KR101650083B1 - 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체 및 이를 이용한 폐렴연쇄상구균 매개 질환 진단 방법 - Google Patents

폐렴연쇄상구균 유래 막소포체 및 이를 이용한 폐렴연쇄상구균 매개 질환 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체 및 이를 이용한 폐렴연쇄상구균 매개 질환 진단 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 그람양성균인 폐렴연쇄상구균으로부터 막소포체를 분리하고 이에 포함된 구성 단백질들을 동정하였으므로, 상기 막소포체 및 단백질들은 폐렴연쇄상구균 매개 질환의 진단 또는 폐렴연쇄상구균 노출 여부를 확인하는데 이용할 수 있는 바이오마커로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

폐렴연쇄상구균 유래 막소포체 및 이를 이용한 폐렴연쇄상구균 매개 질환 진단 방법{Membrane vesicles derived from Streptococcus pneumoniae, and method for the diagnosis of Streptococcus pneumoniae-mediated diseases using the same}
본 발명은 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체 및 이를 이용한 폐렴연쇄상구균 매개 질환 진단 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 폐렴연쇄상구균의 특정 단백질들이 막소포체를 통해 외부로 분비된다는 점으로부터 착안된, 상기 막소포체와 이에 포함된 단백질을 이용하여 폐렴연쇄상구균 매개 질환의 진단 또는 폐렴연쇄상구균 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.
외막소포체(Outer Membrane Vesicles, OMV)는 세균의 몇 가지 분비 기작 중의 하나로 외막이 부풀어 오른 다음 균에서 떨어져 나가 소포체를 형성하는 것이다. 그렇기 때문에 OMV는 외막이 존재하는 그람음성균에서 분비되는 것으로 알려져 왔다. OMV는 구형의 인지질 이중층으로 되어 있고, 그 크기가 20 내지 200 nm이며 여러 가지 외막 단백질을 가지고 있다. 이러한 OMV는 세균 증식을 돕고, 숙주와의 정보 교환, 병원성 요인 및 유전 물질의 전달 등의 역할을 하며, 이와 같은 역할은 숙주세포의 병인에 중요한 요인이 된다고 알려져 있다. 게다가, 최근 대부분의 OMV는 숙주의 면역반응을 유도하는 것으로 밝혀지면서 백신 개발에도 활용될 가능성이 높은 것으로 보고되고 있다.
이러한 OMV는 그 동안 그람음성균에서만 생성되는 것으로 알려져 있었고, 그람양성균의 경우에는 세포 외막이 없고 세포막이 세포벽에 둘러싸여 있어 막소포체를 분비한다는 것이 알려진 바 없었으나, 최근 그람양성균인 포도상구균에서 OMV와 유사한 막소포체(Membrane Vesicles)가 발견됨으로써 그람양성균에서도 세포 밖으로 막소포체가 분비될 수 있다는 사실이 확인되고 있다.
나아가, 사람 또는 실험 동물의 분비물, 배설물 또는 조직 세척액 등에서 막소포체가 발견됨이 보고되었다. 또한, 조직 유래 막세포체는 소포체를 분비하는 조직의 상태를 반영하는 것으로 알려져 있으며, 이를 질병의 진단에 이용될 수 있음이 보고되었다. 그러나 아직까지 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체, 또는 폐렴연쇄상구균에 의해 숙주세포에서 유래된 막소포체를 이용하여 폐렴연쇄상구균 감염에 의해 발생하는 질환에 대한 진단 기술을 개발하고자 한 연구는 보고된 바 없다.
한편, 연쇄상구균(Streptococcus)은 사람의 구강과 호흡기도에 존재하는 이질적인 그람양성균이다. 이 중 주요 병원성균인 폐렴연쇄상구균(Streptococcus. pneumoniae)은 사람의 구강에 존재하는 상주균으로서 건강한 사람의 40~60%가 보균자인데, 보균자의 대다수는 병독성이 약한 종류의 균을 지니고 있고 보균상태도 영구적이 아니라 산발적이며 간헐적인 것이 특징이다. 이러한 페렴연쇄상구균은 호흡기를 통하거나 맥관 계통에 의해서 확산되며, 신체의 다른 부위로 이동하여 폐렴, 이하선염, 결막염, 복막염, 중이염, 심내막염 및 패혈증 등을 일으키는 것으로 알려져 있다(Suzuki et al., J Clin Microbiol, 43: 4528-4534, 2005). 2010년 통계청의 자료에 따르면, 폐렴으로 인한 사망률은 10만명 중 14.9명으로 전체 사망 원인 중 6위, 감염으로 인한 사망에 있어서는 1위를 차지하고 있어 폐렴연쇄상구균은 질병 및 사망의 주된 원인으로 여겨진다.
현재 사용되고 있는 폐렴연쇄상구균 검출 방법으로는 주로 균을 배양한 후 생화학적인 반응이나 대사산물을 측정하는 방법이 가장 흔히 사용되고 있다. 일단 세균의 모양이 구균으로 확인될 경우, 균이 폐렴균인지 확인하기 위하여 옵토킨(optochin)/담즙산에 대한 민감성, 협막 다당류에 대한 항체와의 반응성 등을 측정하고 있다. 그러나 실험이 부적절하게 실행되거나 결과 해석의 오류로 인해 균이 옵토킨이나 답즙산에 내성이 있는 것으로 잘못 판단될 가능성이 높다. 또한, 폐렴연쇄상구균의 협막 다당류에 따라 결정되는 혈청형은 다당류에 대해 만들어진 다가 항혈청 또는 단클론 항체를 이용하고 있으나, 이러한 협막 다당류 항원에 의해 유발된 항혈청은 폐렴연쇄상구균 이외의 다른 세균, 예를 들면 α-연쇄상구균에도 반응하여 동정 결과에 대한 신뢰성이 낮다는 문제점이 있다.
따라서, 이러한 종래의 문제점을 극복하고 신속하며 효과적인 폐렴연쇄상구균 매개 질환의 진단 방법을 제공하기 위하여, 항원성이 크고 세포 외부로 분비되면서 안정적으로 발현되는 표지 마커의 동정과 이를 이용한 신속한 동정 방법의 개발이 절실히 요구되고 있는 상황이다.
한국 공개특허공보 제10-2011-0025603호
본 발명의 목적은 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체 및 이를 이용한 폐렴연쇄상구균 매개 질환의 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae) 유래 막소포체(membrane vesicles)를 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 다른 측면은 1) 생물학적 시료, 환경 시료 및 식품 시료 중 어느 하나로부터 막소포체를 분리하는 단계;
2) 상기 분리된 막소포체에서 폐렴연쇄상구균 유래 단백질들의 존재 여부를 확인하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 단백질들 중 어느 하나 이상의 단백질의 존재가 검출된 경우, 폐렴연쇄상구균에 의한 질환에 걸렸거나 폐렴연쇄상구균에 노출된 것으로 판정하는 단계를 포함하는 폐렴연쇄상구균에 의한 질환 또는 폐렴연쇄상구균 노출 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체는 소낭 형태로 세포 밖으로 분비되고, 상기 소낭 형태의 막소포체 내에 포함되어 분비되는 폐렴연쇄상구균 유래 단백질들은 상기 막소포체에 의해 단백질분해효소 등과 같은 외부요인과 공간적으로 분리됨으로써 물리적으로 보호될 수 있다. 즉, 상기 폐렴연쇄상구균 유래 단백질들은 상기 막소포체에 의해 손상되지 않은 상태(intact state)로 안전하게 분비될 수 있으므로, 상기 막소포체 및 이에 포함된 단백질들은 폐렴연쇄상구균이 감염되어 발생하는 질환 및 주변 환경에 대한 폐렴연쇄상구균의 노출 여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 표지 물질로서 유용하게 이용될 수 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체 분리법의 흐름도에 관한 그림이다.
도 2는 Cryo-TEM으로 확인한 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체의 전자현미경 사진에 관한 그림으로서, 화살표는 막소포체를 나타낸 것이다.
도 3은 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체의 전기영동 결과로 확인된 8개의 분획에 관한 그림이다.
도 4는 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체에 대한 마우스 항체를 상기 막소포체의 단백질과 반응시킨 후 전기영동하여 확인된 6개의 분획에 관한 그림이다.
도 5는 폐렴연쇄상구균 막소포체 항체를 폐렴환자 및 건강한 사람의 혈청에 반응시킨 그림이다.
먼저, 본 발명의 명세서에서 이용된 용어를 설명한다.
본 발명에서 일컫는 그람양성균은 일반적으로 그람염색에서 보라색으로 염색되고, 그람음성균과 비교하여 세포 외막이 없으며 세포벽에 펩디도글리칸 양이 많은 세균을 의미하며, 구형(cocci)의 연쇄상구균(Streptococcus)이 대표적인 그람양성균에 속한다.
