KR102597906B1 - 박테로이데스 균주의 정량을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 장내 박테로이데스 균주의 정확한 정량을 위한 qPCR 전용 프라이머 세트 및 이의용도에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 박테로이데스 균주를 판별하는 경우, 기존 16S 리보좀 RNA 유전자를 이용한 NGS 방법보다 간편, 정확 및 경제성이 높게 박테로이데스 균주를 구별해낼 수 있다.
Description
본 발명은 장내 박테로이데스 균주의 정확한 정량을 위한 qPCR 전용 프라이머 세트 및 이의용도에 관한 것이다.
박테로이데스는 현재 98종(種, species)과 5개의 아종(subspecies)으로 이루어진 세균 속(屬, genus)이며, Bacteroidaceae의 type genus이기도 하다. 박테로이데테스(Bacteroidetes) 문(門, phylum)의 대표적인 세균으로서 인간을 포함한 포유류의 대표적인 장내미생물(gut microbiota)이다. 표준 종(type species)는 Bacteroides fragilis이다 Bacteroidetes 문은 그람음성(Gram-negative)이고 포자를 형성하지 않으며, 토양, 담수, 해수, 인간과 동물의 장 내 등 다양한 환경에 널리 분포하는 세균의 그룹이다. 이 문의 가장 대표적인 Bacteroidales 목은 포자 무형성, 절대혐기성, 막대형 세균으로 구성되어 있으며, 인간의 장 내에 널리 분포하는 Bacteroides가 대표적인 속이다. Bacteroides는 인간이나 동물의 장에 서식하고 있으며 동물이 섭취한 식물을 발효하여 acetate와 succinate 등 유기산으로 전환한다. 이 세균군은 식물의 독소를 분해하고, 섬유소를 분해할 수 없는 동물을 도와 식물의 발효산물을 인간이나 동물이 이용할 수 있도록 한다. Bacteroides를 비롯한 인간의 장내세균은 이러한 점에서 인간이 가지는, 미생물로 구성된 또 하나의 기관이라고도 할 수 있다. 인간 장내세균의 연구 결과 다이어트를 진행 중인 날씬한 사람에게는 Bacteroidetes의 비율이, 비만형 체형에서는 피르미쿠테스(Firmicutes)의 비율이 높은 것으로 나타나 세균이 발효하는 유기산이 중요한 역할을 하고 있는 것을 암시한다.
한편, 차세대염기서열분석(Next-generation sequencing; NGS)은 규명하고자 하는 유전체 또는 유전자 집단의 염기서열 판독 데이터에 대하여 고출력이 가능한 기술이다. 본 기술은 다양한 생물 종의 전장 유전체 판독부터 특정 조직에서 발현되는 유전자의 빈도수를 규명하기까지 다양한 분자 유전학적 연구분야의 발전을 이끌었다. 이와 동시에, NGS의 도입은 미생물 연구분야에도 큰 변화를 가져왔다. 기존 미생물 연구에서 미생물 동정은 배양에 의존적인 균에 대하여 생어 시퀀싱을 통한 16S 동정에 그쳤다. 하지만, NGS 기술의 도입으로 시료 내 존재하는 모든 미생물에 대한 분류가 가능해 지면서 기존에 알지 못하던 난배양성 미생물에 대한 동정 이 가능하게 되었다. 상기한 바와 같이, NGS 기술을 기반으로 주어진 환경 내 존재하는 모든 미생물 유전체 집단을 규명하는 것을 '메타지놈 프로파일링(metagenome profiling)'이라고 한다. 메타지놈 프로파일링에 사용되는 가장 대중적인 방법으로, 모든 세균의 유전체상에 공통적으로 보존되어있는 16S ribiosomal RNA gene 일부 염기서열 정보를 판독하여 미생물 커뮤니티를 분석하는 방법을 들 수 있다. 상기 유전자 내에는 종마다 차이를 보이는 염기서열 영역인 '초 가변부위 영역(variable region)'이 존재한다. 따라서, NGS 기반 16S 메타지놈 프로파일링은 이 가변부위 영역을 판독하여 미생물 군집을 규명하는 것이다. 그러나, NGS의 발전은 다양한 미생물학 연구에 발전을 이끌어 왔지만 여전히 실험 및 분석에 있어 고가의 비용이 요구되며 결과 도출까지의 상당한 시간이 소모된다는 단점을 가지고 있다. 또한, 16S rRNA유전자 내 존재하는 종간의 높은 염기서열 유사성으로 인해 종(species)수준에서의 정확한 균주 표적이 어렵다는 치명적인 연구 장벽이 있다. 이러한 어려움을 극복하기위해, NGS를 기반으로 규명된 특정 프로바이오틱스 균주만을 탐지하여 상대적인 빈도수를 빠른 시간 내 확인할 수 있는 실시간 유전자 증폭 장치(quantitative real-time PCR)를 이용하려는 접근이 행해지고 있다.
