KR20200068248A - 장내 마이크로바이옴의 선택적 양적 비교 분석법 개발 - Google Patents

장내 마이크로바이옴의 선택적 양적 비교 분석법 개발 Download PDF

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KR20200068248A KR1020180154981A KR20180154981A KR20200068248A KR 20200068248 A KR20200068248 A KR 20200068248A KR 1020180154981 A KR1020180154981 A KR 1020180154981A KR 20180154981 A KR20180154981 A KR 20180154981A KR 20200068248 A KR20200068248 A KR 20200068248A
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Abstract

본 발명은 장내 서식 미생물의 검출 또는 정량용 프라이머 세트; 상기 프라이머 세트를 포함하는 조성물; 상기 조성물을 포함하는 키트; 및 상기 프라이머 세트를 이용한 장내 서식 미생물의 검출 또는 정량 방법에 관한 것이다.

Description

장내 마이크로바이옴의 선택적 양적 비교 분석법 개발{Development of selective quantitative comparative analysis of intestinal microbiome}
본 발명은 장내 서식 미생물의 검출 또는 정량용 프라이머 세트; 이를 포함하는 조성물; 이를 포함하는 키트; 및 이를 이용한 장내 서식 미생물의 검출 또는 정량 방법에 관한 것이다.
인간은 인체 세포와 유전체 외에도 공생하고 있는 수많은 미생물의 세포와 유전자 특성을 섞어 놓은 초유기체(super-organism)로서[Nature 2007; 449:804-810], 인체에 자연적으로 존재하는 모든 미생물 군의 집합체를 인간 마이크로비옴(human microbiome)이라 한다. 인체 미생물(human microbiota)은 피부, 구강, 치아, 생식기, 호흡기, 위장관 등 여러 신체 부위에 존재하나, 이 중 가장 많고 다양한 종류의 미생물을 보유하고 있는 곳은 위장관(gastrointestinal tract)이다[Nature 2012; 486:215-221]. 위장관은 ~500-1000 개의 다른 종으로 구성된 미생물 군집에 안정된 거주지를 제공하며, 미생물-미생물 및 인간-미생물 간의 복잡한 상호관계가 이루어지는 주요 신체 부위이다[Mol Microbiol 2006; 59:1639-1650]. 위장관 내에 존재하는 미생물의 무게는 대략 05-1.5 kg에 이르는 것으로 알려져 있으며, 이들 미생물들의 숙주 항상성 유지, 생물학적·대사적 기능의 중요성과 관련하여 위장관 미생물 군집을 잊혀진 장기(Forgotten Organ)로 일컫기도 한다. 세균의 경우 Firmicutes(35-80%), Bacteroidetes(17-60%), Actinobacteria, Proteobacteria, Verrumicrobia 등의 phyla가 위장관에 주로 존재하며, 세균만이 아니라 박테리오파지를 포함한 여러 종류의 바이러스 역시 위장관의 미생물 군집에 중요한 영향을 미친다. 위장관 내 미생물 (특히, 박테리아) 군집의 농도 및 다양성은 위치 별로 상당한 차이가 있는데, 위(stomach) 내의 경우 103~104 정도로 가장 적은 분포를 보이는 반면, 대장(large intestine)의 경우 1 g 당 1011 정도로 가장 많은 미생물이 분포한다[Science 2005; 308:1635-1638].
