KR101695059B1 - 케피어 발효유 내 미생물 그룹별 정량적인 실시간 중합효소 연쇄반응 분석용 조성물 및 그 분석방법 - Google Patents

케피어 발효유 내 미생물 그룹별 정량적인 실시간 중합효소 연쇄반응 분석용 조성물 및 그 분석방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101695059B1
KR101695059B1 KR1020140041430A KR20140041430A KR101695059B1 KR 101695059 B1 KR101695059 B1 KR 101695059B1 KR 1020140041430 A KR1020140041430 A KR 1020140041430A KR 20140041430 A KR20140041430 A KR 20140041430A KR 101695059 B1 KR101695059 B1 KR 101695059B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fermented milk
present
kefir
composition
kefir fermented
Prior art date
Application number
KR1020140041430A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150116319A (ko
Inventor
서건호
김동현
천정환
최다솜
황대근
Original Assignee
건국대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 건국대학교 산학협력단 filed Critical 건국대학교 산학협력단
Priority to KR1020140041430A priority Critical patent/KR101695059B1/ko
Publication of KR20150116319A publication Critical patent/KR20150116319A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101695059B1 publication Critical patent/KR101695059B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/113—Real time assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Abstract

본 발명은 케피어 발효유 품질 관리를 위한 케피어 발효유 내 미생물 그룹별 정량적인 실시간 중합효소 연쇄반응 분석용 조성물 및 그 분석방법에 관한 것으로 본 발명에 따르면, 케피어 발효유 내에 존재하는 주요 미생물 그룹을 성공적으로 정량할 수 있었으며, 본 발명의 기술을 활용하여 케피어 발효유의 품질 관리 및 발효 조건 최적화, 수율 최대화 등 산업적으로 다방면에 활용 가능할 수 있다.

