KR101050391B1

KR101050391B1 - 폐렴구균 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 폐렴구균의 검출방법

Info

Publication number: KR101050391B1
Application number: KR1020080087824A
Authority: KR
Inventors: 김원용; 박희국; 신용호; 김지원
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2008-09-05
Filing date: 2008-09-05
Publication date: 2011-07-19
Also published as: KR20100028880A

Abstract

본 발명은 폐렴구균 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 폐렴구균의 검출방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 서열번호 2의 아미노산을 가지는 cpsA를 암호화하는 유전자를 검출의 표적으로 이용하여 폐렴구균을 효과적으로 검출할 수 있도록 고안된, 폐렴구균 cpsA유전자 및 이에 상보적인 염기서열 유래의 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 폐렴구균의 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 검출방법은 폐렴구균만을 특이적으로 검출할 수 있는 효과가 있으며, 특히 폐렴구균과 매우 유사한 스트렙토코커스 속 균들(Streptococcus strains)과 폐렴구균을 구별할 수 있는 장점이 있다.

폐렴구균, 스트렙토코커스, 프라이머, 프로브, 검출방법

Description

폐렴구균 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 폐렴구균의 검출방법{Primer and probe for detection of Streptococcus pneumoniae and method for detecting Streptococcus pneumoniae using thereof}

본 발명은 폐렴구균 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 폐렴구균의 검출방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 서열번호 2의 아미노산을 가지는 cpsA를 암호화하는 유전자를 검출의 표적으로 이용하여 폐렴구균을 효과적으로 검출할 수 있도록 고안된, 폐렴구균 cpsA 유전자 및 이에 상보적인 염기서열 유래의 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 폐렴구균의 검출하는 방법에 관한 것이다.

연쇄구균(Streptococcus)은 사람의 구강과 호흡기도에 존재하는 이질적인 그람양성세균 군으로, 주요 병원성균인 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 파이오젠스(S. pyogenes) 및 화농성연쇄상구균(S. agalactiae)를 포함한 48종으로 구성된다(Facklam et al., Clin Microbiol Rev, 15:613-630, 2002).

일반적으로 연쇄구균은 16S rDNA 염기서열에 의하여 `pyogenic', `mitis‘, `salivarius', `bovis', `mutans' 및 `anginosus' 군 균 등 6개의 분류군으로 구성되며(Kawamura et al ., Int J Syst Bacteriol, 45:406-408, 1995), 혈청학적 특성 에 기준하여 A-H, K-M 및 O-V(Lancefield et al ., J Exp Med, 145:490-499, 1977)로 분류되며, 적혈구에 대한 용혈성(alpha,　beta 및 gamma) 및 생화학적 성상에 의해서 서로 감별된다(Coykendall, Clin Microbiol Rev, 2:315-328, 1989; Whiley et al., Oral Microbiol Immunol, 13:195-216, 1998).

상기 ‘mitis’ 군 균에 속하는 균들은 스트렙토코커스 미티스(S. mitis), 폐렴구균(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 오라리스(S. oralis), 스트렙토코커스 고도니(S. gordonii), 스트렙토코커스 상기우스(S. sangius) 및 스트렙토코커스 파라상기우스(S. parasangius)등이 있다. 이 중 폐렴구균은 사람의 구강에 존재하는 상주균으로 건강한 사람의 40~60%가 보균자인데, 보균자의 대다수는 병독성이 약한 종류의 균을 지니고 있고 보균상태도 영구적이 아니라 산발적이며 간헐적인 것이 특징이다. 이러한 폐렴구균은 호흡기를 통하거나 맥관 계통에 의해서 확산되며, 신체의 다른 부위로 이동하여 폐렴, 이하선염, 결막염, 복막염, 중이염, 심내막염 및 패혈증 등을 일으키며(Suzuki et al ., J Clin Microbiol, 43: 4528-4534, 2005),미국에서는 연간 500,000건의 폐렴감염환자의 원인체로, 40,000명의 사망을 초래한다(Williams et al ., Ann Intern Med, 108: 616-625, 1988).

반면 스트렙토코커스 미티스와 스트렙토코커스 오라리스는 인간에게 주로 충치를 형성하게 하는 것으로 알려져 왔으나, 최근 연구에 의하면 아급성 심내막염 등 심장질환에 관련된 질병을 일으키는 것으로 보고되어 그 중요성이 증가하고 있다(Whatmore et al., Infect Immun, 68:1374-1382, 2000).

병원성 연쇄구균의 동정은 배양법에 기초한 일련의 생리 화학적 검사와 혈청학적 시험으로 수행되어 왔다(Freney et al ., J Clin Microbiol, 30:2657-2661, 1992). 그러나 종(species) 수준에서의 동정은 균이 늦게 성장하는 특성으로 인하여 생리 화학적 검사에 7일 정도의 기간이 소요되며, 검사 결과도 분자 진화적 계통도에 근거한 유전학적 결과와 일치하지 않는 경우가 있었다(Whiley et al., Oral Microbiol Immunol, 13:195-216, 1998; Heath, Paediatr Respir Rev, 1:4-7, 2000).

폐렴구균의 동정에는 4가지 특성, 즉 집락 형태, 옵토친(optochin) 감수성 시험, 담즙 용해성 및 캡슐 다당류 항체에 대한 응집반응 등의 방법이 이용되어 왔으나, 많은 환자 분리주들이 한 종류 이상의 표준 검사방법에 대해 비정형 반응을 나타내고, 스트렙토코커스 미티스와 스트렙토코커스 오라리스 등 다른 알파용혈성 연쇄구균들도 이러한 시험에서 유사한 결과를 보여 정확한 동정에 어려움이 있었다(Finland et al., J Clin Microbiol, 5:154-166, 1997; Kontiainen et al., Eur J Clin Microbiol, 6:422-424, 1987; Mundy et al., Microbiol Infect Dis, 109:55-61, 1998; Munoz et al., Diagn Microbiol, 13:63-66, 1990).

최근, 이러한 동정의 어려움을 극복하고자 DNA 분석에 근거한 많은 방법들이 연쇄구균의 동정과 검출을 위하여 개발되었다. 예를 들면, 폐렴구균(Davis et al., J Clin Microbiol, 29: 2193-2196, 1991; Pozzi et al., J Clin Microbiol, 27: 370-372, 1989), 스트렙토코커스 파이오젠스, 화농성연쇄상구균 및 스트렙토코커스 보비스(S. bovis) (Whitehead et al., J Clin Microbiol, 31: 2387-2391, 1993)에 대한 특이 프로브를 이용한 하이브리다이제이션 방법이 개발되었으나 실험방법이 복잡하고 시간이 많이 소요되며 특이성이 문제가 있었다. 따라서 현재에는 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction: PCR)에 기초한 방법들이 널리 이용되고 있다 (Salo et al., J Infect Dis, 171:479-482,1995).

Salo 등은 pneumolysin 유전자(ply) (Salo et al., J Infect Dis, 171:479-482,1995), Gillespie 등은 autolysin 유전자(lytA) (Gillespie et al., J Clin Microbiol, 32:1308-1311, 1994)를 이용하여 프라이머들을 제작하고, 중합효소연쇄반응을 개발하여 폐렴구균과 유사 연쇄구균들을 대상으로 시험한 결과 특이성을 보고한 바 있었다. 또한 ply 유전자와 lytA 유전자를 바탕으로 pneumococcal surface antigen A(psaA)(Morrison et al., J Clin Microbiol, 38:424-437, 2000), superoxide dismutase(sodA) (Kawamura et al., Mirobiology, 145:2605-2613, 1999)와 penicillin binding protein(pbp2b)(O'Neill et al ., J Clin Microbiol, 37:157-160, 1999)를 이용한 폐렴구균 검출법이 개발 되었으나 lytA 유전자와 ply 유전자는 스트렙토코커스 미티스와 스트렙토코커스 오라리스에서도 존재하므로(Whatmore et al., Infect Immun, 68:1374-1382, 2000) 다른 방법을 이용한 폐렴구균 검출법의 필요성이 요구되었다. 그 후 일본의 Suzuki 등(Suzuki et al ., J Clin Microbiol. 43:4528-4534, 2005)은 subtractive hybridization 기술을 이용하여 폐렴구균을 검출해내는 프라이머(Spn9802, Spn9828)를 개발하여 폐렴구군을 비롯한 여러 구강 연쇄구균들을 대상으로 시험한 결과 기존의 보고된 lytA와 ply 프라이머들보다 특이성이 높으며, 따라서 폐렴구군의 검출에 이용할 수 있음을 보고 한 바 있다(Abdeldaim et al ., Microbiol Infect Dis. 60:143-150, 2008; Suzuki et al ., J Med Microbiol. 55:709-714, 2006).

또한 대한민국 등록 특허(등록번호 제0763906호)에는 호흡기 질환과 관련된 것으로 알려진 폐렴구균을 포함한 9종의 박테리아에 특이적인 표적 서열 증폭용 프라이머 세트 및 프로브 올리고뉴클레오티드에 대하여 개시되어 있으나, 이는 폐렴구균을 포함한 9종의 박테리아에 모두 공통적인 표적서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트에 관한 것이므로 폐렴구균만을 특이적으로 인식할 수 없다는 문제점이 있다.

따라서, 상술한 문제점을 극복하면서 신속하고 효과적인 폐렴구균의 동정방법이 여전히 요구되고 있다.

한편, 비교유전체 연구의 한 방법인 SSH(suppressive subtractive hybridization)는 원래 cDNA 라이브러리들의 발현 정도의 차이점을 알아보기 위하여 고안되었으나 현재에는 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)(Akopyants et al., Proc Natl Acad Sci USA, 95:13108-13113, 1998), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)(Mahairas et al., J Bacteriol, 178:1274-1282, 1996), 수막구균(Neisseria meningitidis)(Tinsley et al., Proc Natl Acad Sci USA, 93:11109-11114, 1996) 그리고 탄저균(Bacillus anthracis)(Kim et al., J Med Microbiol. 57:279-286, 2008) 등 유전학적으로 높은 근연관계에 있는 미생물들의 유전체 상이점을 규명하는데도 성공적으로 사용되고 있다.

본 발명자들은 이와 같은 점에 착안하여 폐렴구균만을 검출 및 동정하데 이 용할 수 있는 특이유전체를 규명하기 위하여 게노믹 SSH기술을 이용한 결과, 구강 연쇄구균 중 대표적인 병원균인 스트렙토코커스 미티스와 폐렴구균의 유전체 차이를 규명하였으며 폐렴구균 특이 유전자를 발굴하였고, 상기 특이 유전자 즉, 서열번호 2의 아미노산을 가지는 cpsA를 암호화하는 유전자를 검출의 표적으로 이용하여 프라이머 및 프로브를 제작한 결과, 기존의 보고된 lytA, ply, Spn9802 및 Spn9828 프라이머들 보다 특이성과 민감성이 우수하여 폐렴구균만을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 폐렴구균의 cpsA 유전자를 검출의 표적으로 이용하여 폐렴구균을 효과적으로 검출할 수 있도록 고안된, 폐렴구균 cpsA유전자 및 이에 상보적인 염기서열 유래의 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 폐렴구균의 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산을 가지는 cpsA를 암호화하는 유전자, 이에 상보적인 염기서열 및 이들로부터 유래된 염기서열로 이루어진 프로브 및 상기 프로브가 기질 상에 집적되어 있는 것을 특징으로 하는 폐렴구균 검출용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산을 가지는 cpsA를 암호화하는 유전자로부터 유래된 서열번호 3 내지 서열번호 44로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 가지는 프라이머를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 또는 프로브를 이용한 폐렴구균을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 또는 프로브를 포함하는 폐렴구균 검출용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 폐렴구균 검출용 프로브를 제공한다. 본 발명에서 제공되는 프로브는 (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열; (b) 상기 (a)에 상보적인 염기서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 염기서열에서 유래되고, 서열번호 3 내지 서열번호 44로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하는 20bp 이상의 연속적인 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는 상기 (c)의 염기서열은 상기 (a) 또는 (b)의 염기서열에서 유래되고, 서열번호 3 내지 서열번호 44로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하는 20bp 이상이고 50bp 이하, 보다 바람직하게는 20bp 이상이고 100bp 이하의 연속적인 염기서열이다. 또한 상기 (a)의 염기서열은 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 것이 바람직하다. 또한 본 발명의 프로브는 폐렴구균 특이적 검출에 영향을 주지 않는 범위 내에서 변형(예 : 부가, 결실, 치환)될 수 있다.

상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 cpsA를 암호화하는 유전자는 폐렴구균 특이적이라는 특징이 있다. 따라서 본 발명의 프로브는 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 cpsA를 암호화하는 유전자, 이에 상보적인 염기서열 또는 이들로부터 유래된 염기서열로 이루어져 있으며, 폐렴구균을 제외한 스트렙토코커스 속 균주에는 비특이적이고 폐렴구균에만 특이적인 특징이 있기 때문에 폐렴구균을 효율적으로 검출할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 폐렴구균의 cpsA 유전자가 폐렴구균을 제외한 스트렙토코커스 속 균주로부터 폐렴구균을 구별할 수 있는 특이 유전자임을 확인하였다(실시예 1).

본 발명은 서열번호 2의 아미노산을 가지는 폐렴구균의 cpsA를 암호화하는 유전자 및 이에 상보적인 염기서열 유래의 프로브 및 상기 프로브가 기질 상에 집적되어 있는 것을 특징으로 하는 폐렴구균 검출용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명에서 용어 “프로브”란 DNA 또는 RNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 라벨링 되어 있어서 특정 DNA 또는 RNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위원소 등으로 표지될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기의 프로브가 기질 상에 집적되어 있는 것을 특징으로 하는 폐렴구균 검출용 마이크로어레이를 제공한다.

상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어진다. 프로브 폴리뉴클레오티드를 기판 상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 “프로브 폴리뉴클레오티드”는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.

본 발명의 폐렴구균과 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드를 기판 상에 고정화 하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

본 발명은 또한, 폐렴구균 검출용 프라이머를 제공한다.

바람직하게는 본 발명에서 제공하는 프라이머는 서열번호 3 내지 서열번호 44로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 가질 수 있다. 또한 본 발명의 프라이머는 폐렴구균 특이적 검출에 영향을 주지 않는 범위 내에서 변형(예: 부가, 결실, 치환)될 수 있다. 본 발명의 프라이머는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 폐렴구균의 cpsA 암호화하는 염기서열로 이루어진 유전자에서 유래된 서열로 서열번호 3 내지 서열번호 44로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열로 이루어져 있다. 본 발명의 일실시예에서는 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행한 결과, 폐렴구균과 다른 스트렙토코커스 속 균주, 특히 분류학적, 분자생물학적으로 폐렴구균과 매우 유사한 스트렙토코커스 미티스, 스트렙토코커스 오라리스 , 스트렙토코커스 고도니, 스트렙토코커스 상기우스 및 스트렙토코커스 파라상기우스를 구별할 수 있음을 확인하였다(도 5 참조).

본 발명에서 용어 “프라이머”란 상보적인 템플레이트와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.

상기 프라이머는 RFLP(restriction fragment length polymorphism), RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(inter-simple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism) 등과 같이 당업계에 공지된 다양한 DNA 분석에 적합하도록 디자인될 수 있다.

본 발명은 또한, (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열; (b) 상기 (a)에 상보적인 염기서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 염기서열에서 유래되고, 서열번호 3 내지 서열번호 44로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하는 20bp 이상의 연속적인 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프로브 또는 서열번호 3 내지 서열번호 44로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 가지는 프로브를 이용하여 폐렴구균을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 프라이머나 프로브를 이용하여 폐렴구균을 검출할 수 있는 방법으로는, PCR(polymerase chain reaction) 분석, DNA 시퀀싱(DNA sequencing), 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism) 분석, RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(inter-simple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism), 노던 하이브리다이제이션(Northern hybridization) 및 서던 하이브리다이제이션(Southern hybridization) 등과 같은 당업계에 공지된 다양한 DNA 다형성 분석을 이용하여 수행될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 본 발명의 일실시예에서는 폐렴구균의 cpsA 유전자 및 이에 상보적인 염기서열 유래의 프라이머를 이용하여 PCR로 폐렴구균만을 특이적으로 검출하는 방법이 예시되어 있다. 즉, 서열번호 11과 서열번호 12의 프라이머 조합을 이용하여 PCR 분석을 수행하였고. 그 결과, 본 발명의 프라이머가 폐렴구의 cpsA 유전자만을 특이적으로 증폭함으로써 폐렴구균을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 5 참조).

본 발명은 또한, (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열; (b) 상기 (a)에 상보적인 염기서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 염기서열에서 유래되고, 서열번호 3 내지 서열번호 44로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하는 20bp 이상의 연속적인 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프로브 또는 서열번호 3 내지 서열번호 44로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 가지는 프로브를 포함하는 폐렴구균 검출용 조성물을 제공한다.

상기 조성물에는 상기 프라이머 또는 프로브를 이용하여 폐렴구균을 검출하는데 필요한 실험과정(예: PCR, 서던 블럿 등) 및 결과 확인에 필요한 여러 가지 시약들, 예컨대, PCR 반응 혼합물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및/또는 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 검출방법은 폐렴구균만을 특이적으로 검출할 수 있는 효과가 있으며, 폐렴구균을 제외한 스트렙토코커스 속 균주들, 특히 폐렴구균과 분류학적, 분자생물학적으로 매우 유사한 스트렙토코커스 미티스, 스트렙토코커스 오라리스, 스트렙토코커스 고도니, 스트렙토코커스 상기우스 및 스트렙토코커스 파라상기우스 등과 폐렴구균을 구별할 수 있는 장점이 있어, 폐렴구균의 검출에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명은 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 본 실시예로 한정하고자 하는 것은 아니다.

<실시예 1>

SSH(Suppression subtractive hybridization)에 의한 폐렴구균균 특이 유전체의 규명

<1-1> 게노믹 DNA ( Genomic DNA ) 분리

게노믹 DNA의 분리는 폐렴구균(S. pneumoniae) KCTC 5080^T 과 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) KCTC 3556^T를 실험균주로 하였으며, Ausubel 등의 방법(Ausubel et al., Current protocols in molecular biology, section 22.4, John Wiely and Sons, New York, N.Y., 1994)에 준하여 실시하였다.

먼저, 3㎖의 뉴트리언트 브로스(nutrient broth. Difco사)에서 배양한 실험 균주를 1.5㎖ 마이크로튜브로 옮기고 15,000rpm에서 2분간 원심하여 균체를 침전시켰다. 침전된 균체는 100㎕의 TE 버퍼(pH 8.0)를 가하여 잘 현탁하고, 20㎕의 10% SDS(sodium dodecyl sulfate)와 10㎕의 프로테아제(proteinase) K (10㎎/㎖)를 가하여 50℃에서 1시간 반응시켰다. 상기 반응시킨 균체는 200㎕의 10% CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)/0.7M NaCl 용액을 가하여 잘 혼합한 후 다시 65℃에서 10분간 반응하고 여기에 동량의 클로로포름/이소아밀알콜(24:1) 용액을 가하여 5분간 진탕한 다음 4℃에서 5분간 원심분리한 후 상층액만 새로운 튜브로 옮겼다. 여기에 1/10배의 3M 소디움 아세테이트와 2배의 100% 에탄올을 가하여 게노믹 DNA를 침전시켰다. 상기 침전된 게노믹 DNA는 70% 에탄올로 세척한 다음, 50㎕의 TE 완충액에 용해하고 RNase를 최종농도가 20㎍/㎖ 되도록 가한 후 42℃에서 30분간 반응시켜 RNA를 제거하였다. 상기 정제된 DNA는 스펙트로미터(Model MBA 2000, Perkin-Elmer사, Norwalk, CN, USA)를 사용하여 260nm에서 정량하고 -20℃에 보존하면서 실험에 사용하였다.

<1-2> 제한효소 절단

게노믹 DNA에 어댑터(adaptor)를 연결하기 위하여, 상기 추출한 게노믹 DNA에 RsaI 제한효소를 처리하였다.

실시예 <1-1>에서 분리 정제한 폐렴구균(S. pneumoniae) KCTC 5080^T 과 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) KCTC 3556^T의 게노믹 DNA 각 2 ㎍에 제한효소 RsaI (10U/㎕, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) 1.5㎕와 10X 버퍼 5㎕를 가하여 37℃ 항온수조에서 5~16시간 동안 절단한 후, 1.0% LE 아가로즈 겔(FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA)에서 100 V로 20분간 전기영동하였다. 전기영동한 후 EtBr(ethidium bromide) (10㎎/㎖)로 10분간 염색하고, Gel Doc 2000 시스템(Bio-Rad사, Hercules, CA, USA)을 이용하여 절단 유무를 확인하였다. 그 결과 도 1에 나타난 바와 같이, 절단된 것을 확인할 수 있었으며, 절단을 확인한 다음 0.2M EDTA 용액을 2.5㎕ 첨가하여 반응을 정지시켰다. 절단된 DNA는 페놀/클로로포름/이소아밀알콜(25:24:1) 용액을 사용하여 정제하고 0.5배의 3 M 소디움 아세테이트와 2.5배의 100% 에탄올을 가하여 침전시킨 다음 80% 에탄올로 세척하고 6.5㎕의 3차 멸균증류수에 용해하였다.

<1-3> SSH(Suppressive Subtractive Hybridization)

SSH(Suppressive subtractive hybridization)는 CLONTECH Laboratories사(Palo Alto, CA U.S.A.)의 하이브리다이제이션 키트(PCR-Select Bacterial Genome Subtractive Hybridization kit, Catalog#: K1809-1)를 사용하였으며, SSH과정의 모식도를 도 2에 나타내었다.

먼저 시험 균주인 폐렴구균(S. pneumoniae) KCTC 5080^T의 어댑터가 연결된 테스터 DNA(adaptor-ligated tester DNA)를 만들기 위해, RsaI으로 절단된 폐렴구균(S. pneumoniae) 게노믹 DNA 1.2㎕에 증류수 1.8㎕를 첨가하여 희석한 다음 5X 라이게이션 버퍼 2㎕, T4 DNA 라이게이즈 (400U/㎕) 1㎕와 증류수 1.8㎕를 가하여 라이게이션 마스터 믹스(ligation master mix)를 제작하였다. 라이게이션 반응 혼합액은 두개의 튜브에 각각 희석 DNA 1㎕, 10uM 어댑터 1 또는 어댑터 2R 2㎕ 및 라이게이션 마스터 믹스(ligation master mix) 7㎕를 혼합하여 최종 부피가 10㎕이 되도록 조절한 다음 16℃ 항온수조에서 하룻밤 동안 반응시켰다.

1차 하이브리다이제이션(hybridization)을 위해 비교 균주인 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) KCTC 3556^T DNA 2㎕, 1-어댑터가 연결된 테스터 DNA(1-adaptor-linked tester DNA) 1㎕ 및 하이브리다이제이션 버퍼를 사용하여 총 부피가 4㎕이 되도록 조정한 다음 98℃에서 1분 30초 동안 변성시키고 63℃에서 1시간 30분간 하이브리다이제이션을 실시하였다. 2R-어댑터가 연결된 테스터 DNA(2R-adaptor-linked tester DNA) 시료도 상기와 동일한 방법으로 수행하였다.

2차 하이브리다이제이션은 비교 균주인 스트렙토코커스 미티스(S. mitis) KCTC 3556^T의 게노믹 DNA 1㎕에 2X 하이브리다이제이션 버퍼 1㎕을 첨가하여 98℃에서 1분30초 동안 변성시킨 다음 1차 하이브리다이제이션 반응액(1-adaptor-linked tester DNA 이용한 1차 하이브리다이제이션 반응액과 2R-adaptor-linked tester DNA를 이용한 1차 하이브리다이제이션 반응액 2가지)과 잘 혼합하여 63℃에서 하룻밤 반응시켰다. 여기에 200㎕의 희석 버퍼를 첨가하여 63℃에서 7분 동안 반응시키고 -20℃에 보관하였다.

<1-4> 네스티드 PCR( nested PCR )

폐렴구균(S. pneumoniae)의 특이 유전체를 규명하기 위하여 네스티드 PCR(nested PCR)을 실시하였다. 상기 실시예 <1-3>의 하이브리다이제이션 반응액 1㎕에 PCR 프라이머(adaptor sequence specific primer, 서열번호 45) 1㎕, 10X 버퍼 2.5㎕, Taq DNA 중합효소(Roche사) 1㎕ 및 증류수 19.5㎕을 가하여 72℃에서 2분간 반응시킨 후, DNA thermal cycler (Model 480, Perkin Elmer사)에서 94℃에서 30초, 66℃에서 30초, 72℃에서 1.5분의 반응을 25회 실시하였다. 다시 PCR 산물 1 ㎕과 증류수 39㎕을 혼합한 후 2차 PCR을 실시하였다. 프라이머로는 nested primer 1(서열번호 46)과 nested primer 2R(서열번호 47)을 사용하였으며, 94℃에서 30초, 68℃에서 30초, 72℃에서 1.5분 반응을 12회 실시하였다. PCR 증폭 산물은 1.2% LE 아가로즈 겔(FMC)에서 전기영동하여 확인하였다(결과미도시).

<1-5> 클로닝

PCR 증폭 산물은 TOPO TA 클로닝 시스템(Invitrogen사, Carlsbad, CA, U.S.A.)을 사용하여 pCR 2.1 벡터에 클로닝하고 E. coli TOP10으로 형질전환 하였다.

먼저, 상기 실시예 <1-4>의 PCR 산물 1㎕ (10ng)에 DNA 라이게이즈 1㎕ (1U), 10X 버퍼 1㎕, 10mM ATP 1㎕ 및 D.W 6㎕를 차례로 가하고 실온에서 5분간 라이게이션하였다. 라이게이션 용액 1 ㎕를 취하여 50 ㎕의 E. coli TOP 10 컴피턴트 셀(competent cell)과 잘 혼합한 다음 얼음에서 30분간 방치하고 42℃에서 30초간 열 충격을 가하여 DNA를 세포내로 유입시켰다. 형질 전환한 E. coli 배양액은 37℃에서 220rpm으로 1시간 동안 진탕 배양한 다음, 암피실린(50㎍/㎖), 12㎕의 X-gal (50㎎/㎖)을 함유하는 LB 평판배지 (Sigma-Aldrich사, St. Louis, Mo, U.S.A.)에 도말하고 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. PCR 증폭 산물의 삽입유무를 측정하기 위하여 배양 후 성장한 집락 중 흰색 집락만을 취하고 5 ㎖의 LB 브로스에 접종하여 37℃에서 220 rpm으로 16시간동안 진탕 배양한 다음, 플라스미드 DNA 퓨리피케이션 키트(Plasmid DNA purification kit, Promega사. Madison, WI, U.S.A.)를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 상기 분리한 플라스미드 DNA는 제한효소 EcoRI (Roche사)을 가하여 37℃에서 1시간 절단하고 1.0% LE 아가로즈 겔(FMC)로 전기영동하여 PCR 증폭 산물의 클로닝 유무를 관찰하였다.

<1-6> 리버스 서던 하이브리다이제이션( Reverse southern hybridization )

클로닝이 확인된 플라스미드 DNA로부터 상기 실시예 <1-4>에서 사용한 nested primer 1과 nested primer 2R을 이용하여 폐렴구균(S. pneumoniae) DNA를 PCR로 증폭하였으며 이를 도 3에 도시하였다. 상기 증폭된 DNA 30 ㎕는 100℃에서 5분간 가열하여 변성시킨 후 얼음에 5분간 방치하고 20X SSC (USB Co., Cleveland, OH, U.S.A.)를 동량 첨가하여 총 부피를 100㎕로 하였다. 서던 블럿은 ECL 키트(ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection System, Amersham Biosciences사, Little Chafont, Buckinghamshire, UK)를 이용하였다. 6X SSC에 미리 정치하였던 Hybond-N+ 멤브레인(Amersham Biosciences)은 Bio-Dot 미세여과장치(Bio-Dot Microfitration Apparatus, Bio-Rad사)에 넣어 장착하고 각 웰에 증류수 500㎕씩 분주하여 멤브레인을 가수하였다. 각 웰에 DNA 용액을 50㎕씩 분주하고 2X SSC로 세척한 후 멤브레인을 꺼내어 Whatmann 3 MM 페이퍼 위에서 건조시킨 후 StratalinkerUV 크로스링커 (Stratagene, La Jolla, CA, U.S.A.)를 이용하여 1000J에서 3분 30초간 크로스링킹(crosslinking)하였다. 크로스링킹 후 ECL 하이브리다이제이션 버퍼(hybridization buffer) 6㎖을 첨가하여 42℃에서 30분간 프리하이브리다이제이션(prehybridization) 한 후, 표지된 프로브를 넣고 하룻밤 반응시켰다. 상기 표지된 프로브(probe)는 폐렴구균(S. pneumoniae)의 게노믹 DNA(100㎍/㎖) 200㎕을 RsaI(Roche)으로 절단하여 1시간 동안 37℃에서 반응시킨 후 증류수 30㎕에 용해시키고 100℃에서 10분간 변성시킨 다음 DNA 표지용액과 글루타르알데히드(glutaraldehyde)용액을 동량 첨가하고 37℃에서 20분간 반응시켜 제조하였다. 한편, 반응 후 멤브레인은 꺼내어 0.4% SDS, 0.5X SSC에서 20분간 1회, 2X SSC에서 5분간 2회 세척한 후 건조하고 ECL 검출 시약(ECL detection reagent) 첨가하여 필름 카세트(Eastman Kodak사, Rochester, NY, U.S.A.)에 멤브레인을 넣고 ECL 필림(Eastman Kodak사)에 현상하였고, 그 결과를 도 4B에 도시하였다.

한편, 상기 폐렴구균에 특이적인 클론이 스트렙토코커스 미티스에는 비특이적임을 확인하기 위하여, 스트렙토코커스 미티스 게노믹 DNA를 프로브로 사용한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 리버스 서던 하이브리다이제이션을 실시하였고, 그 결과를 도 4A에 도시하였다.

상기, 도 4의 A와 B를 비교한 결과, 폐렴구균에 특이적이고, 스트렙토코커스 미티스에는 비특이적인 클론 90개를 선발할 수 있었다.

<1-7> 유전자 염기서열 분석

상기 실시예 <1-6>에서 서던 하이브리다이제이션(Southern hybridization)을 통해 폐렴구균에 양성으로 나타난 클론 90개를 시퀀싱 키트(BigDye Terminatior Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems사, Foster City, CA, U.S.A.)를 이용하여 유전자 염기서열을 분석하였다. 재조합 플라스미드를 프로메가 DNA 정제 키트(Promega DNA purification kit, Promega사)를 이용하여 E. coli로부터 순수 정제한 후 플라스미드 DNA 2 ㎕(50ng)에 반응액(Bigdye terminator ready reaction mixture) 8㎕과 시퀀싱 프라이머(sequencing primer, M13 또는 SP6) 3.2pM을 가하 고 증류수로 최종 부피를 20㎕이 되도록 조정한 다음 GeneAmp™ PCR 시스템 2700(Applied Biosystems사)에서 96℃ 10초, 50℃ 5초, 60℃ 4분을 25회 반복하는 사이클 시퀀싱 PCR(cycle sequencing PCR)을 수행하였다. 여기에 3M 소디움 아세테이트(pH 4.6) 2㎕와 95% 에탄올 50㎕을 가하여 실온에서 15분간 정치한 후 15,000rpm에서 20분간 원심분리하여 DNA를 침전시키고 70% 에탄올 100㎕로 세척한 다음 건조하여 잔여 염색제(dye)를 제거하였다. 정제된 DNA는 TSR (template suppression reagent) 13㎕에 용해하고 95℃에서 2분간 가열한 후 얼음에서 5분간 정치한 다음 ABI PRISM 310 유전자 분석기(ABI PRISM 310 Genetic Analyzer, Applied Biosystems사)에서 전개하였다.

분석한 유전자 염기서열은 미국 BLAST(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)를 이용하여 검색하고 GenBank에 등재된 유전자 염기서열들과 다중 정렬하고 행렬식 유사도를 구하였으며, ORF finder(NCBI)를 이용하여 단백질 코딩 부위를 분석하였다.

분석결과, 상기 분석된 서열이 GenBank AF030374번의 염기서열과 100% 상동성을 나타내어 폐렴구균의 cpsA 유전자(서열번호 1)임을 동정할 수 있었다.

< 실시예 2>

중합효소연쇄반응을 이용한 폐렴구균( S. pneumoniae ) 특이적 유전자 검출

<2-1> 폐렴구균( S. pneumoniae ) 특이적 프라이머의 제작

폐렴구균 특이적 유전자 검출을 위하여 SSH(suppressive subtractive hybridization)에 의해 선별된 유전자 염기서열들 중 cpsA 유전자 서열을 기초로 프라이머 3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) 프로그램을 이용하여 프라이머를 설계하였다(표 1). 설계된 프라이머는 (주)제노텍 (Taejon, Korea)에 의뢰하여 200pM 스케일(scale)로 합성하고 PAGE로 정제하였다. 합성한 프라이머는 10μM 농도로 희석하고 -20℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.

본 발명의 폐렴구균 특이적 프라이머

정방향 프라이머	서열번호	역방향 프라이머	서열번호
TAACGTCAACCGAAGCACTG	3	GAAGATCCGTCCGACCTGTA	4
CTCACTAGCCGATGGAGACC	5	GAAGATCCGTCCGACCTGTA	6
TGTCAGCTCTGTGTCGCTCT	7	GTCGACCGTCAAATCGGTAT	8
CAGCTCTGTGTCGCTCTTTG	9	GTCGACCGTCAAATCGGTAT	10
ACGCAACTGACGAGTGTGAC	11	GATCGCGACACCGAACTAAT	12
CTCTGTGTCGCTCTTTGCAG	13	GTCGACCGTCAAATCGGTAT	14
GAGTTTGATTGCAGGGGAGA	15	GATCGCGACACCGAACTAAT	16
TCCTTGTCAGCTCTGTGTCG	17	GTCGACCGTCAAATCGGTAT	18
TCTGTGTCGCTCTTTGCAGT	19	GTCGACCGTCAAATCGGTAT	20
TGTCAGCTCTGTGTCGCTCT	21	CGACCGTCAAATCGGTATTC	22
TGTCAGCTCTGTGTCGCTCT	23	TCGACCGTCAAATCGGTATT	24
CAGCTCTGTGTCGCTCTTTG	25	CGACCGTCAAATCGGTATTC	26
CAGCTCTGTGTCGCTCTTTG	27	TCGACCGTCAAATCGGTATT	28
CTCTGTGTCGCTCTTTGCAG	29	CGACCGTCAAATCGGTATTC	30
CTCTGTGTCGCTCTTTGCAG	31	TCGACCGTCAAATCGGTATT	32
TGTCAGCTCTGTGTCGCTCT	33	ACTCTGGTCGACCGTCAAAT	34
CAGCTCTGTGTCGCTCTTTG	35	ACTCTGGTCGACCGTCAAAT	36
CTCTGTGTCGCTCTTTGCAG	37	ACTCTGGTCGACCGTCAAAT	38
ACGCAACTGACGAGTGTGAC	39	TCTTCGATGCGTAGTCTGGA	40
TCCTTGTCAGCTCTGTGTCG	41	CGACCGTCAAATCGGTATTC	42
TCCTTGTCAGCTCTGTGTCG	43	TCGACCGTCAAATCGGTATT	44

<2-2> 중합효소연쇄반응 ( PCR )-1

합성된 프라이머(cpsA)가 폐렴구균 유전자만을 특이적으로 검출할 수 있는지 확인하기 위하여, 상기 합성된 프라이머 중 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 조합을 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 우선, 표 2에 개시된 분리 정제한 폐렴구균과 대조 균주들의 DNA 1㎕ (10ng)에 반응액 (10X Taq buffer 2㎕, 2.5 mM dNTPs 1㎕, D.W. 13.7㎕, 10uM 정방향 프라이머 1㎕, 10uM 역방향 프라이머 1㎕와 Taq 중합효소0.3㎕(Intron, Seoul, Korea)를 각 19㎕씩 가한 다음 94℃ 5분 1회, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 40초간의 반응을 30회 반복하고 72℃에서 10분간 반응하여 증폭하였다. PCR 산물은 1% LE 아가로즈 겔(FMC)에서 전기영동하고 증폭 유무 및 크기를 관찰하였다.

실험결과 도 5에 나타난 바와 같이, 상기 프라이머들이 폐렴구균 유전자만을 특이적으로 증폭시키고, 스트렙토코커스 미티스를 비롯한 다른 스트렙토코커스 속 균주와 다른 유사균종의 유전자는 증폭시키지 않는 것을 알 수 있었다.

<2-3> 중합효소연쇄반응(PCR)-2

합성된 프라이머(cpsA)와 현재까지 폐렴구균 검출에 가장 특이성과 민감도가 높다고 알려진 Suzuki 등(2005)의 Spn9802 프라이머와의 비교를 위해 Spn9802 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 우선, 표 2에 개시된 분리 정제한 폐렴구균과 대조 균주들의 DNA 1㎕ (10ng)에 반응액 (10X Taq buffer 2㎕, 2.5 mM dNTPs 1㎕, D.W. 13.7, 10 uM 정방향 프라이머 1㎕, 10uM 역방향 프라이머 1㎕와 Taq 중합효소0.3㎕ (Intron, Seoul, Korea)를 각 19㎕씩 가한 다음 94℃ 5분 1회, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 40초간의 반응을 30회 반복하고 72℃에서 10분간 반응하여 증폭하였다. PCR 산물은 1% LE 아가로즈 겔(FMC)에서 전기영동하고 증폭 유무 및 크기를 관찰하였다.

폐렴구균과 대조 균주들의 종류

Number	Bacterial strain	Source
1	S. pneumoniae KCTC 5080^T	¹KCTC
2	S. pneumoniae CCARM 4009	²CCARM
3	S. pneumoniae CCARM 4019	²CCARM
4	S. pneumoniae CCARM 4033	²CCARM
5	S. pneumoniae CCARM 4109	²CCARM
6	S. pneumoniae CCARM 4112	²CCARM
7	S. pneumoniae CCARM 4113	²CCARM
8	S. pneumoniae CCARM 4114	²CCARM
9	S. pneumoniae CCARM 4115	²CCARM
10	S. pneumoniae ChDC 4-0134	³ChDC
11	S. pneumoniae ChDC 4-0749	³ChDC
12	S. pneumoniae ChDC 6-4740	³ChDC
13	S. pneumoniae CCARM 4003	²CCARM
14	S. pneumoniae CCARM 4005	²CCARM
15	S. pneumoniae CCARM 4078	²CCARM
16	S. pneumoniae CCARM 4079	²CCARM
17	S. pneumoniae CCARM 4080	²CCARM
18	S. pneumoniae CCARM 4084	²CCARM
19	S. pneumoniae CCARM 4085	²CCARM
20	S. pneumoniae CCARM 4088	²CCARM
21	S. pneumoniae CCARM 4106	²CCARM
22	S. pneumoniae CCARM 4116	²CCARM
23	S. pneumoniae CCARM 4081	²CCARM
24	S. pneumoniae CCARM 4091	²CCARM
25	S. pneumoniae CCARM 4111	²CCARM
26	S. pneumoniae CCARM 4059	²CCARM
27	S. mitis KCTC 3556^T	¹KCTC
28	S. mitis ChDC B183	³ChDC
29	S. mitis ChDC B186	³ChDC
30	S. mitis ChDC B193	³ChDC
31	S. mitis ChDC B194	³ChDC
32	S. mitis ChDC B227	³ChDC
33	S. mitis ChDC B231	³ChDC
34	S. mitis ChDC B239	³ChDC
35	S. mitis ChDC B242	³ChDC
36	S. mitis ChDC B253	³ChDC
37	S. mitis ChDC B258	³ChDC
38	S. mitis ChDC B260	³ChDC
39	S. mitis ChDC B279	³ChDC
40	S. mitis ChDC B286	³ChDC
41	S. mitis ChDC B303-1	³ChDC
42	S. mitis ChDC B315	³ChDC
43	S. mitis ChDC B317	³ChDC
44	S. pyogenes KCTC3984^T	¹KCTC
45	S. pyogenes KCTC 3096	¹KCTC
46	S. pyogenes KCTC 3208	¹KCTC
47	S. oralis KCTC 13048^T	¹KCTC
48	S. oralis ATCC 9811	⁶ATCC
49	S. oralis DSMZ 20379	⁵DSMZ
50	S. oralis DSMZ 20066	⁵DSMZ
51	S. godonii KCTC 3286^T	¹KCTC
52	S. godonii ChDC B180	³ChDC
53	S. godonii ChDC B211	³ChDC
54	S. godonii ChDC B216	³ChDC
55	S. godonii ChDC B241	³ChDC
56	S. sanguinis KCTC 3284^T	¹KCTC
57	S. sanguinis ChDC B203	³ChDC
58	S. sanguinis ChDC B219	³ChDC
59	S. sanguinis ChDC B304-1	³ChDC
60	S. sanguinis ChDC B304-2	³ChDC
61	S. sanguinis ChDC B304-3	³ChDC
62	S. sanguinis ChDC B305-1	³ChDC
63	S. sanguinis ChDC B305-2	³ChDC
64	S. sanguinis ChDC YSA 1	³ChDC
65	S. parasanguinis KCTC 13046^T	¹KCTC
66	S. parasanguinis ChDC B185	³ChDC
67	S. parasanguinis ChDC B195	³ChDC
68	S. parasanguinis ChDC B212	³ChDC
69	S. parasanguinis ChDC B213	³ChDC
70	S. parasanguinis ChDC B215	³ChDC
71	S. parasanguinis ChDC B217	³ChDC
72	S. parasanguinis ChDC OS49	³ChDC
73	S. constellatus ATCC 27823	⁶ATCC
74	S. constellatus B280	⁴KCOM
75	S. constellatus B284	⁴KCOM
76	S. constellatus B290	⁴KCOM
77	S. intermedius KCTC 3268^T	¹KCTC
78	S. ntermedius KB80	⁴KCOM
79	S. intermedius KB80	⁴KCOM
80	S. intermedius KB717	⁴KCOM
81	S. anginosus ATCC 33397	⁶ATCC
82	S. anginosus YA1	⁴KCOM
83	S. anginosus YA3	⁴KCOM
84	S. anginosus YA5	⁴KCOM
85	S. anginosus YA6	⁴KCOM
86	S. anginosus YA7	⁴KCOM
87	S. anginosus YA8	⁴KCOM
88	S. anginosus YA9	⁴KCOM
89	S. anginosus YA10	⁴KCOM
90	S. anginosus YA11	⁴KCOM
91	S. anginosus YA12	⁴KCOM
92	S. anginosus YA13	⁴KCOM
93	S. anginosus B181	⁴KCOM
94	S. anginosus YA201	⁴KCOM
95	S. anginosus B232	⁴KCOM
96	S. anginosus B248	⁴KCOM
97	S. anginosus B252	⁴KCOM
98	S. anginosus B252	⁴KCOM
99	S. anginosus B287	⁴KCOM
100	S. anginosus B311	⁴KCOM
101	S. anginosus B407-1	⁴KCOM
102	L. plantarum DSMZ 20686^T	⁵DSMZ
103	L. lactis sub sp cremoris DSMZ 40699^T	⁵DSMZ
104	L. lactis sub sp hordiae KCTC 3768^T	¹KCTC
105	L. piscum KCTC 3639^T	¹KCTC
106	L. garvieae KCTC 3772^T	¹KCTC
107	L. garvieae LMG 8162	⁶LMG
108	L. garvieae LMG 8501	⁶LMG
109	L. garvieae LMG 9472	⁶LMG
110	L. garvieae LMG 14494	⁶LMG
111	L. lactis sub sp lactis KCTC 3769^T	¹KCTC
112	L. lactis sub sp lactis KCTC 3191	¹KCTC
113	L. lactis sub sp lactis KCTC 2013	¹KCTC
114	L. lactis sub sp lactis KCTC 3894	¹KCTC
115	L. lactis sub sp lactis KCTC 3926	¹KCTC
116	E. solitariusKCTC 3553^T	¹KCTC
117	E. hirae KCTC 3616^T	¹KCTC
118	E. mundtii KCTC 3630^T	¹KCTC
119	E. malodoratus KCTC 3641^T	¹KCTC
120	E. cecorum KCTC 3642^T	¹KCTC
121	E. saccharolyticus KCTC 3643^T	¹KCTC
122	E. villorum KCTC 13904^T	¹KCTC
123	E. haemoperoxidus KCTC 13910^T	¹KCTC
124	E. moraviensis KCTC 13911^T	¹KCTC
125	E. phoeniculicola KCTC 3818^T	¹KCTC
126	E. solitarius KCTC 3923^T	¹KCTC
127	E. raffinosus KCTC 5189^T	¹KCTC
128	E. avium KCTC 5190^T	¹KCTC
129	E. faecalis KCTC 3206^T	¹KCTC
130	V. fluvialis LMG 9464^T	⁷LMG
131	V. salmoninarum LMG 11491^T	⁷LMG
132	V. lutrae LMG 19537^T	⁷LMG

¹KCTC: Korea Collection for Type Culture (Taejon, Korea), ²CCARM: Culture Collection of Antibiotics Resistant Microbe (korea), ³ChDC: Chosun University Dental College, ⁴KCOM: Korean Collection for Oral Microbiology, ⁵DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen ⁶ATCC: American Type culture Collection (Manassas, VA, U.S.A), ⁷LMG: Belgian Co-Ordinated Collection of Micro organism (BCCM/ LMG Bacteria Collection), ^T:type strain.

실험결과 도 6에 나타난 바와 같이, 상기 프라이머들은 폐렴구균 유전자 이외에도 스트렙토코커스 미티스, 스트렙토코커스 오라리스 , 스트렙토코커스 고도니, 스트렙토코커스 상기우스 및 스트렙토코커스 파라상기우스를 비롯한 다른 ‘mitis’ 군 균에 속하는 균들의 유전자도 증폭시키는 것을 알 수 있었다.

<2-4> 중합효소연쇄반응(PCR)-3

합성된 프라이머(cpsA)와 기존에 보고된 Suzuki 등(2005)의 Spn9828 프라이머와의 비교를 위해 Spn9828 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 우선, 표 2에 개시된 분리 정제한 폐렴구균과 대조 균주들의 DNA 1㎕(10ng)에 반응액 (10X Taq buffer 2㎕, 2.5 mM dNTPs 1㎕, D.W. 13.7, 10 uM 정방향 프라이머 1㎕, 10uM 역방향 프라이머 1㎕와 Taq 중합효소0.3㎕(Intron, Seoul, Korea)를 각 19㎕씩 가한 다음 94℃ 5분 1회, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 40초간의 반응을 30회 반복하고 72℃에서 10분간 반응하여 증폭하였다. PCR 산물은 1% LE 아가로즈 겔(FMC)에서 전기영동하고 증폭 유무 및 크기를 관찰하였다.

실험결과 도 7에 나타난 바와 같이, 상기 프라이머들은 폐렴구균 유전자 이외에도 스트렙토코커스 인터메디우스지노수스(S. intermedius)와 스트렙토코커스 앤지노수스(S. anginosus)들의 유전자도 증폭시키는 것을 알 수 있었다.

<실시예 3>

구강검체시료로부터 폐렴구균( S. pneumoniae )의 검출

<3-1> 중합효소연쇄반응(PCR)-1

폐렴구균은 사람의 구강에 존재하는 상주균으로 건강한 사람의 40~60%가 보균자이므로, 건강한 28세 남자의 구강에서 멸균한 이쑤시개로 시료을 채취하고 Ausubel 등의 방법(1994)에 준하여 게노믹 DNA(Genomic DNA)를 분리한 다음, 합성된 프라이머(cpsA)와 기존의 프라이머들(lytA, ply, Spn9802, Spn9828)을 사용하여 동일조건에서 중합 연쇄반응(PCR)을 실시하여 증폭유무 및 크기를 관찰하였다. 폐렴구균(S. pneumoniae) KCTC 5080^T의 게노믹 DNA는 상기 프라이머들을 사용하여 동일조건에서 중합 연쇄반응(PCR)을 실시하여 비교하였다.

실험결과 도 9에 나타난 바와 같이, cpsA 프라이머는 구강검체 게노믹 DNA와 폐렴구균(S. pneumoniae KCTC 5080^T)를 모두 특이적으로 증폭시켰으나, 기존의 프라이머(lytA, ply, Spn9802, Spn9828)들은 폐렴구균(S. pneumoniae KCTC 5080^T)유전자만을 증폭시키고 구강검체 게노믹 DNA에서는 어떠한 유전자도 증폭시키지 않았다.

<3-2> 구강시료로부터 폐렴구균의 분리와 중합효소연쇄반응(PCR)

<실시예 3-1>에 사용한 동일구강검체로부터 5% 면역혈액배지를 이용하여 알파용혈성을 보이는 폐렴구균 추정집락들을 분리하였다(도 10), 분리한 집락 3개로부터 게노믹 DNA를 분리하고 제작한 cpsA 프라이머를 이용하여 상기 조건으로 증폭한 결과 폐렴구균 유전자가 증폭되었다. 따라서 검체로부터 분리한 균들이 폐렴구군임을 확인할 수 있었으며 cpsA 프라이머가 기존에 보고된 프리이머들보다 민감도가 높음도 알 수 있었다(도 11).

본 발명에 따른 검출방법은 폐렴구균만을 특이적으로 검출할 수 있는 효과가 있으며, 폐렴구균을 제외한 스트렙토코커스 속 균주들, 특히 폐렴구균과 분류학적, 분자생물학적으로 매우 유사한 스트렙토코커스 미티스, 스트렙토코커스 오라리스, 스트렙토코커스 고도니, 스트렙토코커스 상기우스 및 스트렙토코커스 파라상 기우스 등과 폐렴구균을 구별할 수 있는 장점이 있어, 폐렴구균의 검출에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 어댑터를 연결하기 위하여 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)과 스트렙토코커스 미티스(S. mitis)의 게노믹 DNA를 Rsa I으로 처리한 결과이다.

도 2는 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)과 스트렙토코커스 미티스(S. mitis)의 게노믹 DNA로 SSH(Suppression subtractive hybridization)하는 과정을 나타낸 모식도이다.

도 3은 리버스 서던 하이브리다이제이션을 하기 위하여 클로닝이 확인된 플라스미드를 PCR로 증폭한 결과이다.

도 4는 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae) 특이적 클론을 선별하기 위하여 리버스 서던 하이브리다이제이션(Reverse southern hybridization)한 결과이다(A: ECL 라벨링된 스트렙토코커스 미티스 게노믹 DNA를 프로브로 사용한 경우, B: ECL 라벨링된 폐렴구균 게노믹 DNA를 프로브로 사용한 경우).

도 5는 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 조합을 이용하여 PCR 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이다(라인 1~26: 폐렴구균 게노믹 DNA를 주형으로 사용한 경우, 라인 27~132: 폐렴구균을 제외한 다른 스트렙토코커스 속 균주들과 락토코커스, 엔테로코커스 속의 게노믹 DNA를 주형으로 사용한 경우, 각 라인 번호는 표 2의 균주 번호와 일치).

도 6은 현재 가장 특이적인 것으로 보고된 프라이머(Spn9802, Suzuki et al., J Clin Microbiol, 43:4528-4534, 2005)조합을 이용하여 PCR 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이다(라인 1~26: 폐렴구균 게노믹 DNA를 주형으로 사용한 경 우, 라인 27~132: 폐렴구균을 제외한 다른 스트렙토코커스 속 균주들과 락토코커스, 엔테로코커스 속의 게노믹 DNA를 주형으로 사용한 경우, 각 라인 번호는 표 2의 균주 번호와 일치).

도 7은 기존에 보고된 프라이머(Spn9828, Suzuki et al ., J Clin Microbiol, 43:4528-4534, 2005)조합을 이용하여 PCR 분석을 수행한 결과를 나타내는 사진이다(라인 1~26: 폐렴구균 게노믹 DNA를 주형으로 사용한 경우, 라인 27~132: 폐렴구균을 제외한 다른 스트렙토코커스 속 균주들과 락토코커스, 엔테로코커스 속의 게노믹 DNA를 주형으로 사용한 경우, 각 라인 번호는 표 2의 균주 번호와 일치).

도 8은 기존에 보고된 Spn9802, Spn9828 프라이머들과 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머를 이용하여 132개 균주들의 DNA증폭을 비교한 표이다.

도 9는 기존의 발표된 프라이머들(lytA, ply, Spn9802, Spn9828)과 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 조합을 이용하여 일반인의 구강에서 총 미생물의 DNA를 추출하고 유전자를 증폭한 결과이다(라인 1: 구강채취 시료, 라인 2: S. pneumoniae KCTC 5080^T).

도 10은 도 9에서 일반인의 구강채취 시료로부터 분리한 폐렴구균추정 집락의 그림이다.

도 11은 도 9에서 일반인의 구강에서 분리한 폐렴구균에서 DNA를 추출하여 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 조합을 이용하여 유전자를 증폭한 결과이다(라인 1~3: 일반인의 구강에서 분리한 폐렴구균 추정균의 게믹 DNA를 주형으로 사용한 경우).

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Primer and probe for detection of Streptococcus pneumoniae and method for detecting Streptococcus pneumoniae using thereof <130> NP08-0098 <160> 47 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1446 <212> DNA <213> Nuclotide sequence encoding cpsA gene <400> 1 atgagtagac gttttaaaaa atcacgttca cagaaagtga agcgaagtgt taatatcgtt 60 ttgctgacta tttatttatt gttaatttgt tttttattgt tcttaatctt taagtacaat 120 atccttgctt ttagatatct taatctagtg gtaactgcgt tagtcctact agttgccttg 180 gtagggctac tcttgattat ctataaaaaa gctgaaaagt ttactatttt tctgttgctg 240 ttctctatcc ttgtcagctc tgtgtcgctc tttgcagtac agcagtttgt tggactgacc 300 aatcgtttaa atgcgacttc taattactca gaatattcaa tcagtgtcgc tgttttagca 360 gatagtgaga tcgaaaatgt tacgcaactg acgagtgtga cagcaccgac tgggactgat 420 aatgaaaata ttcaaaaact actagctgat attaagtcaa gtcagaatac cgatttgacg 480 gtcgaccaga gttcgtctta cttggcagct tacaagagtt tgattgcagg ggagactaag 540 gccattgtct taaatagtgt ctttgaaaat atcatcgagt cagagtatcc agactacgca 600 tcgaagataa aaaagattta taccaaggga ttcactaaaa aagtagaagc tcctaagacg 660 tctaagaatc agtctttcaa tatctatgtt agtggaattg acacctatgg tcctattagt 720 tcggtgtcgc gatcagatgt caatatcctg atgactgtca atcgagatac caagaaaatc 780 ctcttgacca caacgccacg tgatgcctat gtaccaatag cagatggtgg aaataatcaa 840 aaagataaat taacccatgc gggcatttat ggagttgatt cgtccattca caccttagaa 900 aatctctatg gagtggatat caattactat gtgcgattga acttcacttc tttcttgaaa 960 atgattgact tattgggagg ggtagatgtt cataatgatc aagagttttc agctctacat 1020 gggaagttcc atttcccagt agggaatgtc catctagact ctgagcaggc tctaggtttt 1080 gtacgtgaac gctactcact agccgatgga gaccgtgacc gtggtcgcaa ccaacaaaag 1140 gttattgtag ctatccttca aaaattaacg tcaaccgaag cactgaaaaa ttatagtacg 1200 atcattgata gcttgcaaga ttctatccaa acaaatatgc cacttgagac tatgataaat 1260 ttggtcaatg ctcagttaga aagtggaggg aattataaag taaattctca agatttaaaa 1320 ggtacaggtc ggacggatct tccttcttat gcaatgccag acagtaacct ctatgtgatg 1380 gaaatagatg atagtagttt agctgtagtt aaagcagcta tacaggatgt gatggagggt 1440 agatga 1446 <210> 2 <211> 481 <212> PRT <213> cpsA protein <400> 2 Met Ser Arg Arg Phe Lys Lys Ser Arg Ser Gln Lys Val Lys Arg Ser 1 5 10 15 Val Asn Ile Val Leu Leu Thr Ile Tyr Leu Leu Leu Ile Cys Phe Leu 20 25 30 Leu Phe Leu Ile Phe Lys Tyr Asn Ile Leu Ala Phe Arg Tyr Leu Asn 35 40 45 Leu Val Val Thr Ala Leu Val Leu Leu Val Ala Leu Val Gly Leu Leu 50 55 60 Leu Ile Ile Tyr Lys Lys Ala Glu Lys Phe Thr Ile Phe Leu Leu Leu 65 70 75 80 Phe Ser Ile Leu Val Ser Ser Val Ser Leu Phe Ala Val Gln Gln Phe 85 90 95 Val Gly Leu Thr Asn Arg Leu Asn Ala Thr Ser Asn Tyr Ser Glu Tyr 100 105 110 Ser Ile Ser Val Ala Val Leu Ala Asp Ser Glu Ile Glu Asn Val Thr 115 120 125 Gln Leu Thr Ser Val Thr Ala Pro Thr Gly Thr Asp Asn Glu Asn Ile 130 135 140 Gln Lys Leu Leu Ala Asp Ile Lys Ser Ser Gln Asn Thr Asp Leu Thr 145 150 155 160 Val Asp Gln Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Ala Tyr Lys Ser Leu Ile Ala 165 170 175 Gly Glu Thr Lys Ala Ile Val Leu Asn Ser Val Phe Glu Asn Ile Ile 180 185 190 Glu Ser Glu Tyr Pro Asp Tyr Ala Ser Lys Ile Lys Lys Ile Tyr Thr 195 200 205 Lys Gly Phe Thr Lys Lys Val Glu Ala Pro Lys Thr Ser Lys Asn Gln 210 215 220 Ser Phe Asn Ile Tyr Val Ser Gly Ile Asp Thr Tyr Gly Pro Ile Ser 225 230 235 240 Ser Val Ser Arg Ser Asp Val Asn Ile Leu Met Thr Val Asn Arg Asp 245 250 255 Thr Lys Lys Ile Leu Leu Thr Thr Thr Pro Arg Asp Ala Tyr Val Pro 260 265 270 Ile Ala Asp Gly Gly Asn Asn Gln Lys Asp Lys Leu Thr His Ala Gly 275 280 285 Ile Tyr Gly Val Asp Ser Ser Ile His Thr Leu Glu Asn Leu Tyr Gly 290 295 300 Val Asp Ile Asn Tyr Tyr Val Arg Leu Asn Phe Thr Ser Phe Leu Lys 305 310 315 320 Met Ile Asp Leu Leu Gly Gly Val Asp Val His Asn Asp Gln Glu Phe 325 330 335 Ser Ala Leu His Gly Lys Phe His Phe Pro Val Gly Asn Val His Leu 340 345 350 Asp Ser Glu Gln Ala Leu Gly Phe Val Arg Glu Arg Tyr Ser Leu Ala 355 360 365 Asp Gly Asp Arg Asp Arg Gly Arg Asn Gln Gln Lys Val Ile Val Ala 370 375 380 Ile Leu Gln Lys Leu Thr Ser Thr Glu Ala Leu Lys Asn Tyr Ser Thr 385 390 395 400 Ile Ile Asp Ser Leu Gln Asp Ser Ile Gln Thr Asn Met Pro Leu Glu 405 410 415 Thr Met Ile Asn Leu Val Asn Ala Gln Leu Glu Ser Gly Gly Asn Tyr 420 425 430 Lys Val Asn Ser Gln Asp Leu Lys Gly Thr Gly Arg Thr Asp Leu Pro 435 440 445 Ser Tyr Ala Met Pro Asp Ser Asn Leu Tyr Val Met Glu Ile Asp Asp 450 455 460 Ser Ser Leu Ala Val Val Lys Ala Ala Ile Gln Asp Val Met Glu Gly 465 470 475 480 Arg <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 3 taacgtcaac cgaagcactg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer <400> 4 gaagatccgt ccgacctgta 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 5 ctcactagcc gatggagacc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer <400> 6 gaagatccgt ccgacctgta 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 7 tgtcagctct gtgtcgctct 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer <400> 8 gtcgaccgtc aaatcggtat 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 9 cagctctgtg tcgctctttg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer <400> 10 gtcgaccgtc aaatcggtat 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 11 acgcaactga cgagtgtgac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer <400> 12 gatcgcgaca ccgaactaat 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 13 ctctgtgtcg ctctttgcag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer <400> 14 gtcgaccgtc aaatcggtat 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 15 gagtttgatt gcaggggaga 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer <400> 16 gatcgcgaca ccgaactaat 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 17 tccttgtcag ctctgtgtcg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer <400> 18 gtcgaccgtc aaatcggtat 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 19 tctgtgtcgc tctttgcagt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer <400> 20 gtcgaccgtc aaatcggtat 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 21 tgtcagctct gtgtcgctct 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer <400> 22 cgaccgtcaa atcggtattc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 23 tgtcagctct gtgtcgctct 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer <400> 24 tcgaccgtca aatcggtatt 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 25 cagctctgtg tcgctctttg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer <400> 26 cgaccgtcaa atcggtattc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 27 cagctctgtg tcgctctttg 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer <400> 28 tcgaccgtca aatcggtatt 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 29 ctctgtgtcg ctctttgcag 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer <400> 30 cgaccgtcaa atcggtattc 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 31 ctctgtgtcg ctctttgcag 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer <400> 32 tcgaccgtca aatcggtatt 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 33 tgtcagctct gtgtcgctct 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer <400> 34 actctggtcg accgtcaaat 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 35 cagctctgtg tcgctctttg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer <400> 36 actctggtcg accgtcaaat 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 37 ctctgtgtcg ctctttgcag 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer <400> 38 actctggtcg accgtcaaat 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 39 acgcaactga cgagtgtgac 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer <400> 40 tcttcgatgc gtagtctgga 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 41 tccttgtcag ctctgtgtcg 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer <400> 42 cgaccgtcaa atcggtattc 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 43 tccttgtcag ctctgtgtcg 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer <400> 44 tcgaccgtca aatcggtatt 20 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adaptor sequence specific primer <400> 45 ctaatacgac tcactatagg gc 22 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nested primer 1 <400> 46 tcgagcggcc gcccgggcag gt 22 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nested primer 2R <400> 47 agcgtggtcg cggccgaggt 20

Claims

(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열; (b) 상기 (a)에 상보적인 염기서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 염기서열에서 유래되고, 서열번호 3 내지 서열번호 44로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하는 20bp 이상의 연속적인 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폐렴구균 검출용 프로브.
제1항에 있어서, 상기 (a)의 염기서열이 서열번호 1로 이루어지는 것을 특징으로 하는 폐렴구균 검출용 프로브.
제1항 또는 제2항의 프로브가 기질 상에 집적되어 있는 것을 특징으로 하는 폐렴구균 검출용 마이크로어레이.
서열번호 3 내지 서열번호 44로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열을 갖는 폐렴구균 검출용 프라이머.
제1항의 프로브, 제2항의 프로브 및 제4항의 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것을 이용하여 폐렴구균을 검출하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 검출은 PCR(Polymerase Chain Reaction) 분석, DNA 시퀀싱(DNA sequencing), 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism) 분석, RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(inter-simple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism), 노던 하이브리다이제이션(Northern hybridization) 및 서던 하이브리다이제이션 (Southern hybridization)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 프로브, 제2항의 프로브 및 제4항의 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것을 포함하는 폐렴구균 검출용 조성물.