KPC型碳青霉烯酶基因含量越高；阳性信号越弱，表示所述待测样本中含有的KPC型碳青霉烯酶基因含量越低。
本文中，所述阳性信号可为荧光信号。在同一检测时间内，实验组荧光强度值比阴性对照(ddH2O)荧光强度值高1倍以上即判定为阳性结果(阳性信号)。
进一步地，所述待测样本可为纯化菌落。
本发明还提供了所述组合物，和/或，所述crRNA或复合物的下述任一种应用：
B1)在检测KPC型碳青霉烯酶基因中的应用；
B2)在制备用于检测KPC型碳青霉烯酶基因的产品中的应用；
B3)在鉴定产碳青霉烯酶菌株中的应用；
B4)在制备用于鉴定产碳青霉烯酶菌株的产品中的应用；
B5)在检测微生物耐药性中的应用；
B6)在制备用于检测微生物耐药性的产品中的应用。
所述产品可为试剂或试剂盒。
B5)所述检测微生物耐药性可通过检测待测微生物样品中是否含有碳青霉烯酶基因进行，如果含有碳青霉烯酶基因表明待测微生物大概率存在对碳青霉烯类抗生素的耐药性。进一步可用于诊断具有碳青霉烯抗性的受试者，以及开发对于具有细菌感染的受试者合适的治疗方案，其中所述治疗基于碳青霉烯抗性的存在或不存在来确定。
所述微生物可为肠杆菌科细菌，包括但不限于铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、肠杆菌属物种(Enterobactersp.)、肠沙门氏菌(Salmonellaenterica)、大肠杆菌等。
上述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。
本发明涉及细菌检测领域，具体涉及基于PCR-CRISPR-Cas13a检测KPC型碳青霉烯酶基因的试剂盒、组合物及其应用。本发明公开了一种基于CRIPSR-Cas13a的核酸检测技术，其最主要的机制是Cas13a蛋白可以在向导RNA的帮助下识别具有靶向序列的RNA片段，随后被激活的不受序列限制的RNA酶活性，通过在反应体系中加入RNA链降解导致的信号报告分子，最终实现具有靶向序列的RNA片段的信号识别。
本发明采用PCR技术联合CRISPR-Cas13a技术检测KPC型碳青霉烯酶基因的方法，通过设计、构建、筛选，最终提供一段用于检测KPC型碳青霉烯酶基因的靶向该序列的特异性crRNA，本发明提供的方法简便、快速、具有较高的灵敏度和特异性。可用于临床快速鉴定产碳青霉烯酶菌株，从而对患者进行合理的抗生素治疗，以缩短治疗周期。有着非常重要的临床应用前景和开发价值。
附图说明
图1为实施例1中步骤四的PCR扩增产物的琼脂糖电泳检测结果图。
图2为实施例2中步骤二的crRNA转录模板的琼脂糖电泳检测结果图。
图3为KPC型碳青霉烯酶基因特异的crRNA(crRNA1、crRNA2、crRNA3、crRNA4、crRNA5)筛选结果图。
图4为实施例4中的灵敏度检测结果图。
图5为实施例4中的稳定性实验结果图。其中样本3和样本8为纸片扩散法检测产非KPC型碳青霉烯酶肠杆菌菌株。样本1、2、4、5、6、7为纸片扩散法检测的产KPC型碳青霉烯酶肠杆菌菌株。
图6为KPC-CRISPR-Cas13a检测方法的特异性检测。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的基因组提取试剂盒为天根公司产品，DNA纯化回收试剂盒(货号DP315)、2×Taq mix(货号MT211-02)和ddH2O为博迈德公司产品。
下述实施例中所用的临床样本为首都医科大学附属北京佑安医院的临床标本。
实施例1 质粒标准品的制备、引物的设计和筛选
本发明所提供的基于PCR-CRISPR-cas13a检测KPC型碳青霉烯酶基因的方法的基本原理是：首先将KPC型碳青霉烯酶基因进行转录转变成单链RNA，再通过CRISPR的crRNA特异性结合目的片段，最后利用Cas13a酶切活性带有荧光信号的报告RNA，通过荧光信号来检测KPC型碳青霉烯酶基因。
一、质粒标准品的制备
首先对KPC型碳青霉烯酶基因序列进行保守性分析，在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载84株KPC型碳青霉烯酶基因序列信息，应用MEGA7软件对序列进行生物信息学分析，分析得保守序列为SEQ ID No.6的KPC型碳青霉烯酶基因片段。本发明用携带核苷酸序列是SEQ ID No.6的KPC型碳青霉烯酶基因片段的重组质粒(质粒pUC57-KPC)作为检测模板(质粒标准品)。
所述重组质粒pUC57-KPC是将pUC57载体的EcoRV限制性核酸内切酶识别位点间的片段(小片段)替换为序列表中SEQ ID No.6所示的DNA片段，保持pUC57载体的其它核苷酸序列不变，得到的重组载体。
KPC型碳青霉烯酶质粒pUC57-KPC由博迈德生物公司合成，质粒浓度为：200ng/μL。质粒长度为3295bp。
拷贝数计算公式：6.02×1023×200(ng/μL)×10-9/3295×660＝5.5×1010拷贝/μL
