WO2023234577A1 - 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 균종 판별 방법 - Google Patents
프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 균종 판별 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2023234577A1 WO2023234577A1 PCT/KR2023/006187 KR2023006187W WO2023234577A1 WO 2023234577 A1 WO2023234577 A1 WO 2023234577A1 KR 2023006187 W KR2023006187 W KR 2023006187W WO 2023234577 A1 WO2023234577 A1 WO 2023234577A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- bacterial species
- species
- primer set
- probiotic
- probiotic composition
- Prior art date
Links
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 title claims abstract description 78
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 title claims abstract description 78
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 73
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 35
- 241000894007 species Species 0.000 claims abstract description 133
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 claims abstract description 62
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 14
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 8
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 6
- 108091023242 Internal transcribed spacer Proteins 0.000 claims description 4
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 claims description 3
- 240000002605 Lactobacillus helveticus Species 0.000 claims description 3
- 235000013967 Lactobacillus helveticus Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 claims description 3
- 229940054346 lactobacillus helveticus Drugs 0.000 claims description 3
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 claims description 2
- 241001134770 Bifidobacterium animalis Species 0.000 claims description 2
- 241000186016 Bifidobacterium bifidum Species 0.000 claims description 2
- 241000186012 Bifidobacterium breve Species 0.000 claims description 2
- 241001608472 Bifidobacterium longum Species 0.000 claims description 2
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 claims description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 2
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims description 2
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 claims description 2
- 235000013956 Lactobacillus acidophilus Nutrition 0.000 claims description 2
- 241000186606 Lactobacillus gasseri Species 0.000 claims description 2
- 241000194035 Lactococcus lactis Species 0.000 claims description 2
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 claims description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims description 2
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 claims description 2
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 claims description 2
- 229940054340 bacillus coagulans Drugs 0.000 claims description 2
- 229940002008 bifidobacterium bifidum Drugs 0.000 claims description 2
- 229940009291 bifidobacterium longum Drugs 0.000 claims description 2
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 claims description 2
- 229940039695 lactobacillus acidophilus Drugs 0.000 claims description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 claims 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 25
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 16
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 abstract description 4
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 abstract description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract description 4
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 abstract description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 26
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 24
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 22
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 22
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 8
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 230000036541 health Effects 0.000 description 6
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 5
- 241000135333 Lactica Species 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 5
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 5
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 241000218492 Lactobacillus crispatus Species 0.000 description 1
- 241000186840 Lactobacillus fermentum Species 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000012356 Product development Methods 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 229940118852 bifidobacterium animalis Drugs 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007407 health benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008821 health effect Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 229940012969 lactobacillus fermentum Drugs 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- XEBWQGVWTUSTLN-UHFFFAOYSA-M phenylmercury acetate Chemical compound CC(=O)O[Hg]C1=CC=CC=C1 XEBWQGVWTUSTLN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Definitions
- Probiotics are known to have beneficial health effects on the host when consumed in appropriate amounts. Scientific evidence continues to accumulate about the beneficial effects of probiotics on human health in various aspects such as alleviating immune disorders, inflammatory bowel disease, type 2 diabetes, and arteriosclerosis.
- Two substantially complementary strands may be, for example, completely complementary or may contain from one to a number of mismatches, for example, sufficiently allowing for differences between the paired and unpaired sequences. You can. Accordingly, a “substantially complementary” sequence can mean a sequence that has a base pair complementarity of more than 100, 95, 90, 80, 75, 70, 60, 50%, or any of the above numbers in the double-stranded region. .
- the fungal species may be probiotic species and pathogenic bacterial species.
- the probiotic species may be a bacterial species recognized and notified as a health functional food by the Ministry of Food and Drug Safety and a bacterial species that can be used in food.
- detection of the amplification product in step 3) may be performed through sequencing, such as Next Generation Sequencing (NGS).
- NGS Next Generation Sequencing
- sequencing can be performed using small NGS equipment such as iSeq100, thus lowering sequencing costs and improving speed.
- NCBI National Center for Biological Information
- ANI Average Nucleotide Identity
- pyani a program to obtain ANI
- the maximum value of ANI for each strain between species was calculated for the 160bp region of the ITS sequence located after the primer region, and the ANI standard for species discrimination was set. Specifically, the maximum ANI values between species are shown in [Table 5] below.
- Amplicon PCR was performed on the extracted sample DNA using the fusion primer set of ⁇ Example 1> above as follows. Add 10 mM Tris pH 8.5 to the extracted sample DNA, dilute the DNA concentration to 12 ng/ ⁇ L, and prepare a PCR reaction solution using the fusion primer prepared in ⁇ Example 1> as shown in [Table 8] below. , PCR was performed under the conditions shown in [Table 9] below. Next, purification of the PCR-completed sample was performed using HiAccuBead according to the manufacturer's procedures.
- the primer set is used to determine the bacterial species in the probiotic composition. It can be useful for discrimination.
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
Abstract
본 발명은 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 균종 판별 방법에 관한 것으로, 구체적으로 프로바이오틱스 종 및 병원성 박테리아 종의 16S rRNA와 23S rRNA 사이의 ITS(intergenic transcribed spacer) 영역을 타겟으로 하는 프라이머 세트를 제작하고, 이를 이용하여 프로바이오틱스 조성물의 메타게놈 분석을 수행함으로써, 21종의 프로바이오틱스 종 및 4종의 병원성 박테리아 종을 높은 해상도 및 정확도로 판별할 수 있음을 확인하였으므로, 상기 프라이머 세트는 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별을 위해 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 균종 판별 방법에 관한 것이다.
