KR20220010100A - 프로바이오틱스 미생물을 종 수준에서 판별하기 위한 조성물 - Google Patents
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Abstract
식품의약품안전처로부터 기능성을 인정받은 19 종류의 프로바이오틱스 균주를 종 수준(species level)에서 식별하기 위한 조성물이 개시된다.
Description
본 발명은 한국 식품의약품안전처로부터 기능성을 인정받은 19 종류의 프로바이오틱스 균주를 종 수준(species level)에서 식별하기 위한 조성물에 관한 것이다.
프로바이오틱스(probiotics)란 우리말로 유익균을 뜻하며, 적당량을 섭취했을 때 인체에 이로움을 주는 살아있는 모든 균으로 총칭한다.
미생물은 인체의 피부, 구강, 치아, 생식기, 호흡기, 위장관 등 여러 부위에 존재하나, 이중 가장 풍부하고 다양한 종류의 미생물을 보유하고 있는 곳은 위장관(gastrointestinal tract)이다. 위장관에는 500-1000 개의 서로 다른 종으로 구성된 미생물이 군집을 이루어 상호작용을 하는 생태계(ecosystem)을 형성하고 있다. 위장관 내에 존재하는 미생물의 무게는 대략 2 kg에 이르는 것으로 알려져 있으며, 약 80%의 세균이 장 내에 서식한다. 건강한 사람인 경우 그람 음성균인 프로테오박테리아, 박테로이데테스 문과 그람 양성균인 퍼미큐테스가 대부분을 차지하며 적절한 비율을 이루고 있다(symbiosis). 그리고 스트레스나 항생제와 같은 장내 환경적 요인이 변하여 장내 미생물 군집상태가 변하는 것을 군집붕괴(dysbiosis)라 한다.
장내에서 군집붕괴가 일어나 유해균이 증가하면 비만, 당뇨병 등의 대사증후군을 발생시킬 수 있다. 하지만 유해균이 아닌 유익균이 증가하면 인체의 건강과 면역기능에 도움을 줄 수 있다. 나이가 들면서 유익균은 감소하고 유해균은 증가한다. 이러한 정상적인 노화 과정에서 장내 균을 건강한 상태로 유지하도록 돕는 것이 프로바이오틱스의 기능이다. 프로바이오틱스의 장기간의 섭취는 사람이 건강한 상태를 유지하는데 도움을 줄 수 있고, 그 외에도 유아, 과민성 대장 증후군, 염증성 장질환 등 다양한 질병의 개선에도 도움을 줄 수 있다. 프로바이오틱스는 유당 불내증을 개선하고 결장암을 예방하여 콜레스테롤 및 혈압을 낮춰준다. 뿐만 아니라, 면역기능 개선, 감염예방, 스트레스로 인한 유해균의 성장 방지, 과민성대장증후군과 결장염 개선 등의 역할을 한다. 또한, 프로바이오틱스의 섭취는 면역시스템을 강하게 하며, 캔디다증과 관련된 장의 치료와 항생제로서 권고되었다. 프로바이오틱스는 항생제 사용, 과잉의 알코올, 스트레스, 질병, 그리고 독성물질에 노출 등의 상황에 우리 몸이 균형을 유지할 수 있도록 하는 역할을 한다.
2020.05.14일 기준으로 식품의약품안전처로부터 기능성을 인정받아 고시된 프로바이오틱스 균주 19종(이하 19종 균주라 지칭할 수 있다)은 Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus delbrueckii ssp Bulgaricus, Lactococcus lactis, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcus thermophiles, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis ssp. Lactis 이다.
상기 19종의 균주는 속명(Genus) 및 종명(Species)이 결합하여 명명되어 있다. 동일한 종에는 여러 계통(Strain) 또는 혈청형이 포함될 수 있다.
지금까지 프로바이오틱스 제품의 유산균 유무를 확인 및 종 단계의 검출은 Next generation sequencing (NGS) 기법을 이용한다. NGS 기법은 특정한 환경의 모든 미생물을 검출할 수 있지만 최소한 일주일이라는 시간과 많은 실험비용이 소요된다. PCR 검출에 사용되는 16s rRNA gene 기반 프라이머가 개발되어 있으나, 전장유전체를 이용해 종 수준에서 정확하게 판별할 수 있는 프라이머는 아직 개발 되지 않았다.
일 구체예에 따르면, 대한민국 식품의약품안전처에서 식품용으로 안전성이 있다고 인정한 19종 유산균을 종 수준에서 판별하기 위한 프라이머쌍을 제공한다.
일 양상은 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는, 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 검출용 프라이머쌍을 제공한다. 상기 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 검출용 프라이머쌍은 세부적인 계통(Strain)을 달리하는 미생물에 대해서 엔테로코커스 패칼리스에 속하는지 여부를 판별할 수 있다.