稀释：取4μL质粒到18μL水中，得到浓度为1×1010拷贝/μL质粒标准品。再分别梯度稀释为109拷贝/μL、108拷贝/μL、107拷贝/μL、106拷贝/μL、105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、101拷贝/μL、100拷贝/μL。
二、PCR引物的设计
针对KPC型碳青霉烯酶基因保守序列(SEQ ID No.6)设计用于特异性扩增KPC型碳青霉烯酶基因的引物对。
在所述引物的5’端具有一段T7转录序列，使得PCR扩增得到的双链DNA(dsDNA)可以被T7 RNA聚合酶识别并且进行转录。引物序列如表1所示，由生工生物工程(上海)有限公司合成。
表1、KPC型碳青霉烯酶基因PCR扩增引物
名称 序列(5’-3’)
KPC-F1 aattctaatacgactcactatagggcggtgtgtacgcgatggata
KPC-F2 aattctaatacgactcactatagggctccatcggtgtgtacgcga
KPC-F3 aattctaatacgactcactatagggtggcggctccatcggtgtgt
KPC-R1 acggaacgtggtatcgccga
KPC-R2 cggttttgtctccgactgcc
KPC-R3 tgcagagcccagtgtcagtt
注：表1中下划线部分为T7转录序列。
三、PCR扩增
以步骤一所得的质粒标准品pUC57-KPC作为模板，采用表1中设计的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(KPC扩增产物)。PCR扩增体系如表2所示。
表2、PCR扩增体系
Figure BDA0003449964650000061
Figure BDA0003449964650000071
PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃30s，55℃30s，72℃45s，循环35次，72℃延伸10min。该PCR扩增产物为KPC扩增产物。
四、PCR引物的筛选
以104拷贝/μL的步骤一所得的质粒标准品pUC57-KPC作为模板，用步骤三所述方法进行PCR扩增，引物分别为表1所示的引物组合，组合形式为F1R1(引物KPC-F1和引物KPC-R1)、F2R2(引物KPC-F2和引物KPC-R2)、F3R3(引物KPC-F3和引物KPC-R3)，得到PCR扩增产物。设置水为模板的扩增产物作为阴性对照。
PCR结束后取5μL扩增产物，加入1μL 6×Loading Buffer，混匀后进行琼脂糖凝胶电泳检测。
检测结果如图1所示，结果显示，引物KPC-F3和引物KPC-R3的引物组合(引物对)扩增效率较高。引物KPC-F3和引物KPC-R3作为最佳扩增引物对用于针对KPC碳青霉烯酶耐药基因的扩增。
筛选得到的用于特异性扩增KPC型碳青霉烯酶基因的引物对由引物KPC-F3和引物KPC-R3组成，所述引物KPC-F3为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子；所述引物KPC-R3为SEQID No.4所示的单链DNA分子。
实施例2 crRNA的设计和筛选
一、crRNA的设计
根据实施例1中筛选出的PCR扩增引物(引物KPC-F3和引物KPC-R3)和序列比对分析结果，在KPC型碳青霉烯酶基因保守序列(SEQ ID No.6)中设计5条crRNA：KPC-crRNA-1、KPC-crRNA-2、KPC-crRNA-3、KPC-crRNA-4、KPC-crRNA-5。
其中KPC-crRNA-1靶点序列如下：cccatctcggaaaaatatctgacaacag，位于KPC型碳青霉烯酶基因组(GenBank ID：NG049253.1)第321-348位；KPC-crRNA-2靶点序列如下：cacccatctcggaaaaatatctgacaac，位于KPC型碳青霉烯酶基因组(GenBank ID：NG049253.1)第319-346位；KPC-crRNA-3靶点序列如下：catctcggaaaaatatctg acaacaggc，位于KPC型碳青霉烯酶基因组(GenBank ID：NG049253.1)第323-350位；KPC-crRNA-4靶点序列如下：tcacccatctcggaaaaatatctgacaa，位于KPC型碳青霉烯酶基因组(GenBank ID：NG049253.1)第318-345位；KPC-crRNA-5靶点序列如下：atctcggaaaaatatctgacaacaggca(SEQ IDNo.5)，位于KPC型碳青霉烯酶基因组(GenBank ID：NG049253.1)第324-351位。
crRNA制备所需引物为如下表3所示。
表3、制备crRNA所需模板与引物序列
Figure BDA0003449964650000081
二、crRNA的制备
1、PCR扩增
将表3中合成的引物用ddH2O稀释成10μM，配制PCR反应体系。配制PCR反应体系如表4所示。
表4、PCR扩增体系
名称 体积
KPC-crRNA-F 2μL
T7-crRNA-F 2μL
KPC-crRNA-R 2μL