프로바이오틱스는 적절한 양으로 섭취되었을 때 숙주에게 건강상 유익한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 면역 장애의 완화, 염증성 장질환, 제2형 당뇨병, 동맥경화증 등의 다양한 방면에서 프로바이오틱스가 사람의 건강에 미치는 유익한 영향에 대한 과학적 증거는 계속하여 축적되고 있다.
그러나, 프로바이오틱스 관련 제품에 대한 객관적인 품질정보는 부족한 상태이며, 국내에서 실제로 제품에 사용된 균주와 신고된 균주가 차이가 있음이 밝혀진 경우도 있었다. 최초 허가된 균주가 아닌 다른 균주가 제품에 사용될 경우 해당 균주의 안전성 및 기능성을 보장할 수 없으므로 제품 내 사용되는 프로바이오틱스 균주의 정확한 판별이 필요하며 이를 바탕으로 안전성 확보가 중요하다.
국내에서 프로바이오틱스는 건강기능식품으로 분류되며 '건강기능식품에 관한 법률'로 관리되고 있다. 기능성을 가진 원료는 식품의약품안전처장(이하 식약처장)이 고시(고시된 원료)하거나 별도로 인정한 원료(개별인정된 원료)로 구분되는데, 현재 국내에서 프로바이오틱스로 사용이 가능한 고시형 균주는 총 19종이다.
2002년에 발표된 FAO와 WHO의 프로바이오틱스 제품 가이드라인은 프로바이오틱스의 효능이 균주 특이적(strain specific)이기 때문에, 균주(strain)의 정확한 동정이 그 균주의 효능과의 연관성 및 정확한 추적과 역학연구에 있어서 매우 중요하다고 명시하였다. 특히 신경학적인 효과, 면역조절 효과, 내분비학적인 효과, 특정 생리활성 물질의 생산 등은 동일한 속(genus)과 종(species)의 균주라도 프로바이오틱스의 효능에서는 매우 큰 차이를 나타내기 때문이다. 따라서 프로바이오틱스 제품 내에서 특정 균주의 확인기술은 제품관리뿐 아니라, 해당 균주를 포함하는 제품의 섭취 후 인체 내에서의 해당 균주의 추적을 위해서도 반드시 필요하다. 최근에는 선발된 균주의 전장 유전체(whole genome) 분석이 쉬워졌기 때문에 비교 유전체 기술을 이용한 균주 특이적 프라이머의 디자인과 이를 이용한 PCR(polymerase chain reaction)을 통하여 특정 균주의 정량적·정성적 분석이 가능해졌다. 그러나 각 균종별 프라이머가 필요하여 여러 균종을 대상으로 수행할 경우 실험 과정이 번거로워진다.
식품의약품안전평가원에서는 2021년에 건강기능식품 기능성 원료 프로바이오틱스 안전성 평가 가이드를 배포하여, NGS 기반 메타게놈/메타샷건 기술을 통해 프로바이오틱스 제품 내 또는 복합균주 내 균주 종류 파악 및 조성 분석을 통한 안전성 평가 방법을 제시하였다. 따라서 NGS 분석 서비스 기관에서 제공하는 16S 메타게놈 NGS 분석법을 통해 제품 내 미생물 균종 동정을 수행한다. 그 중 대표적인 서비스인 MTP(Microbiome taxonomic profiling, 미생물군집에 대한 분류학적 프로파일링)는 약 460 bp 정도 길이의 16S V3V4를 타겟팅하고 있다. 그러나 긴 서열을 확보하기 위해 MiSeq 혹은 HiSeq 등의 고가 장비를 통해 250×2 paired read 분석을 진행해야 하며, 약 2주의 분석 기간과 제품 당 20만원 이상의 비용이 소요된다. 또 다른 분석 서비스인 PCC(Probiotics contents certificate, 프로바이오틱스 함량 증명서)는 WGS 메타게놈 분석법을 통해 균종 동정을 수행을 하는데, 분석에 충분한 coverage를 얻기 위해서 HiSeq 등의 고가 장비가 필요하며, 약 1달의 분석 기간과 제품 당 약 100만원 이상의 비용이 소요된다.
또한, 16S 메타게놈 분석법 기반인 MTP에서는 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus) 등 16S rRNA 서열 유사도가 98% 이상인, 유사 균종간에는 구분이 불가능하여 속 수준 분석으로 제한된다. WGS 메타게놈 분석법인 PCC에서는 종 수준 분석이 가능하지만, 검출한계 값이 약 1%이므로 저비율로 포함된 균종에 대한 검출력이 떨어진다.
이에, 본 발명자들은 고가의 분석 장비를 요하지 않고, 분석기법이 번거롭지 않으며, 분석 시간 단축 및 비용 절감 등의 경제성을 확보할 수 있는 프로바이오틱스 제품 품질 관리 기술을 개발하기 위해 노력한 결과, 프로바이오틱스 종(species) 및 병원성 박테리아 종의 16S rRNA와 23S rRNA 사이의 약 200 bp 정도 길이의 ITS(intergenic transcribed spacer) 영역을 타겟으로 하는 프라이머 세트를 제작하였고, 이를 이용하여 프로바이오틱스 조성물의 메타게놈 분석을 수행함으로써, 21종의 프로바이오틱스 종 및 4종의 병원성 박테리아 종을 높은 해상도 및 정확도로 판별할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 상기 프라이머 및 이를 이용한 균종 판별 방법은 프로바이오틱스 제품 내 균종 판별을 위해 유용하게 이용될 수 있고, 이를 통해 프로바이오틱스 제품의 품질 정보 및 안전성에 대한 객관적이고 합리적인 정보를 제공할 수 있음을 밝힘으로써, 본 출원에 이르게 되었다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
대한민국 공개특허 제10-2020-0029689호
대한민국 공개특허 제10-2020-0027900호
[비특허문헌]
성영제, 박명수. 국내외 프로바이오틱스 제품 개발 현황. Food Science and Industry (Vol.52 No.3), 229-240
이주훈. 프로바이오틱스 유전자 특성 및 안전성 확인 방법 연구. 식품의약품안전처 (2010-11), TRKO202100007735
종래 프로바이오틱스 제품 내 프로바이오틱스 균종을 판별하는 방법은 분석 기간이 길고, 고가의 비용이 소요되며, 종(species) 수준의 분석이 어렵다는 문제점이 있다.