qRT-PCR은 특정 표적 유전자에 대한 중합연쇄반응을 실시간으로 모니터링할 수 있는 2세대 유전자 증폭 장치다. qRT-PCR은 샘플 내 존재하는 표적 유전자에 대한 상대적 혹은 절대적인 정량을 목적으로 할 때 주로 이용된다. 최근, COVID-19의 원인이 되는 코로나바이러스에 대한 분자적 진단 역시 특이적 프라이머를 이용한 qRT-PCR 진단이 최적의 기준(gold standard)으로 인정 받을 정도로 장비의 측광 민감도 및 정확성이 높은 것을 알 수 있다. 또한, 미생물 연구분야에서도 qRT-PCR은 배양이 어려운 미생물 균주에 대하여 16S rRNA 유전자 영역이 아닌 균주가 보유한 특정 단백질 코딩 영역을 대상으로 프라이머를 제작하여 존재를 확인하는데 사용되고 있다. 예를 들어, 세균 세포벽 형성에 반드시 필수적인 단백질에 대한 특정 세균 종이 보유한 유전자 코딩 영역에 프라이머를 디자인하는 것이다. 이러한 접근 방법은 NGS가 지닌 시간적, 금전적인 비용부담을 줄일 수 있고, 장비의 높은 민감도와 16S rRNA 유전자가 지닌 염기서열 유사성 문제를 회피할 수 있는 정확한 균주 표적의 이점이 될 수 있다.
따라서, 본 발명은 기존의 문제점을 극복하기 위하여, NGS 기반 16S 메타지놈 분석기술을 통해 분류되는 박테로이데스(Bacteroides 균주)에 대하여 16S rRNA 영역이 아닌 특정 단백질 코딩 영역에 qRT-PCR전용 프라이머를 디자인하여 qRT-PCR 분석으로 박테로이데스 속 균주의 장내 존재 여부를 확인할 수 있는 접근 방법을 제공한다.
본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머를 포함하는 장내 서식 미생물의 검출을 위한 프라이머 세트를 제공함에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 장내 서식 미생물의 검출 또는 정량용 조성물을 제공함에 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 프라이머 세트를 포함하는 장내 서식 미생물의 검출 또는 정량용 키트를 제공함에 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 시료에 상기 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하고 분석하는 단계를 포함하는 장내 서식 미생물의 검출 또는 정량방법을 제공함에 있다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머를 포함하는 장내 서식 미생물의 검출을 위한 프라이머 세트를 제공한다.
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또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 장내 서식 미생물의 검출 또는 정량용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 시료에 상기 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하고 분석하는 단계를 포함하는 장내 서식 미생물의 검출 또는 정량방법을 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 박테로이데스를 판별하는 경우, 기존 16S 리보좀 RNA 유전자를 이용한 NGS 방법보다 간편, 정확 및 경제성이 높게 장내 서식하는 박테로이데스 속 균주를 구별해낼 수 있다.
도 1은 본 발명의 박테로이데스 균주 검출을 위한 전체적인 실험 모식도이다.
도 2는 본 발명의 프라이머 세트에 대한 박테로이데스 균주 특이성을 증명하는 in silico 검정 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 qPCR 방법 및 NGS를 이용한 방법의 박테로이데스 균주 검출 및 정량의 효과를 비교한 도이다.
도 2는 본 발명의 프라이머 세트에 대한 박테로이데스 균주 특이성을 증명하는 in silico 검정 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 qPCR 방법 및 NGS를 이용한 방법의 박테로이데스 균주 검출 및 정량의 효과를 비교한 도이다.