다른 양상은 서열번호 3의 염기서열 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus Helveticus) 검출용 프라이머쌍을 제공한다. 상기 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus Helveticus) 검출용 프라이머쌍은 세부적인 계통(Strain)을 달리하는 미생물에 대해서 락토바실러스 헬베티커스에 속하는지 여부를 판별할 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 5의 염기서열 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 검출용 프라이머쌍을 제공한다. 상기 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 검출용 프라이머쌍은 세부적인 계통(Strain)을 달리하는 미생물에 대해서 락토바실러스 가세리에 속하는지 여부를 판별할 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 7의 염기서열 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 검출용 프라이머쌍을 제공한다. 상기 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 검출용 프라이머쌍은 세부적인 계통(Strain)을 달리하는 미생물에 대해서 락토바실러스 람노서스에 속하는지 여부를 판별할 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 9의 염기서열 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어지는, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 검출용 프라이머쌍을 제공한다. 상기 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 검출용 프라이머쌍은 세부적인 계통(Strain)을 달리하는 미생물에 대해서 락토바실러스 애시도필러스에 속하는지 여부를 판별할 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어지는, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 검출용 프라이머쌍을 제공한다. 상기 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 검출용 프라이머쌍은 세부적인 계통(Strain)을 달리하는 미생물에 대해서 락토바실러스 카제이에 속하는지 여부를 판별할 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 13의 염기서열 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어지는, 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 검출용 프라이머쌍을 제공한다. 상기 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 검출용 프라이머쌍은 세부적인 계통(Strain)을 달리하는 미생물에 대해서 락토바실러스 퍼멘텀에 속하는지 여부를 판별할 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 15의 염기서열 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어지는, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 검출용 프라이머쌍을 제공한다. 상기 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 검출용 프라이머쌍은 세부적인 계통(Strain)을 달리하는 미생물에 대해서 락토바실러스 파라카제이에 속하는지 여부를 판별할 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 17의 염기서열 및 서열번호 18의 염기서열로 이루어지는, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 검출용 프라이머쌍을 제공한다. 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 검출용 프라이머쌍은 세부적인 계통(Strain)을 달리하는 미생물에 대해서 락토바실러스 플란타룸에 속하는지 여부를 판별할 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 19의 염기서열 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어지는, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 검출용 프라이머쌍을 제공한다. 상기 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 검출용 프라이머쌍은 세부적인 계통(Strain)을 달리하는 미생물에 대해서 스트렙토코커스 써모필러스에 속하는지 여부를 판별할 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 21의 염기서열 및 서열번호 22의 염기서열로 이루어지는, 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidium) 검출용 프라이머쌍을 제공한다. 상기 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidium) 검출용 프라이머쌍은 세부적인 계통(Strain)을 달리하는 미생물에 대해서 비피도박테리움 비피덤에 속하는지 여부를 판별할 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 23의 염기서열 및 서열번호 24의 염기서열로 이루어지는, 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) 검출용 프라이머쌍을 제공한다. 상기 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) 검출용 프라이머쌍은 세부적인 계통(Strain)을 달리하는 미생물에 대해서 비피도박테리움 브레브에 속하는지 여부를 판별할 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 25의 염기서열 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어지는, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 검출용 프라이머쌍을 제공한다. 상기 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 검출용 프라이머쌍은 세부적인 계통(Strain)을 달리하는 미생물에 대해서 비피도박테리움 롱검에 속하는지 여부를 판별할 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 27의 염기서열 및 서열번호 28의 염기서열로 이루어지는, 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 검출용 프라이머쌍을 제공한다. 상기 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 검출용 프라이머쌍은 세부적인 계통(Strain)을 달리하는 미생물에 대해서 락토바실러스 루테리에 속하는지 여부를 판별할 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 29의 염기서열 및 서열번호 30의 염기서열로 이루어지는, 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) 검출용 프라이머쌍을 제공한다. 상기 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) 검출용 프라이머쌍은 세부적인 계통(Strain)을 달리하는 미생물에 대해서 락토바실러스 살리바리우스에 속하는지 여부를 판별할 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 31의 염기서열 및 서열번호 32의 염기서열로 이루어지는, 비피도박테리움 애니멀리스 ssp. 락티스(Bifidobacterium animalis ssp. lactis) 검출용 프라이머쌍을 제공한다. 상기 비피도박테리움 애니멀리스 ssp. 락티스는 비피도박테리움 락티스일 수 있다. 상기 비피도박테리움 애니멀리스 ssp. 락티스 검출용 프라이머쌍은 세부적인 계통(Strain)을 달리하는 미생물에 대해서 비피도박테리움 애니멀리스 ssp. 락티스에 속하는지 여부를 판별할 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 33의 염기서열 및 서열번호 34의 염기서열로 이루어지는, 엔테로코커스 파시움(Enterococcus faecium) 검출용 프라이머쌍을 제공한다. 상기 엔테로코커스 파시움(Enterococcus faecium) 검출용 프라이머쌍은 세부적인 계통(Strain)을 달리하는 미생물에 대해서 엔테로코커스 파시움에 속하는지 여부를 판별할 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 35의 염기서열 및 서열번호 36의 염기서열로 이루어지는, 락토바실러스 델브루키 ssp. 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus) 검출용 프라이머쌍을 제공한다. 상기 락토바실러스 델브루키 ssp. 불가리쿠스는 락토바실러스 불가리쿠스일 수 있다. 상기 락토바실러스 델브루키 ssp. 불가리쿠스 검출용 프라이머쌍은 세부적인 계통(Strain)을 달리하는 미생물에 대해서 락토바실러스 델브루키 ssp. 불가리쿠스에 속하는지 여부를 판별할 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 37의 염기서열 및 서열번호 38의 염기서열로 이루어지는, 락토바실러스 락티스(Lactococcus lactis) 검출용 프라이머쌍을 제공한다. 상기 락토바실러스 락티스(Lactococcus lactis) 검출용 프라이머쌍은 세부적인 계통(Strain)을 달리하는 미생물에 대해서 락토바실러스 락티스에 속하는지 여부를 판별할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 19 종류의 검출용 프라이머쌍로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머쌍을 포함하는, 유산균 검출용 프라이머세트를 제공한다. 구체적으로, 상기 유산균 검출용 프라이머세트는 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 3의 염기서열 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 5의 염기서열 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 7의 염기서열 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 9의 염기서열 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 11의 염기서열 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 13의 염기서열 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 15의 염기서열 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 17의 염기서열 및 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 19의 염기서열 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 21의 염기서열 및 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 23의 염기서열 및 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 25의 염기서열 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 27의 염기서열 및 서열번호 28의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 29의 염기서열 및 서열번호 30의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 31의 염기서열 및 서열번호 32의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 33의 염기서열 및 서열번호 34의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 35의 염기서열 및 서열번호 36의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 및 서열번호 37의 염기서열 및 서열번호 38의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머쌍을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 프라이머쌍을 이용하면, 판별하고자 하는 유산균이 어느 종에 속하는지를 정확히 판별할 수 있다.