이에, 본 발명의 목적은 상기 문제점을 해결하고, 프로바이오틱스 제품 내 프로바이오틱스 및 병원성 박테리아 등 다양한 균종을 동시에 판별할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 프로바이오틱스 제품 내 균종 판별 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 9로 표시되는 프라이머를 포함하는 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별용 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 프로바이오틱스 조성물로부터 DNA를 분리하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 분리한 DNA를 주형으로 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별 방법을 제공한다.
본 발명에서는 프로바이오틱스 종 및 병원성 박테리아 종의 16S rRNA와 23S rRNA 사이의 약 200 bp 정도 길이의 ITS(intergenic transcribed spacer) 영역을 타겟으로 하는 프라이머 세트를 제작하고, 이를 이용하여 프로바이오틱스 조성물의 메타게놈 분석을 수행함으로써, 21종의 프로바이오틱스 종 및 4종의 병원성 박테리아 종을 높은 해상도 및 정확도로 판별할 수 있음을 확인하였으므로, 상기 프라이머 세트는 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별을 위해 유용하게 이용될 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 약 200 bp 정도 길이의 ITS 영역을 타겟팅함으로써, 300×1 single read 데이터로도 충분하여 iSeq100을 포함한 저가 NGS 장비를 통해서도 충분한 데이터를 얻어낼 수 있고, 이를 통해 프로바이오틱스 제품을 약 3일, 제품 당 5.5만원 정도로 분석이 가능하여, 기존 기술에 비해 경제성을 높이는 효과가 있다.
또한, 상기 프라이머 세트는 공통 ITS 영역을 타겟팅하여 프로바이오틱스 제품 내 포함된 다양한 균종을 종(speices) 수준에서 동시에 판별할 수 있으므로, 균종별 프라이머를 제작해야 하는 번거로움을 제거하는 효과가 있다.
따라서, 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 이를 이용한 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별 방법을 이용하여 프로바이오틱스 제품의 품질 정보 및 안전성에 대한 객관적이고 합리적인 정보를 제공할 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 9로 표시되는 프라이머를 포함하는 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 용어 "프로바이오틱스(probiotics)"는 건강상의 이익을 부여하는 살아있는 미생물, 예컨대 박테리아 균을 말한다. 또한, "프로바이오틱스 조성물"은 프로바이오틱스를 포함하는 조성물을 말하며, "프로바이오틱스 제품"과 혼용하여 사용될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction: PCR)"은 중합효소를 사용하여 핵산을 연쇄적으로 합성하여 개시 핵산 물질을 기하급수적으로 증폭하는 방법으로 보편적으로 사용된다.
본 발명에서, 용어 "프라이머(primer)"는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 서열을 말하며, PCR에 있어서 복제, 증폭되는 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로 작용하며, 정방향 프라이머(Forward primer)와 역방향 프라이머(Reverse primer)로 구분된다.
본 발명에서, 상기 프라이머 세트는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함하며, 구체적으로 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 2 내지 9로 표시되는 역방향 프라이머를 포함한다.
또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 주형의 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열일 수 있고, 주형의 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열이 아니고, 본 개시가 목적으로 하는 타겟 유전자의 증폭을 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 상보적인 서열일 수도 있다.
여기서 "실질적으로 상보적인(substantially complementary)"은 서열 내에서 충분히 상보적인 2개의 핵산 가닥이 어닐링되고 안정적인 듀플렉스를 형성하는 것을 의미한다. 상기 상보성은 완전할 필요는 없다. 예를 들어, 2개의 핵산 사이에 염기 쌍의 미스매치(mismatch)가 몇 개 정도 있을 수 있다. 그러나, 미스매치의 숫자가 너무 많아서 최소한의 엄격한 혼성화 조건에서 조차 혼성화가 일어나지 않는 경우에는, 상기 서열은 실질적으로 상보적인 서열이 아니다. 본 발명에서 2개의 서열이 "실질적으로 상보적인" 것으로 해석되면, 상기 서열은 엄격한 혼성화 조건과 같이 선택된 반응 조건 하에서 서로가 혼성화될 수 있도록 충분히 상보적인 것을 의미한다. 특이성을 달성할 수 있는 충분한 핵산의 상보성과 혼성화의 엄격성의 관계는 당업계에 잘 알려져 있다. 2개의 실질적으로 상보적인 가닥은, 예를 들어, 완전하게 상보적이거나 또는 예를 들어, 쌍을 이루는 서열 및 쌍을 이루지 않는 서열 사이의 차이점을 충분히 허용하는 한 1 내지 다수의 미스매치를 포함할 수 있다. 따라서, "실질적으로 상보적인" 서열은 이중 가닥 구역에서 100, 95, 90, 80, 75, 70, 60, 50% 이상, 또는 상기 숫자 사이의 어떠한 %의 염기쌍 상보성을 갖는 서열을 의미할 수 있다.