2×Taq Mix 25μL
ddH2O 19μL
总体积 50μL
PCR反应条件为：95℃5min热变性；95℃30s，55℃30s，72℃45s，共35个循环；72℃自动延伸10min；4℃保存PCR产物。
PCR结束后可取5μl PCR产物，加入1μL 6×Loading Buffer，混匀后做琼脂糖凝胶检测，获得产物大小约为130bp，结果如图2。
2、PCR产物的纯化
使用Tris平衡酚对步骤1获得的PCR产物进行纯化，具体步骤如下：Tris平衡酚(灏样生物)取500μL，加入等体积的三氯甲烷，振荡混匀后短暂离心，弃上清；取130μL酚氯仿混合液加入PCR产物中，混匀后12,000rpm离心1min；取上清液到一个新的1.5mL离心管，加入无水乙醇使上清与乙醇比例为3:7(体积比)混合，震荡，12,000rpm离心10min，弃上清；加入200μL 75％的乙醇，12,000rpm离心10min，弃上清(该步骤共进行三次)。得到的沉淀室温晾干(约10min)，加入40μL无RNA酶的水，ND5000超微量分光光度计检测浓度，-20℃保存。
3、转录
取1μg步骤2获得的纯化PCR产物，使用T7转录试剂盒(NEB，产品货号为E2050S)转录crRNA。crRNA转录体系如表5所示。
表5、crRNA转录体系
名称 体积
NTP Mix 10μL
PCR产物 1μg
T7 RNA聚合酶 2μL
无Nuclease水 XμL
总体积 20μL
上述crRNA转录体系混匀后，37℃转录过夜，使用DNaseⅠ去除多余的DNA：上一步得到的转录产物加入20μL无RNase的水，加入2μL DNaseⅠ，混匀，37℃孵育15min。
4、crRNA的纯化
按照Agencourt RNA Clean XP说明书(Beckman Coulter)纯化步骤3转录获得的crRNA，具体步骤如下：磁珠振荡混匀，向转录产物中加入1.8倍体积的磁珠，吹打10次或涡旋30s以混匀磁珠和转录体系，室温静置5min。将反应体系放到磁力架，静置5-10min以分离磁珠。轻轻吸出体系中的液体，避免磁珠被吸出，向磁珠中加入200μL 70％的乙醇(无RNase水配制)，室温孵育30s，吸出乙醇；重复此过程清洗磁珠，共3次。室温晾干体系，去除体系中的乙醇，约10min。加入50μL RNase-free水，涡旋30s或用移液器吹打10次，吸出上清液，放入无RNase的1.5mL离心管中，ND5000分光光度计测定纯化得到的crRNA浓度，-80℃分装备用。
最终所得五条crRNA的序列如下所示：
crRNA1：
GGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACcuguugucagauauuuuuccgagaugggcrRNA2：
GGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACguugucagauauuuuuccgagaugggugcrRNA3：
GGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACgccuguugucagauauuuuuccgagaugcrRNA4：
GGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACuugucagauauuuuuccgagaugggugacrRNA5：
GGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACugccuguugucagauauuuuuccgagau(SEQ ID No.2)
三、crRNA的筛选
1、以103拷贝/μL的实施例1步骤一所得的质粒标准品pUC57-KPC作为模板，表1中的引物KPC-F3和引物KPC-R3)(SEQ ID No.3和SEQ ID No.4)为引物，按照实施例1中步骤三的方法进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
2、经PCR扩增后，取5μL扩增产物按照实施例3中的方法利用不同crRNA检测KPC型碳青霉烯酶基因，同时设置水为模板的扩增产物作为阴性对照。
检测结果显示，在用103浓度的KPC质粒作模板时，crRNA5(SEQ ID No.2，第1-38位为锚定序列，用于与Cas13a蛋白结合，第39-66位为导向序列，用于结合PCR扩增产物)检测的荧光值较其他4条crRNA检测的荧光值要高(图3)。因此，将crRNA5作为KPC型碳青霉烯酶基因检测的首选crRNA。
实施例3 基于CRISPR-Cas13a检测KPC型碳青霉烯酶基因
一、CRISPR-Cas13a检测体系的配制
以实施例1的步骤三中获得的KPC扩增产物为模板，按表6配制CRISPR-Cas13a检测体系。
将表6中的PCR产物替换为ddH2O，且保持其他试剂组分不变，即为阴性对照。
表6、CRISPR-Cas13a检测体系
Figure BDA0003449964650000101
Figure BDA0003449964650000111