이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 박테로이데스 속 균주를 검출하기 위한 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물 및 키트에 대하여 상세하게 설명한다.
이하, 본 발명에서 사용된 용어를 정의한다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 본 명세서에서 사용된 “및/또는”은 언급된 구성요소의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “포함한다(comprises)” 및/또는 “포함하는(comprising)”은 언급된 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자는 하나 이상의 다른 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.
본 발명에서의 용어, "마이크로바이옴(Microbiome)"은 인체에 서식하는 미생물로서 장내 미생물 자체 또는 장내 미생물의 유전정보 전체를 말한다.
또한, 본 명세서에서 사용된 용어 “판별”은 시료로부터, 본 발명의 프라이머 세트에 의해 박테로이데스 속 균주를 다른 균주로 부터 구별하는 것을 의미한다.
또한, 본 명세서에서 사용된 용어“프라이머”는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로 작용한다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 하며, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명의 프라이머 세트는 장내 서식 균주에 특이적으로 존재하는 유전자를 증폭을 위하여 각각 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머로 구성되어 있다. 본 발명의 프라이머 세트는 프라이머의 길이, Tm 값, 프라이머의 GC 함량, 및 프라이머 내의 자가-상보적 서열에 의한 프라이머의 복합체(dimer) 형성 방지와 같은 조건들을 충분히 고려하고, 장내 서식 균주의 검출에 대한 민감도 및 특이도를 최대화할 수 있도록 세심하게 디자인된 것이다. 본 발명의 프라이머 세트는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 염기서열은 또한 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포티오에이트 등)로의 변형이 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 세트의 염기서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 본 발명의 프로브는 프로브의 말단에 형광물질로 표지될 수 있다. 프로브의 5'-말단에는 형광 표지인자(reporter dye)가 결합될 수 있고, 3'-말단에는 형광 억제물질(quencher)이 결합될 수 있다. 상기 형광 표지인자로는 현재까지 개발된 어떠한 물질을 사용하여도 무방하며, 예를 들어, FAM(6-carboxyfluorescein), HEX(hexachloro-6-carboxyfluorescein), TET(tetrachlorofluorescein), 텍사스 레드(texas red), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), NED(N-(1-naphthyl) ethylenediamine), Cy5(cyanine-5) 또는 Cy3(cyanine-3)이 사용될 수 있고, 바람직하게는 FAM(6-carboxyfluorescein)을 사용할 수 있다.
상기 형광 억제물질로는 TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(blackhole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher) 또는 아이오와 블랙(Iowa black)이 사용될 수 있고, 바람직하게는 TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine)를 사용할 수 있다.
본 발명에서 중합효소연쇄반응은 (i) 초기 변성(denaturation) 단계; (ii) 변성(denaturation), 어닐링(annealing) 및 연장(extension)으로 이루어지는 한 싸이클을 수회 내지 수십 회 반복하는 단계; 및 (iii) 최종 열처리 단계; 또는 이들 단계을 적합하게 변형한 열 싸이클(thermal cycle) 프로그램을 통해 수행될 수 있다.구체적으로, 본 발명에서의 PCR 조건으로는 90~95℃에서 5~20분간 열처리하여 초기 변성시킨 후, 90~95℃에서 10초~2분간 변성 단계(denaturation); 54~60℃(Tm)에서 10초~2분간 어닐링 단계(annealing); 및 70~75℃에서 10초~2분간 합성 단계(extension)를 총 10~50회 반복하여 PCR 증폭을 실시할 수 있으며, 상기 반응 온도 및 반응 시간 조건은 당업자가 적절하게 변형하여 수행할 수 있다.
본 발명에서 PCR 증폭 산물의 크기의 분석은 당업계에 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 아가로즈 또는 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 의하여 표적 크기 마커와의 비교를 통하여 증폭 산물의 크기를 알 수 있다.