또한, 상기 프라이머는 5' 말단에 어댑터(adaptor) 서열을 더 포함할 수 있으며. 구체적으로, 서열번호 10 내지 18로 표시되는 프라이머일 수 있다. 보다 구체적으로 서열번호 1로 표시되는 프라이머의 5' 말단에 어댑터 서열을 더 포함하는 서열번호 10로 표시되는 프라이머, 서열번호 2로 표시되는 프라이머의 5' 말단에 어댑터 서열을 더 포함하는 서열번호 11로 표시되는 프라이머, 서열번호 3으로 표시되는 프라이머의 5' 말단에 어댑터 서열을 더 포함하는 서열번호 12로 표시되는 프라이머, 서열번호 4로 표시되는 프라이머의 5' 말단에 어댑터 서열을 더 포함하는 서열번호 13로 표시되는 프라이머, 서열번호 5로 표시되는 프라이머의 5' 말단에 어댑터 서열을 더 포함하는 서열번호 14로 표시되는 프라이머, 서열번호 6으로 표시되는 프라이머의 5' 말단에 어댑터 서열을 더 포함하는 서열번호 15로 표시되는 프라이머, 서열번호 7로 표시되는 프라이머의 5' 말단에 어댑터 서열을 더 포함하는 서열번호 16으로 표시되는 프라이머, 서열번호 8로 표시되는 프라이머의 5' 말단에 어댑터 서열을 더 포함하는 서열번호 17로 표시되는 프라이머 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머의 5' 말단에 어댑터 서열을 더 포함하는 서열번호 18로 표시되는 프라이머일 수 있다.
본 발명에서, 상기 균종은 프로바이오틱스 종 및 병원성 박테리아 균종일 수 있다. 구체적으로, 상기 프로바이오틱스 종은 식품의약품안전처에서 건강기능식품으로 인정 및 고시된 박테리아 균종 및 식품에 사용할 수 있는 박테리아 균종일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 식품의약품안전처에서 건강기능식품으로 인정 및 고시된 박테리아 균종은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbruecki ssp. Bulgaricus), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락티카제이바실러스 카제이 (Lacticaseibacillus casei), 락티카제이바실러스 파라카제이 (Lacticaseibacillus paracasei), 락티카제이바실러스 람노서스(Lacticaseibacillus rhamnosus), 리모시락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum), 리모시락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri), 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum), 리기락토바실러스 살리바리우스(Ligilactobacillus salivarius), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 및 비피도박테리움 아니말리스 락티스(Bifidobacterium animalis ssp. lactis)일 수 있다.
또한, 상기 식품에 사용할 수 있는 박테리아 균종은 라티락토바실러스 커바투스(Latilactobacillus curvatus) 및 바실러스 코아귤런스(Bacillus coagulans)일 수 있다.
또한, 상기 병원성 박테리아 균종은 대장균(Escherichia coli), 살모넬라(Salmonella spp.), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)일 수 있다.
본 발명에서, 상기 프라이머 세트는 상기 균종의 ITS(internal transcribed spacer) 영역을 타겟으로 하고, 구체적으로 약 200 bp 정도 길이의 ITS 영역을 타겟으로 한다. 이에, 프로바이오틱스 제품 내 포함된 상기 균종을 동시에 판별할 수 있다. 또한, 약 200 bp 정도 길이의 ITS 영역을 타겟팅하여 iSeq100 등의 저가 NGS 장비를 통해서도 분석이 가능하므로, 프로바이오틱스 제품 내 균종 판별 비용 및 기간을 절감할 수 있다.
본 발명에서, 상기 조성물은 PCR을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있다.
상기 PCR을 수행하기 위한 시약은 해당 기술분야에서 널리 공지된 것은 어느 것이나 포함될 수 있다. 예컨대, 내열성 DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼(buffer) 등을 포함할 수 있다. 상기 dNTPs는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, 내열성 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소 등 시판되는 내열성 중합효소를 이용할 수 있다.
아울러, 본 발명은
1) 프로바이오틱스 조성물로부터 DNA를 분리하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 분리한 DNA를 주형으로 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 프라이머, 균종 등에 대해서는 상술한 바와 동일하므로, 구체적인 설명은 상기 내용을 원용한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 1)에서 DNA 분리는 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 수행될 수 있으며, 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 2)에서 PCR은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 수행될 수 있으며, 상업적으로 판매되는 PCR을 수행하기 위한 시약을 이용하여 수행될 수 있다.
또한, 상기 단계 2)의 증폭 산물을 주형으로 인덱스 PCR(index PCR)을 수행하는 것을 더 포함할 수 있다. 상기 인덱스 PCR을 수행하여 증폭 산물에 인덱스를 부착할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 3)에서 증폭 산물의 검출은 시퀀싱, 예컨대 차세대 염기서열분석(Next Generation Sequencing; NGS)을 통해 수행될 수 있다. 특히 iSeq100 등의 소형 NGS 장비를 활용하여 시퀀싱을 수행할 수 있으므로 시퀀싱 비용을 낮추고 속도를 향상시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 프로바이오틱스 제품 내 균종 판별용 프라이머 세트 제작
프로바이오틱스 제품에 사용되는 프로바이오틱스 종으로 19종의 식약처 고시종 및 2종의 식품 첨가종과 4종의 병원성 박테리아 종을 판별할 수 있는 프라이머를 제작하였다.
구체적으로, 미국 국립생물정보센터(NCBI)의 GenBank 데이터베이스에서 하기 [표 1]과 같이 19종의 식약처 고시종, 2종의 식품 첨가종 및 4종의 병원성 박테리아 종의 complete genome 정보를 획득하였다. 상기 균종에 대한 NCBI GeneBank 데이터베이스에서의 Accession number는 하기 [표 2]와 같다.