일 구체예에 따른 프라이머쌍을 이용하면 판별하고자 하는 유산균의 세부적인 아종 또는 계통이 다르더라도 해당 유산균이 속하는 종을 정확히 판별할 수 있다.
도 1의 A 내지 J는 각각의 프라이머가 목표로 하는 종의 미생물에 대해서만 특이적으로 검출할 수 있음을 확인한 결과이다. 구체적으로, Enterococcus faecalis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus rhamonosus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum, Streptococcus thermophilus의 DNA가 혼합된 시료에 대해서 본 발명의 프라이머쌍 중 10종류를 이용하여 종단위 특이적으로 증폭가능한지 확인하였다.
A 내지 J는 각각에 해당하는 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 실시하고 밴드가 특이적으로 증폭되는지 확인한 것이다. A는 Entv2 프라이머쌍을 이용한 것으로 증폭산물이 280bp이고, B는 Helv2 프라이머쌍을 이용한 것이고, C는 Rhav2 프라이머쌍을 이용한 것으로 증폭산물은 377bp이고, D는 Gav2 프라이머쌍을 이용한 것으로 증폭산물은 348bp이고, E는 Aciv2 프라이머쌍을 이용한 것으로 증폭산물은 395bp이고, F는 Casv2 프라이머쌍을 이용한 것이고, G는 Ferv2 프라이머쌍을 이용한 것으로 증폭산물은 280bp이고, H는 Parav2 프라이머쌍을 이용한 것으로 증폭산물은 400bp이고, I는 Planv2 프라이머쌍을 이용한 것으로 증폭산물은 399bp이고, J는 Therv2 프라이머쌍을 이용한 것으로 증폭산물은 314bp이다.
도 2는 프로바이오틱스 제품 A에 대해 도 1과 동일한 10 종류의 프라이머쌍으로 증폭한 결과를 나타낸 것이다. A는 PCR 증폭결과, B는 제품에 표기된 성분과 PCR 결과를 비교한 표이다.
도 3은 프로바이오틱스 제품 B에 대해 도 1과 동일한 10 종류의 프라이머쌍으로 증폭한 결과를 나타낸 것이다. A는 PCR 증폭결과, B는 제품에 표기된 성분과 PCR 결과를 비교한 표이다.
도 4은 프로바이오틱스 제품 C에 대해 도 1과 동일한 10 종류의 프라이머쌍으로 증폭한 결과를 나타낸 것이다. A는 PCR 증폭결과, B는 제품에 표기된 성분과 PCR 결과를 비교한 표이다.
도 5은 프로바이오틱스 제품 D에 대해 도 1과 동일한 10 종류의 프라이머쌍으로 증폭한 결과를 나타낸 것이다. A는 PCR 증폭결과, B는 제품에 표기된 성분과 PCR 결과를 비교한 표이다.
A 내지 J는 각각에 해당하는 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 실시하고 밴드가 특이적으로 증폭되는지 확인한 것이다. A는 Entv2 프라이머쌍을 이용한 것으로 증폭산물이 280bp이고, B는 Helv2 프라이머쌍을 이용한 것이고, C는 Rhav2 프라이머쌍을 이용한 것으로 증폭산물은 377bp이고, D는 Gav2 프라이머쌍을 이용한 것으로 증폭산물은 348bp이고, E는 Aciv2 프라이머쌍을 이용한 것으로 증폭산물은 395bp이고, F는 Casv2 프라이머쌍을 이용한 것이고, G는 Ferv2 프라이머쌍을 이용한 것으로 증폭산물은 280bp이고, H는 Parav2 프라이머쌍을 이용한 것으로 증폭산물은 400bp이고, I는 Planv2 프라이머쌍을 이용한 것으로 증폭산물은 399bp이고, J는 Therv2 프라이머쌍을 이용한 것으로 증폭산물은 314bp이다.
도 2는 프로바이오틱스 제품 A에 대해 도 1과 동일한 10 종류의 프라이머쌍으로 증폭한 결과를 나타낸 것이다. A는 PCR 증폭결과, B는 제품에 표기된 성분과 PCR 결과를 비교한 표이다.
도 3은 프로바이오틱스 제품 B에 대해 도 1과 동일한 10 종류의 프라이머쌍으로 증폭한 결과를 나타낸 것이다. A는 PCR 증폭결과, B는 제품에 표기된 성분과 PCR 결과를 비교한 표이다.
도 4은 프로바이오틱스 제품 C에 대해 도 1과 동일한 10 종류의 프라이머쌍으로 증폭한 결과를 나타낸 것이다. A는 PCR 증폭결과, B는 제품에 표기된 성분과 PCR 결과를 비교한 표이다.
도 5은 프로바이오틱스 제품 D에 대해 도 1과 동일한 10 종류의 프라이머쌍으로 증폭한 결과를 나타낸 것이다. A는 PCR 증폭결과, B는 제품에 표기된 성분과 PCR 결과를 비교한 표이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 각 종(Species)에 특이적으로 결합하는 프라이머 제작
본 발명에서 각 종(Species)에 특이적으로 결합하는 프라이머를 제작하기 위해 NCBI에 업로드 되어 있는 19종 균주 각각의 종에 속하는 계통(Strain)들의 전장유전체(Whole genome sequence)들을 다운로드 하였다.