Description

케피어 발효유 내 미생물 그룹별 정량적인 실시간 중합효소 연쇄반응 분석용 조성물 및 그 분석방법{A COMPOSITION FOR ANALYZING MICROBIAL FLORA IN KEFIR FERMENTED MILK AND A QUANTITATIVE REAL-TIME PCR METHOD THEREFOR}
본 발명은 케피어 발효유 품질 관리를 위한 케피어 발효유 내 미생물 그룹별 정량적인 실시간 중합효소 연쇄반응 분석용 조성물 및 그 분석방법에 관한 것이다.
케피어는 50종 이상의 유산균, 초산균, 효모가 공생계를 형성하고 있는 천연 발효유제품이다. 케피어를 정기적으로 섭취할 경우 정장작용, 항비만작용, 항염증작용, 항미생물작용 등 다양한 건강 유익효과를 얻을 수 다고 알려져 있으며, 케피어가 처음으로 유래된 구 소련의 코카서스 지방에서는 장수식품, 당뇨병의 치료 보조식품으로서 이용되어 왔다.
케피어 발효유는 케피어 그레인을 스타터로 하여 우유, 산양유, 마유 등을 첨가하여 발효시키는데, 대부분 재래식으로 배양하기 때문에 배양에 사용하는 우유의 종류, 배양온도나 배양시간, 배양 용기 등이 통일되어 있지 않기 때문에 발효유에 함유되어 있는 미생물의 종류나 양 또한 다양하다. 이러한 이유로 케피어 발효유의 산업화를 위해서는 케피어 발효유 내에 존재하는 다양한 미생물을 그룹별로 정량 분석할 수 있는 방법이 필수적이지만, 아직까지 관련 기술이 개발되어있지 않아서 케피어의 산업화 및 품질관리에 어려움이 있다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 케피어 발효유 내 미생물 그룹별 정량적인 실시간 중합효소 연쇄반응 분석용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 케피어 발효유 내 미생물 그룹별 정량적인 실시간 중합효소 연쇄반응 분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 케피어 발효유 내 미생물 그룹 분석용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 케피어 발효유 내 미생물 그룹 분석 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 내지 18의 프라이머를 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.
용어 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속,철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 케피어 발효유에 존재하는 미생물 종류 분석용 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 케피어 발효유에 존재하는 미생물 종류 분석용 키트를 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 케피어 발효유에 존재하는 미생물 정량 분석용 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 케피어 발효유에 존재하는 미생물 정량 분석용 키트를 제공한다.
본 발명의 검출용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다. 구체적으로, 실시간 PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제, 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또 본 발명은 케피어 발효유로부터 지노믹 DNA를 추출하여 상기 본 발명의 조성물을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는 케피어 발효유에 존재하는 미생물 종류 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 미생물은 젖산균, 초산균 및 효모인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 케피어 발효유로부터 지노믹 DNA를 추출하여 상기 본 발명의 조성물을 이용하여 실시간(real-time) 중합효소 연쇄반응을 수행하여 얻은 Ct(Cycle threshold) 값을 표준 검량선에 대입하여 케피어 발효유에 존재하는 미생물을 그룹별로 정량분석하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 실시간 PCR 방법은 지수적인 증폭이 일어나는 초기 시료의 양을 형광물질의 지수적 증가가 탐지되기 시작하는 사이클의 수(Cycle threshold, 이하 'Ct'라고 칭함)로 나타내므로 보다 정확한 정량분석이 가능하며 반응을 실시간으로 분석할 수 방법으로, 이 방법은 전기영동하여 영상분석기로 강도를 측정하는 단계가 생략되고 증폭산물의 증폭정도를 자동화, 수치화시켜 빠르고 간편하게 진단할 수 있는 방법이다. 예를 들어, 형광을 이용한 실시간 PCR 방법 중 PCR에 의해서 증폭된 이중가닥 DNA에 형광염료가 삽입되어 형광을 나타내는 형광삽입 (intercalation) 방법을 사용할 수 있으며, 이때 발생하는 형광 강도를 측정함으로써 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명은 케피어 발효유의 생물학적 품질관리, 발효조건 최적화, 발효 생성물 최대화 등 다양한 관련 연구를 수행할 수 있는 핵심 기술로 그 필요성 및 중요성이 크며, 본 발명에서는 케피어 발효유 내에 존재하는 미생물들을 그룹별로 정량검출 할 수 있는 quantitative real-time PCR 분석법을 확립하였다
본 발명에서 확립한 미생물 분석법을 이용하여 25℃에서 24시간 동안 멸균우유를 발효시켜 얻은 케피어 발효유 내에 존재하는 주요 미생물 그룹을 성공적으로 정량할 수 있었으며, 본 발명의 기술을 활용하여 케피어 발효유의 품질 관리 및 발효 조건 최적화, 수율 최대화 등 다양한 조건을 확립하는 등 산업적으로 다방면에 활용 가능할 수 있다.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1: 케피어 발효유의 준비
케피어 발효유에 존재하는 미생물총을 분석하기 위하여 본 연구소에서 기 보유하고 있던 케피어 그레인 5종을 발효 스타터로 사용하였다. 4℃에서 5% w/v의 비율로 멸균우유에 접종되어 보관하고 있던 케피어 그레인의 활력을 회복시키기 위하여 케피어 그레인을 수확한 후, 새로운 멸균우유에 5% w/v이 되도록 접종하여 25℃ 에서 24시간 동안 3회 계대배양한 후 얻은 발효유를 실험에 사용하였다.
실시예 2: 케피어 발효유로부터 Genomic DNA 추출
Genomic DNA의 추출에는 Nuclisens EasyMAG을 사용하였다. 케피어 발효유 100ul를 취하여 900ul의 lysis buffer를 첨가한 후 상온에서 10분간 반응시킨 다음 50ul의 magnetic silica를 첨가하여 충분히 피펫팅하여 풀어준 후 Nuclisens EasyMAG 장비에 loading하여 Genomic DNA를 추출하였다.
실시예 3: 케피어 발효유에 존재하는 미생물 분석을 위한 quantitative real - time PCR
Real-time qPCR에는 아래 표 1과 같은 프라이머 서열을 사용하였다.
표적그룹 프라이머 서열 (5'→3') 표준균주
Lactic acid bacteria WLAB1
WLAB2		 TCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGA(서열번호 1)
TCGAATTAAACCACATGCTCCA(서열번호 2)		 Lactobacillus acidophilus ATCC4357
Total Yeast YEASTF
YEASTR		 GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGC(서열번호 3)
TCTCTTTCCAAAGTTCTTTTCATCTTT(서열번호 4)		 Sacharomycecerevisiae ATCC 7752
Acetic acid bacteria AQ1F
AQ2R		 TCAAGTCCTCATGGCCCTTATG(서열번호 5)
CGCCATTGTAGCACGTGTGTA(서열번호 6)		 Acetobacter aceti ATCC 23746
Lactobacillus/Lactococcus group LabF362