본 발명에서 실시간 중합효소연쇄반응은 타겟 DNA의 증폭과 동시에 형광 방출에 의한 타겟 DNA의 절대 또는 상대적인 정량이 가능한 실험방법으로서, 전기영동하여 분석하는 단계가 생략되고, 증폭산물의 증폭정도를 자동화, 수치화시켜 신속하고 정확하게 검출 및 정량이 가능하다. 상기 방법을 수행하는 경우 타겟 DNA 내의 증폭된 서열에 특이적으로 결합하고 형광 표지인자 및 형광 억제물질이 태깅되어 있는 프로브를 사용하여 수행될 수 있고, 프로브의 사용없이 SYBR-Green 등의 형광물질을 사용하여 수행될 수도 있다. 실시간 중합효소연쇄반응에 대한 결과는 Ct(cycle threshold) 값을 이용하여 분석될 수 있다.
이 하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.
실시예 1. 본 발명의 프라이머 세트 제조
Google/NAVER 등 여러 웹 사이트를 통하여 찾고자 하는 속(Genus)과 관련하여 메타지놈 관련 연구 내용이 담긴 논문을 조사하여 후보유전자를 선정하였다.
이 후, 선정한 유전자 리스트에 대해서 NCBI 홈페이지에서 'identical protein' category에서 유전자 이름과 속 이름(genus name)을 조사하였고, 나열된 유전자 리스트에 대하여 summary file을 전부 다운 받고, 엑셀파일로 정리하였다.
이 후, Hypothetical protein 또는 잘못된 단백질 명칭, 박테리아 명칭은 삭제하고, 필터링을 거친 후, 속에 대한 종의 정보가 100개가 넘어갈 경우에는 종에 대한 균주수를 2 내지 5개로 설정하였다. 필터링이 다 끝난 후, summary file의 Protein이라는 행의 Protein ID를 텍스트 파일로 붙여 넣고 저장하였다. 이 후, 'Bio edit' tool을 이용하여 내려 받은 CDS 서열을 불러온 뒤, 서열에 대한 정보를 아미노산 형식으로 전환하고, Clustal multiple alignment를 진행 한 후, 서열 형식으로 전환하였다. Alignment가 끝난 뒤, 전혀 다른 단백질로 보이거나, 상관성이 없는 서열은 제거하여, 다시 alignment를 진행하였다. Alignment가 끝난 후, 서열간 보존된 서열 영역 내에서 real-time PCR을 위한 조건에 맞는 프라이머를 도출하였다. 이 후, 디자인한 프라이머에 대해서 'Oligo calc' , 'Oligo Analysis' tool 을 이용하여 프라이머가 적합한지에 대하여 확인하였다. 이 후, NCBI Nucleotide BLAST test를 통해 다른 박테리아의 서열과 겹치는 곳이 있는지를 먼저 확인 하였고, 그 다음 'In silico (http://insilico.ehu.es/PCR/)' 라는 tool로 확인한 후, 프라이머 세트를 제작하여 이의 정보를 표 1에 나타내었다(도 1 및 도 2 참조).
| Bacterial taxon | Rank | Target gene |
Foward primer
(5'-3') |
Reverse primer
(5'-3') |
Tm ℃ |
GC %
(F/R) |
Amplicon Size (bp) |
| Bacteroides | Genus | nusG | GGTGCCTCTCAGACAATCAG | CAATGATACCACTGAATCCGCT | 60.5/60.1 | 55/45 | 149 |
실시예 2. 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 인간분변으로부터 박테로이데스 속 검출 확인
실시예 1에서 도출한 프라이머 세트의 장내 박테로이데스 속 균주의 검출의 효과를 확인하기 위하여, 하기의 실험을 수행하였다.
먼저, 10명의 인간 분변으로부터 미생물 전장 유전체를 추출하였다. 시중에 제공되는 QIAGEN사의 미생물 유전체 추출 전용키트를 사용하여 마이크로바이옴의 DNA를 추출한 후, 추출된 DNA 수율과 퀄리티를 확인하였다(ThermoFisher사에서 제공되는 Qubit assay 장비 사용). 이 후, 각 DNA 시료의 이중가닥 DNA 농도를 10ng/ul로 희석시켜 표준화 시킨 후, 표준화된 마이크로바이옴의 DNA로부터 박테로이데스 속 균주 특이적 프라이머를 사용한 실시간 유전자 증폭을 실시하였고, 이의 결과를 확인하였다(PCR 조성: Template DNA(microbial genomic DNA; 10ng/ul)-1ul; Forward primer- 1ul, Reverse primer-1ul; SYBR Green taq pol-10ul/ D.W- 7ul).