인간 마이크로비옴은 개인, 가족, 인종, 성별, 나이, 식습관, 지역, 생활 방식 등 다양한 원인에 의해 역동적으로 변화한다. 그러나, 각 개인의 미생물 군집을 구성하는 미생물 종(species)의 다양성과는 달리 마이크로비옴을 이루는 주요 기능성 유전자들(core microbiome)은 개체 특성과 환경 조건의 차이에도 상당 부분 공유됨이 밝혀 졌다. 인간 마이크로비옴의 기본 구조와 변화 양상, 다양성 및 안정성(stability)에 관한 이해는 전세계적 마이크로비옴 컨소시엄에 의해 주도된 대규모 연구의 역할이 크다. 이 중 대표적인 것들로 미국국립보건원(US National Institutes of Health, NIH)에서 지원을 받는 HMP(Human Microbiome Project), 유럽 연합 집행 기관 (European Commission)의 지원을 받는 Meta-HIT (Metagenomics of the human intestinal tract), 인간 마이크로비옴 연구를 통한 데이터 자원 공유를 목적으로 구성된 IHMC(International Human Microbiome Consortium) 등을 들 수 있다. 특히, Meta-HIT과 HMP의 경우 인체 각 부위의 마이크로비옴의 구조에 대한 기본 자료(reference microbiome)를 제공하고, 미생물 군집이 인간의 건강과 질병에 미치는 직·간접적 영향에 관한 주요 연구 결과를 보고하였다.
You et al. 인간 장내 마이크로비옴 연구: 개념과 전략. KJPH, 52(1):11-19, 2015.
본 발명의 목적은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 장내 서식 미생물의 검출 또는 정량용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 장내 서식 미생물의 검출 또는 정량용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 장내 서식 미생물의 검출 또는 정량용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 시료로부터 분리된 DNA에 대하여 상기 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)을 수행하고 분석하는 단계를 포함하는 장내 서식 미생물의 검출 또는 정량 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 장내 서식 미생물의 검출 또는 정량용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 장내 서식 미생물은 박터로이데스(Bacteroides) 속 균주, 엔테로코커스(Enterococcus) 속 균주, 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 프라이머 세트는 장내 서식 미생물의 16s rRNA를 특이적으로 증폭하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 장내 서식 미생물의 검출 또는 정량용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 장내 서식 미생물의 검출 또는 정량용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 키트는 DNA 중합효소, dNTP 및 버퍼를 추가적으로 더 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 시료로부터 분리된 DNA에 대하여 상기 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)을 수행하고 분석하는 단계를 포함하는 장내 서식 미생물의 검출 또는 정량 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 장내 서식 미생물은 박터로이데스(Bacteroides) 속 균주, 엔테로코커스(Enterococcus) 속 균주, 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주인 것일 수 있다.
상기 시료는 분변인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 또는 경쟁적 중합효소연쇄반응(Competitive RT-PCR)인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 분석에서 Ct 값이 확인되면 시료 내에 장내 서식 미생물이 존재하는 것으로 판단하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 분석에서 용융 곡선에서의 피크가 존재하면 시료 내에 장내 서식 미생물이 존재하는 것으로 판단하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머 세트, 조성물, 키트 또는 방법에 의하여 장내 서식 미생물의 검출 또는 정량이 가능함으로써, 장내 세균 정보 분석이 가능하다.
도 1은 박터로이데스(Bacteroides) 속 균주에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 통해 나타낸 증폭 곡선 결과이다.
도 2는 엔테로코커스(Enterococcus) 속 균주에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 통해 나타낸 증폭 곡선 결과이다.
도 3은 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 통해 나타낸 증폭 곡선 결과이다.
도 4는 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 통해 나타낸 증폭 곡선 결과이다.
도 5는 동일량으로 섞인 4 종류의 혼합 미생물에 대하여, 박터로이데스(Bacteroides) 속 균주에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 통해 나타낸 용융 곡선(melt curve) 결과이다.
도 6은 동일량으로 섞인 4 종류의 혼합 미생물에 대하여, 엔테로코커스(Enterococcus) 속 균주에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 통해 나타낸 용융 곡선(melt curve) 결과이다.
도 7은 동일량으로 섞인 4 종류의 혼합 미생물에 대하여, 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 통해 나타낸 용융 곡선(melt curve) 결과이다.
도 8은 동일량으로 섞인 4 종류의 혼합 미생물에 대하여, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 통해 나타낸 용융 곡선(melt curve) 결과이다.