본 발명에서 일컫는 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체는 체내 또는 주변 환경에 서식하는 폐렴연쇄상구균이 자연적 또는 인공적으로 분비하는 소포체를 의미하며, 세포밖 소포체(extracellular vesicles)와 상호 혼용 가능한 의미이다.
본 발명에서 일컫는 진단은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 폐렴연쇄상구균 매개 질환 또는 폐렴연쇄상구균 노출 여부를 확인하는 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 폐렴연쇄상구균( Streptococcus pneumoniae ) 유래 막소포체( membrane vesicles )
본 발명의 일 측면은 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체를 제공한다.
본 발명의 막소포체는 폐렴연쇄상구균 세포 밖으로 분비되는 세포밖 소포체(extracellular vesicles)인 것이 바람직하고, 폐렴연쇄상구균 배양액으로 분비되는 것, 자연적으로 분비되는 것 또는 인공적으로 분비되는 것을 모두 포함한다.
상기 막소포체는 하기 방법에 의해 분리되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다. 구체적으로, 상기 분리 방법은
1) 폐렴연쇄상구균 배양액을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계;
2) 상기 수득된 상등액을 1차 여과하여 불순물 및 세포를 제거하는 단계;
3) 상기 수득된 여과물을 300 kDa 내지 1000 kDa의 분자량 컷오프(cutoff), 바람직하게는 500 kDa의 분자량 컷오프를 갖는 막으로 2차 여과하여 상기 컷오프값 이상의 분자량을 갖는 분획물을 수득하는 단계; 및
4) 상기 수득된 분획물을 초원심분리하여 침전물을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 단계 3)의 2차 여과 후, 그 여과물을 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 단계 4) 이후에 수득된 침전물을 자당(sucrose) 농도구배식 초원심분리함으로써 침전된 막소포체를 보다 순수하게 분리하는 단계를 추가로 수행하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니하고, 최종적으로 수득된 침전물을 현탁하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 그람양성균인 폐렴연쇄상구균으로부터 막소포체를 분리하기 위하여, 폐렴연쇄상구균 배양액을 8,000 rpm으로 원심분리하여 배지 성분만을 수득한 후, 이를 0.2 ㎛ 여과막으로 여과하여 배지에 남아있는 세포와 부유물을 제거하고 2차 여과를 통해 500 kDa 이상의 물질만을 수득하였다. 그런 다음, 얻어진 용액을 초고속 원심분리하여 침전된 막소포체를 회수하고, 섞여있는 단백질들을 제거하기 위하여 자당농도구배를 이용한 2차 초고속 원심분리를 실시하여 막소포체가 보다 순수하게 분리된 것을 확인하였다(도 1 및 도 2 참조).
상기와 같이 분리된 본 발명의 막소포체는 폐렴연쇄상구균 유래 단백질로서, Hypothetical protein spr0747(NCBI gene no. spr0747), ABC transporter substrate-binding protein-manganese transport(NCBI gene no. spr1494), foldase protein PrsA(NCBI gene no. spr0884), branched chain amino acid ABC transporter amino acid-binding protein(NCBI gene no. spr0659), ABC transporter substrate-binding protein-amino acid transport(NCBI gene no. spr0146), ABC transporter substrate-binding protein-oligopeptide transport(NCBI gene no. spr0327), iron-compound ABC transporter, iron compound-binding protein(NCBI gene no. spr0934), amino acid ABC transporter amino acid-binding protein(NCBI gene no. spr1251), hypothetical protein spr0931(NCBI gene no. spr0931), adenylosuccinate synthetase(NCBI gene no. spr0021), ABC transporter substrate-binding protein-oligopeptide transport(NCBI gene no. spr1707), hypothetical protein spr0554(NCBI gene no. spr0554), peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, cyclophilin-type(NCBI gene no. spr0679), surface protein pspA precursor(NCBI gene no. spr0121), lipoprotein(NCBI gene no. spr0147), amino acid ABC transporter amino acid-binding protein(NCBI gene no. spr1353), hypothetical protein spr0688(NCBI gene no. spr0688), phosphopyruvate hydratase(NCBI gene no. spr1036), preprotein translocase subunit YajC(NCBI gene no. spr1840), zinc ABC transporter zinc-binding protein(NCBI gene no. spr1975), hypothetical protein spr1782(NCBI gene no. spr1782), signal peptidase I(NCBI gene no. spr0364), ABC transporter substrate-binding protein-oligopeptide transport(NCBI gene no. spr1382), hypothetical protein spr1912(NCBI gene no. spr1912), 30S ribosomal protein S8(NCBI gene no. spr0203), phosphate ABC transporter phosphate-binding protein(NCBI gene no. spr1257), glucokinase(NCBI gene no. spr0584), hypothetical protein spr0975(NCBI gene no. spr0975), sugar ABC transporter, sugar-binding protein(NCBI gene no. spr1527), ABC transporter substrate-binding protein(NCBI gene no. spr2003), 50S ribosomal protein L18(NCBI gene no. spr0205), L-lactate dehydrogenase(NCBI gene no. spr1100), phosphate transporter PhoU(NCBI gene no. spr1252), 30S ribosomal protein S5(NCBI gene no. spr0206), hypothetical protein spr1370(NCBI gene no. spr1370), ABC transporter substrate-binding protein-oligopeptide transport(NCBI gene no. spr1194), hypothetical protein spr1962(NCBI gene no. spr1962), penicillin-binding protein 1A(NCBI gene no. spr0329), 3-ketoacyl-(acyl-carrier-protein) reductase(NCBI gene no. spr0381), glycerol uptake facilitator protein, putative(NCBI gene no. spr1344), hypothetical protein spr0693(NCBI gene no. spr0693), hypothetical protein spr1457(NCBI gene no. spr1457), preprotein translocase subunit SecG(NCBI gene no. spr0877), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(NCBI gene no. spr1825), sugar ABC transporter, ATP-binding protein(NCBI gene no. spr1437), cytoplasmic membrane protein(NCBI gene no. spr1163), phosphoglycerate kinase(NCBI gene no. spr0441), ABC transporter substrate-binding protein(NCBI gene no. spr1645), phosphoglyceromutase(NCBI gene no. spr1499), ribosome-binding factor A(NCBI gene no. spr0482, hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase(NCBI gene no. spr0011), 30S ribosomal protein S7(NCBI gene no. spr0249), amino acid ABC transporter permease/amino acid-binding protein(NCBI gene no. spr1120), 50S ribosomal protein L22(NCBI gene no. spr0194), 50S ribosomal protein L5(NCBI gene no. spr0201), hypothetical protein spr0174(NCBI gene no. spr0174), pyruvate oxidase(NCBI gene no. spr0642), cell division protein DivIVA(NCBI gene no. spr1505), iron-compound ABC transporter, iron-compound-binding protein(NCBI gene no. spr1687), hypothetical protein spr1112(NCBI gene no. spr1112), F0F1 ATP synthase subunit delta(NCBI gene no. spr1363), D-alanyl-D-alanine carboxypeptidase(NCBI gene no. spr0776), large conductance mechanosensitive channel protein MscL(NCBI gene no. spr0915), PTS system, mannose-specific IIC component(NCBI gene no. spr0260), hypothetical protein spr0595(NCBI gene no. spr0595), hypothetical protein spr0615(NCBI gene no. spr0615), rod shape-determining protein MreC(NCBI gene no. spr2023), adhesion lipoprotein(NCBI gene no. spr0906), transcriptional repressor CodY(NCBI gene no. spr1439), hypothetical protein spr1056(NCBI gene no. spr1056), 50S ribosomal protein L16(NCBI gene no. spr0196), F0F1 ATP synthase subunit beta(NCBI gene no. spr1360), serine protease(NCBI gene no. spr2045), phosphotransferase system, mannose-specific EIID(NCBI gene no. spr0259), 50S ribosomal protein L13(NCBI gene no. spr0271), ABC transporter ATP-binding protein-unknown substrate((NCBI gene no. spr1559), 50S ribosomal protein L10(NCBI gene no. spr1212), phosphate ABC transporter ATP-binding protein(NCBI gene no. spr1253), choline transporter(NCBI gene no. spr1678), ABC transporter substrate-binding protein(NCBI gene no. spr0083), peptidoglycan GlcNAc deacetylase(NCBI gene no. spr1333), lactate oxidase(NCBI gene no. spr0627), PTS system, fructose specific IIABC components(NCBI gene no. spr0780), Zinc metalloprotease(NCBI gene no. spr0581), hypothetical protein spr0904(NCBI gene no. spr0904), fructose-bisphosphate aldolase(NCBI gene no. spr0530), phosphotransferase system, trehalose-specific IIBC component(NCBI gene no. spr1699), ribose-phosphate pyrophosphokinase(NCBI gene no. spr0028), endo-beta-N-acetylglucosaminidase(NCBI gene no. spr0867), transcriptional regulator(NCBI gene no. spr1759), 6-phosphogluconate dehydrogenase(NCBI gene no. spr0335), manganese ABC transporter, ATP-binding protein(NCBI gene no. spr1492), PTS system, IIABC components(NCBI gene no. spr0668), glutamine synthetase, type I(NCBI gene no. spr0444), sodium:alanine symporter family protein(NCBI gene no. spr0369), sugar ABC transporter, sugar-binding protein(NCBI gene no. spr1712), DNA-directed RNA polymerase subunit beta~(NCBI gene no. spr1776), polysaccharide biosynthesis protein, putative(NCBI gene no. spr1150), NADH oxidase(NCBI gene no. spr1323), maltodextrin phosphorylase(NCBI gene no. spr1916), preprotein translocase subunit SecY(NCBI gene no. spr0209), beta-galactosidase precursor(NCBI gene no. spr0565), isoleucyl-tRNA synthetase(NCBI gene no. spr1502) 및 maltose/maltodextrin ABC transporter, maltose/maltodextrin-binding protein(NCBI gene no. spr1918)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다.