실시예 3. 본 발명의 프라이머세트와 16s rRNA를 타겟하는 세트와 비교
1. 건강한 사람 100명의 분변으로부터 분리된 미생물의 유전체 DNA 시료의 dsDNA 양적 표준화
하기 표 2는 특정 표적 미생물 균주의 샘플 내 상대적인 빈도수를 평가하기 위해 반드시 진행되어야 하는 Bacterial genomic dsDNA quantity를 동일한 농도 조건으로 표준화시킨 것을 확인할 수 있는 qRT-PCR assay를 활용한 표준곡선 계산(standard curve calculation method)한 결과이다. 이론상으로, 모든 미생물 유전체 상에는 16S 리보좀 RNA를 코딩하고 있는 서열(약 1.5kbp)을 포함하고 있다. qRT-PCR을 진행하기 위한 실험 최적의 amplicon size가 약 100-200bp인 것을 고려하여 16S 서열상에 존재하는 4번째 초가변영역(hyper-variable region; 약 150-180bp)인 V4 region을 타겟하여 qRT-PCR을 진행하였다. 실험의 순서는 하기와 같다.
먼저, 다양한 균주의 DNA가 혼합된 DNA 시료의 이중가닥 DNA 양을 ThermoFisher사의 Qbit 4.0 장비를 통하여 확인하였다. 이 후, 모든 샘플의 dsDNA 농도를 희석하여 10ng/ul로 표준화하였다. 이 후, qRT-PCR을 이용한 표준곡선(Standard curve)계산을 위하여, 모든 희석된 dsDNA샘플(10ng/ul로 희석된 100개 의 시료)을 10^-1, 10^-2 및 10^-3배로 순차적으로 희석하였다. 각 희석된 샘플(순차적으로 희석된 시료 300개)을 주형 DNA로, 16S V4 region universal primer pairs(515F: 5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3' / 806R: 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')를 사용하여 qRT-PCR을 진행하였다.
2. NGS에 의하여 측정된 특이적 균주의 샘플 내 빈도와 qRT-PCR의 Ct값으로부터 계산된 동일 샘플 내 미생물 빈도의 비교
Ct value로부터 특정 미생물이 차지하는 상대적 빈도를 하기와 같이 계산하였다.
(1)relative bacterial frequency value = 1/2^(Ct value)
(2)relative bacterial Proportion value (%) = 해당 frequency data/100개 frequency data의 합 X 100
본 비교 데이터를 통해 NGS 빈도와 qPCR 빈도가 유사한 것을 확인할 수 있으며 이는 NGS를 통해 검출 및 정량화된 특정 균주가 샘플 내 차지하는 상대적 비중이 Qrt-PCR 전용 프라이머를 사용하여서도 유의하게 검출 및 정량화될 수 있다는 것을 확인 할 수 있다.
3. 본 발명의 프라이머를 이용한 경우, 균주의 특이도(specificity)를 Sanger sequencing을 통한 검증
본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 제작된 Qpcr amplicon product 일부를 사용하여 Sanger sequencing와 NCBI BLAST를 통해 Bacterial taxonomy identification을 진행하였다.
보다 구체적으로, Qrt-PCR에 적용된 amplicon product 일부를 정제하여 순수한 DNA를 확보하였다. Qrt-pcr product의 amplicon size는 약 100-150bp 이므로 sanger sequencing을 위한 적정 library size에 부합하였다. 따라서, M13 sequence가 포함된 TA cloning vector를 사용한 유전자 라이게이션을 통해 library 크기를 약 400bp로 확장시켰다. 이 후, CP-cell(E-coli)에 플라스미드 DNA를 형질전환 시켜준 뒤 LB배지에 도말하였다. LB배지 상에 형성된 White colony (potential transformed CP-cell)를 적출하여 Colony PCR을 진행하였다. 이때 사용된 PCR 프라이머는 M13 universal sequence를 사용하였다. 정제된 Colony PCR amplicon product를 template DNA로 사용하여 sanger sequencing을 수행하였다. 이 후, Sanger sequencing 결과 출력된 서열데이터를 사용하여 NCBI nucleotide BLAST를 통한 bacterial identification을 수행하여 타겟 균주의 속이 맞는지 규명하였다.상기 방법을 통하여, 박테로이데스 속 균주가 검출된 것을 확인하였다(표 3 내지 7).