[표 1]
[표 2]
그 다음, 16S의 후반 약 100 bp 내에 위치한 공통 서열 및 23S의 초반 약 100bp 내에 위치한 공통 서열을 활용한 (Massimiliano et al., Appl. Environ. Microbiol., 2004, 70, 6147-6156) In silico PCR을 통해 상기 25종 균주의 16S 및 23S rRNA 사이에 위치한 ITS(internal transcribed spacer) 구간 서열을 획득하였다. 상기 획득한 서열을 이용하여 CLC Genomics Workbench(Qiagen)의 CLC Microbial Genomics Module의 절차를 따라 메타게놈 분석용 ITS 균종 판별 데이터베이스를 생성하고, 하기 [표 3]의 프라이머 세트를 도출하였다. 또한 하기 [표 4]와 같이 각 프라이머 서열 앞에 illumina adaptor 서열을 디자인하여, 표적 서열을 증폭하는 동시에 NGS 라이브러리가 제작이 가능한 fusion 형태로 제작하였다. 도출한 프라이머 세트는 마크로젠사에 의뢰하여 제작하였다.
[표 3]
[표 4]
<실시예 2> 19종의 식약처 고시종 간 서열 유사도 확인 및 동정을 위한 ANI 기준 설정
상기 <실시예 1>에서 획득한 19종의 식약처 고시종 ITS 구간 서열간의 ANI (평균 서열 유사도, Average Nucleotide Identity)를 확인하기 위해 ANI를 구하는 프로그램 pyani를 활용하였다 (19종 서열 정보가 저장된 폴더 [19종 fastq]를 통해 ANI 결과 폴더 [ANI 결과]를 생성하는 명령어 : average_nucleotide_identity.py -i [19종 fasta] -o [ANI 결과] -m ANIb -g). 이 때, 프라이머 영역 다음에 위치한 ITS 서열의 160bp 영역에 대해서 종 간의 균주 (strain) 별 ANI 중 최대값을 구하여 종 판별을 위한 ANI 기준을 설정하였다. 구체적으로 종 간의 ANI 최대값은 하기 [표 5]와 같다.
[표 5]
상기 분석 결과에서 -는 어떠한 종과의 계산결과에도 ANI 값이 0%인 것을 의미하며, 그 외에는 타 종과의 ANI 최대값일 때 ANI 출력값과 이에 해당되는 종 명을 기재하였다.
그 결과, 표 5에 나타낸 바와 같이, 락티카제이바실러스 (Lacticaseibacillus) 속에 해당하는 락티카제이바실러스 카제이(Lacticaseibacillus casei), 락티카제이바실러스 파라카제이(Lacticaseibacillus paracasei) 및 락티카제이바실러스 람노서스(Lacticaseibacillus rhamnosus)의 일부 균주에서 ITS 구간 서열의 ANI가 99%이상 임을 확인하였고, 그 외 나머지 종에 대해서는 모두 97% 미만의 ANI를 확인하였다.
상기 결과를 토대로, 식약처 고시 프로바이오틱스 19종에 대한 판별을 통해 락티카제이바실러스 속과 나머지 17종으로 수행할 수 있음을 확인하였다. 구체적으로는 종 판별을 위해 CLC Genomics Workbench (Qiagen)의 CLC Microbial Genomics Module의 절차에 따르며, 판별을 위한 참조 서열은 상기 <실시예 1>에서 획득한 ITS 구간 서열을 사용하였다. 판별을 위한 ANI 는 98% 이상으로 설정하였으며, 락티카제이바실러스 카제이, 락티카제이바실러스 파라카제이 혹은 락티카제이바실러스 람노서스로 판별되는 서열에 한해서는 락티카제이바실러스 속으로 판별하도록 하였고, 나머지 17종의 프로바이오틱스 종에 대해서는 각각의 단일 종으로 판별하도록 하였다.
<실시예 3> 19종의 식약처 고시종과 NCBI 등재된 전체 균종의 전장유전체간의 상동성 검사
상기 <실시예 1>에서 획득한 19종의 식약처 고시종 ITS 구간 서열과 상기 <실시예 2>의 균종간 서열 유사도 확인 방법을 통해 19종의 식약처 고시종과 NCBI 등재된 전체 균종의 전장유전체의 상동성을 검사하였다.
구체적으로, 미국 국립생물정보센터(NCBI)의 GenBank 데이터베이스에서 필터조건 "Search all[filter] AND bacteria[filter] AND latest[filter] AND "complete genome"[filter] AND all[filter] NOT anomalous[filter]"으로 검색하여 총 24,487개 균종에 대한 전장유전체를 획득하였다. 그 다음, [표 3]의 프라이머 세트를 활용한 in silico PCR을 통해, [표 3]의 프라이머 세트로부터 얻을 수 있는 모든 균종의 서열을 획득하였다. 그 후, 19종의 식약처 고시종과 타 종과의 ITS 서열 비교를 통해 상동성이 있는 균종을 확인한 결과를 [표 6]에 나타내었다. 여기서 상동성이 있다고 판단하는 기준은 서열 간 ANI 값이 98% 이상인 경우로 하였다.
[표 6]
그 결과, 표 6에 나타낸 바와 같이, NCBI에 등재된 전체 균종 중 9종에 대해서만 19종의 식약처 고시종과의 상동성을 확인하였다.
<실시예 4> 혼합 균주 현탁액으로부터 균종 판별
본 발명의 방법을 이용하여 혼합 균주 현탁액으로부터 19종의 식약처 고시종, 2종의 식품 첨가종 및 4종의 병원성 박테리아 종을 판별할 수 있는지 확인하였다.
구체적으로, 하기 [표 7]과 같이 국립농업과학원 및 한국 미생물 보존센터로부터 19종의 식약처 고시종의 표준 균주를 분양받았고, HY와 사빈사로부터 2종의 식품 첨가종 원말을 제공 받아 분리하였으며, ATCC로부터 4종의 병원성 박테리아 종을 분양받았다. 그 후, 상기 <실시예 1>의 fusion 프라이머 세트를 이용하여 혼합 균주 현탁액으로부터 상기 균주의 판별을 수행하였다.