| 번호 | 종명 | NCBI에서 다운받은 계통들의 전장유전체수 |
| 1 | Enterococcus faecalis | 50 |
| 2 | Lactobacillus helveticus | 15 |
| 3 | Lactobacillus gasseri | 4 |
| 4 | Lactobacillus rhamnosus | 19 |
| 5 | Lactobacillus acidophilus | 7 |
| 6 | Lacticaseibacillus casei(Lactobacillus casei) | 6 |
| 7 | Limosillactobacillus fermentum(Lactobacillus fermentum) | 19 |
| 8 | Lacticaseibacillus paracasei (Lactobacillus paracasei) | 36 |
| 9 | Lactiplantibacillus plantarum (Lactobacillus plantarum) | 107 |
| 10 | Streptococcus thermophilus | 34 |
| 11 | Bifidobacterium bifidium | 9 |
| 12 | Bifidobacterium breve | 44 |
| 13 | Bifidobacterium longum | 31 |
| 14 | Limosillactobacillus reuteri (Lactobacillus reuteri) | 9 |
| 15 | Ligilactobacillus salivarius (Lactobacillus salivarius) | 9 |
| 16 | Bifidobacterium animalis ssp. Lactis | 15 |
| 17 | Enterococcus faecium | 139 |
| 18 | Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus | 10 |
| 19 | Lactococcus lactis | 4 |
같은 종에 속하는 계통들의 전장유전체를 400 bp 단위로 자른 후, 각각의 영역을 비교하였다. 또한, NCBI Blast nucleotide를 이용하여 각각의 영역이 해당되는 종을 제외한 다른 종의 미생물에는 존재하지 않는 영역임을 확인하였다.
실시예 2: NCBI primer blast를 이용한 프라이머의 미생물 검출정도 예측
제작한 각 프라이머의 검출률을 확인하기 위해 NCBI Primer blast 데이터베이스를 기반으로 한 In silico PCR을 실시하였다.
그 결과 50 종류의 Enterococcus faecalis 검출을 위한 프라이머의 경우 Mismatch가 하나도 없는 것으로 설정하면 100%의 확률로 Enterococcus faecalis 종에 속하는 균주만을 검출할 수 있었다. 그리고 프라이머 염기서열 중 Mismatch를 1개 허용하는 것으로 설정해도 100%의 확률로 Enterococcus faecalis 종에 속하는 균주만을 검출할 수 있는 것으로 확인되었다. 상기 방법으로 도출한 Enterococcus faecalis 검출용 프라이머쌍을 Entv-F 및 Entv-R로 명명하였다.
Lactobacillus Helveticus의 경우, Mismatch가 하나도 없는 것으로 설정하면 100%의 확률로 Lactobacillus Helveticus 종에 속하는 균주만을 검출할 수 있었다. 그리고 프라이머 염기서열 중 Mismatch를 1개까지 허용하는 것으로 설정하더라도 100%의 확률로 Lactobacillus Helveticus 종에 속하는 균주만을 검출할 수 있었다. 이 Lactobacillus Helveticus 검출을 위한 프라이머쌍을 Helv-F 및 Helv-R로 명명하였다.
Lactobacillus gasseri의 경우, Mismatch가 하나도 없는 것으로 설정하면 100%의 확률로 Lactobacillus gasseri 종에 속하는 균주만을 검출할 수 있었다. 그리고 프라이머 염기서열 중 Mismatch를 1개까지 허용하는 것으로 설정하면 75%의 확률로 Lactobacillus gasseri 종에 속하는 균주를 검출할 수 있었다. 이 Lactobacillus gasseri 검출을 위한 프라이머쌍을 Gav-F 및 Gav-R로 명명하였다.
Lactobacillus rhamnosus의 경우, Mismatch가 하나도 없는 것으로 설정하면 100%의 확률로 Lactobacillus rhamnosus종에 속하는 균주만을 검출할 수 있었다. 그리고 프라이머 염기서열 중 Mismatch를 1개까지 허용하는 것으로 설정해도 100%의 확률로 Lactobacillus rhamnosus 종에 속하는 균주를 검출할 수 있다. 이 Lactobacillus rhamnosus 검출을 위한 프라이머쌍을 Rhav-F 및 Rhav-R로 명명하였다.
Lactobacillus acidophilus의 경우, Mismatch가 하나도 없는 것으로 설정하면 100%의 확률로 Lactobacillus acidophilus 종에 속하는 균주만을 검출할 수 있었다. 그리고 프라이머 염기서열 중 Mismatch를 1개까지 허용하는 것으로 설정해도 100%의 확률로 Lactobacillus acidophilus 종에 속하는 균주만을 검출할 수 있다. 이 Lactobacillus acidophilus 검출을 위한 프라이머쌍을 Aciv-F 및 Aciv-R로 명명하였다.
Lacticaseibacillus casei (Lactobacillus casei)의 경우, Mismatch가 하나도 없는 것으로 설정하면 100%의 확률로 Lacticaseibacillus casei (Lactobacillus casei) 종에 속하는 균주만을 검출할 수 있었다. 그리고 프라이머 염기서열 중 Mismatch를 1개까지 허용하는 것으로 설정하면 50% 확률로 Lacticaseibacillus casei 종에 속하는 균주만을 검출할 수 있다. 이 Lacticaseibacillus casei (Lactobacillus casei) 검출을 위한 프라이머쌍을 Casv-F 및 Casv-R로 명명하였다.
Limosillactobacillus fermentum (Lactobacillus fermentum) 의 경우, Mismatch가 하나도 없는 것으로 설정하면 100%의 확률로 Limosillactobacillus fermentum (Lactobacillus fermentum) 종에 속하는 균주만을 검출할 수 있었다. 그리고 프라이머 염기서열 중 Mismatch를 1개까지 허용하는 것으로 설정해도 100% 확률로 Limosillactobacillus fermentum (Lactobacillus fermentum) 종에 속하는 균주만을 검출할 수 있었다. 이 Limosillactobacillus fermentum (Lactobacillus fermentum) 검출을 위한 프라이머쌍을 Ferv-F 및 Ferv-R로 명명하였다.