表6中相关试剂：LwCas13a蛋白为杭州众测生物科技有限公司，货号为R101zc。NTPMix为BBI公司产品，货号为B600056-0500。报告RNA为RNaseAlertTM QC System v2，具体为InvitrogenTM公司产品，货号为4479769。内含报告RNA，当其被降解时会产生荧光信号。RNA酶抑制剂(Murine RNase inhibitor)，T7 RNA聚合酶为NEB公司产品,货号分别为M0314S和M0251S。HEPES Buffer Solution具体为gibco公司产品，货号为15630-106。
二、荧光强度检测
将上述配制的反应体系加入PCR管，放入荧光定量PCR仪中，FAM通道检测荧光信号变化。设置37℃，每2min读取一次荧光强度值，读取30次。结果判定：在同一检测时间内，实验组荧光强度值比阴性对照(ddH2O)荧光强度值高1倍以上即判定为阳性结果(阳性信号)。
进一步地，根据阳性信号的有无判定所述待测样本中是否含有KPC型碳青霉烯酶基因，和/或，根据阳性信号的强弱判定所述待测样本中KPC型碳青霉烯酶基因的浓度：
(1)如果有阳性信号，则判定所述待测样本中含有或者候选含有KPC型碳青霉烯酶基因；如果无阳性信号，则判定所述待测样本中不含有或者候选不含有KPC型碳青霉烯酶基因；
(2)阳性信号越强，表示所述待测样本中含有的KPC型碳青霉烯酶基因含量越高；阳性信号越弱，表示所述待测样本中含有的KPC型碳青霉烯酶基因含量越低。
实施例4 灵敏度、特异性和稳定性实验
一、灵敏度检测
以实施例1中梯度稀释后的质粒标准品pUC57-KPC作为模板，按照实施例3中的方法检测含有不同浓度的KPC型碳青霉烯酶质粒，以检测本发明方法的灵敏度。具体步骤如下：
1、按照实施例1的步骤三中的方法分别对不同浓度的KPC型碳青霉烯酶质粒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
2、经PCR扩增后，取5μL扩增产物按照实施例3中的方法检测KPC型碳青霉烯酶质粒。将105拷贝/μl质粒梯度稀释至1拷贝/μl，阴性对照为水，作为模板采用本发明方法(参照实施例3进行)进行检测，所有PCR产物，采用本发明方法(参照实施例3进行)进行CRISPR-Cas13a检测后显示，在10拷贝/μl时，检测40min时，即可与阴性对照的荧光值发生显著差异，提示本发明方法的灵敏度良好，可低至10拷贝/μl(图4)。
二、稳定性实验
采用本发明方法，以梯度稀释的质粒标准品pUC57-KPC(即步骤一制备的标准品)为样本，每个样本分别进行3次重复实验(参照实施例1进行)，组间组内无显著性差异(p<0.05)。对临床来源的8份样本进行3次重复检测(参照实施例1进行)，8份样本均来自于北京市佑安医院。组间组内无显著性差异(p<0.05)，表明本发明方法稳定性及可重复性较好(图5)。
三、特异性检测
从北京市佑安医院检验科获得两株CRKP菌株,使用PCR方法检测显示分别为携带KPC型碳青霉烯酶基因菌株和NDM型碳青霉烯酶基因菌株。
1、以两株菌株所提DNA为模板，按照实施例3中的方法进行检测，以验证本发明方法的特异性。具体步骤如下：
(1)分别以携带KPC型碳青霉烯酶基因菌株DNA和携带NDM型碳青霉烯酶基因菌株DNA为检测模板，按照实施例1的步骤三中的方法进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
(2)取5μL上述扩增产物按照实施例3中的方法检测，同时设置水为模板的扩增产物作为阴性对照。
CRISPR-Cas13a检测结果显示，携带KPC型碳青霉烯酶基因菌株的实验组的荧光信号在反应开始后逐渐升高，而阴性对照组(ddH2O)以及携带NDM型碳青霉烯酶基因菌株的实验组中的荧光强度不随时间推移而升高，在检测30min后，携带KPC型碳青霉烯酶基因的实验组荧光强度要显著高于阴性对照以及携带NDM型碳青霉烯酶基因菌株组(图6)。说明本发明的基于CRISPR-Cas13a系统检测KPC型碳青霉烯酶基因的方法具有很高的特异性，检测过程中不存在交叉反应。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 首都医科大学附属北京佑安医院
<120> KPC型碳青霉烯酶基因检测试剂盒、组合物及其应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
ugccuguugu cagauauuuu uccgagau 28
<210> 2
<211> 66
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
gggauuuaga cuaccccaaa aacgaagggg acuaaaacug ccuguuguca gauauuuuuc 60
cgagau 66
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
aattctaata cgactcacta tagggtggcg gctccatcgg tgtgt 45