LabR677		 AGCAGTAGGGAATCTTCCA(서열번호 7)
CACCGCTACACATGGAG(서열번호 8)		 Lactobacillus acidophilus ATCC4357
Enterococcus group Enc-F-rt
Enc-FR-rt		 CCCTTATTGTTAGTTGCCATCATT(서열번호 9)
ACTCGTTGTACTTCCCATTGT(서열번호 10)		 Enterococcus faecalis
ATCC 19433
Streptococcus group Str1
Str2		 GTACAGTTGCTTCAGGACGTATC(서열번호 11)
ACGTTCGATTTCATCACGTTG(서열번호 12)		 Streptotoccus salivarius subsp. thermophilus NBIMCC 1374
Bifidobacterium group g-Bifid-F
g-Bifid-R		 CTCCTGGAAACGGGTGG(서열번호 13)
GGTGTTCTTCCCGATATCTACA(서열번호 14)		 Bifidobacterium adolecentis ATCC15703
Candida group CTSF
CTSR		 TCGCATCGATGAAGAACGCAGC(서열번호 15)
TCTTTTCCTCCGCTTATTGATATGC(서열번호 16)		 Candida inconspicua ATCC16783
Saccharomyces group SC1
SC2		 GAAAACTCCACAGTGTGTTG(서열번호 17)
GCTTAAGTGCGCGGTCTTG(서열번호 18)		 Sacharomycecerevisiae ATCC 7752
표 1은 케피어 발효유 내의 미생물 정량을 위한 그룹 특이적 프라이머 세트 목록
이어 아래 표 2와 같은 PCR 반응용액을 제조하였다. 반응액을 7500 real-time PCR system (Applied Biosystems)을 이용하여 95℃에서 30초간 반응시킨 후, 95℃에서 5초, 60℃에서 34초로 구성된 반응사이클을 40회 반복하며 형광값을 측정하여 결과를 얻었다. 증폭산물의 특이성 검정을 위하여 해리곡선 분석을 추가적으로 실시하였다.
재료 용량
SYBR Green Premix (Takara) 10 μL
Forward primer 0.4 μL
Reverse primer 0.4 μL
Rox dye 0.4 μL
멸균증류수 6.8 μL
Genomic DNA 2 μL
총 합 20 μL
표 2는 PCR 반응 용액의 제조 조성 표
실시예 4: 케피어 발효유에 존재하는 미생물의 그룹별 정량
상기 표 1에서 제시한 표준균주들로부터 genomic DNA를 추출하여 단계희석 한 후, 위와 동일한 방법으로 real-time PCR 반응을 수행하였다. Real-time PCR에서 얻은 Ct값과 배양법을 통해서 구한 균수를 각각 대응시켜 표준검량선을 작성하였다. 이어, 실시예 3에서 얻은 Ct값을 표준 검량선에 대입하여 케피어 발효유에 존재하는 미생물을 그룹별로 정량분석하였다.
상기 본 발명의 실시예의 실험의 결과는 Microsoft Excel 2010 (Microsoft)를 이용하여 평균 ± 표준편차로 제시하였다. 또한 정량치간의 통계학적 유의차는 ANOVA(Duncan's multiple range test)로 분석하였으며 P값이 0.05이하인 경우를 통계학적으로 유의차가 있는 것으로 간주하였다.
상기 본 발명의 실시예의 결과는 하기와 같다.
(1)표준 검량선
케피어 발효유 내에 존재하는 미생물을 정량하기 위해서 작성한 표준 검량선이 아래 표 3에 제시되어있다.
미생물 그룹 경사 Y절편 R 2
Lactic acid bacteria -3.841 39.934 0.998
Total Yeasts -3.403 38.205 0.998
Acetic acid bacteria -3.005 36.574 0.998
Lactobacillus/Lactococcus group -3.841 39.934 0.998
Enterococcus group -3.309 36.096 0.999
Streptococcus group -2.757 35.627 0.996
Bifidobacterium group -3.224 40.345 0.998
Candida group -3.272 35.656 0.999
Saccharomyces group -3.131 36.923 0.998
표 3은 미생물 정량에 사용된 표준 검량선
(2)케피어 발효유 내의 미생물 정량
대분류 그룹 케피어 발효유 1mL당 Log균수 *
주요 미생물 그룹 Lactic acid bacteria 8.61 ± 0.53 A
Acetic acid bacteria 8.30 ± 0.35 A
Total yeast 6.69 ± 0.44 B
유산균 Lactobacillus/Lactococcus 8.15 ± 0.22 A
Streptococcus 6.51 ± 1.39 B
Enterococcus 6.31 ± 0.24 B
Bifidobacterium 검출되지 않음
효모 Candida 6.16 ± 0.37 B
Saccharomyces 5.51 ± 1.38 B
표 4는 케피어 발효유 내에 존재하는 미생물 정량치를 나타내는 것으로, 표에서 * 동일 열 내의 다른 알파벳은 두 값 사이의 통계학적 유의차가 있음을 의미함 (P < 0.05)
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> {A COMPOSITION FOR ANALYZING MICROBIAL FLORA IN KEFIR FERMENTED MILK AND A QUANTITATIVE REAL-TIME PCR METHOD THEREFOR <130> HY140350 <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tccggattta ttgggcgtaa agcga 25 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcgaattaaa ccacatgctc ca 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gagtcgagtt gtttgggaat gc 22 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tctctttcca aagttctttt catcttt 27 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tcaagtcctc atggccctta tg 22 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cgccattgta gcacgtgtgt a 21 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 agcagtaggg aatcttcca 19 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 caccgctaca catggag 17 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cccttattgt tagttgccat catt 24 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 actcgttgta cttcccattg t 21 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gtacagttgc ttcaggacgt atc 23 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 acgttcgatt tcatcacgtt g 21 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ctcctggaaa cgggtgg 17 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ggtgttcttc ccgatatcta ca 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tcgcatcgat gaagaacgca gc 22 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tcttttcctc cgcttattga tatgc 25 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gaaaactcca cagtgtgttg 20 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gcttaagtgc gcggtcttg 19