Lacticaseibacillus paracasei (Lactobacillus paracasei) 의 경우, Mismatch가 하나도 없는 것으로 설정하면 88.8%의 확률로 Lacticaseibacillus paracasei (Lactobacillus paracasei) 종에 속하는 균주를 검출할 수 있었다. 그리고 프라이머 염기서열 중 Mismatch를 1개까지 허용하는 것으로 설정하면 88.8% 확률로 Lacticaseibacillus paracasei (Lactobacillus paracasei) 종에 속하는 균주를 검출할 수 있었다. 이 Lacticaseibacillus paracasei (Lactobacillus paracasei) 검출을 위한 프라이머쌍을 Parav-F 및 Parav-R로 명명하였다.
Lactiplantibacillus plantarum (Lactobacillus plantarum) 의 경우, Mismatch가 하나도 없는 것으로 설정하면 100%의 확률로 Lactiplantibacillus plantarum (Lactobacillus plantarum) 종에 속하는 균주를 검출할 수 있었다. 그리고 프라이머 염기서열 중 Mismatch를 1개까지 허용하는 것으로 설정해도 100%의 확률로 Lactiplantibacillus plantarum (Lactobacillus plantarum) 종에 속하는 균주를 검출할 수 있었다. 이 Lactiplantibacillus plantarum (Lactobacillus plantarum) 검출을 위한 프라이머쌍을 Planv-F 및 Planv-R로 명명하였다.
Streptococcus thermophilus 의 경우, Mismatch가 하나도 없는 것으로 설정하면 100%의 확률로 Streptococcus thermophilus 종에 속하는 균주를 검출할 수 있었다. 그리고 프라이머 염기서열 중 Mismatch를 1개까지 허용되는 것으로 설정하면 99%의 확률로 Streptococcus thermophilus 종에 속하는 균주를 검출할 수 있었다. 이 Streptococcus thermophilus 검출을 위한 프라이머쌍을 Therv-F 및 Therv-R로 명명하였다.
Bifidobacterium bifidium 의 경우, Mismatch가 하나도 없는 것으로 설정하면 100%의 확률로 Bifidobacterium bifidium 종에 속하는 균주를 검출할 수 있었다. 그리고 프라이머 염기서열 중 Mismatch를 1개까지 허용되는 것으로 설정하면 100%의 확률로 Bifidobacterium bifidium 종에 속하는 균주를 검출할 수 있었다. 이 Bifidobacterium bifidium 검출을 위한 프라이머쌍을 Bifiv-F 및 Bifiv-R로 명명하였다.
Bifidobacterium breve 의 경우, Mismatch가 하나도 없는 것으로 설정하면 100%의 확률로 Bifidobacterium breve 종에 속하는 균주를 검출할 수 있었다. 그리고 프라이머 염기서열 중 Mismatch를 1개까지 허용되는 것으로 설정하면 60%의 확률로 Bifidobacterium breve 종에 속하는 균주를 검출할 수 있었다. 이 Bifidobacterium breve 검출을 위한 프라이머쌍을 Brev-F 및 Brev-R로 명명하였다.
Bifidobacterium longum의 경우, Mismatch가 하나도 없는 것으로 설정하면 100%의 확률로 Bifidobacterium longum 종에 속하는 균주를 검출할 수 있었다. 그리고 프라이머 염기서열 중 Mismatch를 1개까지 허용되는 것으로 설정하면 60%의 확률로 Bifidobacterium longum 종에 속하는 균주를 검출할 수 있었다. 이 Bifidobacterium longum 검출을 위한 프라이머쌍을 Longv-F 및 Longv-R로 명명하였다.
Limosillactobacillus reuteri (Lactobacillus reuteri) 의 경우, Mismatch가 하나도 없는 것으로 설정하면 100%의 확률로 Limosillactobacillus reuteri (Lactobacillus reuteri) 종에 속하는 균주를 검출할 수 있었다. 그리고 프라이머 염기서열 중 Mismatch를 1개까지 허용하는 것으로 설정하면 60%의 확률로 Limosillactobacillus reuteri (Lactobacillus reuteri) 종에 속하는 균주를 검출할 수 있었다. 이 Limosillactobacillus reuteri (Lactobacillus reuteri) 검출을 위한 프라이머쌍을 Reuv-F 및 Reuv-R로 명명하였다.
Ligilactobacillus salivarius (Lactobacillus salivarius) 의 경우, Mismatch가 하나도 없는 것으로 설정하면 100%의 확률로 Ligilactobacillus salivarius (Lactobacillus salivarius) 종에 속하는 균주를 검출할 수 있었다. 그리고 프라이머 염기서열 중 Mismatch를 1개까지 허용하는 것으로 설정하면 60%의 확률로 Ligilactobacillus salivarius (Lactobacillus salivarius) 종에 속하는 균주를 검출할 수 있었다. 이 Ligilactobacillus salivarius (Lactobacillus salivarius) 검출을 위한 프라이머쌍을 Saliv-F 및 Saliv-R로 명명하였다.
Bifidobacterium animalis ssp. lactis 의 경우, Mismatch가 하나도 없는 것으로 설정하면 100%의 확률로 Bifidobacterium animalis ssp. lactis 종에 속하는 균주를 검출할 수 있다. 그리고 프라이머 염기서열 중 Mismatch를 1개까지 허용하는 것으로 설정하면 60%의 확률로 Bifidobacterium animalis ssp. lactis 종에 속하는 균주를 검출할 수 있다. 이 Bifidobacterium animalis ssp. lactis 검출을 위한 프라이머쌍을 BLacv-F 및 BLacv-R로 명명하였다.