| Sample ID | Target gene | *Ct value (10^-3) | Ct value (10^-2) | Ct alue (10^-1) |
| Candidate 1 | 16S rRNA V4 region | 26.24 | 22.17 | 19.27 |
| Candidate 2 | 16S rRNA V4 region | 26.28 | 22.48 | 19.38 |
| Candidate 3 | 16S rRNA V4 region | 26.09 | 22.66 | 19.03 |
| Candidate 4 | 16S rRNA V4 region | 26.01 | 22.78 | 19.15 |
| Candidate 5 | 16S rRNA V4 region | 26.58 | 22.03 | 19.23 |
| Candidate 6 | 16S rRNA V4 region | 26.56 | 22.07 | 19.18 |
| Candidate 7 | 16S rRNA V4 region | 26.47 | 22.08 | 19.80 |
| Candidate 8 | 16S rRNA V4 region | 27.38 | 22.11 | 19.57 |
| Candidate 9 | 16S rRNA V4 region | 26.92 | 22.22 | 19.75 |
| Candidate 10 | 16S rRNA V4 region | 26.78 | 22.26 | 19.84 |
| Candidate 11 | 16S rRNA V4 region | 26.46 | 22.39 | 19.63 |
| Candidate 12 | 16S rRNA V4 region | 26.96 | 22.43 | 19.36 |
| Candidate 13 | 16S rRNA V4 region | 26.79 | 22.47 | 19.85 |
| Candidate 14 | 16S rRNA V4 region | 26.50 | 22.54 | 19.04 |
| Candidate 15 | 16S rRNA V4 region | 26.72 | 22.59 | 19.45 |
| Candidate 16 | 16S rRNA V4 region | 27.03 | 22.59 | 19.20 |
| Candidate 17 | 16S rRNA V4 region | 26.57 | 22.59 | 18.70 |
| Candidate 18 | 16S rRNA V4 region | 27.13 | 22.60 | 19.00 |
| Candidate 19 | 16S rRNA V4 region | 26.91 | 22.66 | 18.91 |
| Candidate 20 | 16S rRNA V4 region | 26.26 | 22.78 | 19.00 |
| Candidate 21 | 16S rRNA V4 region | 26.68 | 22.83 | 19.23 |
| Candidate 22 | 16S rRNA V4 region | 26.96 | 22.85 | 19.62 |
| Candidate 23 | 16S rRNA V4 region | 26.58 | 22.96 | 19.89 |
| Candidate 24 | 16S rRNA V4 region | 26.97 | 23.03 | 19.50 |
| Candidate 25 | 16S rRNA V4 region | 27.32 | 23.11 | 19.34 |
| Candidate 26 | 16S rRNA V4 region | 27.22 | 23.13 | 19.29 |
| Candidate 27 | 16S rRNA V4 region | 27.00 | 23.27 | 19.30 |
| Candidate 28 | 16S rRNA V4 region | 26.90 | 23.29 | 19.04 |
| Candidate 29 | 16S rRNA V4 region | 27.37 | 23.31 | 19.96 |
| Candidate 30 | 16S rRNA V4 region | 27.55 | 23.32 | 20.72 |
| Candidate 31 | 16S rRNA V4 region | 27.54 | 23.35 | 18.63 |
| Candidate 32 | 16S rRNA V4 region | 26.95 | 23.40 | 19.38 |
| Candidate 33 | 16S rRNA V4 region | 27.46 | 23.42 | 19.03 |
| Candidate 34 | 16S rRNA V4 region | 27.37 | 23.48 | 19.02 |
| Candidate 35 | 16S rRNA V4 region | 27.56 | 23.48 | 19.98 |
| Candidate 36 | 16S rRNA V4 region | 27.14 | 23.52 | 19.11 |
| Candidate 37 | 16S rRNA V4 region | 27.94 | 23.52 | 19.97 |
| Candidate 38 | 16S rRNA V4 region | 26.97 | 23.67 | 20.12 |
| Candidate 39 | 16S rRNA V4 region | 27.38 | 23.67 | 19.25 |
| Candidate 40 | 16S rRNA V4 region | 27.18 | 23.70 | 18.32 |
| Candidate 41 | 16S rRNA V4 region | 27.28 | 23.71 | 19.92 |
| Candidate 42 | 16S rRNA V4 region | 27.53 | 23.73 | 19.96 |
| Candidate 43 | 16S rRNA V4 region | 27.76 | 23.77 | 19.70 |