Claims (9)

  1. 서열번호 1 내지 18의 프라이머를 유효성분으로 포함하는, 한국 내 케피어 발효유에 존재하는 Lactobacillus acidophilus, Saccharomyces cerevisiae, Acetobacter aceti, Enterococcus faecalis, Streptococcus salivarius, Bifidobacterium adolecentis 및 Candida inconspicua 분석용 조성물.
  2. 삭제
  3. 서열번호 1 내지 18의 프라이머를 포함하는, 한국 내 케피어 발효유에 존재하는 Lactobacillus acidophilus, Saccharomyces cerevisiae, Acetobacter aceti, Enterococcus faecalis, Streptococcus salivarius, Bifidobacterium adolecentis 및 Candida inconspicua 분석용 키트.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 한국 내 케피어 발효유로부터 지노믹 DNA를 추출하여 제1항의 조성물을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는, 한국 내 케피어 발효유에 존재하는 Lactobacillus acidophilus, Saccharomyces cerevisiae, Acetobacter aceti, Enterococcus faecalis, Streptococcus salivarius, Bifidobacterium adolecentis 및 Candida inconspicua 분석 방법.
  7. 삭제
  8. 한국 내 케피어 발효유로부터 지노믹 DNA를 추출하여 제1항의 조성물을 이용하여 실시간(real-time) 중합효소 연쇄반응을 수행하여 얻은 Ct 값을 표준 검량선에 대입하여 한국 내 케피어 발효유에 존재하는 Lactobacillus acidophilus, Saccharomyces cerevisiae, Acetobacter aceti, Enterococcus faecalis, Streptococcus salivarius, Bifidobacterium adolecentis 및 Candida inconspicua을 그룹별로 정량분석하는 방법.
  9. 삭제
KR1020140041430A 2014-04-07 2014-04-07 케피어 발효유 내 미생물 그룹별 정량적인 실시간 중합효소 연쇄반응 분석용 조성물 및 그 분석방법 KR101695059B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140041430A KR101695059B1 (ko) 2014-04-07 2014-04-07 케피어 발효유 내 미생물 그룹별 정량적인 실시간 중합효소 연쇄반응 분석용 조성물 및 그 분석방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140041430A KR101695059B1 (ko) 2014-04-07 2014-04-07 케피어 발효유 내 미생물 그룹별 정량적인 실시간 중합효소 연쇄반응 분석용 조성물 및 그 분석방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150116319A KR20150116319A (ko) 2015-10-15
KR101695059B1 true KR101695059B1 (ko) 2017-01-23

Family

ID=54356927

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140041430A KR101695059B1 (ko) 2014-04-07 2014-04-07 케피어 발효유 내 미생물 그룹별 정량적인 실시간 중합효소 연쇄반응 분석용 조성물 및 그 분석방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101695059B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023234577A1 (ko) * 2022-05-31 2023-12-07 종근당건강 주식회사 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 균종 판별 방법

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102237098B1 (ko) 2019-10-07 2021-04-06 건국대학교 산학협력단 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 프로바이오틱 효모 사카로마이세스 유니스포러스의 검출 및 정량 방법

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61147542A (ja) * 1984-12-21 1986-07-05 Toshiba Seiki Kk 良品ペレツトの判別装置
JP2006034267A (ja) * 2004-07-22 2006-02-09 Fisu:Kk 複合発酵乳の製造方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Food Microbiology. 2008, vol. 25, pp. 849-856.*
Microbiota of kefir grains, Mljekarstvo. 2013, vol. 63, no. 1, pp. 3-14.*

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023234577A1 (ko) * 2022-05-31 2023-12-07 종근당건강 주식회사 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 균종 판별 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20150116319A (ko) 2015-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cocolin et al. An application of PCR-DGGE analysis to profile the yeast populations in raw milk
JP5238248B2 (ja) ｒＲＮＡを標的とした微生物の定量的解析方法
FI102298B (fi) Menetelmä maitohappobakteerilajien määrittämiseksi ja menetelmään sove ltuvia oligonukleotideja
Pisal et al. Detection of mycoplasma contamination directly from culture supernatant using polymerase chain reaction
EP1953247A1 (en) A method for measuring the number of oral streptococci, and a PCR primers-probe set used for the same
Cobo et al. Comparative evaluation of MALDI-TOF MS and 16S rRNA gene sequencing for the identification of clinically relevant anaerobic bacteria. Critical evaluation of discrepant results
KR101695059B1 (ko) 케피어 발효유 내 미생물 그룹별 정량적인 실시간 중합효소 연쇄반응 분석용 조성물 및 그 분석방법
Galetto et al. Real-time PCR diagnosis and quantification of phytoplasmas
JP5048622B2 (ja) 乳酸菌検出用ｐｃｒプライマー
ES2439227T3 (es) Nuevos métodos y kits relacionados con la detección, la identificación y la cuantificación de levaduras en vino, cerveza y zumos
KR101509071B1 (ko) 마이크로시스티스속 균주의 유전자 증폭용 프라이머 및 이를 이용한 마이크로시스티스속 균주의 탐지방법
CN108350508B (zh) 雌马酚产生能力的测定方法
JP3338924B2 (ja) 乳酸菌検出用オリゴヌクレオチド及びそれを用いた判定法
KR20200004944A (ko) 락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸 특이 검출 및 선발을 위한 마커 및 이를 이용한 분석 방법
KR101750850B1 (ko) 바이셀라 코리엔시스의 특이적 프라이머 쌍 및 이를 이용한 바이셀라 코리엔시스의 검출방법
KR101752274B1 (ko) 장출혈성 대장균의 시가독소 유전자형 stx1 및 stx2를 동시에 판별하기 위한 고감도 실시간 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이를 이용한 장출혈성 대장균의 시가독소 유전자형의 판별 방법
JP4648023B2 (ja) ジャガイモそうか病原因菌種の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子若しくは１６ＳｒＲＮＡ遺伝子からＩＴＳ領域間を増幅するための新規プライマー対、及びそれらを用いたジャガイモそうか病原因菌種の検出・識別方法
KR102000462B1 (ko) 락토바실러스 플란타룸 아종 아르젠토라텐시스 특이 검출 및 선발을 위한 마커 및 이를 이용한 분석 방법
KR102084862B1 (ko) 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 초산균의 검출 및 정량 방법
KR101961652B1 (ko) 바이셀라 비리데센스의 특이적 프라이머 및 이를 이용한 바이셀라 비리데센스의 검출방법
EP1975257B1 (en) A method for measuring the number of oral lactobacillus, and a PCR primers-probe set used for the same
JP2007020423A (ja) 腸内細菌群検出用核酸断片
KR102237098B1 (ko) 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 프로바이오틱 효모 사카로마이세스 유니스포러스의 검출 및 정량 방법
JP2014064543A (ja) ビフィドバクテリウム・ロンガムの検出および／または定量用オリゴヌクレオチド
JP7252606B2 (ja) 乳酸菌検出プライマーセットおよび該プライマーセットを用いた検出方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
E90F Notification of reason for final refusal
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200102

Year of fee payment: 4