도 9는 분변 샘플로부터 추출된 genomic DNA에 대하여, 각 균주에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 통해 각 균주 대한 양적 비율을 나타내는 그래프이다 (파란색: 박터로이데스 속 균주; 회색: 엔테로코커스 속 균주; 빨강색: 비피도박테리움 속 균주; 및 노란색: 락토바실러스 속 균주).
본 발명은 장내 서식 미생물의 검출 또는 정량용 프라이머 세트; 이를 포함하는 조성물; 이를 포함하는 키트; 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다.
본 발명에서의 용어, "마이크로바이옴(Microbiome)"은 인체에 서식하는 미생물로서 장내 미생물 자체 또는 장내 미생물의 유전정보 전체를 말한다.
본 발명에서의 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3'-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로서, 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고, 템플레이트 가닥 복사을 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 염기서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지 dNTP(Deoxynucleoside triphosphate)의 존재 하에 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 장내 서식 균주에 특이적으로 존재하는 유전자를 증폭을 위하여 각각 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머로 구성되어 있다. 본 발명의 프라이머 세트는 프라이머의 길이, Tm 값, 프라이머의 GC 함량, 및 프라이머 내의 자가-상보적 서열에 의한 프라이머의 복합체(dimer) 형성 방지와 같은 조건들을 충분히 고려하고, 장내 서식 균주의 검출에 대한 민감도 및 특이도를 최대화할 수 있도록 세심하게 디자인된 것이다.
본 발명의 프라이머 세트는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 염기서열은 또한 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 세트의 염기서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다.
본 발명의 프로브는 프로브의 말단에 형광물질로 표지될 수 있다. 프로브의 5'-말단에는 형광 표지인자(reporter dye)가 결합될 수 있고, 3'-말단에는 형광 억제물질(quencher)이 결합될 수 있다.
상기 형광 표지인자로는 현재까지 개발된 어떠한 물질을 사용하여도 무방하며, 예를 들어, FAM(6-carboxyfluorescein), HEX(hexachloro-6-carboxyfluorescein), TET(tetrachlorofluorescein), 텍사스 레드(texas red), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), NED(N-(1-naphthyl) ethylenediamine), Cy5(cyanine-5) 또는 Cy3(cyanine-3)이 사용될 수 있고, 바람직하게는 FAM(6-carboxyfluorescein)을 사용할 수 있다.
상기 형광 억제물질로는 TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher) 또는 아이오와 블랙(Iowa black)이 사용될 수 있고, 바람직하게는 TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine)를 사용할 수 있다.
본 발명에서 중합효소연쇄반응은 (i) 초기 변성(denaturation) 단계; (ii) 변성(denaturation), 어닐링(annealing) 및 연장(extension)으로 이루어지는 한 싸이클을 수회 내지 수십 회 반복하는 단계; 및 (iii) 최종 열처리 단계; 또는 이들 단계을 적합하게 변형한 열 싸이클(thermal cycle) 프로그램을 통해 수행될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서의 PCR 조건으로는 90~95℃에서 5~20분간 열처리하여 초기 변성시킨 후, 90~95℃에서 10초~2분간 변성 단계(denaturation); 54~60℃(Tm)에서 10초~2분간 어닐링 단계(annealing); 및 70~75℃에서 10초~2분간 합성 단계(extension)를 총 10~50회 반복하여 PCR 증폭을 실시할 수 있으며, 상기 반응 온도 및 반응 시간 조건은 당업자가 적절하게 변형하여 수행할 수 있다.
본 발명에서 PCR 증폭 산물의 크기의 분석은 당업계에 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 아가로즈 또는 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 의하여 표적 크기 마커와의 비교를 통하여 증폭 산물의 크기를 알 수 있다.