Enterococcus faecium 의 경우, Mismatch가 하나도 없는 것으로 설정하면 100%의 확률로 Enterococcus faecium 종에 속하는 균주를 검출할 수 있었다. 그리고 프라이머 염기서열 중 Mismatch를 1개까지 허용하는 것으로 설정하면 60%의 확률로 Enterococcus faecium 종에 속하는 균주를 검출할 수 있었다. 이 Enterococcus faecium 검출을 위한 프라이머쌍을 Faev-F 및 Faev-R로 명명하였다.
Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus 의 경우, Mismatch가 하나도 는 것으로 설정하면 100%의 확률로 Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus 종에 속하는 균주를 검출할 수 있었다. 그리고 프라이머 염기서열 중 Mismatch를 1개까지 허용하는 것으로 설정하면 60%의 확률로 Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus 종에 속하는 균주를 검출할 수 있었다. 이 Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus 검출을 위한 프라이머쌍을 LacvB-F 및 LacvB-R로 명명하였다.
Lactococcus lactis 의 경우, Mismatch가 하나도 없는 것으로 설정하면 100%의 확률로 Lactococcus lactis 종에 속하는 균주를 검출할 수 있었다. 그리고 프라이머 염기서열 중 Mismatch를 1개까지 허용하는 것으로 설정하면 60%의 확률로 Lactococcus lactis 종에 속하는 균주를 검출할 수 있었다. 이 Lactococcus lactis 검출을 위한 프라이머쌍을 LacvL-F 및 LacvL-R로 명명하였다.
상기 프라이머쌍의 명칭, 검출대상 균주, 및 프라이머쌍의 서열은 하기 표 2에 기재되어 있다.
| 검출 대상 균주 (종) | 프라이머쌍 명칭 | 서열 | |
| 1 | Enterococcus faecalis | Entv-F | GGCTGCTATTGGCGGTAATTATCGCATT |
| 2 | Entv-R | TCTAAATAAGACGTAACTTGGCTAGCGG | |
| 3 | Lactobacillus Helveticus | Helv-F | GGCGTAAGTTAATAGGGGGTATTCTGGT |
| 4 | Helv-R | CCAAGTGCTGGCCGAATACCGAATATAT | |
| 5 | Lactobacillus gasseri | Gav-F | GGGCTGGGTTAGGGATGTCTTTATAAG |
| 6 | Gav-R | CAGCCAAGTTGGAAAAATGGGACCTTGG | |
| 7 | Lactobacillus rhamnosus | Rhav-F | GGGAGAATCGCCAAAATCTCCTTTAACG |
| 8 | Rhav-R | ACCTTGTCACGTCACACCATAACGCGTG | |
| 9 | Lactobacillus acidophilus | Aciv-F | TGTGATTGATCACCATAGACGAGGAGA |
| 10 | Aciv-R | GATCAATTACCTTATCATCTGGGCC | |
| 11 | Lacticaseibacillus casei (Lactobacillus casei) | Casv-F | CCTGACTGGTTTAAAAATCGTCCTCACT |
| 12 | Casv-R | GTCGGCTTTCTTGATTAGAAACGG | |
| 13 | Limosillactobacillus fermentum (Lactobacillus fermentum) | Ferv-F | GCCGCCCACAAAAGGTTTAGGGAGATC |
| 14 | Ferv-R | CGTCCTGGAACGAATACAAGACTCCC | |
| 15 | Lacticaseibacillus paracasei (Lactobacillus paracasei) | Parav-F | AATGCCAACCATCTGCCAGATGATCTCA |
| 16 | Parav-R | GCAACGCCAAGAAAGCTACAAAGAC | |
| 17 | Lactiplantibacillus plantarum (Lactobacillus plantarum) | Planv-F | GGTGACGAAACATGCACGGTTTTTTAGG |
| 18 | Planv-R | TGGCTGGACCAGTTGCAAAAATG | |
| 19 | Streptococcus thermophilus | Therv-F | AGCCCATCAGCCTATCTTCTCCAAGCC |
| 20 | Therv-R | AATAGAGACGCCCCGCAACATAGAG | |
| 21 | Bifidobacterium bifidium | Bifiv-F | CATGAAGATGACCACGGCCGTCAAGCC |
| 22 | Bifiv-R | ATGACCGGTAATGGTCAAGCGCAAGA | |
| 23 | Bifidobacterium breve | Brev-F | GAAGCCATGGATCTCAAGCAGAGTCTGG |
| 24 | Brev-R | AACGTAACGCGACGTTTGGCGGTATCA | |
| 25 | Bifidobacterium longum | Longv-F | TTTGGATGCGGGAATATGGAAGGCGTT |
| 26 | Longv-R | AGACAAGCCCGTTCACTACACGCA | |
| 27 | Limosillactobacillus reuteri (Lactobacillus reuteri) | Reuv-F | CGTTAAGGACCCTTGGAAATTAGCACA |
| 28 | Reuv-R | TTAGATCTTGGCCCGTTTCATC | |
| 29 | Ligilactobacillus salivarius (Lactobacillus salivarius) | Saliv-F | GTTATTTTGTTTGCACCGGAAGACCT |
| 30 | Saliv-R | ATTGTAAGTGCTCTTTGCCTTGAG | |
| 31 | Bifidobacterium animalis ssp. lactis | BLacv-F | ACAATGCTCAGTCTGGTGACAATGCCCA |
| 32 | BLacv-R | AAAGCTTGGCGAATTTCACTCTCGCG | |
| 33 | Enterococcus faecium | Faev-F | GAGATCTCGGGAGCTTCGACTAACCCA |
| 34 | Faev-R | AGACGATCACGGAGACTCAAAGGGAAG | |
| 35 | Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus(Lactobacillus bulgaricus) | LacvB-F | GGCCTCAATCAACAGTGAAGCCAAGACC |
| 36 | LacvB-R | GAATGTAGCGGACGTTGGCAATTGG | |
| 37 | Lactococcus lactis | LacvL-F | CTCCTGAGGTAGGTTCTGTCCATGAA |
| 38 | LacvL-R | GGCTGTAAAGTGAACGGACGAAC |
실시예 3: 제작한 프라이머의 특이적 반응 확인
프라이머가 목적하는 DNA에만 특이적으로 결합하는지 확인하기 위해 Enterococcus faecalis KCTC 3206, Lactobacillus helveticus KCTC 15060, Lactobacillus gasseri ATCC33323, Lactobacillus rhamnosus JCM 1112, Lactobacillus acidophilus CIP 76.13, Lacticaseibacillus casei (Lactobacillus casei) ATCC 393, Limosillactobacillus fermentum (Lactobacillus fermentum) CECT 562, Lacticaseibacillus paracasei (Lactobacillus paracasei) ATCC 25302, Lactiplantibacillus plantarum (Lactobacillus plantarum) KCTC 3108 그리고 Streptococcus thermophilus ATCC 19258의 DNA를 프라이머쌍의 종 수준에서 검출 가능성 확인을 위한 template DNA로 사용했다.