[표 7]
각 균주들은 분양처에서 제시한 방법에 따라 배양 후 분주 평판법을 통해 생균수를 측정하였고, PBS로 적절히 희석 (105-108 CFU/mL) 한 후 다른 균주들과 적절한 비율로 혼합 (0.01-10%) 하여 검사체로 사용하였다.
그 다음, Omega pathogen kit(Omega, #51604)를 이용하여 제조사의 절차에 따라 DNA를 추출하고, HiAccuBead(AccuGene, #ACNO1.50)를 이용하여 제조사의 절차에 따라 추출한 DNA를 정제하였다.
추출한 검체 DNA를 상기 <실시예 1>의 fusion 프라이머 세트를 이용하여 Amplicon PCR을 다음과 같이 수행하였다. 추출한 검체 DNA에 10 mM Tris pH 8.5를 넣어, DNA 농도를 12 ng/μL로 희석하고, 하기 [표 8]과 같이 상기 <실시예 1>에서 제작한 fusion 프라이머를 이용하여 PCR 반응액을 조제한 후, 하기 [표 9]의 조건으로 PCR을 수행하였다. 그 다음, HiAccuBead를 이용하여 제조사의 절차에 따라 PCR이 끝난 검체에 대한 정제를 수행하였다.
[표 8]
[표 9]
상기 Amplicon PCR로 획득한 검체를 이용하여 Index PCR을 다음과 같이 수행하였다. 하기 [표 10]과 같이 Nextera XT Index Kit v2 (Illumina, #20528300)를 이용하여 제조사의 절차에 따라 PCR 반응액을 조제하고, 하기 [표 11]의 조건으로 PCR을 수행하였다. 그 다음, HiAccuBead를 이용하여 제조사의 절차에 따라 PCR이 끝난 검체에 대한 정제를 수행하였다.
[표 10]
[표 11]
상기 Index PCR로 획득한 DNA 라이브러리의 시퀀싱(sequencing)을 다음과 같이 수행하였다. 상기 Index PCR로 획득한 DNA 라이브러리의 농도를 100 nM로 희석한 후, phiX Control v3 (Illumina, RGT25975053) 100 nM 과 7:3 비율로 혼합하였다. iSeq100 장비의 시스템 가이드에 따라 DNA 라이브러리를 로딩하여 300 bp single read로 시퀀싱을 진행하여 fastq 파일을 획득하였다. 그 다음, 획득한 fastq 파일을 이용하여 CLC Genomics Workbench (Qiagen)의 CLC Microbial Genomics Module의 절차에 따라 OTU (Operational Taxonomic Unit) 분포 분석을 수행하여 [표 1]의 19종의 식약처 고시종, 2종의 식품 첨가종 및 4종의 병원성 박테리아 종을 확인하였다. 구체적으로, 2반복 시험을 통해 하기 [표 12]와 같이 생균 수에 따른 검출능을 확인하였고, 하기 [표 13]과 같이 검사체 내 포함된 각 종의 비율에 따른 검출능을 확인하였다.
[표 12]
[표 13]
상기 균종 동정법 판정 결과에서 - 는 검사체 내에 해당 종을 투입하였으나 종 판별 방법을 통해 균 검출을 하지 못하였음을 의미하고, + 는 균 검출에 성공하였음을 의미한다.
그 결과, 표 12 및 표 13에 나타낸 바와 같이, 혼합 균주 현탁액으로부터 19종의 식약처 고시종, 2종의 식품 첨가종 및 4종의 병원성 박테리아 종을 모두 판별하기 위한 검출 한계는 생균 수 105 CFU/mL 이상, 검사체 내 포함 비율은 0.1%임을 확인하였다.
<실시예 5> 부원료가 포함된 혼합 균주 현탁액에서 균종 판별
상기 <실시예 1>의 fusion 프라이머 세트와 상기 <실시예 3>의 균종 판별 방법을 통해 부원료가 포함된 혼합 균주 현탁액에서 균종 판별을 할 수 있는지 확인하였다.
구체적으로, 상기 [표 7]의 19종의 식약처 고시종, 2종의 식품 첨가종 및 4종의 병원성 박테리아 종을 분양처에서 제시한 방법에 따라 배양 후 분주 평판법을 통해 생균수를 측정하였고, PBS로 희석하여 5×106 CFU/mL로 제작 및 혼합하여 동일 CFU로 섞인 25종의 균종 혼합액을 제작하였다. 제작된 혼합액에 난소화성말토덱스트린 2 g을 투입하여 부원료가 포함된 혼합 균주 현탁액을 제작하였다. 그 다음, 상기 <실시예 3>에서와 동일한 방법으로 25종의 균종을 확인하였다.
그 결과, 부원료의 포함 여부와 관계 없이 시험체에 혼합한 19종의 식약처 고시종, 2종의 식품 첨가종 및 4종의 병원성 박테리아 종 모두 판별에 성공하여, 해당 방법은 부원료가 포함된 시험체에서도 가능함을 확인하였다.
<실시예 6> 균종 판별용 프라이머 세트를 이용한 프로바이오틱스 제품 내 균종 판별
상기 <실시예 1>의 fusion 프라이머 세트와 상기 <실시예 3>의 균종 판별 방법을 통해 국내 및 해외에서 시판되는 프로바이오틱스 함유 제품으로부터 19종의 식약처 고시종, 2종의 식품 첨가종 및 4종의 병원성 박테리아 종을 판별할 수 있는지 확인하였다. 5종의 프로바이오틱스 제품에 대해 균종 판별 방법을 2반복으로 수행한 결과를 [표 14]에 나타내었다.