본 발명에서 실시간 중합효소연쇄반응은 타겟 DNA의 증폭과 동시에 형광 방출에 의한 타겟 DNA의 절대 또는 상대적인 정량이 가능한 실험방법으로서, 전기영동하여 분석하는 단계가 생략되고, 증폭산물의 증폭정도를 자동화, 수치화시켜 신속하고 정확하게 검출 및 정량이 가능하다. 상기 방법을 수행하는 경우 타겟 DNA 내의 증폭된 서열에 특이적으로 결합하고 형광 표지인자 및 형광 억제물질이 태깅되어 있는 프로브를 사용하여 수행될 수 있고, 프로브의 사용없이 SYBR-Green 등의 형광물질을 사용하여 수행될 수도 있다. 실시간 중합효소연쇄반응에 대한 결과는 Ct(cycle threshold) 값을 이용하여 분석될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 프라이머 제작
본 발명자들은 분변에서 채취한 DNA로부터 장내 서식 미생물들의 선택적 및 양적 분석을 통해 장내 세균의 정보를 분석하고자 하였다. 이에 장내 서식 미생물에 특이적인 프라이머 세트를 제작하였고, 상기 프라이머 세트에 대한 정보는 표 1과 같다. 상기 프라이머 세트는 장내 서식 미생물의 16s rRNA 유전자를 타겟으로 하여 제작된 것이고, 이를 이용하여 real-time PCR을 수행함으로써 장내 서식 미생물의 정량 분석을 수행하였다.
표 1에서와 같이, 박터로이데스(Bacteroides) 속 균주는 중간균으로서, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 분석되었고, 엔테로코커스(Enterococcus) 속 균주는 유해균으로서, 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 분석되었다. 엔테로코커스(Enterococcus) 속 균주의 경우, 요로감염을 비롯해 다양한 종류의 병원성 감염을 야기할 수 있고, 높은 항생제 내성균이 발견되고 있는 만큼 주의가 필요한 것으로 알려져 있다. 그러나, 건강한 사람에게서도 많이 발견되기에 유익균과 유해균 사이에서 중간균으로 분류될 수도 있다. 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주는 유익균으로서, 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 분석되었고, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주도 유익균으로서, 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 분석되었다.
Bacteroides Forward 5'-GGCGGTCTTCCGGGTAAA-3' (서열번호 1)
Reverse 5'-TGGCATATAGCGGAAGAAAAAAG-3' (서열번호 2)
Enterococcus Forward 5'-GGACGMAAGTCTGACCGA-3' (서열번호 3)
Reverse 5'-TTAAGAAACCGCCTGCGC-3' (서열번호 4)
Lactobacillus Forward 5'-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3' (서열번호 5)
Reverse 5'-CACCGCTACACATGGAG-3' (서열번호 6)
Bifidobacterium Forward 5'-GGGTGGTAATGCCGGATG-3' (서열번호 7)
Reverse 5'-TAAGCGATGGACTTTCACACC-3' (서열번호 8)
실시예 2. 증폭 플롯 (Amplication Plot)
본 발명자들은 박터로이데스(Bacteroides) 속 균주, 엔테로코커스(Enterococcus) 속 균주, 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주에서 각각 추출된 genomic DNA를 주형으로 하여 각 균주에 특이적으로 제작된 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 수행한 경우 증폭 곡선이 그려지는지 여부를 확인하는 실험을 수행하였다.
그 결과, 박터로이데스(Bacteroides) 속 균주에 특이적인 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 수행한 경우 도 1과 같은 증폭 곡선이 그려지는 것을 확인하였고, 엔테로코커스(Enterococcus) 속 균주에 특이적인 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 수행한 경우 도 2과 같은 증폭 곡선이 그려지는 것을 확인하였다. 또한, 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주에 특이적인 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 수행한 경우 도 3과 같은 증폭 곡선이 그려지는 것을 확인하였고, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주에 특이적인 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 수행한 경우 도 4과 같은 증폭 곡선이 그려지는 것을 확인하였다.
이로써, 박터로이데스(Bacteroides) 속 균주, 엔테로코커스(Enterococcus) 속 균주, 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 수행한 경우 상기 균주의 양에 따라 증폭 곡선이 잘 그려지는 것을 확인하였다.