각각의 종들의 type-strain을 template로 하고 Aciv-F 및 Aciv-R 프라이머를 사용해서 PCR을 실시하면, Lactobacillus acidophilus을 사용한 PCR 생산물에서만 DNA 밴드를 확인할 수 있었고 나머지 종를 사용한 PCR 생산물에서는 밴드가 띄지 않았다.
이와 동일한 방법으로, 각각의 프라이머를 이용하면 목표로 하는 종의 미생물에 대해서만 특이적으로 검출한다는 것을 확인하였다. (도 1의 A 내지 J)
실시예 4: 프로바이오틱스 제품에 대한 프라이머 검증
4-1. 최적의 PCR 증폭조건 확립
상기 프라이머쌍들의 최적의 PCR 증폭 조건을 정립하였다. 최적의 PCR 조건은 하기 표 4 및 표 5에 개시되어 있다. 하기 표 4에서, 2 ~ 4 단계를 28번 반복하였다.
| 균주명 | Annealing Temperature (℃) |
| Enterococcus faecalis | 67.2 |
| Lactobacillus helveticus | 68.6 |
| Lactobacillus gasseri | 67.5 |
| Lactobacillus rhamnosus | 68.6 |
| Lactobacillus acidophilus | 64.2 |
| Lacticaseibacillus casei (Lactobacillus casei ) | 64.9 |
| Limosillactobacillus fermentum (Lactobacillus fermentum) | 69.2 |
| Lacticaseibacillus paracasei (Lactobacillus paracasei) | 67.7 |
| Lactiplantibacillus plantarum (Lactobacillus plantarum) | 67.4 |
| Streptococcus thermophilus | 61.2 |
| Bifidobacterium bifidium | 71.2 |
| Bifidobacterium breve | 71.1 |
| Bifidobacterium longum | 71.1 |
| Limosillactobacillus reuteri (Lactobacillus reuteri) | 64.4 |
| Ligilactobacillus salivarius (Lactobacillus salivarius) | 64.6 |
| Bifidobacterium animalis ssp. lactis | 70.7 |
| Enterococcus faecium | 70.2 |
| Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus | 69.3 |
| Lactococcus lactis | 66.6 |
4-2. 프로바이오틱스 제품을 이용한 PCR 프라이머쌍 검증
시판되는 프로바이오틱스 제품 A 내지 D에 대해 프라이머쌍들을 이용하여 PCR 증폭을 하였다. 각각의 제품을 이용한 PCR 결과와 NGS 결과를 비교하여 프라이머의 효과를 검증하였다. 도 2 내지 4에 따르면, A 내지 D 제품에 대한 PCR 실험 결과는 제품에 표기된 프로바이오틱스의 성분과 동일하게 검출되었다.
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<120> Composition for discriminating probiotic microorganisms at the
species level
<130> PN200076
<160> 38
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Entv-F
<400> 1
ggctgctatt ggcggtaatt atcgcatt 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Entv-R
<400> 2
tctaaataag acgtaacttg gctagcgg 28
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Helv-F
<400> 3
ggcgtaagtt aatagggggt attctggt 28
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Helv-R
<400> 4
ccaagtgctg gccgaatacc gaatatat 28
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gav-F
<400> 5
gggctgggtt agggatgtct ttataag 27
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gav-R
<400> 6
cagccaagtt ggaaaaatgg gaccttgg 28
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rhav-F
<400> 7
gggagaatcg ccaaaatctc ctttaacg 28
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rhav-R
<400> 8
accttgtcac gtcacaccat aacgcgtg 28
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Aciv-F
<400> 9
tgtgattgat caccatagac gaggaga 27
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Aciv-R
<400> 10
gatcaattac cttatcatct gggcc 25
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Casv-F
<400> 11
cctgactggt ttaaaaatcg tcctcact 28
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Casv-R
<400> 12
gtcggctttc ttgattagaa acgg 24
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ferv-F
<400> 13
gccgcccaca aaaggtttag ggagatc 27
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ferv-R
<400> 14
cgtcctggaa cgaatacaag actccc 26
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Parav-F
<400> 15
aatgccaacc atctgccaga tgatctca 28
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Parav-R
<400> 16
gcaacgccaa gaaagctaca aagac 25
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Planv-F
<400> 17
ggtgacgaaa catgcacggt tttttagg 28
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Planv-R
<400> 18
tggctggacc agttgcaaaa atg 23
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Therv-F
<400> 19
agcccatcag cctatcttct ccaagcc 27
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Therv-R
<400> 20
aatagagacg ccccgcaaca tagag 25
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bifiv-F
<400> 21
catgaagatg accacggccg tcaagcc 27
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bifiv-R
<400> 22
atgaccggta atggtcaagc gcaaga 26
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Brev-F
<400> 23
gaagccatgg atctcaagca gagtctgg 28
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Brev-R
<400> 24
aacgtaacgc gacgtttggc ggtatca 27
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Longv-F
<400> 25
tttggatgcg ggaatatgga aggcgtt 27
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Longv-R
<400> 26
agacaagccc gttcactaca cgca 24
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reuv-F
<400> 27
cgttaaggac ccttggaaat tagcaca 27
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reuv-R
<400> 28
ttagatcttg gcccgtttca tc 22
<210> 29
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Saliv-F
<400> 29
gttattttgt ttgcaccgga agacct 26
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Saliv-R
<400> 30
attgtaagtg ctctttgcct tgag 24
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BLacv-F
<400> 31
acaatgctca gtctggtgac aatgccca 28
<210> 32
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BLacv-R