| Candidate 44 | 16S rRNA V4 region | 27.93 | 23.83 | 19.07 |
| Candidate 45 | 16S rRNA V4 region | 27.93 | 23.83 | 19.40 |
| Candidate 46 | 16S rRNA V4 region | 27.46 | 23.84 | 19.66 |
| Candidate 47 | 16S rRNA V4 region | 27.28 | 23.85 | 20.27 |
| Candidate 48 | 16S rRNA V4 region | 27.07 | 23.86 | 19.22 |
| Candidate 49 | 16S rRNA V4 region | 27.77 | 23.89 | 20.07 |
| Candidate 50 | 16S rRNA V4 region | 27.62 | 23.91 | 20.69 |
| Candidate 51 | 16S rRNA V4 region | 27.05 | 23.98 | 19.63 |
| Candidate 52 | 16S rRNA V4 region | 27.90 | 23.98 | 20.21 |
| Candidate 53 | 16S rRNA V4 region | 27.99 | 23.99 | 20.06 |
| Candidate 54 | 16S rRNA V4 region | 27.59 | 23.03 | 19.75 |
| Candidate 55 | 16S rRNA V4 region | 27.44 | 23.07 | 19.75 |
| Candidate 56 | 16S rRNA V4 region | 27.58 | 23.08 | 20.20 |
| Candidate 57 | 16S rRNA V4 region | 26.96 | 23.09 | 20.61 |
| Candidate 58 | 16S rRNA V4 region | 27.90 | 23.09 | 19.91 |
| Candidate 59 | 16S rRNA V4 region | 27.27 | 23.10 | 20.69 |
| Candidate 60 | 16S rRNA V4 region | 27.54 | 23.12 | 19.76 |
| Candidate 61 | 16S rRNA V4 region | 27.75 | 23.13 | 20.15 |
| Candidate 62 | 16S rRNA V4 region | 27.27 | 23.16 | 20.49 |
| Candidate 63 | 16S rRNA V4 region | 27.48 | 23.16 | 19.62 |
| Candidate 64 | 16S rRNA V4 region | 26.94 | 23.18 | 20.82 |
| Candidate 65 | 16S rRNA V4 region | 27.20 | 23.19 | 20.02 |
| Candidate 66 | 16S rRNA V4 region | 27.37 | 23.23 | 20.18 |
| Candidate 67 | 16S rRNA V4 region | 27.56 | 23.24 | 20.23 |
| Candidate 68 | 16S rRNA V4 region | 27.29 | 23.26 | 20.70 |
| Candidate 69 | 16S rRNA V4 region | 28.06 | 23.26 | 19.96 |
| Candidate 70 | 16S rRNA V4 region | 27.96 | 23.26 | 19.97 |
| Candidate 71 | 16S rRNA V4 region | 27.96 | 23.27 | 20.05 |
| Candidate 72 | 16S rRNA V4 region | 27.43 | 23.29 | 20.61 |
| Candidate 73 | 16S rRNA V4 region | 27.58 | 23.30 | 19.92 |
| Candidate 74 | 16S rRNA V4 region | 27.35 | 23.31 | 20.77 |
| Candidate 75 | 16S rRNA V4 region | 27.66 | 23.31 | 19.87 |
| Candidate 76 | 16S rRNA V4 region | 27.93 | 23.35 | 20.16 |
| Candidate 77 | 16S rRNA V4 region | 27.12 | 23.38 | 19.37 |
| Candidate 78 | 16S rRNA V4 region | 27.36 | 23.51 | 20.01 |
| Candidate 79 | 16S rRNA V4 region | 27.34 | 23.54 | 20.83 |
| Candidate 80 | 16S rRNA V4 region | 27.99 | 23.59 | 20.52 |
| Candidate 81 | 16S rRNA V4 region | 27.86 | 23.61 | 19.76 |
| Candidate 82 | 16S rRNA V4 region | 27.81 | 23.67 | 20.31 |
| Candidate 83 | 16S rRNA V4 region | 27.73 | 23.71 | 20.00 |
| Candidate 84 | 16S rRNA V4 region | 27.96 | 23.76 | 20.33 |
| Candidate 85 | 16S rRNA V4 region | 28.02 | 23.78 | 20.65 |
| Candidate 86 | 16S rRNA V4 region | 27.43 | 23.85 | 20.30 |
| Candidate 87 | 16S rRNA V4 region | 27.95 | 23.87 | 19.87 |
| Candidate 88 | 16S rRNA V4 region | 27.20 | 23.96 | 20.37 |