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
tgcagagccc agtgtcagtt 20
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
atctcggaaa aatatctgac aacaggca 28
<210> 6
<211> 619
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
gcggaaccat tcgctaaact cgaacaggac tttggcggct ccatcggtgt gtacgcgatg 60
gataccggct caggcgcaac tgtaagttac cgcgctgagg agcgcttccc actgtgcagc 120
tcattcaagg gctttcttgc tgccgctgtg ctggctcgca gccagcagca ggccggcttg 180
ctggacacac ccatccgtta cggcaaaaat gcgctggttc cgtggtcacc catctcggaa 240
aaatatctga caacaggcat gacggtggcg gagctgtccg cggccgccgt gcaatacagt 300
gataacgccg ccgccaattt gttgctgaag gagttgggcg gcccggccgg gctgacggcc 360
ttcatgcgct ctatcggcga taccacgttc cgtctggacc gctgggagct ggagctgaac 420
tccgccatcc caggcgatgc gcgcgatacc tcatcgccgc gcgccgtgac ggaaagctta 480
caaaaactga cactgggctc tgcactggct gcgccgcagc ggcagcagtt tgttgattgg 540
ctaaagggaa acacgaccgg caaccaccgc atccgcgcgg cggtgccggc agactgggca 600
gtcggagaca aaaccggaa 619

Claims (10)

1.用于检测KPC型碳青霉烯酶基因的组合物，其特征在于，所述组合物包括引物对和crRNA，所述crRNA的序列由用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向KPC型碳青霉烯酶基因靶点序列的向导序列组成，所述向导序列为SEQ ID No.1。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述crRNA的核苷酸序列为SEQ IDNo.2。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述引物对由引物KPC-F3和引物KPC-R3组成，所述引物KPC-F3为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子；所述引物KPC-R3为SEQID No.4所示的单链DNA分子。
4.用于检测KPC型碳青霉烯酶基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3中任一项所述的组合物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Cas13a蛋白。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括报告RNA。
7.权利要求1或2中所述的crRNA或权利要求1或2中所述的crRNA与Cas13a蛋白的复合物。
8.一种检测KPC型碳青霉烯酶基因的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
A1)提取待测样本DNA；
A2)以所述DNA为模板，利用权利要求3中所述的引物KPC-F3和引物KPC-R3进行PCR扩增，得到扩增产物；
A3)利用CRISPR-Cas13a检测体系进行检测；
所述CRISPR-Cas13a检测体系包括权利要求1或2中所述的crRNA。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas13a检测体系还包括Cas13a蛋白和/或转录酶。
10.权利要求1-3中任一项所述的组合物，和/或，权利要求7所述的crRNA或复合物的下述任一种应用：
B1)在检测KPC型碳青霉烯酶基因中的应用；
B2)在制备用于检测KPC型碳青霉烯酶基因的产品中的应用；
B3)在鉴定产碳青霉烯酶菌株中的应用；
B4)在制备用于鉴定产碳青霉烯酶菌株的产品中的应用；
B5)在检测微生物耐药性中的应用；
B6)在制备用于检测微生物耐药性的产品中的应用。
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