실시예 3. 용융곡선 플롯 (Melt curve plot)
본 발명자들은 박터로이데스(Bacteroides) 속 균주, 엔테로코커스(Enterococcus) 속 균주, 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주로부터 분리된 genomic DNA를 동일량으로 섞은 후, 각 균주에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR를 수행한 경우 각 균주에 대한 1개의 melt curve가 나타나는지 여부를 분석하는 실험을 수행하였다.
그 결과, 동일량으로 섞인 4 종류의 혼합 미생물의 genomic DNA에 대하여, 박터로이데스(Bacteroides) 속 균주에 특이적인 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 수행한 경우, melt curve가 1개의 피크(peak)로 나타났음을 확인하였다 (도 5). 이로써, 상기 프라이머 세트는 4 종류의 장내 미생물 중 박터로이데스(Bacteroides) 속 균주만을 특이적으로 증폭할 수 있음을 증명하였다.
또한, 동일량으로 섞인 4 종류의 혼합 미생물의 genomic DNA에 대하여, 엔테로코커스(Enterococcus) 속 균주에 특이적인 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 수행한 경우, melt curve가 1개의 피크(peak)로 나타났음을 확인하였다 (도 6). 이로써, 상기 프라이머 세트는 4 종류의 장내 미생물 중 엔테로코커스(Enterococcus) 속 균주만을 특이적으로 증폭할 수 있음을 증명하였다.
또한, 동일량으로 섞인 4 종류의 혼합 미생물의 genomic DNA에 대하여, 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주에 특이적인 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 수행한 경우, melt curve가 1개의 피크(peak)로 나타났음을 확인하였다 (도 7). 이로써, 상기 프라이머 세트는 4 종류의 장내 미생물 중 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주만을 특이적으로 증폭할 수 있음을 증명하였다.
또한, 동일량으로 섞인 4 종류의 혼합 미생물의 genomic DNA에 대하여, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주에 특이적인 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 수행한 경우, melt curve가 1개의 피크(peak)로 나타났음을 확인하였다 (도 8). 이로써, 상기 프라이머 세트는 4 종류의 장내 미생물 중 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주만을 특이적으로 증폭할 수 있음을 증명하였다.
실시예 4. 데이터 분석
본 발명자들은 분변에서 얻은 장내 미생물로부터 추출된 genomic DNA에 대하여 각 균주에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 수행함으로써 장내 미생물의 정량 분석을 수행하였고, 이로부터 각 미생물의 양적 비율에 대한 그래프를 통해 각 샘플에 대한 미생물 분포도 등의 데이터 분석이 가능함을 확인하였다.
도 9에서는 분변 샘플에서 genomic DNA를 얻은 후, 각 균주에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 수행하여 각 균주에 대한 정량 분석을 수행한 후, 각 균주에 대한 양적 비율을 나타내는 그래프를 나타낸 것으로서, 상기 샘플의 경우 파란색으로 표시한 박터로이데스(Bacteroides) 속 균주는 46.0% 이고, 회색으로 표시한 엔테로코커스(Enterococcus) 속 균주는 44.4% 이며, 빨간색으로 표시한 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주는 0.3% 이며, 노란색으로 표시한 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주는 9.3% 로 나타남으로써, 장내 미생물 중 유익균의 분포가 9.6 %로 이루어지는 것을 확인하였다. 상기와 같이, 분변 샘플로부터 장내 미생물의 정량 분석에 의해 각 미생물의 양적 비율을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명자들은 각 균주에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 real-time PCR을 통해 정량 분석을 수행함으로써, 장내 서식 미생물에 대한 정보를 분석할 수 있음을 확인하였다.
