KR101151728B1 - 스트렙토코커스 오라리스 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 스트렙토코커스 오라리스의 검출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 스트렙토코커스 오라리스 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 스트렙토코커스 오라리스의 검출방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 서열번호 2의 아미노산을 가지는 rgg를 암호화하는 유전자를 검출의 표적으로 이용하여 스트렙토코커스 오라리스을 효과적으로 검출할 수 있도록 고안된, 스트렙토코커스 오라리스 rgg유전자 및 이에 상보적인 염기서열 유래의 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 스트렙토코커스 오라리스의 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 검출방법은 스트렙토코커스 오라리스만을 특이적으로 검출할 수 있는 효과가 있으며, 특히 스트렙토코커스 오라리스과 매우 유사한 스트렙토코커스 속 균들(Streptococcus strains)과 스트렙토코커스 오라리스을 구별할 수 있는 장점이 있다.

스트렙토코커스 오라리스, 스트렙토코커스, 프라이머, 프로브, 검출방법

Description

스트렙토코커스 오라리스 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 스트렙토코커스 오라리스의 검출방법{Primer and probe for detection of Streptococcus oralis and method for detecting Streptococcus oralis using thereof}

본 발명은 스트렙토코커스 오라리스 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 스트렙토코커스 오라리스의 검출방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 서열번호 2의 아미노산을 가지는 rgg를 암호화하는 유전자를 검출의 표적으로 이용하여 스트렙토코커스 오라리스를 효과적으로 검출할 수 있도록 고안된, 스트렙토코커스 오라리스 rgg 유전자 및 이에 상보적인 염기서열 유래의 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 스트렙토코커스 오라리스의 검출하는 방법에 관한 것이다.

연쇄구균(Streptococcus)은 사람의 구강과 호흡기도에 존재하는 이질적인 그람양성세균 군으로, 주요 병원성균인 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 파이오젠스(S. pyogenes) 및 화농성연쇄상구균(S. agalactiae)를 포함한 48종으로 구성된다(Facklam et al., Clin Microbiol Rev, 15:613-630, 2002).

일반적으로 연쇄구균은 16S rDNA 염기서열에 의하여 `pyogenic', `mitis‘, `salivarius', `bovis', `mutans' 및 `anginosus' 군 균 등 6개의 분류군으로 구성되며(Kawamura et al., Int J Syst Bacteriol, 45:406-408(1995)), 혈청학적 특성에 기준하여 A-H, K-M 및 O-V(Lancefield et al., J Exp Med, 145:490-499(1977))로 분류되며, 적혈구에 대한 용혈성(alpha,　beta 및 gamma) 및 생화학적 성상에 의해서 서로 감별된다(Coykendall, Clin Microbiol Rev, 2:315-328(1989); Whiley et al., Oral Microbiol Immunol, 13:195-216(1998)).

‘mitis’ 군 균에 속하는 균들은 스트렙토코커스 미티스(S. mitis), 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis), 스트렙토코커스 고도니 (S. gordonii), 스트렙토코커스 상기우스 (S. sangius) 및 스트렙토코커스 파라상기우스 (S. parasangius)등이 있다. 스트렙토코커스 미티스와 스트렙토코커스 오라리스는 인간에게 주로 충치를 형성하게 하는 것으로 알려져 왔으나, 최근 연구에 의하면 아급성 심내막염 등 심장질환에 관련된 질병을 일으키는 것으로 보고되어 그 중요성이 증가하고 있다(Whatmore et al., Infect Immun, 68:1374-1382(2000)).

병원성 연쇄구균의 동정은 배양법에 기초한 일련의 생리 화학적 검사와 혈청학적 시험으로 수행되어 왔다(Freney et al., J Clin Microbiol, 30:2657-2661, (1992)). 그러나 종(species) 수준에서의 동정은 균이 늦게 성장하는 특성으로 인하여 생리 화학적 검사에 7일 정도의 기간이 소요되며, 검사 결과도 분자 진화적 계통도에 근거한 유전학적 결과와 일치하지 않는 경우가 있었다(Whiley et al., Oral Microbiol Immunol, 13:195-216(1998); Heath, Paediatr Respir Rev, 1:4- 7(2000)).

스트렙토코커스 미티스와 스트렙토코커스 오라리스 등과 같은 알파용혈성 연쇄구균의 동정에는 4가지 특성, 즉 집락 형태, 옵토친(optochin) 감수성 시험, 담즙 용해성 및 캡슐 다당류 항체에 대한 응집반응 등의 방법이 이용되어 왔으나, 많은 환자 분리 주들이 한 종류 이상의 표준 검사방법에 대해 비정형 반응을 나타내어 정확한 동정에 어려움이 있었다(Finland et al., J Clin Microbiol, 5:154-166(1997); Kontiainen et al., Eur J Clin Microbiol, 6:422-424(1987); Mundy et al., Microbiol Infect Dis, 109:55-61(1998); Munoz et al., Diagn Microbiol, 13:63-66(1990)).

최근, 이러한 동정의 어려움을 극복하고자 DNA 분석에 근거한 많은 방법들이 연쇄구균의 동정과 검출을 위하여 개발되었다. 예를 들면, 폐렴구균(Davis et al., J Clin Microbiol, 29: 2193-2196(1991); Pozzi et al., J Clin Microbiol, 27: 370-372(1989)), 스트렙토코커스 파이오젠스, 화농성연쇄상구균 및 스트렙토코커스 보비스(S. bovis) (Whitehead et al., J Clin Microbiol, 31: 2387-2391(1993)에 대한 특이 프로브를 이용한 하이브리다이제이션 방법이 개발되었으나 실험방법이 복잡하고 시간이 많이 소요되며 특이성이 문제가 있었다. 따라서 현재에는 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction: PCR)에 기초한 방법들이 널리 이용되고 있다(Salo et al., J Infect Dis, 171:479-482(1995)).