| Candidate 89 | 16S rRNA V4 region | 27.16 | 23.97 | 20.93 |
| Candidate 90 | 16S rRNA V4 region | 27.45 | 23.98 | 21.76 |
| Candidate 91 | 16S rRNA V4 region | 27.92 | 24.11 | 20.62 |
| Candidate 92 | 16S rRNA V4 region | 27.32 | 23.22 | 21.23 |
| Candidate 93 | 16S rRNA V4 region | 27.12 | 23.25 | 21.24 |
| Candidate 94 | 16S rRNA V4 region | 27.52 | 23.25 | 20.49 |
| Candidate 95 | 16S rRNA V4 region | 27.94 | 23.38 | 19.83 |
| Candidate 96 | 16S rRNA V4 region | 27.63 | 23.60 | 19.03 |
| Candidate 97 | 16S rRNA V4 region | 27.62 | 23.63 | 19.39 |
| Candidate 98 | 16S rRNA V4 region | 27.64 | 23.63 | 20.73 |
| Candidate 99 | 16S rRNA V4 region | 27.79 | 23.83 | 20.52 |
| Candidate 100 | 16S rRNA V4 region | 27.40 | 23.88 | 19.61 |
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University
<120> PRIMER SET FOR DETECTING BACTEROIDES AND USE THEREOF
<130> P-1
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for nusG
<400> 1
ggtgcctctc agacaatcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> revers primer for nusG
<400> 2
caatgatacc actgaatccg ct 22
Claims (8)
- 서열번호 1로 표시되는 염기서열; 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 박테로이데스 균주의 검출을 위한 프라이머 세트.
- 삭제
- 제1항의 프라이머 세트는 nusG 유전자를 증폭하는 것을 특징으로 하는, 박테로이데스 균주의 검출을 위한 프라이머 세트.
- 제 1항의 프라이머 세트를 포함하는 박테로이데스 균주의 검출 또는 정량용 조성물.
- 제 1항의 프라이머 세트를 포함하는 박테로이데스 균주의 검출 또는 정량용 키트.
- 시료에 제 1항의 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하고 분석하는 단계를 포함하는 박테로이데스 균주의 검출 또는 정량방법.
- 삭제
- 제 6항에 있어서, 상기 시료는 분변인 것인, 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210107486A KR102597906B1 (ko) | 2021-08-13 | 2021-08-13 | 박테로이데스 균주의 정량을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210107486A KR102597906B1 (ko) | 2021-08-13 | 2021-08-13 | 박테로이데스 균주의 정량을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230025222A KR20230025222A (ko) | 2023-02-21 |
| KR102597906B1 true KR102597906B1 (ko) | 2023-11-02 |
Family
ID=85328308
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210107486A KR102597906B1 (ko) | 2021-08-13 | 2021-08-13 | 박테로이데스 균주의 정량을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102597906B1 (ko) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| KR102330639B1 (ko) * | 2019-01-18 | 2021-11-24 | 주식회사 천랩 | 과민성대장증후군 특이적 미생물 바이오마커와 이를 이용하여 과민성대장증후군의 위험도를 예측하는 방법 |
-
2021
- 2021-08-13 KR KR1020210107486A patent/KR102597906B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Kyudong Han 등, Research Square, "Evaluatio of an effective detection and quantification method for particular microorganisms by comparing NGS-based metagenome profiling data", preprint, 2021.06.21.* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20230025222A (ko) | 2023-02-21 |
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