<110> Industry-academic coorperation foundation Daegu Haany University <120> Development of selective quantitative comparative analysis of intestinal microbiome <130> PN1811-480 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacteroides 16s rRNA forward <400> 1 ggcggtcttc cgggtaaa 18 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacteroides 16s rRNA reverse <400> 2 tggcatatag cggaagaaaa aag 23 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Enterococcus 16s rRNA forward <400> 3 ggacgmaagt ctgaccga 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Enterococcus 16s rRNA reverse <400> 4 ttaagaaacc gcctgcgc 18 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus 16s rRNA forward <400> 5 agcagtaggg aatcttcca 19 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus 16s rRNA reverse <400> 6 caccgctaca catggag 17 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bifidobacterium 16s rRNA forward <400> 7 gggtggtaat gccggatg 18 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bifidobacterium 16s rRNA reverse <400> 8 taagcgatgg actttcacac c 21

Claims (12)

  1. 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트;
    서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트;
    서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및
    서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 장내 서식 미생물의 검출 또는 정량용 프라이머 세트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 장내 서식 미생물은 박터로이데스(Bacteroides) 속 균주, 엔테로코커스(Enterococcus) 속 균주, 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 장내 서식 미생물의 16s rRNA를 특이적으로 증폭하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항의 프라이머 세트를 포함하는 장내 서식 미생물의 검출 또는 정량용 조성물.
  5. 제 4 항의 조성물을 포함하는 장내 서식 미생물의 검출 또는 정량용 키트.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 키트는 DNA 중합효소, dNTP 및 버퍼를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  7. 시료로부터 분리된 DNA에 대하여 제 1 항의 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)을 수행하고 분석하는 단계를 포함하는 장내 서식 미생물의 검출 또는 정량 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 장내 서식 미생물은 박터로이데스(Bacteroides) 속 균주, 엔테로코커스(Enterococcus) 속 균주, 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 시료는 분변인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 7 항에 있어서,
    상기 중합효소연쇄반응은 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 또는 경쟁적 중합효소연쇄반응(Competitive RT-PCR)인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 7 항에 있어서,
    상기 분석에서 Ct 값이 확인되면 시료 내에 장내 서식 미생물이 존재하는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 7 항에 있어서,
    상기 분석에서 용융 곡선에서의 피크가 존재하면 시료 내에 장내 서식 미생물이 존재하는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220068865A (ko) * 2020-11-19 2022-05-26 고려대학교 산학협력단 대장점막의 장내미생물총분석을 이용한 고위험성대장선종, 진행성 결장암 궤양성 대장염 및 정상대조군의 감별 진단 방법
KR20230025224A (ko) * 2021-08-13 2023-02-21 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 장내 미생물의 정량을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
KR20230025222A (ko) * 2021-08-13 2023-02-21 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 박테로이데스 균주의 정량을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
KR20230025221A (ko) * 2021-08-13 2023-02-21 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 아커만시아 균주의 정량을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
KR20230025223A (ko) * 2021-08-13 2023-02-21 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 비피더스 균주의 정량을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
KR20230025225A (ko) * 2021-08-13 2023-02-21 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 Roseburia 균주의 정량을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
You et al. 인간 장내 마이크로비옴 연구: 개념과 전략. KJPH, 52(1):11-19, 2015.

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220068865A (ko) * 2020-11-19 2022-05-26 고려대학교 산학협력단 대장점막의 장내미생물총분석을 이용한 고위험성대장선종, 진행성 결장암 궤양성 대장염 및 정상대조군의 감별 진단 방법
KR20230025224A (ko) * 2021-08-13 2023-02-21 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 장내 미생물의 정량을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
KR20230025222A (ko) * 2021-08-13 2023-02-21 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 박테로이데스 균주의 정량을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
KR20230025221A (ko) * 2021-08-13 2023-02-21 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 아커만시아 균주의 정량을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
KR20230025223A (ko) * 2021-08-13 2023-02-21 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 비피더스 균주의 정량을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
KR20230025225A (ko) * 2021-08-13 2023-02-21 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 Roseburia 균주의 정량을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도

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