<400> 32
aaagcttggc gaatttcact ctcgcg 26
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Faev-F
<400> 33
gagatctcgg gagcttcgac taaccca 27
<210> 34
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Faev-R
<400> 34
agacgatcac ggagactcaa agggaag 27
<210> 35
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LacvB-F
<400> 35
ggcctcaatc aacagtgaag ccaagacc 28
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LacvB-R
<400> 36
gaatgtagcg gacgttggca attgg 25
<210> 37
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LacvL-F
<400> 37
ctcctgaggt aggttctgtc catgaa 26
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LacvL-R
<400> 38
ggctgtaaag tgaacggacg aac 23
Claims (20)
- 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는,
엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 검출용 프라이머쌍. - 서열번호 3 의 염기서열 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는,
락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus Helveticus) 검출용 프라이머쌍. - 서열번호 5 의 염기서열 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는,
락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 검출용 프라이머쌍. - 서열번호 7 의 염기서열 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는,
락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 검출용 프라이머쌍. - 서열번호 9 의 염기서열 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어지는,
락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 검출용 프라이머쌍. - 서열번호 11 의 염기서열 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어지는,
락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 검출용 프라이머쌍. - 서열번호 13 의 염기서열 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어지는,
락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 검출용 프라이머쌍. - 서열번호 15 의 염기서열 및 서열번호 16의 염기서열로 이루어지는,
락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 검출용 프라이머쌍. - 서열번호 17 의 염기서열 및 서열번호 18의 염기서열로 이루어지는,
락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 검출용 프라이머쌍. - 서열번호 19 의 염기서열 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어지는,
스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 검출용 프라이머쌍. - 서열번호 21 의 염기서열 및 서열번호 22의 염기서열로 이루어지는,
비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidium) 검출용 프라이머쌍. - 서열번호 23 의 염기서열 및 서열번호 24의 염기서열로 이루어지는,
비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) 검출용 프라이머쌍. - 서열번호 25 의 염기서열 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어지는,
비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 검출용 프라이머쌍. - 서열번호 27 의 염기서열 및 서열번호 28의 염기서열로 이루어지는,
락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 검출용 프라이머쌍. - 서열번호 29 의 염기서열 및 서열번호 30의 염기서열로 이루어지는,
락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) 검출용 프라이머쌍. - 서열번호 31 의 염기서열 및 서열번호 32의 염기서열로 이루어지는,
비피도박테리움 애니멀리스 ssp. 락티스(Bifidobacterium animalis ssp. lactis) 검출용 프라이머쌍. - 서열번호 33 의 염기서열 및 서열번호 34의 염기서열로 이루어지는,
엔테로코커스 파시움(Enterococcus faecium) 검출용 프라이머쌍. - 서열번호 35 의 염기서열 및 서열번호 36의 염기서열로 이루어지는,
락토바실러스 델브루키 ssp. 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus) 검출용 프라이머쌍. - 서열번호 37 의 염기서열 및 서열번호 38의 염기서열로 이루어지는,
락토바실러스 락티스(Lactococcus lactis) 검출용 프라이머쌍. - 제 1항 내지 제 19항의 검출용 프라이머쌍로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머쌍을 포함하는,
유산균 검출용 프라이머세트.
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|---|---|---|---|
| KR1020200088588A KR102525504B1 (ko) | 2020-07-17 | 2020-07-17 | 프로바이오틱스 미생물을 종 수준에서 판별하기 위한 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200088588A KR102525504B1 (ko) | 2020-07-17 | 2020-07-17 | 프로바이오틱스 미생물을 종 수준에서 판별하기 위한 조성물 |
Publications (2)
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|---|---|
| KR20220010100A true KR20220010100A (ko) | 2022-01-25 |
| KR102525504B1 KR102525504B1 (ko) | 2023-04-25 |
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ID=80049202
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| KR (1) | KR102525504B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023234577A1 (ko) * | 2022-05-31 | 2023-12-07 | 종근당건강 주식회사 | 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 균종 판별 방법 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20040077544A (ko) | 2003-02-28 | 2004-09-04 | 일동제약주식회사 | 락토바실러스 속 균종의 동정방법 |
| KR20050012505A (ko) * | 2003-07-25 | 2005-02-02 | 일동제약주식회사 | 비피도박테리움 속 균종의 동정방법 |
| KR102099344B1 (ko) * | 2019-02-27 | 2020-04-09 | 경희대학교 산학협력단 | 락토바실러스 균주 검출용 멀티플렉스 pcr 프라이머 및 이의 용도 |
-
2020
- 2020-07-17 KR KR1020200088588A patent/KR102525504B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20040077544A (ko) | 2003-02-28 | 2004-09-04 | 일동제약주식회사 | 락토바실러스 속 균종의 동정방법 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| John M. Williams et al., Journal of Endodontics, 32(8), p.715-721, 2006. * |
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| WO2023234577A1 (ko) * | 2022-05-31 | 2023-12-07 | 종근당건강 주식회사 | 프로바이오틱스 조성물 내 균종 판별을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 균종 판별 방법 |
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|---|---|
| KR102525504B1 (ko) | 2023-04-25 |
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