따라서, 상술한 문제점을 극복하면서 신속하고 효과적인 스트렙토코커스 오라리스의 동정방법이 여전히 요구되고 있다.

한편, 비교유전체 연구의 한 방법인 SSH(suppressive subtractive hybridization)는 원래 cDNA 라이브러리들의 발현 정도의 차이점을 알아보기 위하여 고안되었으나 현재에는 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) (Akopyants et al., Proc Natl Acad Sci USA, 95:13108-13113(1998)), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) (Mahairas et al., J Bacteriol, 178:1274-1282(1996), 수막구균(Neisseria meningitidis) (Tinsley et al., Proc Natl Acad Sci USA, 93:11109-11114(1996)) 그리고 탄저균(Bacillus anthracis)(Kim et al., J Med Microbiol. 57:279-286(2008)) 등 유전학적으로 높은 근연관계에 있는 미생물들의 유전체 상이점을 규명하는데도 성공적으로 사용되고 있다.

본 발명자들은 이와 같은 점에 착안하여 스트렙토코커스 오라리스만을 검출 및 동정하는데 이용할 수 있는 특이유전체를 규명하기 위하여 게노믹 SSH(genomic suppressive subtractive hybridization) 기술을 이용한 결과, 구강 연쇄구균 중 대표적인 병원균인 스트렙토코커스 오라리스와 폐렴구균의 유전체 차이를 규명하였으며 스트렙토코커스 오라리스 특이 유전자를 발굴하였고, 상기 특이 유전자 즉, 서열번호 2의 아미노산을 가지는 rgg를 암호화하는 유전자를 검출의 표적으로 이용하여 프라이머 및 프로브를 제작한 결과, 스트렙토코커스 오라리스과 매우 유사한 스트렙토코커스 속 균들(Streptococcus strains)로부터 스트렙토코커스 오라리스만을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시 되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

따라서, 본 발명의 목적은 스트렙토코커스 오라리스의 rgg 유전자를 검출의 표적으로 이용하여 스트렙토코커스 오라리스을 효과적으로 검출할 수 있도록 고안된, 스트렙토코커스 오라리스 rgg 유전자 및 이에 상보적인 염기서열 유래의 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 스트렙토코커스 오라리스의 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산을 가지는 rgg를 암호화하는 유전자, 이에 상보적인 염기서열 및 이들로부터 유래된 염기서열로 이루어진 프로브 및 상기 프로브가 기질 상에 집적되어 있는 것을 특징으로 하는 스트렙토코커스 오라리스 검출용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산을 가지는 rgg를 암호화하는 유전자로부터 유래된 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열을 가지는 프라이머를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 또는 프로브를 이용한 스트렙토코커스 오라리스을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 또는 프로브를 포함하는 스트렙토코커스 오라리스 검출용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 스트렙토코커스 오라리스 검출용 프로브를 제공한다. 본 발명에서 제공되는 프로브는 (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열; (b) 상기 (a)에 상보적인 염기서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 염기서열에서 유래되고, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 15bp 이상의 연속적인 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는 상기 (c)의 염기서열은 상기 (a) 또는 (b)의 염기서열에서 유래되고, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 15-100bp 이상의 염기서열이고, 보다 바람직하게는 20-100bp의 염기서열이고, 보다 바람직하게는 25-75bp의 연속적인 염기서열이며, 가장 바람직하게는 30-45bp의 연속적인 염기서열이다. 또한 상기 (a)의 염기서열은 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 것이 바람직하다. 또한 본 발명의 프로브는 스트렙토코커스 오라리스 특이적 검출에 영향을 주지 않는 범위 내에서 변형(예 : 부가, 결실, 치환)될 수 있다.

상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 rgg를 암호화하는 유전자는 스트렙토코커스 오라리스 특이적이라는 특징이 있다. 따라서 본 발명의 프로브는 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 rgg를 암호화하는 유전자, 이에 상보적인 염기서열 또는 이들로부터 유래된 염기서열로 이루어져 있으며, 스트렙토코커스 오 라리스를 제외한 스트렙토코커스 속 균주에는 비특이적이고 스트렙토코커스 오라리스에만 특이적인 특징이 있기 때문에 스트렙토코커스 오라리스를 효율적으로 검출할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 스트렙토코커스 오라리스의 rgg 유전자가 스트렙토코커스 오라리스를 제외한 스트렙토코커스 속 균주로부터 스트렙토코커스 오라리스를 구별할 수 있는 특이 유전자임을 확인하였다(실시예 1).

본 발명은 서열번호 2의 아미노산을 가지는 스트렙토코커스 오라리스의 rgg를 암호화하는 유전자 및 이에 상보적인 염기서열 유래의 프로브 및 상기 프로브가 기질 상에 집적되어 있는 것을 특징으로 하는 스트렙토코커스 오라리스 검출용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명에서 용어 “프로브”란 DNA 또는 RNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 라벨링 되어 있어서 특정 DNA 또는 RNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위원소 등으로 표지될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기의 프로브가 기질 상에 집적되어 있는 것을 특징으로 하는 스트렙토코커스 오라리스 검출용 마이크로어레이를 제공한다.

상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어진다.

프로브 폴리뉴클레오티드를 기판 상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 “프로브 폴리뉴클레오티드”는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.

본 발명의 스트렙토코커스 오라리스와 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드를 기판 상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

본 발명은 또한, 스트렙토코커스 오라리스 검출용 프라이머를 제공한다.

바람직하게는 본 발명에서 제공하는 프라이머는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열 또는 이에 상보적인 염기서열을 가질 수 있다. 또한 본 발명의 프라이머는 스트렙토코커스 오라리스 특이적 검출에 영향을 주지 않는 범위 내에서 변형(예: 부가, 결실, 치환)될 수 있다. 본 발명의 프라이머는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 스트렙토코커스 오라리스의 rgg 암호화하는 염기서열로 이루어진 유전자에서 유래된 서열로 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어져 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 스트렙토코커스 오라리스와 다른 스트렙토코커스 속 균주, 특히 분류학적, 분자생물학적으로 스트렙토코커스 오라리스와 매우 유사한 스트렙토코커스 미티스, 스트렙토코커스 뉴모니아, 스트렙토코커스 파이오제네스, 스트렙토코커스 고도니, 스트렙토코커스 오스트라리스, 스트렙토코커스 시넨시스, 스트렙토코커스 상기우스, 스트렙토코커스 파라상기우스, 스트렙토코커스 콘스텔라투스 및 스트렙토코커스 인터메디우스등의 균종과 구별할 수 있음을 확인하였다(도 6 참조).

본 발명에서 용어 “프라이머”란 상보적인 템플레이트와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.

상기 프라이머는 RFLP(restriction fragment length polymerphism), RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(inter-simple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism) 등과 같이 당업계에 공지된 다양한 DNA 분석에 적합하도록 디자인될 수 있다.

본 발명은 또한, (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열; (b) 상기 (a)에 상보적인 염기서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 염기서열에서 유래되고, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 15bp 이상의 연속적인 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프로브 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열을 가지는 프로브를 이용하여 스트렙토코커스 오라리스를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 프라이머나 프로브를 이용하여 스트렙토코커스 오라리스를 검출할 수 있는 방법으로는, PCR(polymerase chain reaction) 분석, DNA 시퀀싱(DNA sequencing), 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, PCR-RFLP(restriction fragment length polymerphism) 분석, RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(inter-simple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism), 노던 하이브리다이제이션(Northern hybridization) 및 서던 하이브리다이제이션(Southern hybridization) 등과 같은 당업계에 공지된 다양한 DNA 다형성 분석을 이용하여 수행될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 본 발명의 일실시예에서는 스트렙토코커스 오라리스의 rgg 유전자 및 이에 상보적인 염기서열 유래의 프라이머를 이용하여 PCR로 스트렙토코커스 오라리스만을 특이적으로 검출하는 방법이 예시되어 있다. 즉, 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머 조합을 이용하여 PCR 분석을 수행하였고. 그 결과, 본 발명의 프라이머가 스트렙토코커스 오라리스의 rgg 유전자만을 특이적으로 증폭함으로써 스트렙토코커스 오라리스를 특이적으로 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 6 참조).

본 발명은 또한, (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열; (b) 상기 (a)에 상보적인 염기서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 염기서열에서 유래되고, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 15bp 이상의 연속적인 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프로브 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열을 가지는 프로브를 포함하는 스트렙토코커스 오라리스 검출용 조성물을 제공한다.

상기 조성물에는 상기 프라이머 또는 프로브를 이용하여 스트렙토코커스 오라리스를 검출하는데 필요한 실험과정(예: PCR, 서던 블럿 등) 및 결과 확인에 필요한 여러 가지 시약들, 예컨대, PCR 반응 혼합물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및/또는 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 검출방법은 스트렙토코커스 오라리스만을 특이적으로 검출할 수 있는 효과가 있으며, 스트렙토코커스 오라리스를 제외한 스 트렙토코커스 속 균주들, 특히 스트렙토코커스 오라리스와 분류학적, 분자생물학적으로 매우 유사한 스트렙토코커스 미티스, 스트렙토코커스 뉴코니아, 스트렙토코커스 고도니, 스트렙토코커스 상기우스 및 스트렙토코커스 파라상기우스 등과 스트렙토코커스 오라리스을 구별할 수 있는 장점이 있어, 스트렙토코커스 오라리스의 검출에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: SSH(Suppression subtractive hybridization)에 의한 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis) 특이 유전체의 규명

실시예 1-1: gDNA(Genomic DNA)의 분리

스트렙토코커스 오라리스(S. oralis) KCTC 13048^T 및 폐렴구균(S. pneumoniae) KCTC 5080^T 으로부터 Ausubel 등의 방법(Ausubel et al., Current protocols in molecular biology, section 22.4, John Wiely and Sons, New York, N.Y., 1994)에 따라 gDNA를 분리하였다.

먼저, 3 ㎖의 뉴트리언트 브로스(nutrient broth. Difco사)에서 배양한 상기 균주를 1.5 ㎖ 마이크로튜브에 옮기고 15,000 rpm에서 2분간 원심 분리하여 균체를 침전시켰다. 침전된 균체는 100 ㎕의 TE 버퍼(pH 8.0)를 가하여 잘 현탁하고, 20 ㎕의 10％ SDS(sodium dodecyl sulfate)와 10 ㎕의 프로테아제 K(proteinase K; 10 ㎎/㎖(Sigma)를 가하여 50 ℃에서 1시간 반응시켰다. 상기 반응시킨 균체는 200 ㎕의 10％ CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)/0.7 M NaCl 용액을 가하여 잘 혼합한 후 다시 65℃에서 10분간 반응하고 여기에 동량의 클로로포름/이소아밀알콜(24:1) 용액을 가하여 5분간 진탕한 다음 4℃에서 5분간 원심분리한 후 상층액만 새로운 튜브로 옮겼다. 여기에 1/10배의 3 M 소디움 아세테이트와 2배의 100％ 에탄올을 가하여 gDNA를 침전시켰다. 상기 침전된 gDNA는 70％ 에탄올로 세척한 다음, 50 ㎕의 TE 완충액에 용해하고 RNase(Sigma)를 최종농도가 20 ㎍/㎖ 되도록 가한 후 42℃에서 30분간 반응시켜 RNA를 제거하였다. 상기 정제된 DNA는 스펙트로미터(Model MBA 2000, Perkin-Elmer사, Norwalk, CN, USA)를 사용하여 260nm에서 정량하고 -20℃에 보존하면서 실험에 사용하였다.

실시예 1-2: 제한효소 절단

gDNA에 어댑터(adaptor)를 연결하기 위하여, 상기 추출한 gDNA에 RsaI 제한효소를 처리하였다. 상기 실시예 1-1에서 분리 정제한 스트렙토코커스 오라리 스(S. oralis) KCTC 13048^T 및 폐렴구균(S. pneumoniae) KCTC 5080^T 의 gDNA 각 2 ㎍에 제한효소 RsaI (10 unit/㎕, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) 1.5 ㎕ 와 10 X 버퍼 5 ㎕를 가하여 37℃ 항온수조에서 5-16 시간 동안 절단한 후, 1.0％ LE 아가로즈 겔(FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA)에서 100 V로 20분간 전기영동하였다. 전기영동한 후 EtBr(ethidium bromide) (10 ㎎/㎖)로 10분간 염색하고, Gel Doc 2000 시스템 (Bio-Rad사, Hercules, CA, USA)을 이용하여 절단 유무를 확인하였다.

절단을 확인한 다음 0.2 M EDTA 용액을 2.5 ㎕ 첨가하여 반응을 정지시켰다. 절단된 DNA는 페놀/클로로포름/이소아밀알콜(25:24:1) 용액을 사용하여 정제하고 0.5배의 3 M 소디움 아세테이트와 2.5배의 100％ 에탄올을 가하여 침전시킨 다음 80％ 에탄올로 세척하고 6.5 ㎕의 3차 멸균증류수에 용해하였다.

실시예 1-3 : SSH(Suppressive Subtractive Hybridization)

SSH (Suppressive subtractive hybridization)는 CLONTECH Laboratories사(Palo Alto, CA U.S.A.)의 하이브리다이제이션 키트(PCR-Select Bacterial Genome Subtractive Hybridization kit, Catalog#: K1809-1)를 사용하였으며, SSH 과정은 도 2에 모식도로 나타내었다. 먼저 시험 균주인 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis) KCTC 13048^T 의 어댑터가 연결된 테스터 DNA(adaptor-ligated tester DNA)를 만들기 위해, RsaI으로 절단된 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis) gDNA 1.2 ㎕에 증류수 1.8 ㎕를 첨가하여 희석한 다음 5 X 라이게이션 버퍼 2 ㎕, T4 DNA 라이게이즈 (400 units/㎕) 1 ㎕와 증류수 1.8 ㎕를 가하여 라이게이션 마스터 믹스(ligation master mix)를 제작하였다. 라이게이션 반응 혼합액은 두개의 튜브에 각각 희석 DNA 1 ㎕, 10 μM 어댑터 1 또는 어댑터 2R 2 ㎕ 및 라이게이션 마스터 믹스(ligation master mix) 7 ㎕를 혼합하여 최종 부피가 10 ㎕이 되도록 조절한 다음 16℃ 항온수조에서 하룻밤 동안 반응시켰다.

1차 하이브리다이제이션(hybridization)을 위해 비교 균주인 폐렴구균(S. pneumoniae) KCTC 5080^T gDNA 2 ㎕, 1-어댑터가 연결된 테스터 DNA(1-adaptor-linked tester DNA) 1 ㎕ 및 하이브리다이제이션 버퍼를 사용하여 총 부피가 4 ㎕이 되도록 조정한 다음 98℃에서 1분 30초 동안 변성시키고 63℃에서 1시간 30분간 하이브리다이제이션을 실시하였다. 2R-어댑터가 연결된 테스터 DNA(2R-adaptor-linked tester DNA) 시료도 상기와 동일한 방법으로 수행하였다.

2차 하이브리다이제이션은 비교 균주인 폐렴구균(S. pneumoniae) KCTC 5080^T gDNA 1 ㎕에 2 X 하이브리다이제이션 버퍼 1 ㎕을 첨가하여 98℃에서 1분 30초 동안 변성시킨 다음 1차 하이브리다이제이션 반응액(1-adaptor-linked tester DNA 이용한 1차 하이브리다이제이션 반응액과 2R-adaptor-linked tester DNA를 이용한 1차 하이브리다이제이션 반응액 2가지)과 잘 혼합하여 63℃에서 하룻밤 반응시켰다. 여기에 200 ㎕의 희석 버퍼를 첨가하여 63℃에서 7분 동안 반응시키고 -20℃에 보관하였다.

실시예 1-4 : 네스티드 PCR(nested PCR)

스트렙토코커스 오라리스(S. oralis) gDNA 1.2 ㎕의 특이 유전체를 규명하기 위하여 네스티드 PCR(nested PCR)을 실시하였다. 상기 실시예 1-3의 하이브리다이제이션 반응액 1 ㎕에 PCR 프라이머(adaptor sequence specific primer, 서열번호 (5‘-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3') 1 ㎕, 10X 버퍼 2.5 ㎕, Taq DNA 중합효소(Roche사) 1 ㎕ 및 증류수 19.5 ㎕을 가하여 72℃에서 2분간 반응시킨 후, DNA thermal cycler (Model 480, Perkin Elmer사)에서 94℃에서 30초, 66℃에서 30초, 72℃에서 1.5분의 반응을 25회 실시하였다. 다시 PCR 산물 1 ㎕과 증류수 39 ㎕을 혼합한 후 2차 PCR을 실시하였다. 프라이머로는 nested primer 1(5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'; 서열번호 5)과 nested primer 2R(서열번호 (5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'; 서열번호 6)을 사용하였으며, 94℃에서 30초, 68℃에서 30초, 72℃에서 1.5분 반응을 12회 실시하였다. PCR 증폭 산물은 1.2％ LE 아가로즈 겔 (FMC)에서 전기영동하여 확인하였다(결과미도시).

실시예 1-5: 클로닝

PCR 증폭 산물은 TOPO TA 클로닝 시스템(Invitrogen사, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 pCR 2.1 벡터에 클로닝하고 E. coli TOP 10으로 형질전환 하였다. 먼저, 상기 실시예 1-4의 PCR 산물 1 ㎕ (10 ng)에 DNA 라이게이즈 1 ㎕ (1 U), 10 X 버퍼 1 ㎕, 10 mM ATP 1 ㎕ 및 D.W 6 ㎕를 차례로 가하고 실온에서 5분간 라이게 이션하였다. 라이게이션 용액 1 ㎕를 취하여 50 ㎕의 E. coli TOP 10 컴페턴트 셀(competent cell)과 잘 혼합한 다음 얼음에서 30분간 방치하고 42℃에서 30초간 열 충격을 가하여 DNA를 세포내로 유입시켰다. 형질 전환한 E. coli 배양액은 37℃에서 220 rpm으로 1시간 동안 진탕 배양한 다음, 암피실린(50 ㎍/㎖), 12 ㎕의 X-gal (50 ㎎/㎖)을 함유하는 LB 평판배지 (Sigma-Aldrich사, St. Louis, Mo, USA)에 도말하고 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. PCR 증폭 산물의 삽입유무를 측정하기 위하여 배양 후 성장한 집락 중 흰색 집락만을 취하고 5 ㎖의 LB 브로스에 접종하여 37℃에서 220 rpm으로 16시간동안 진탕 배양한 다음, 플라스미드 DNA 퓨리피케이션 키트(Plasmid DNA purification kit, Promega사. Madison, WI, USA)를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 상기 분리한 플라스미드 DNA는 제한효소 EcoRI (Roche사)을 가하여 37℃에서 1시간 절단하고 1.0％ LE 아가로즈 겔(FMC)로 전기영동하여 PCR 증폭 산물의 클로닝 유무를 관찰하였다.

실시예 1-6 : 리버스 서던 하이브리다이제이션(Reverse southern hybridization)

클로닝이 확인된 플라스미드 DNA로부터 상기 실시예 1-4 에서 사용한 네스티드 프라이머 1과 네스티드 프라이머 2R을 이용하여 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis) gDNA를 PCR로 증폭하였다. 상기 증폭된 DNA 30 ㎕는 100℃에서 5분간 가열하여 변성시킨 후 얼음에 5분간 방치하고 20 X SSC (USB Co., Cleveland, OH, USA)를 동량 첨가하여 총 부피를 100 ㎕로 하였다. 서던 블럿은 ECL 키트(ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection System, Amersham Biosciences 사, Little Chafont, Buckinghamshire, UK)를 이용하였다. 6 X SSC에 미리 정치하였던 Hybond-N+ 멤브레인(Amersham Biosciences)은 Bio-Dot 미세여과장치(Bio-Dot Microfitration Apparatus, Bio-Rad사)에 넣어 장착하고 각 웰에 증류수 500 ㎕씩 분주하여 멤브레인을 가수하였다. 각 웰에 DNA 용액을 50 ㎕씩 분주하고 2X SSC로 세척한 후 멤브레인을 꺼내어 Whatmann 3 MM 페이퍼 위에서 건조시킨 후 StratalinkerUV 크로스링커 (Stratagene, La Jolla, CA, USA)를 이용하여 1000 J에서 3분 30초간 크로스링킹(crosslinking)하였다. 크로스링킹 후 ECL 하이브리다이제이션 버퍼(hybridization buffer) 6 ㎖을 첨가하여 42℃에서 30분간 프리하이브리다이제이션(prehybridization) 한 후, 표지된 프로브를 넣고 하룻밤 반응시켰다.

상기 표지된 프로브(Probe)는 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis) gDNA (100 ㎍/㎖) 200 ㎕을 RsaI (Roche)으로 절단하여 1시간 동안 37℃에서 반응시킨 후 증류수 30 ㎕에 용해시키고 100℃에서 10분간 변성시킨 다음 DNA 표지용액과 글루타르알데히드(glutaraldehyde)용액을 동량 첨가하고 37℃에서 20분간 반응시켜 제조하였다. 한편, 반응 후 멤브레인은 꺼내어 0.4% SDS, 0.5 X SSC에서 20분간 1회, 2 X SSC에서 5분간 2회 세척한 후 건조하고 ECL 검출 시약(ECL detection reagent) 첨가하여 필름 카세트 (Eastman Kodak사, Rochester, NY, USA)에 멤브레인을 넣고 ECL 필림 (Eastman Kodak사)에 현상하였고, 그 결과를 도 4 패널(b)에 도시하였다.

한편, 상기 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)에 특이적인 클론이 폐렴구균(S. pneumoniae)에는 비특이적임을 확인하기 위하여, 폐렴구균 게노믹 DNA를 프로브로 사용한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 리버스 서던 하이브리다이제이션을 실시하였고, 그 결과를 도 4 패널(a)에 도시하였다.

상기, 도 4의 패널 (a)와 (b)를 비교한 결과, 스트렙토코커스 오라리스에 특이적이고, 폐렴구균(S. pneumoniae)에는 비특이적인 클론 86개를 선발할 수 있었다.

실시예 1-7: 유전자 염기서열 분석

상기 실시예 1-6에서 서던 하이브리다이제이션(Southern hybridization)을 통해 스트렙토코커스 오라리스에 양성으로 나타난 클론 86개를 시퀀싱 키트(BigDye Terminatior Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems사, Foster City, CA, USA)를 이용하여 유전자 염기서열을 분석하였다. 재조합 플라스미드를 프로메가 DNA 정제 키트(Promega DNA purification kit, Promega사)를 이용하여 E. coli로부터 순수 정제한 후 플라스미드 DNA 2 ㎕(50 ng)에 반응액(Bigdye terminator ready reaction mixture) 8 ㎕과 시퀀싱 프라이머(sequencing primer, M13 또는 SP6) 3.2 pM을 가하고 증류수로 최종 부피를 20 ㎕이 되도록 조정한 다음 GeneAmp™ PCR 시스템 2700 (Applied Biosystems사)에서 96℃ 10초, 50℃ 5초, 60℃ 4분을 25회 반복하는 사이클 시퀀싱 PCR(cycle sequencing PCR)을 수행하였다. 여기에 3 M 소디움 아세테이트(pH 4.6) 2 ㎕와 95% 에탄올 50 ㎕을 가하여 실온에서 15분간 정치한 후 15,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 DNA를 침전시키고 70% 에탄올 100 ㎕로 세척한 다음 건조하여 잔여 염색제(dye)을 제거하였다. 정제된 DNA는 TSR (template suppression reagent) 13 ㎕에 용해하고 95℃에서 2분간 가열한 후 얼음에서 5분간 정치한 다음 ABI PRISM 310 유전자 분석기(ABI PRISM 310 Genetic Analyzer, Applied Biosystems사)에서 전개하였다.

분석한 유전자 염기서열은 미국 BLAST(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)를 이용하여 검색하고 GenBank에 등재된 유전자 염기서열들과 다중 정렬하고 행렬식 유사도를 구하였으며, ORF finder(NCBI)를 이용하여 단백질 코딩 부위를 분석하였다.

분석결과, 상기 분석된 서열이 GenBank AB025228.1번의 염기서열과 100%의 상동성을 나타내어 스트렙토코커스 오라리스의 rgg 유전자(서열번호 1)임을 동정할 수 있었다(표 1).

표 1-1

표 1-2

실시예 2: 중합효소연쇄반응을 이용한 스트렙토코커스 오라리스 특이적 유전자 검 출

실시예 2-1: 스트렙토코커스 오라리스 특이적 프라이머의 제작

스트렙토코커스 오라리스 특이적 유전자 검출을 위하여 SSH(suppressive subtractive hybridization)에 의해 선별된 유전자 염기서열들 중 rgg 유전자 서열을 기초로 프라이머 3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) 프로그램을 이용하여 프라이머를 설계하였다(표 2). 설계된 프라이머는 (주)제노텍 (Taejon, Korea)에 의뢰하여 200 pM 스케일(scale)로 합성하고 PAGE로 정제하였다. 합성한 프라이머는 10 μM 농도로 희석하고 -20℃에 보관하면서 실험에 사용하였다(표 2).

표 2

실시예 2-2: 중합효소연쇄반응(PCR)

합성된 프라이머가 스트렙토코커스 오라리스 유전자만을 특이적으로 검출할 수 있는지 확인하기 위하여, 상기 합성된 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 조합을 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 우선, 표 3에 개시된 분리 정제한 스트렙토코커스 오라리스와 대조 균주들의 DNA 1 ㎕ (10 ng)에 반응액 (10 X Taq 버퍼 2 ㎕, 2.5 mM dNTPs 1㎕, D.W. 13.7, 10 uM 정방향 프라이머 1 ㎕, 10 uM 역방향 프라이머 1 ㎕와 Taq 중합효소 0.3 ㎕ (Intron, 대한민국)를 각 19 ㎕씩 가한 다음 94℃ 5분 1회, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 40초간의 반응을 30회 반복 하고 72℃에서 10분간 반응하여 증폭하였다. PCR 산물은 1% LE 아가로즈 겔(FMC)에서 전기영동하고 증폭 유무 및 크기를 관찰하였다.

실험결과 도 6에 나타난 바와 같이, 상기 프라이머들이 스트렙토코커스 오라리스 유전자만을 특이적으로 증폭시키고, 폐렴 균주를 비롯한 다른 스트렙토코커스 속 균주와 다른 유사균종의 유전자는 증폭시키지 않는 것을 알 수 있었다.

표 3-1

표 3-2

표 3-3

KCTC (Korea Collection for Type Culture): 한국유전자은행 (대전, 한국), CCARM (Culture Collection of Antibiotics Resistant Microbe): 항생제내성균주은 행 (한국), ChDC (Chosun University Dental College) KCOM (Korean Collection for Oral Microbiology): 구강미생물자원센터, DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen): 독일미생물보존센터, ATCC (American Type culture Collection): 미국 미생물보존센터(Manassas, VA, 미국), LMG (Belgian Co-Ordinated Collection of Micro organism (BCCM/ LMG Bacteria Collection), T: 타입 계통(type strain)을 의미한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 어댑터를 연결하기 위하여 스트렙토코커스 오라리스(Streptococos oralis)과 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)의 게노믹 DNA를 RsaI으로 처리한 결과이다.

도 2는 스트렙토코커스 오라리스(Streptococos oralis)와 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)의 게노믹 DNA로 SSH(Suppression subtractive hybridization)하는 과정을 나타낸 모식도이다.

도 3은 리버스 서던 하이브리다이제이션을 하기 위하여 클로닝이 확인된 플라스미드를 PCR로 증폭한 결과이다.

도 4는 스트렙토코커스 오라리스(Streptococos oralis) 특이적 클론을 선별하기 위하여 리버스 서던 하이브리다이제이션(Reverse southern hybridization)한 결과이다. 패널(A)는 ECL 라벨링된 폐렴구균 게노믹 DNA를 프로브로 사용한 경우이고, 패널(B)는 ECL 라벨링된 스트렙토코커스 오라리스 게노믹 DNA를 프로브로 사용한 경우이다.

도 5는 SSH 라이브러리로부터 디자인된 본 발명의 프라이머의 특이성을 나타낸 결과이다. 1: S.oralis KCTC 13048^T, 2: S.oralis ATCC 9811, 3: S.oralis DSMZ 20395, 4: S.oralis DSMZ 20066, 5: S.oralis ATCC 700233, 6: S.oralis KCOM 1401, 7: S.oralis KCOM 1407, 8: S.oralis KCOM 1408, 9: S.oralis KCOM 1414, 10: S.oralis KCOM 1416, 12: S. mitis, 13: S. pneumoniae, 14: S. sanguinis, 15: S. parasanguinis, 16: S. pyogenes, 17: S. godonii, 17: S. infantis, 18: S australis, 19: S. sinensis, 20: S. constellatus, 21: S. intermidius, 22: S. anginosus, 23: L. plantarum DSMZ 20686^T , 24: L. plantarum, 25: L. lactis sub sp cremoris DSMZ 40699^T, 26: L. lactis sub sp hordiae KCTC 3768^T, 27: L. piscum KCTC 3639^T, 28: L. garvieae 29: L. lactis sub sp lactis KCTC 3769^T, 30: E. solitarius KCTC 3553^T, 31: E. hirae KCTC 3616^T, 32: E. mundtii KCTC 3630^T, 33: E. malodoratus KCTC 3641^T, 34: E. cecorum KCTC 3642^T, 35: E. saccharolyticus KCTC 3643^T, 36: E. villorum KCTC 13904^T, 37: E. haemoperoxidus KCTC 13910^T, 38: E. moraviensis KCTC 13911^T, 39: E. phoeniculicola KCTC 3818^T, 40: E. solitarius KCTC^T, 41: E. raffinosus KCTC 5189^T, 42: E. avium KCTC^T, 43: E. faecalis KCTC 3206^T, 44: V. fluvialis LMG 9464^T, 45: V. salmoninarum LMG 11491^T, 46: V. lutrae LMG 19537^T, ( )은 본 발명에서 이용된 계통(strains)의 수를 의미한다.

도 6은 서열번호 (1) 및 서열번호 (2)의 프라이머 조합을 이용하여 PCR 분석을 수행한 결과를 나타내는 이미지이다. 1 레인: S.oralis KCTC 13048 ^T, 2 레인: S.oralis ATCC 9811, 3 레인: S.oralis DSMZ 20395, 4 레인: S.oralis DSMZ 20066, 5 레인: S.oralis ATCC 700233, 6 레인: S.oralis KCOM 1401, 7 레인: S.oralis KCOM 1407, 8 레인: S.oralis KCOM 1408, 9 레인: S.oralis KCOM 1414, 10 레인: S.oralis KCOM 1416, 11 레인: S. mitis KCTC 3556^T, 12 레인: S. pneumoniae KCTC5080^T, 13 레인: S. sanguinis KCTC 3284^T, 14 레인: S. parasanguinis KCTC 3284^T, 15 레인: S.pyogenes KCTC 3984 ^T, 16 레인: S.godonii KCTC 3286 ^T. T는 타입 계통(type strain)을 의미한다. 다른 스트렙토코커스 속 균주들과 락토코커스, 엔테로코커스 속 균주들은 상기 스트렙토코커스 오라리스외 다른 균주들과 동일한 결과를 나타내었다.

<110> CHUNG ANG University Industry Academic Cooperation Foundation <120> Primer and probe for detection of Streptococcus mitis and method for detecting Streptococcus mitis using thereof <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 864 <212> DNA <213> Streptococcus oralis <220> <221> gene <222> (1)..(864) <223> rgg <400> 1 atgttggaaa cttttggaaa aatattcaaa gtcattagag aatcaaaaaa aatgtccctg 60 aaagaggtag ctgctggtga tatttccgtg gctcagctat cccgttttga acggggagtc 120 aatggaatca cacttgattc tttttattgc tgtttaaaaa atatggccgt ttccctagag 180 gagtttcagt atgtttacca taattacatt gattcagatg atgtgctgtt ctcaaaaaaa 240 gtagctgatg catatcagga aaacaatgtt gtcaagctcc aaaatatttt gtcaagctca 300 gaagctttga ccgaacagtt tcctgagaag aaaaactata aactcaatac aatcattgtc 360 agggccctct tgtcctcctg ttgctcagat tttcagatta gcaagaagga tattgaattc 420 ctgacggatc atctctattc tgttgaggag tggggacgtt atgaactctg gctttttaca 480 aacagtgttg atttgatgac cttggaaacg ctggaaacct tcgctagtga gatgatcaat 540 cgtacccagt tttataataa cctacctgaa aatcgccgcc gtattatcaa gatgctactt 600 aatgtcatta gcgtctgtat cgaaggaaac catctgctag ttgctatgag gtttctcaat 660 tatctcgacc actctaaaat tcctgaaaca gatctatatg atcgaacgct gattaagtat 720 catagggctc tttactccta caaggtgggg aataccaatg ctctcagtga catcgagcaa 780 tgcctatctt tttttgaatt tttagattcc tttggtgttg ctcaaaagct taaagaacag 840 tttgaaagaa tttgcctttc atag 864 <210> 2 <211> 287 <212> PRT <213> Streptococcus oralis <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(287) <223> rgg <400> 2 Met Leu Glu Thr Phe Gly Lys Ile Phe Lys Val Ile Arg Glu Ser Lys 1 5 10 15 Lys Met Ser Leu Lys Glu Val Ala Ala Gly Asp Ile Ser Val Ala Gln 20 25 30 Leu Ser Arg Phe Glu Arg Gly Val Asn Gly Ile Thr Leu Asp Ser Phe 35 40 45 Tyr Cys Cys Leu Lys Asn Met Ala Val Ser Leu Glu Glu Phe Gln Tyr 50 55 60 Val Tyr His Asn Tyr Ile Asp Ser Asp Asp Val Leu Phe Ser Lys Lys 65 70 75 80 Val Ala Asp Ala Tyr Gln Glu Asn Asn Val Val Lys Leu Gln Asn Ile 85 90 95 Leu Ser Ser Ser Glu Ala Leu Thr Glu Gln Phe Pro Glu Lys Lys Asn 100 105 110 Tyr Lys Leu Asn Thr Ile Ile Val Arg Ala Leu Leu Ser Ser Cys Cys 115 120 125 Ser Asp Phe Gln Ile Ser Lys Lys Asp Ile Glu Phe Leu Thr Asp His 130 135 140 Leu Tyr Ser Val Glu Glu Trp Gly Arg Tyr Glu Leu Trp Leu Phe Thr 145 150 155 160 Asn Ser Val Asp Leu Met Thr Leu Glu Thr Leu Glu Thr Phe Ala Ser 165 170 175 Glu Met Ile Asn Arg Thr Gln Phe Tyr Asn Asn Leu Pro Glu Asn Arg 180 185 190 Arg Arg Ile Ile Lys Met Leu Leu Asn Val Ile Ser Val Cys Ile Glu 195 200 205 Gly Asn His Leu Leu Val Ala Met Arg Phe Leu Asn Tyr Leu Asp His 210 215 220 Ser Lys Ile Pro Glu Thr Asp Leu Tyr Asp Arg Thr Leu Ile Lys Tyr 225 230 235 240 His Arg Ala Leu Tyr Ser Tyr Lys Val Gly Asn Thr Asn Ala Leu Ser 245 250 255 Asp Ile Glu Gln Cys Leu Ser Phe Phe Glu Phe Leu Asp Ser Phe Gly 260 265 270 Val Ala Gln Lys Leu Lys Glu Gln Phe Glu Arg Ile Cys Leu Ser 275 280 285 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rggL <400> 3 gctttgaccg aacagtttcc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rggR <400> 4 cattggtatt ccccaccttg 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nested primer 1 <400> 5 tcgagcggcc gcccgggcag gt 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nested primer 2R <400> 6 agcgtggtcg cggccgaggt 20

Claims (7)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 포함하는 프라이머쌍으로서, 스트렙토코커스 미티스(S. mitis), 스트렙토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 파이오제네스(S. pyogenes), 스트렙토코커스 고도니(S. godonii), 스트렙토코커스 인펀티스(S. infantis), 스트렙토코커스 오스트라리스(S. australis), 스트렙토코커스 시넨시스(S. sinensis), 스트렙토코커스 상기니스(S. sanguinis), 스트렙토코커스 파라상기니스(S. parasanguinis), 스트렙토코커스 콘스텔라투스(S. constellatus), 스트렙토코커스 인터메디우스(S. intermedius), 및 스트렙토코커스 안기노서스(S. anginosus)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 미생물로부터 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis)를 분별하여 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis) 검출용 프라이머쌍.
5. 제 4 항의 프라이머쌍을 이용하여 스트렙토코커스 오라리스를 검출하는 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 검출은 PCR(Polymerase Chain Reaction) 분석 방법에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 4 항의 프라이머쌍을 유효성분으로 포함하는 스트렙토코커스 오라리스 검출용 조성물.

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