[표 14]
상기 균종 동정법 판정 결과에서 - 는 제품에 성분표기가 되어 있지 않고 균종 판별 결과 검출 되지 않았음을 의미하고, + 는 제품에 성분표기가 되어 있으며 균종 판별 결과 검출 되었음을 의미한다.
그 결과, 표 14에 나타낸 바와 같이, 제품에 표기된 프로바이오틱스 성분과 일치함을 확인하였다.
상기 결과를 통해 본 발명의 프라이머 세트 및 이를 이용한 균종 판별 방법으로 제품에 표기된 프로바이오틱스 성분을 모두 판별해 낼 수 있으며, 이에 국내 및 해외에서 시판되는 프로바이오틱스 함유 제품 내 균종 판별을 저비용으로 신속하게 수행할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따른 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별을 위한 프라이머 세트를 이용하여 21종의 프로바이오틱스 종 및 4종의 병원성 박테리아 종을 높은 해상도 및 정확도로 판별할 수 있음을 확인하였으므로, 상기 프라이머 세트는 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별을 위해 유용하게 이용될 수 있다.
Claims (9)
- 서열번호 1 내지 9로 표시되는 프라이머를 포함하는 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별용 프라이머 세트.
- 제 1항에 있어서, 상기 프라이머는 5' 말단에 어댑터(adaptor) 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별용 프라이머 세트.
- 제 2항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 10 내지 18로 표시되는 것을 특징으로 하는, 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별용 프라이머 세트.
- 제 1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 균종의 ITS(internal transcribed spacer) 영역을 타겟으로 하는 것을 특징으로 하는, 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별용 프라이머 세트.
- 제 1항에 있어서, 상기 균종은 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbruecki ssp. Bulgaricus), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락티카제이바실러스 카제이 (Lacticaseibacillus casei), 락티카제이바실러스 파라카제이 (Lacticaseibacillus paracasei), 락티카제이바실러스 람노서스(Lacticaseibacillus rhamnosus), 리모시락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum), 리모시락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri), 락티플란티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum), 리기락토바실러스 살리바리우스(Ligilactobacillus salivarius), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 아니말리스 락티스(Bifidobacterium animalis ssp. lactis), 라티락토바실러스 커바투스(Latilactobacillus curvatus), 바실러스 코아귤런스(Bacillus coagulans), 대장균(Escherichia coli), 살모넬라(Salmonella spp.), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)인 것을 특징으로 하는, 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별용 프라이머 세트.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별용 조성물.
- 1) 프로바이오틱스 조성물로부터 DNA를 분리하는 단계;2) 상기 단계 1)에서 분리한 DNA를 주형으로 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및3) 상기 단계 2)의 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별 방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 단계 2)의 증폭 산물을 주형으로 인덱스 PCR(index PCR)을 수행하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별 방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 PCR 증폭 산물의 검출은 시퀀싱을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는, 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별 방법.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202380012251.9A CN117500944A (zh) | 2022-05-31 | 2023-05-08 | 用于鉴定益生菌组合物中的菌种的引物组以及利用其的菌种的鉴定方法 |
| EP23816241.6A EP4343005A1 (en) | 2022-05-31 | 2023-05-08 | Primer set for identifying bacterial species in probiotics composition and method for identifying bacterial species using same |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2022-0067077 | 2022-05-31 | ||
| KR20220067077 | 2022-05-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2023234577A1 true WO2023234577A1 (ko) | 2023-12-07 |
Family
ID=89025247
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/KR2023/006187 WO2023234577A1 (ko) | 2022-05-31 | 2023-05-08 | 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 균종 판별 방법 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4343005A1 (ko) |
| KR (1) | KR20230167285A (ko) |
| CN (1) | CN117500944A (ko) |
| WO (1) | WO2023234577A1 (ko) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11123093A (ja) * | 1997-08-14 | 1999-05-11 | Yakult Honsha Co Ltd | ビフィドバクテリウム属細菌用プライマー |
| KR20040077544A (ko) * | 2003-02-28 | 2004-09-04 | 일동제약주식회사 | 락토바실러스 속 균종의 동정방법 |
| KR101695059B1 (ko) * | 2014-04-07 | 2017-01-23 | 건국대학교 산학협력단 | 케피어 발효유 내 미생물 그룹별 정량적인 실시간 중합효소 연쇄반응 분석용 조성물 및 그 분석방법 |
| KR20200027900A (ko) | 2018-09-05 | 2020-03-13 | 주식회사 천랩 | 시료 미생물의 동정 및 분류 방법 |
| KR20200029689A (ko) | 2018-09-10 | 2020-03-19 | 주식회사 조앤김지노믹스 | 유산균 동정용 참조서열 제조방법 및 이를 이용한 유산균 동정방법 |
| KR102334331B1 (ko) * | 2020-07-01 | 2021-12-02 | 경희대학교 산학협력단 | 비피도박테리움 균주 검출용 실시간 pcr 프라이머 및 이의 용도 |
| KR20220010100A (ko) * | 2020-07-17 | 2022-01-25 | 경북대학교 산학협력단 | 프로바이오틱스 미생물을 종 수준에서 판별하기 위한 조성물 |
-
2022
- 2022-09-14 KR KR1020220115369A patent/KR20230167285A/ko unknown
-
2023
- 2023-05-08 EP EP23816241.6A patent/EP4343005A1/en active Pending
- 2023-05-08 WO PCT/KR2023/006187 patent/WO2023234577A1/ko active Application Filing
- 2023-05-08 CN CN202380012251.9A patent/CN117500944A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11123093A (ja) * | 1997-08-14 | 1999-05-11 | Yakult Honsha Co Ltd | ビフィドバクテリウム属細菌用プライマー |
| KR20040077544A (ko) * | 2003-02-28 | 2004-09-04 | 일동제약주식회사 | 락토바실러스 속 균종의 동정방법 |
| KR101695059B1 (ko) * | 2014-04-07 | 2017-01-23 | 건국대학교 산학협력단 | 케피어 발효유 내 미생물 그룹별 정량적인 실시간 중합효소 연쇄반응 분석용 조성물 및 그 분석방법 |