상기 단백질 중 Hypothetical protein spr0747(NCBI gene no. spr0747), ABC transporter substrate-binding protein-manganese transport(NCBI gene no. spr1494), foldase protein PrsA(NCBI gene no. spr0884), branched chain amino acid ABC transporter amino acid-binding protein(NCBI gene no. spr0659), ABC transporter substrate-binding protein-amino acid transport(NCBI gene no. spr0146), ABC transporter substrate-binding protein-oligopeptide transport(NCBI gene no. spr0327), iron-compound ABC transporter, iron compound-binding protein(NCBI gene no. spr0934), amino acid ABC transporter amino acid-binding protein(NCBI gene no. spr1251), hypothetical protein spr0931(NCBI gene no. spr0931), ABC transporter substrate-binding protein-oligopeptide transport(NCBI gene no. spr1707), hypothetical protein spr0554(NCBI gene no. spr0554), peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, cyclophilin-type(NCBI gene no. spr0679), lipoprotein(NCBI gene no. spr0147), amino acid ABC transporter amino acid-binding protein(NCBI gene no. spr1353), zinc ABC transporter zinc-binding protein(NCBI gene no. spr1975), ABC transporter substrate-binding protein-oligopeptide transport(NCBI gene no. spr1382), phosphate ABC transporter phosphate-binding protein(NCBI gene no. spr1257), hypothetical protein spr0975(NCBI gene no. spr0975), sugar ABC transporter, sugar-binding protein(NCBI gene no. spr1527), ABC transporter substrate-binding protein(NCBI gene no. spr2003), ABC transporter substrate-binding protein-oligopeptide transport(NCBI gene no. spr1194), ABC transporter substrate-binding protein(NCBI gene no. spr1645), 50S ribosomal protein L5(NCBI gene no. spr0201), hypothetical protein spr0174(NCBI gene no. spr0174), iron-compound ABC transporter, iron-compound-binding protein(NCBI gene no. spr1687), D-alanyl-D-alanine carboxypeptidase(NCBI gene no. spr0776), adhesion lipoprotein(NCBI gene no. spr0906), ABC transporter substrate-binding protein(NCBI gene no. spr0083), hypothetical protein spr0904(NCBI gene no. spr0904), endo-beta-N-acetylglucosaminidase(NCBI gene no. spr0867), transcriptional regulator(NCBI gene no. spr1759), sugar ABC transporter, sugar-binding protein(NCBI gene no. spr1712) 및 maltose/maltodextrin ABC transporter, maltose/maltodextrin-binding protein(NCBI gene no. spr1918)은 분비 단백질이고, 상기 adenylosuccinate synthetase(NCBI gene no. spr0021), hypothetical protein spr0688(NCBI gene no. spr0688), phosphopyruvate hydratase(NCBI gene no. spr1036), hypothetical protein spr1912(NCBI gene no. spr1912), 30S ribosomal protein S8(NCBI gene no. spr0203), glucokinase(NCBI gene no. spr0584), 50S ribosomal protein L18(NCBI gene no. spr0205), L-lactate dehydrogenase(NCBI gene no. spr1100), phosphate transporter PhoU(NCBI gene no. spr1252), 30S ribosomal protein S5(NCBI gene no. spr0206), hypothetical protein spr1370(NCBI gene no. spr1370), 3-ketoacyl-(acyl-carrier-protein) reductase(NCBI gene no. spr0381), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(NCBI gene no. spr1825), sugar ABC transporter, ATP-binding protein(NCBI gene no. spr1437), phosphoglycerate kinase(NCBI gene no. spr0441), phosphoglyceromutase(NCBI gene no. spr1499), ribosome-binding factor A(NCBI gene no. spr0482), hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase(NCBI gene no. spr0011), 30S ribosomal protein S7(NCBI gene no. spr0249), 50S ribosomal protein L22(NCBI gene no. spr0194), 50S ribosomal protein L5(NCBI gene no. spr0201), pyruvate oxidase(NCBI gene no. spr0642), cell division protein DivIVA(NCBI gene no. spr1505), F0F1 ATP synthase subunit delta(NCBI gene no. spr1363), transcriptional repressor CodY(NCBI gene no. spr1439), hypothetical protein spr1056(NCBI gene no. spr1056), 50S ribosomal protein L16(NCBI gene no. spr0196), F0F1 ATP synthase subunit beta(NCBI gene no. spr1360), 50S ribosomal protein L13(NCBI gene no. spr0271), ABC transporter ATP-binding protein-unknown substrate((NCBI gene no. spr1559), 50S ribosomal protein L10(NCBI gene no. spr1212), phosphate ABC transporter ATP-binding protein(NCBI gene no. spr1253), choline transporter(NCBI gene no. spr1678), lactate oxidase(NCBI gene no. spr0627), fructose-bisphosphate aldolase(NCBI gene no. spr0530), ribose-phosphate pyrophosphokinase(NCBI gene no. spr0028), 6-phosphogluconate dehydrogenase(NCBI gene no. spr0335), manganese ABC transporter, ATP-binding protein(NCBI gene no. spr1492), glutamine synthetase, type I(NCBI gene no. spr0444), DNA-directed RNA polymerase subunit beta~(NCBI gene no. spr1776), NADH oxidase(NCBI gene no. spr1323), maltodextrin phosphorylase(NCBI gene no. spr1916) 및 isoleucyl-tRNA synthetase(NCBI gene no. spr1502)는 세포질 단백질이며, 상기 surface protein pspA precursor(NCBI gene no. spr0121), preprotein translocase subunit YajC(NCBI gene no. spr1840), hypothetical protein spr1782(NCBI gene no. spr1782), signal peptidase I(NCBI gene no. spr0364), hypothetical protein spr1962(NCBI gene no. spr1962), penicillin-binding protein 1A(NCBI gene no. spr0329), glycerol uptake facilitator protein, putative(NCBI gene no. spr1344), hypothetical protein spr0693(NCBI gene no. spr0693), hypothetical protein spr1457(NCBI gene no. spr1457), preprotein translocase subunit SecG(NCBI gene no. spr0877), cytoplasmic membrane protein(NCBI gene no. spr1163), amino acid ABC transporter permease/amino acid-binding protein(NCBI gene no. spr1120), hypothetical protein spr1112(NCBI gene no. spr1112), large conductance mechanosensitive channel protein MscL(NCBI gene no. spr0915), PTS system, mannose-specific IIC component(NCBI gene no. spr0260), hypothetical protein spr0595(NCBI gene no. spr0595), hypothetical protein spr0615(NCBI gene no. spr0615), rod shape-determining protein MreC(NCBI gene no. spr2023), serine protease(NCBI gene no. spr2045), phosphotransferase system, mannose-specific EIID(NCBI gene no. spr0259), peptidoglycan GlcNAc deacetylase(NCBI gene no. spr1333), PTS system, fructose specific IIABC components(NCBI gene no. spr0780), Zinc metalloprotease(NCBI gene no. spr0581), phosphotransferase system, trehalose-specific IIBC component(NCBI gene no. spr1699), PTS system, IIABC components(NCBI gene no. spr0668), sodium:alanine symporter family protein(NCBI gene no. spr0369), polysaccharide biosynthesis protein, putative(NCBI gene no. spr1150) 및 preprotein translocase subunit SecY(NCBI gene no. spr0209)는 세포막 단백질이고, 상기 beta-galactosidase precursor(NCBI gene no. spr0565)는 세포벽 단백질이다.
본 발명에 있어서, 상기 폐렴연쇄상구균 유래 단백질들은 폐렴연쇄상구균의 막소포체로부터 동정된 것으로서, 28개의 막 단백질, 1개의 세포벽 단백질, 32개의 분비 단백질 및 43개의 세포질 단백질로 구성된다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체에 존재하는 단백질들을 동정하기 위하여, SDS-PAGE로 막소포체의 단백질을 전기영동한 후, 각 밴드에 대하여 in-gel digestion을 수행하였고, 유전자 데이터베이스로 NCBI의 S. pneumoniae R6를 사용하여 단백질을 분석 및 동정하였다.
그 결과, 상기와 같은 단백질들이 막소포체 내에 포함되어 있는 것을 확인함으로써 상기 단백질들은 폐렴연쇄상구균의 존재를 판단할 수 있는 생물학적 분자 표지 마커로서 활용될 수 있음을 확인하였다(도 3 내지 4 및 표 1 참조).
2. 폐렴연쇄상구균에 의한 질환 또는 폐렴연쇄상구균 노출 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법
본 발명의 다른 측면은 폐렴연쇄상구균에 의한 질환 또는 폐렴연쇄상구균 노출 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 단백질 검출 방법은
1) 생물학적 시료, 환경 시료 및 식품 시료 중 어느 하나로부터 막소포체를 분리하는 단계;
2) 상기 분리된 막소포체에서, 폐렴연쇄상구균 유래 단백질들의 존재 여부를 확인하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 단백질들 중 어느 하나 이상의 단백질의 존재가 검출된 경우, 폐렴연쇄상구균에 의한 질환에 걸렸거나 폐렴연쇄상구균에 노출된 것으로 판정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 단백질 검출 방법에 있어서, 상기 단계 1)에서 분리된 막소포체는 전자현미경 하에서의 검정법에 의해 확인할 수 있으나, 본 방법에서는 막소포체를 확인하는 단계를 반드시 시행할 필요는 없다.
상기 단계 1)의 생물학적 시료는 폐렴연쇄상구균에 감염되었거나 감염된 것으로 의심되는 환자로부터 채취한 혈액, 혈청, 폐세척액, 기관지세척액, 소변, 복수, 활액, 가래, 침, 땀, 눈물 및 콧물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 상기 환경 시료는 음용수, 지하수, 하천수, 축산폐수, 토양, 공기 및 폐기물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
상기 단계 1)의 막소포체를 분리하는 단계에 관해서는 상기 1. 폐렴연쇄상구 균(Streptococcus pneumoniae) 유래 막소포체(membrane vesicles) 항목에서 설명한 바와 동일하다. 따라서 이에 관해서는 상기 1. 폐렴연쇄상구균( Streptococcus pneumoniae) 유래 막소포체 ( membrane vesicles ) 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 하고, 상기 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체를 통해 폐렴연쇄상구균에 의한 질환 또는 폐렴연쇄상구균 노출 진단의 정보를 제공하는 방법에 특이적인 구성에 대해서만 설명한다.
상기 단계 2)의 단백질들의 존재 여부를 확인하는 방법은 본 기술 분야에 공지된 다양한 분석 방법을 사용할 수 있다. 단백질의 존재를 검출하는 면역 진단학적 또는 분자 진단학적 방법 등을 사용할 수 있으며, 폐렴연쇄상구균의 막소포체 유래 단백질들에 특이적으로 결합하는 각각의 항체를 사용하여 항원-항체 반응으로 검출할 수 있다. 상기 '항원-항체 반응'이란 검체 시료 중의 특정 단백질과 이를 특이적으로 인지하는 항체의 결합 반응을 의미한다. 상기 항원-항체 결합반응으로는 면역블롯법, 효소면역법, 면역침강법, 형광면역법, 효소기질발색법 및 항원항체 응집법이 사용될 수 있다. 구체적으로, 통상의 ELISA, RIA(Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법(Sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블롯, 면역 블롯 분석 또는 면역조직화학염색 방법(Immnohistochemical staining) 등으로 측정할 수 있다. 또한, 상기 단백질에 특이적인 항체를 생물학적 마이크로칩(Biological microchip) 상에 고정시킨 후 시료와 반응시켜 상기 항체에 대한 항원 단백질을 검출할 수 있는 생물학적 마이크로칩(Biological microchip) 및 자동화된 미세배열 시스템(Microarray system)을 이용하면 대량으로 시료를 진단할 수도 있다.
상기 '항체'란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에 사용되는 항체는 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예를 들어, Fab 또는 (Fab)2 단편), 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 Fv 분자, 키메릭 항체 등일 수 있다. 본 발명에 사용되는 항체는 상기 폐렴연쇄상구균 유래 단백질들을 항원으로 하여 면역학 분야에서 널리 알려져 있는 통상의 방법으로 제조할 수 있다.
다클론 항체는 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 토끼, 마우스 또는 래트와 같은 여러 온혈동물을 이용하여 제조할 수 있다. 단클론 항체도 공지된 융합방법(fusion method)(Kohler and Milstein, European J. Immnunol ., 6:511-519 1976), 재조합 DNA 방법(미국 등록특허 제4,816,567호) 및 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352, 624-628, 1991; Marks et al., J. Mol . Biol ., 222, 58:1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
상기 단계 2)에서 검출 대상이 되는 폐렴연쇄상구균 유래 단백질들로는 Hypothetical protein spr0747(NCBI gene no. spr0747), ABC transporter substrate-binding protein-manganese transport(NCBI gene no. spr1494), foldase protein PrsA(NCBI gene no. spr0884), branched chain amino acid ABC transporter amino acid-binding protein(NCBI gene no. spr0659), ABC transporter substrate-binding protein-amino acid transport(NCBI gene no. spr0146), ABC transporter substrate-binding protein-oligopeptide transport(NCBI gene no. spr0327), iron-compound ABC transporter, iron compound-binding protein(NCBI gene no. spr0934), amino acid ABC transporter amino acid-binding protein(NCBI gene no. spr1251), hypothetical protein spr0931(NCBI gene no. spr0931), adenylosuccinate synthetase(NCBI gene no. spr0021), ABC transporter substrate-binding protein-oligopeptide transport(NCBI gene no. spr1707), hypothetical protein spr0554(NCBI gene no. spr0554), peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, cyclophilin-type(NCBI gene no. spr0679), surface protein pspA precursor(NCBI gene no. spr0121), lipoprotein(NCBI gene no. spr0147), amino acid ABC transporter amino acid-binding protein(NCBI gene no. spr1353), hypothetical protein spr0688(NCBI gene no. spr0688), phosphopyruvate hydratase(NCBI gene no. spr1036), preprotein translocase subunit YajC(NCBI gene no. spr1840), zinc ABC transporter zinc-binding protein(NCBI gene no. spr1975), hypothetical protein spr1782(NCBI gene no. spr1782), signal peptidase I(NCBI gene no. spr0364), ABC transporter substrate-binding protein-oligopeptide transport(NCBI gene no. spr1382), hypothetical protein spr1912(NCBI gene no. spr1912), 30S ribosomal protein S8(NCBI gene no. spr0203), phosphate ABC transporter phosphate-binding protein(NCBI gene no. spr1257), glucokinase(NCBI gene no. spr0584), hypothetical protein spr0975(NCBI gene no. spr0975), sugar ABC transporter, sugar-binding protein(NCBI gene no. spr1527), ABC transporter substrate-binding protein(NCBI gene no. spr2003), 50S ribosomal protein L18(NCBI gene no. spr0205), L-lactate dehydrogenase(NCBI gene no. spr1100), phosphate transporter PhoU(NCBI gene no. spr1252), 30S ribosomal protein S5(NCBI gene no. spr0206), hypothetical protein spr1370(NCBI gene no. spr1370), ABC transporter substrate-binding protein-oligopeptide transport(NCBI gene no. spr1194), hypothetical protein spr1962(NCBI gene no. spr1962), penicillin-binding protein 1A(NCBI gene no. spr0329), 3-ketoacyl-(acyl-carrier-protein) reductase(NCBI gene no. spr0381), glycerol uptake facilitator protein, putative(NCBI gene no. spr1344), hypothetical protein spr0693(NCBI gene no. spr0693), hypothetical protein spr1457(NCBI gene no. spr1457), preprotein translocase subunit SecG(NCBI gene no. spr0877), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(NCBI gene no. spr1825), sugar ABC transporter, ATP-binding protein(NCBI gene no. spr1437), cytoplasmic membrane protein(NCBI gene no. spr1163), phosphoglycerate kinase(NCBI gene no. spr0441), ABC transporter substrate-binding protein(NCBI gene no. spr1645), phosphoglyceromutase(NCBI gene no. spr1499), ribosome-binding factor A(NCBI gene no. spr0482, hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase(NCBI gene no. spr0011), 30S ribosomal protein S7(NCBI gene no. spr0249), amino acid ABC transporter permease/amino acid-binding protein(NCBI gene no. spr1120), 50S ribosomal protein L22(NCBI gene no. spr0194), 50S ribosomal protein L5(NCBI gene no. spr0201), hypothetical protein spr0174(NCBI gene no. spr0174), pyruvate oxidase(NCBI gene no. spr0642), cell division protein DivIVA(NCBI gene no. spr1505), iron-compound ABC transporter, iron-compound-binding protein(NCBI gene no. spr1687), hypothetical protein spr1112(NCBI gene no. spr1112), F0F1 ATP synthase subunit delta(NCBI gene no. spr1363), D-alanyl-D-alanine carboxypeptidase(NCBI gene no. spr0776), large conductance mechanosensitive channel protein MscL(NCBI gene no. spr0915), PTS system, mannose-specific IIC component(NCBI gene no. spr0260), hypothetical protein spr0595(NCBI gene no. spr0595), hypothetical protein spr0615(NCBI gene no. spr0615), rod shape-determining protein MreC(NCBI gene no. spr2023), adhesion lipoprotein(NCBI gene no. spr0906), transcriptional repressor CodY(NCBI gene no. spr1439), hypothetical protein spr1056(NCBI gene no. spr1056), 50S ribosomal protein L16(NCBI gene no. spr0196), F0F1 ATP synthase subunit beta(NCBI gene no. spr1360), serine protease(NCBI gene no. spr2045), phosphotransferase system, mannose-specific EIID(NCBI gene no. spr0259), 50S ribosomal protein L13(NCBI gene no. spr0271), ABC transporter ATP-binding protein-unknown substrate((NCBI gene no. spr1559), 50S ribosomal protein L10(NCBI gene no. spr1212), phosphate ABC transporter ATP-binding protein(NCBI gene no. spr1253), choline transporter(NCBI gene no. spr1678), ABC transporter substrate-binding protein(NCBI gene no. spr0083), peptidoglycan GlcNAc deacetylase(NCBI gene no. spr1333), lactate oxidase(NCBI gene no. spr0627), PTS system, fructose specific IIABC components(NCBI gene no. spr0780), Zinc metalloprotease(NCBI gene no. spr0581), hypothetical protein spr0904(NCBI gene no. spr0904), fructose-bisphosphate aldolase(NCBI gene no. spr0530), phosphotransferase system, trehalose-specific IIBC component(NCBI gene no. spr1699), ribose-phosphate pyrophosphokinase(NCBI gene no. spr0028), endo-beta-N-acetylglucosaminidase(NCBI gene no. spr0867), transcriptional regulator(NCBI gene no. spr1759), 6-phosphogluconate dehydrogenase(NCBI gene no. spr0335), manganese ABC transporter, ATP-binding protein(NCBI gene no. spr1492), PTS system, IIABC components(NCBI gene no. spr0668), glutamine synthetase, type I(NCBI gene no. spr0444), sodium:alanine symporter family protein(NCBI gene no. spr0369), sugar ABC transporter, sugar-binding protein(NCBI gene no. spr1712), DNA-directed RNA polymerase subunit beta~(NCBI gene no. spr1776), polysaccharide biosynthesis protein, putative(NCBI gene no. spr1150), NADH oxidase(NCBI gene no. spr1323), maltodextrin phosphorylase(NCBI gene no. spr1916), preprotein translocase subunit SecY(NCBI gene no. spr0209), beta-galactosidase precursor(NCBI gene no. spr0565), isoleucyl-tRNA synthetase(NCBI gene no. spr1502) 및 maltose/maltodextrin ABC transporter, maltose/maltodextrin-binding protein(NCBI gene no. spr1918)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있고, foldase protein PrsA(NCBI gene no. spr0884), penicillin-binding protein 1A(NCBI gene no. spr0329), surface protein pspA precursor(NCBI gene no. spr0121) 및 maltose/maltodextrin ABC transporter, maltose/maltodextrin-binding protein(NCBI gene no. spr1918)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
상기 폐렴연쇄상구균에 의한 질환은 폐렴, 이하선염, 결막염, 복막염, 중이염, 심내막염 및 패혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나 이에 한정되지 아니하고, 폐렴연쇄상구균의 감염에 의해 발생하는 모든 질환에 대하여 진단가능하다. 폐렴연쇄상구균은 일반적으로 인간 비인강(nasopharynx)의 점막 표면을 콜로니화 하는 편리공생체로서, 숙주가 생물체의 하기도 접근을 허용하는 경우, 왕성한 염증 반응이 일어나고 폐포 공간에 삼출물이 차면서 경화를 야기시킨다. 이러한 상태를 통상 폐렴이라 칭한다. 폐렴연쇄상구균 감염의 심각한 징후로서 패혈증, 수막염, 또는 패혈증과 수막염 모두에 의하여 악화될 수 있는 균혈증이 있으며, 이하선염, 결막염, 복막염, 중이염 또는 심내막염을 일으킬 수 있다(Suzuki et al., J. Clin . Microbiol ., 43: 4528-4534, 2005).
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 체내에 서식하거나 주변 환경에 존재하는 그람양성균인 폐렴연쇄상구균이 세포 밖으로 막소포체를 분비한다는 것을 확인함으로써, 상기 막소포체를 이용하여 폐렴연쇄상구균 매개 질환이나 폐렴연쇄상구균 노출 여부를 진단하는 방법을 개발하고자 하였다. 구체적으로, 폐렴연쇄상구균 배양액으로부터 막소포체를 분리 및 확인하였고(도 1 및 도 2 참조), 상기 막소포체 표지마커로서 이용할 수 있는 단백질을 전기영동 및 질량분석을 통해 확인한 결과, 28개의 막 단백질, 1개의 세포벽 단백질, 32개의 분비 단백질 및 43개의 세포질 단백질이 확인되었다(표 1 및 도 3 참조). 이 중에서 38개의 단백질이 ABC transporter 또는 PTS system과 같은 물질 수송에 관련된 단백질들인 것으로 확인되었다.
특히, 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체에 대한 마우스 혈청 항원과 상기 단백질들을 면역 반응시킨 결과, foldase protein PrsA(NCBI gene no. spr0884), penicillin-binding protein 1A(NCBI gene no. spr0329), surface protein pspA precursor(NCBI gene no. spr0121) 및 maltose/maltodextrin ABC transporter, maltose/maltodextrin-binding protein(NCBI gene no. spr1918) 단백질의 경우 강하게 항원-항체 반응이 유도되는 것을 확인하였다(도 4 참조). 이로써 기관지폐포성 세척액 등과 같이 채취가 용이한 생물학적 시료, 환경 시료 또는 식품 시료 등에서, 본 발명에서 규명한 막소포체 단백질들의 존재 여부를 확인함으로써 폐렴연쇄상구균의 감염이나 노출을 효율적으로 진단할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
폐렴연쇄상구균 유래 막소포체의 분리
<1-1> 폐렴연쇄상구균의 배양 및 회수
폐렴연쇄상구균(BAA-255)을 4ℓ의 배양액(Thdd-Hewitt broth, BD, 미국)에 첨가하고 0.5% 효모추출물(THY)을 추가하여 고압멸균한 다음, 37℃, 5% CO2 조건하에서 흡광도(optical density) 0.9가 될 때까지 정체 배양하였다. 그런 다음, 배양한 균을 4℃에서 8,000 rpm으로 30분간 원심 분리하여 상등액인 배지 성분과 세포를 분리하였다.
<1-2> 막소포체(Membrane Vesicles, MVs)의 분리 및 확인
상기 실시예 <1-1>에서 회수된 상등액을 0.2 ㎛ 필터로 여과하여 배지에 포함된 세포와 부유물을 제거한 다음, QUIXStandTM system(GE, 미국)을 이용하여 500 kDa 이하의 물질들을 제거하고 500 kDa 이상만을 수득하여 이를 200 ㎖ 이하로 농축하였다. 이렇게 얻어진 용액을 초고속원심분리기를 사용하여 원심 분리한 다음 바닥에 가라앉은 막소포체를 회수하였다. 그런 다음, 회수한 막소포체에 섞여있는 단백질들을 제거하기 위하여 자당(sucrose)을 사용하여 농도 구배를 만든 후, 2차 초고속원심분리를 실시하여 순수한 막소포체를 회수하였다. 이와 같이 회수된 막소포체를 확인하기 위하여 전자현미경(Cryo-TEM)을 사용하여 분리된 막소포체를 육안으로 확인하였다(도 1 참조).
그 결과, 폐렴연쇄상구균 배양물의 배지 성분으로부터 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체가 분리되었음을 확인하였다(도 2 참조).
<실시예 2>
폐렴연쇄상구균 유래 막소포체에 포함된 단백질의 동정
<2-1> 전기영동 및 질량분석을 통한 막소포체의 단백질 동정
12% SDS-PAGE에 막소포체 15 ㎍을 로딩하여 전기영동 한 후, 겔을 8개의 분획으로 절단한 다음 각각의 분획에 트립신(trypsin)을 사용하여 in-gel digestion을 수행하였다(도 3 참조). 이렇게 얻은 각각의 펩티드는 LCQ DECA XP plus(Thermo Finnigan, 미국)를 사용하여 분석하였다. 상기 분석 결과는 MASCOT 소프트웨어(ver. 2.4) 및 유전자 데이터베이스인 NCBI의 S. pneumoniae R6를 사용하여 각각의 특정 단백질을 동정하였다.
<2-2> 막소포체 단백질의 분석
상기와 실시예 <2-1>과 같이 동정된 막소포체 단백질은 emPAI 계산법에 의해 각 단백질의 농도를 정량하였고, LocateP 데이터베이스를 이용하여 각 단백질들의 세포내에서의 위치를 규명하였다.
그 결과, 28개의 막 단백질, 1개의 세포벽 단백질, 32개의 분비 단백질, 및 43개의 세포질 단백질이 확인되었다. 이 중, 탄산나트륨 침전법에 의해서만 확인된 막 단백질은 12개인 것으로 확인되었고, 38개의 단백질이 ABC 수송체(transporter) 또는 PTS 시스템과 같은 물질 수송에 관련된 단백질인 것으로 확인되었다(표 1 참조).
Gene No. 단백질 이름 MW
(분자량)		 pI
(등전점)		 유전자 이름 세포내 위치 Average%
spr0747 hypothetical protein spr0747 39481 5.46 - Extracellular
(세포밖)		 9.388
spr1494 ABC transporter substrate-binding protein - manganese transport. 34573 5.3 psaA Extracellular 8.669
spr0884 foldase protein PrsA 34419 5.04 prsA Extracellular 6.588
spr1918 maltose/maltodextrin ABC transporter,maltose/maltodextrin-binding protein 45339 5.1 malX Extracellular 6.124
spr0659 branched chain amino acid ABC transporter amino acid-binding protein 40389 5.29 livJ Extracellular 4.398
spr0146 ABC transporter substrate-binding protein - amino acid transport 30609 5.14 ABC-SBP Extracellular 3.453
spr0327 ABC transporter substrate-binding protein - oligopeptide transport 72958 5 aliA Extracellular 3.241
spr0934 iron-compound ABC transporter, iron compound-binding protein 37483 5.38 ABC-SBP Extracellular 3.175
spr1251 amino acid ABC transporter amino acid-binding protein 29246 4.96 glnH Extracellular 2.973
spr0931 hypothetical protein spr0931 35377 5.46 - Extracellular 2.494
spr0021 adenylosuccinate synthetase 47541 5.49 purA Cytoplasmic
(세포질)		 2.279
spr1707 ABC transporter substrate-binding protein - oligopeptide transport 72460 4.95 amiA Extracellular 2.218
spr0554 hypothetical protein spr0554 26522 5.13 - Extracellular 2.010
spr0679 peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, cyclophilin-type 28991 5.47 ppiA Extracellular 1.936
spr0121 surface protein pspA precursor 68563 5.12 pspA Membrane
(막)		 1.518
spr0147 lipoprotein 31128 5.46 ABC-SBP Extracellular 1.507
spr1353 amino acid ABC transporter amino acid-binding protein 31000 4.83 glnH Extracellular 1.486
spr0688 hypothetical protein spr0688 12929 6.97 - Cytoplasmic 1.409
spr1036 phosphopyruvate hydratase 47074 4.7 eno Cytoplasmic 1.340
spr1840 preprotein translocase subunit YajC 11040 5.39 yajC Membrane 1.290
spr1975 zinc ABC transporter zinc-binding protein 56237 5.05 adcA Extracellular 1.142
spr1782 hypothetical protein spr1782 37514 5.26 - Membrane 1.070
spr0364 signal peptidase I 23483 5.84 spi Membrane 1.050
spr1382 ABC transporter substrate-binding protein - oligopeptide transport 72517 5.24 aliB Extracellular 0.990
spr1912 hypothetical protein spr1912 11376 6.6 - Cytoplasmic 0.976
spr0203 30S ribosomal protein S8 14745 9.58 rpsH Cytoplasmic 0.884
spr1257 phosphate ABC transporter phosphate-binding protein 31182 4.77 pstS Extracellular 0.883
spr0584 glucokinase 34164 4.95 glcK Cytoplasmic 0.880
spr0975 hypothetical protein spr0975 36417 7.74 ABC-SBP Extracellular 0.877
spr1527 sugar ABC transporter, sugar-binding protein 48273 5.31 ABC-SBP Extracellular 0.850
spr2003 ABC transporter substrate-binding protein 37753 5.41 - Extracellular 0.836
spr0205 50S ribosomal protein L18 12859 10.4 rplR Cytoplasmic 0.771
spr1100 L-lactate dehydrogenase 35333 5.09 ldh Cytoplasmic 0.757
spr1252 phosphate transporter PhoU 25013 4.73 phoU Cytoplasmic 0.756
spr0206 30S ribosomal protein S5 17046 9.52 rpsE Cytoplasmic 0.737
spr1370 hypothetical protein spr1370 60776 5.07 - Cytoplasmic 0.733
spr1194 ABC transporter substrate-binding protein - oligopeptide transport 61169 5.86 appA Extracellular 0.725
spr1962 hypothetical protein spr1962 33573 5.62 - Membrane 0.666
spr0329 penicillin-binding protein 1A 79652 5.41 pbpA Membrane 0.651
spr0381 3-ketoacyl-(acyl-carrier-protein) reductase 25753 5.49 fabG Cytoplasmic 0.647
spr1344 glycerol uptake facilitator protein, putative 30652 9.02 glpF Membrane 0.543
spr0693 hypothetical protein spr0693 41839 5.12 - Membrane 0.532
spr1457 hypothetical protein spr1457 16787 5.03 - Membrane 0.522
spr0877 preprotein translocase subunit SecG 8545 9.69 secG Membrane 0.521
spr1825 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 38739 5.78 gapA Cytoplasmic 0.494
spr1437 sugar ABC transporter, ATP-binding protein 41808 5.83 msmK Cytoplasmic 0.493
spr1163 cytoplasmic membrane protein 20621 5.66 lemA Membrane 0.472
spr0441 phosphoglycerate kinase 41913 4.92 pgk Cytoplasmic 0.468
spr1645 ABC transporter substrate-binding protein 39178 5.61 ABC-SBP Extracellular 0.450
spr1499 phosphoglyceromutase 26035 5.14 gpmA Cytoplasmic 0.429
spr0482 ribosome-binding factor A 14456 9.36 rbfA Cytoplasmic 0.418
spr0011 hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 20199 5.26 hgt Cytoplasmic 0.416
spr0249 30S ribosomal protein S7 17745 10.29 rpsG Cytoplasmic 0.383
spr1120 amino acid ABC transporter permease/amino acid-binding protein 78318 8.39 glnP Membrane 0.367
spr0194 50S ribosomal protein L22 12193 10.76 rplV Cytoplasmic 0.347
spr0201 50S ribosomal protein L5 19762 9.04 rplE Cytoplasmic 0.339
spr0174 hypothetical protein spr0174 21027 5.83 - Extracellular 0.333
spr0642 pyruvate oxidase 65214 5.03 spxB Cytoplasmic 0.329
spr1505 cell division protein DivIVA 30724 4.7 divIVA Cytoplasmic 0.328
spr1687 iron-compound ABC transporter, iron-compound-binding protein 34841 5.55 fatB Extracellular 0.328
spr1112 hypothetical protein spr1112 20260 10.38 - Membrane 0.323
spr1363 F0F1 ATP synthase subunit delta 20528 7.77 atpH Cytoplasmic 0.323
spr0776 D-alanyl-D-alanine carboxypeptidase 45192 4.87 dacA Extracellular 0.322
spr0915 large conductance mechanosensitive channel protein MscL 13608 9.78 mscL Membrane 0.315
spr0260 PTS system, mannose-specific IIC component 27213 4.84 manM Membrane 0.302
spr0595 hypothetical protein spr0595 14568 10.05 - Membrane 0.293
spr0615 hypothetical protein spr0615 14431 8.76 - Membrane 0.293
spr2023 rod shape-determining protein MreC 29721 5.87 mreC Membrane 0.293
spr0906 adhesion lipoprotein 34678 5.27 lmb Extracellular 0.287
spr1439 transcriptional repressor CodY 29738 5.55 codY Cytoplasmic 0.277
spr1056 hypothetical protein spr1056 25660 6.34 - Cytoplasmic 0.273
spr0196 50S ribosomal protein L16 15426 10.66 rplP Cytoplasmic 0.271
spr1360 F0F1 ATP synthase subunit beta 50872 4.85 atpD Cytoplasmic 0.271
spr2045 serine protease 42262 6.15 sphtra Membrane 0.265
spr0259 phosphotransferase system, mannose-specific EIID 33764 8.79 manN Membrane 0.263
spr0271 50S ribosomal protein L13 16133 9.95 rplM Cytoplasmic 0.261
spr1559 ABC transporter ATP-binding protein - unknown substrate 26664 5.71 ABC-NBD Cytoplasmic 0.246
spr1212 50S ribosomal protein L10 17469 5.08 rplJ Cytoplasmic 0.239
spr1253 phosphate ABC transporter ATP-binding protein 27936 5.36 pstB Cytoplasmic 0.235
spr1678 choline transporter 27082 4.97 proV Cytoplasmic 0.220
spr0083 ABC transporter substrate-binding protein 57190 5.94 ABC-SBP Extracellular 0.210
spr1333 peptidoglycan GlcNAc deacetylase 52642 5.45 pgdA Membrane 0.207
spr0627 lactate oxidase 41463 5.67 lctO Cytoplasmic 0.206
spr0780 PTS system, fructose specific IIABC components 66892 5.31 fruA Membrane 0.205
spr0581 Zinc metalloprotease 210928 5.3 zmpB Membrane 0.198
spr0904 hypothetical protein spr0904 21348 7.59 - Extracellular 0.195
spr0530 fructose-bisphosphate aldolase 31382 5 fba Cytoplasmic 0.186
spr1699 phosphotransferase system, trehalose-specific IIBC component 75669 5.28 treP Membrane 0.176
spr0028 ribose-phosphate pyrophosphokinase 37379 5.39 prsA Cytoplasmic 0.169
spr0867 endo-beta-N-acetylglucosaminidase 84238 5.46 lytB Extracellular 0.165
spr1759 transcriptional regulator 37543 5.11 lytR Extracellular 0.157
spr0335 6-phosphogluconate dehydrogenase 52546 4.92 gnd Cytoplasmic 0.152
spr1492 manganese ABC transporter, ATP-binding protein 26813 7.05 psaB Cytoplasmic 0.152
spr0668 PTS system, IIABC components 77972 5.94 ptsG Membrane 0.140
spr0444 glutamine synthetase, type I 50290 4.93 glnA Cytoplasmic 0.126
spr0369 sodium:alanine symporter family protein 46692 8.67 dagA Membrane 0.124
spr1712 sugar ABC transporter, sugar-binding protein 46632 5.13 msmE Extracellular 0.124
spr1776 DNA-directed RNA polymerase subunit beta~ 136877 6.8 rpoC Cytoplasmic 0.119
spr1150 polysaccharide biosynthesis protein, putative 56482 9.44 - Membrane 0.110
spr1323 NADH oxidase 50180 4.99 nox Cytoplasmic 0.108
spr1916 maltodextrin phosphorylase 85101 5.03 malP Cytoplasmic 0.098
spr0209 preprotein translocase subunit SecY 47323 9.68 secY Membrane 0.087
spr0565 beta-galactosidase precursor 246632 5.81 bgaA Cell Wall 0.063
spr1502 isoleucyl-tRNA synthetase 105409 4.93 ileS Cytoplasmic 0.059
<실시예 3>
항체를 이용한 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체 단백질의 확인
상기 실시예 2를 통해 동정된 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체 단백질들의 바이오마커로서의 유용성을 확인하기 위하여, 마우스에 108개의 S. pneimoniae BAA-255 균주를 3회 주사한 후 상기 마우스로부터 혈청을 획득하였다. 그런 다음, 상기 표 1에 기재된 막소포체 단백질들을 전기영동하여 상기 혈청을 1:500으로 처리한 후 웨스턴 블랏을 실시하였다.
그 결과, 6개의 밴드에서 특히 강한 신호가 검출되었고, 이 6개의 단백질 중 foldase protein PrsA(NCBI gene no. spr0884), penicillin-binding protein 1A(NCBI gene no. spr0329), surface protein pspA precursor(NCBI gene no. spr0121) 및 maltose/maltodextrin ABC transporter, maltose/maltodextrin-binding protein(NCBI gene no. spr1918) 단백질이 포함되어 있는 것으로 확인되었다(도 4 참조).
<실시예 4>
환자 유래의 시료를 이용한 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체 단백질의 확인
폐렴환자의 혈액에서 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체 단백질 유무를 알아보기 위해 점 블라팅(dot blotting)을 실시하였다. 실험군으로는 임상병리과에서 원인균이 폐렴연쇄상구균으로 밝혀진 폐렴환자의 혈청 4개를 사용하였고, 대조군으로는 건강한 사람의 혈청 1개를 사용하였다. 도 5와 같이 니트로셀룰로오스막(NC membrane; GE, USA)에 각각의 검체(대조군을 포함한 폐렴환자 혈청) 1ul씩 로딩하였고, 검체가 니트로셀룰로오스막에 흡착이 완료되면 트리스완충식염수(Tris-buffered saline)에 5% 탈지유(WAKO, Japan)를 넣은 용액으로 막을 30분 동안 차단하였다. 그 후 1차 항체로 막소포체 항체를 1 : 5,000, 1 : 10,000 비율로 트리스완충식염수에 3% 탈지유를 넣은 용액에 섞어 4시간 처리한 후, TTBS(Tris-buffered saline with 0.1% tween-20)으로 10분씩 3회 세척하였다. 여기에 2차 항체로 항 토끼 IgG 항체를 트리스완충식염수에 3% 탈지유를 넣은 용액에 1 : 5,000 비율로 희석하여 1시간 처리해준 후, 다시 TTBS로 10분씩 3회 세척하였다. 여기에 ECL 용액(Electrochemiluminescence solution; GE. USA)을 처리하여 발색시켰다.
그 결과, 도 5에서와 같이 폐렴연쇄상구균 막소포체 항체를 사용하여 폐렴환자 및 건강한 사람의 혈청에 반응시켰을 경우, 폐렴환자의 혈청 대부분이 막소포체 항체에 반응을 보이는 것으로 나타났다. 환자의 혈청은 1차 단계에서 폐렴연쇄상구균에 감염이 확진된 환자에서 채취한 것으로 다른 바이러스성 폐렴환자의 시료는 아니므로, 위 결과는 폐렴연쇄상구균에 의한 폐렴환자의 검체(혈청)에서 막소포체 항체를 이용한 진단이 가능한 것으로 보여졌다.
도 5를 참조하여 설명하면, 1번인 대조군에서는 막소포체 항체에 반응이 나타나지 않았고, 2~3번(폐렴환자 혈청 a~b)은 반응이 강하게 나타났다. 또한, 4번(페렴환자 혈청 c)은 약하지만 확인 가능한 반응이 나타났고, 5번(페렴환자 혈청 d)은 반응성이 아주 약하여 육안 확인이 불가능하나 결과의 이미지 농도를 조절할 경우 약하게 반응을 나타냄을 확인할 수 있었다. 그러나, 막소포체 항체의 희석 비율에 따른 환자 시료에서의 반응성은 큰 차이를 나타내지 않는 것으로 나타났다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

Claims (14)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 1) 생물학적 시료, 환경 시료 및 식품 시료 중 어느 하나로부터 세포밖 소포체를 분리하는 단계;
    2) 상기 분리된 세포밖 소포체에서, 폐렴연쇄상구균 유래 단백질들의 존재 여부를 확인하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 단백질들 중 어느 하나 이상의 단백질의 존재가 검출된 경우, 폐렴연쇄상구균에 의한 질환에 걸렸거나 폐렴연쇄상구균에 노출된 것으로 판정하는 단계를 포함하고,
    상기 단계 1)의 세포밖 소포체를 분리하는 단계가
    1) 폐렴연쇄상구균 배양액을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계;
    2) 상기 수득된 상등액을 1차 여과하여 불순물 및 세포를 제거하는 단계;
    3) 상기 수득된 여과물을 500 kDa의 분자량 컷오프를 갖는 막으로 2차 여과하여 상기 컷오프값 이상의 분자량을 갖는 분획물을 수득하는 단계; 및
    4) 상기 수득된 분획물을 초원심분리하여 침전물을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 폐렴연쇄상구균에 의한 질환 또는 폐렴연쇄상구균 노출 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 단계 1)의 생물학적 시료는 폐렴연쇄상구균에 감염된 것으로 의심되는 환자 유래의 혈액, 혈청, 폐세척액, 기관지세척액, 소변, 복수, 활액, 가래, 침, 땀, 눈물 및 콧물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 폐렴연쇄상구균에 의한 질환 또는 폐렴연쇄상구균 노출 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 단계 1)의 환경 시료는 음용수, 지하수, 하천수, 축산폐수, 토양, 공기 및 폐기물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 폐렴연쇄상구균에 의한 질환 또는 폐렴연쇄상구균 노출 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
  10. 삭제
  11. 청구항 7에 있어서, 상기 단계 2)의 단백질들의 존재 여부를 확인하는 방법은 상기 단계 2)의 단백질들에 특이적으로 결합하는 각각의 항체를 사용하여 항원-항체 반응을 검출하는 것을 특징으로 하는 폐렴연쇄상구균에 의한 질환 또는 폐렴연쇄상구균 노출 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
  12. 청구항 7에 있어서, 상기 단계 2)의 폐렴연쇄상구균 유래 단백질들은 foldase protein PrsA(NCBI gene no. spr0884), penicillin-binding protein 1A(NCBI gene no. spr0329), surface protein pspA precursor(NCBI gene no. spr0121) 및 maltose/maltodextrin ABC transporter, maltose/maltodextrin-binding protein(NCBI gene no. spr1918)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 폐렴연쇄상구균에 의한 질환 또는 폐렴연쇄상구균 노출 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
  13. 청구항 7에 있어서, 상기 단계 2)의 폐렴연쇄상구균 유래 단백질들은 Hypothetical protein spr0747(NCBI gene no. spr0747), ABC transporter substrate-binding protein-manganese transport(NCBI gene no. spr1494), foldase protein PrsA(NCBI gene no. spr0884), branched chain amino acid ABC transporter amino acid-binding protein(NCBI gene no. spr0659), ABC transporter substrate-binding protein-amino acid transport(NCBI gene no. spr0146), ABC transporter substrate-binding protein-oligopeptide transport(NCBI gene no. spr0327), iron-compound ABC transporter, iron compound-binding protein(NCBI gene no. spr0934), amino acid ABC transporter amino acid-binding protein(NCBI gene no. spr1251), hypothetical protein spr0931(NCBI gene no. spr0931), adenylosuccinate synthetase(NCBI gene no. spr0021), ABC transporter substrate-binding protein-oligopeptide transport(NCBI gene no. spr1707), hypothetical protein spr0554(NCBI gene no. spr0554), peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, cyclophilin-type(NCBI gene no. spr0679), surface protein pspA precursor(NCBI gene no. spr0121), lipoprotein(NCBI gene no. spr0147), amino acid ABC transporter amino acid-binding protein(NCBI gene no. spr1353), hypothetical protein spr0688(NCBI gene no. spr0688), phosphopyruvate hydratase(NCBI gene no. spr1036), preprotein translocase subunit YajC(NCBI gene no. spr1840), zinc ABC transporter zinc-binding protein(NCBI gene no. spr1975), hypothetical protein spr1782(NCBI gene no. spr1782), signal peptidase I(NCBI gene no. spr0364), ABC transporter substrate-binding protein-oligopeptide transport(NCBI gene no. spr1382), hypothetical protein spr1912(NCBI gene no. spr1912), 30S ribosomal protein S8(NCBI gene no. spr0203), phosphate ABC transporter phosphate-binding protein(NCBI gene no. spr1257), glucokinase(NCBI gene no. spr0584), hypothetical protein spr0975(NCBI gene no. spr0975), sugar ABC transporter, sugar-binding protein(NCBI gene no. spr1527), ABC transporter substrate-binding protein(NCBI gene no. spr2003), 50S ribosomal protein L18(NCBI gene no. spr0205), L-lactate dehydrogenase(NCBI gene no. spr1100), phosphate transporter PhoU(NCBI gene no. spr1252), 30S ribosomal protein S5(NCBI gene no. spr0206), hypothetical protein spr1370(NCBI gene no. spr1370), ABC transporter substrate-binding protein-oligopeptide transport(NCBI gene no. spr1194), hypothetical protein spr1962(NCBI gene no. spr1962), penicillin-binding protein 1A(NCBI gene no. spr0329), 3-ketoacyl-(acyl-carrier-protein) reductase(NCBI gene no. spr0381), glycerol uptake facilitator protein, putative(NCBI gene no. spr1344), hypothetical protein spr0693(NCBI gene no. spr0693), hypothetical protein spr1457(NCBI gene no. spr1457), preprotein translocase subunit SecG(NCBI gene no. spr0877), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(NCBI gene no. spr1825), sugar ABC transporter, ATP-binding protein(NCBI gene no. spr1437), cytoplasmic membrane protein(NCBI gene no. spr1163), phosphoglycerate kinase(NCBI gene no. spr0441), ABC transporter substrate-binding protein(NCBI gene no. spr1645), phosphoglyceromutase(NCBI gene no. spr1499), ribosome-binding factor A(NCBI gene no. spr0482, hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase(NCBI gene no. spr0011), 30S ribosomal protein S7(NCBI gene no. spr0249), amino acid ABC transporter permease/amino acid-binding protein(NCBI gene no. spr1120), 50S ribosomal protein L22(NCBI gene no. spr0194), 50S ribosomal protein L5(NCBI gene no. spr0201), hypothetical protein spr0174(NCBI gene no. spr0174), pyruvate oxidase(NCBI gene no. spr0642), cell division protein DivIVA(NCBI gene no. spr1505), iron-compound ABC transporter, iron-compound-binding protein(NCBI gene no. spr1687), hypothetical protein spr1112(NCBI gene no. spr1112), F0F1 ATP synthase subunit delta(NCBI gene no. spr1363), D-alanyl-D-alanine carboxypeptidase(NCBI gene no. spr0776), large conductance mechanosensitive channel protein MscL(NCBI gene no. spr0915), PTS system, mannose-specific IIC component(NCBI gene no. spr0260), hypothetical protein spr0595(NCBI gene no. spr0595), hypothetical protein spr0615(NCBI gene no. spr0615), rod shape-determining protein MreC(NCBI gene no. spr2023), adhesion lipoprotein(NCBI gene no. spr0906), transcriptional repressor CodY(NCBI gene no. spr1439), hypothetical protein spr1056(NCBI gene no. spr1056), 50S ribosomal protein L16(NCBI gene no. spr0196), F0F1 ATP synthase subunit beta(NCBI gene no. spr1360), serine protease(NCBI gene no. spr2045), phosphotransferase system, mannose-specific EIID(NCBI gene no. spr0259), 50S ribosomal protein L13(NCBI gene no. spr0271), ABC transporter ATP-binding protein-unknown substrate((NCBI gene no. spr1559), 50S ribosomal protein L10(NCBI gene no. spr1212), phosphate ABC transporter ATP-binding protein(NCBI gene no. spr1253), choline transporter(NCBI gene no. spr1678), ABC transporter substrate-binding protein(NCBI gene no. spr0083), peptidoglycan GlcNAc deacetylase(NCBI gene no. spr1333), lactate oxidase(NCBI gene no. spr0627), PTS system, fructose specific IIABC components(NCBI gene no. spr0780), Zinc metalloprotease(NCBI gene no. spr0581), hypothetical protein spr0904(NCBI gene no. spr0904), fructose-bisphosphate aldolase(NCBI gene no. spr0530), phosphotransferase system, trehalose-specific IIBC component(NCBI gene no. spr1699), ribose-phosphate pyrophosphokinase(NCBI gene no. spr0028), endo-beta-N-acetylglucosaminidase(NCBI gene no. spr0867), transcriptional regulator(NCBI gene no. spr1759), 6-phosphogluconate dehydrogenase(NCBI gene no. spr0335), manganese ABC transporter, ATP-binding protein(NCBI gene no. spr1492), PTS system, IIABC components(NCBI gene no. spr0668), glutamine synthetase, type I(NCBI gene no. spr0444), sodium:alanine symporter family protein(NCBI gene no. spr0369), sugar ABC transporter, sugar-binding protein(NCBI gene no. spr1712), DNA-directed RNA polymerase subunit beta~(NCBI gene no. spr1776), polysaccharide biosynthesis protein, putative(NCBI gene no. spr1150), NADH oxidase(NCBI gene no. spr1323), maltodextrin phosphorylase(NCBI gene no. spr1916), preprotein translocase subunit SecY(NCBI gene no. spr0209), beta-galactosidase precursor(NCBI gene no. spr0565), isoleucyl-tRNA synthetase(NCBI gene no. spr1502) 및 maltose/maltodextrin ABC transporter, maltose/maltodextrin-binding protein(NCBI gene no. spr1918)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 폐렴연쇄상구균에 의한 질환 또는 폐렴연쇄상구균 노출 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
  14. 청구항 7에 있어서, 상기 폐렴연쇄상구균에 의한 질환은 폐렴, 이하선염, 결막염, 복막염, 중이염, 심내막염 및 패혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 단백질 검출 방법.
KR1020140174974A 2013-12-09 2014-12-08 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체 및 이를 이용한 폐렴연쇄상구균 매개 질환 진단 방법 KR101650083B1 (ko)

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