| KR20200027900A (ko) | 2018-09-05 | 2020-03-13 | 주식회사 천랩 | 시료 미생물의 동정 및 분류 방법 |
| KR20200029689A (ko) | 2018-09-10 | 2020-03-19 | 주식회사 조앤김지노믹스 | 유산균 동정용 참조서열 제조방법 및 이를 이용한 유산균 동정방법 |
| KR102334331B1 (ko) * | 2020-07-01 | 2021-12-02 | 경희대학교 산학협력단 | 비피도박테리움 균주 검출용 실시간 pcr 프라이머 및 이의 용도 |
| KR20220010100A (ko) * | 2020-07-17 | 2022-01-25 | 경북대학교 산학협력단 | 프로바이오틱스 미생물을 종 수준에서 판별하기 위한 조성물 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| LEE JOO-HOON: "Study on probiotic genetic characteristics and safety confirmation method", November 2011, MINISTRY OF FOOD AND DRUG SAFETY |
| MASSIMILIANO ET AL., APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 70, 2004, pages 6147 - 6156 |
| SEONG YOUNG-JEPARK MYUNG-SOO: "Current status of domestic and international probiotic product development", FOOD SCIENCE AND INDUSTRY, vol. 52, no. 3, pages 229 - 240 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117500944A (zh) | 2024-02-02 |
| EP4343005A1 (en) | 2024-03-27 |
| KR20230167285A (ko) | 2023-12-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Klijn et al. | Identification of mesophilic lactic acid bacteria by using polymerase chain reaction-amplified variable regions of 16S rRNA and specific DNA probes | |
| Ventura et al. | Specific identification and targeted characterization of Bifidobacterium lactis from different environmental isolates by a combined multiplex-PCR approach | |
| Jackson et al. | Comparison of two selective media for the detection and enumeration of Lactobacilli in human faeces | |
| Chen et al. | Development of species-specific primers for detection of Streptococcus mutans in mixed bacterial samples | |
| Skånseng et al. | Comparison of chicken gut colonisation by the pathogens Campylobacter jejuni and Clostridium perfringens by real-time quantitative PCR | |
| Ehrmann et al. | Reverse dot blot hybridization: a useful method for the direct identification of lactic acid bacteria in fermented food | |
| Kolak et al. | Molecular typing of the bacterial flora in sputum of cystic fibrosis patients | |
| Delgado et al. | Identification of dominant bacteria in feces and colonic mucosa from healthy Spanish adults by culturing and by 16S rDNA sequence analysis | |
| Vitali et al. | Quantitative detection of probiotic Bifidobacterium strains in bacterial mixtures by using real-time PCR | |
| US7601822B2 (en) | Molecular identification of bacteria of genus Streptococcus and related genera | |
| WO2023234577A1 (ko) | 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 균종 판별 방법 | |
| CN116814822A (zh) | 一种长双歧杆菌婴儿亚种cicc 6069菌株的鉴定方法和应用 | |
| Toshimitsu et al. | Strain-specific identification of Bifidobacterium bifidum OLB6378 by PCR | |
| WO2016098953A1 (ko) | Streptococcus iniae의 병원성 판별용 유전자 마커 및 펩티드핵산을 이용한 병원성 결정 마커 검사키트 | |
| KR101050391B1 (ko) | 폐렴구균 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 폐렴구균의 검출방법 | |
| WO2013100810A2 (ru) | МЕТОД ВИДОВОЙ И ШТАММОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛАКТОБАЦИЛЛ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНОВ СИСТЕМ ТОКСИН-АНТИТОКСИН II ТИПА СУПЕРСЕМЕЙСТВ ReIBE и MazEF | |
| Berthoud et al. | Comparison of partial gene sequences encoding a phosphoketolase for the identification of bifidobacteria | |
| WO2015037769A1 (ko) | 패혈증 진단용 조성물 및 그 방법 및 키트 | |
| US6037122A (en) | Nucleotide fragment of the 16S ribosomal RNA of corynebacteria, derived probes and primers, reagent and method of detection | |
| Scornec et al. | Rapid 96-well plates DNA extraction and sequencing procedures to identify genome-wide transposon insertion sites in a difficult to lyse bacterium: Lactobacillus casei | |
| Kaneko et al. | Digoxigenin-labeled deoxyribonucleic acid probes for the enumeration of bifidobacteria in fecal samples | |
| Tsai et al. | Use of specific primers based on the 16S–23S internal transcribed spacer (ITS) region for the screening Bifidobacterium adolescentis in yogurt products and human stool samples | |
| Sidarenka et al. | Application of molecular methods to classification and identification of bacteria of the genus Bifidobacterium | |
| KR101151728B1 (ko) | 스트렙토코커스 오라리스 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 스트렙토코커스 오라리스의 검출방법 | |
| KR101108967B1 (ko) | 스트렙토코커스 미티스 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 스트렙토코커스 미티스의 검출방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2023574612 Country of ref document: JP Kind code of ref document: A |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 202380012251.9 Country of ref document: CN |
|
| WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 2023816241 Country of ref document: EP |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2023816241 Country of ref document: EP Effective date: 20231220 |
|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 23816241 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |