JP2017132712A - モノクローナル抗体、検出方法、及び検出装置 - Google Patents

Abstract

【課題】マイコプラズマ・ニューモニエに対する反応性の高いモノクローナル抗体、及び、検出装置の提供。【解決手段】マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパクにおける、Ｎ末端より１７７番目から２７４番目までのＣ末端側に複数回出現する特定のアミノ酸配列に特異的に反応するが、Ｎ末端から１７６番目までには反応しない前記モノクローナル抗体。及び、前記モノクローナル抗体を用いたサンドイッチ法によるイムノクロマトによる免疫学的検出装置。【選択図】図１

Description

本発明は、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の検出に用いるモノクローナル抗体及びそれを用いる関連技術に関するものである。

マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、肺炎の原因となる菌の一つであり、感染すると激しい咳と発熱が長期にわたり続くのが特徴である。

患者の気道からは、数週から数ヶ月にわたりこの菌が分離され、主に接触や咳による飛沫感染で伝播し、家庭や学校、病院などの施設内のような閉鎖的な空間で流行しやすい。気管支や肺胞外部にある間質という組織で炎症を起こすため、他の肺炎と異なり聴診器で聞かれる雑音が出にくく、診断が遅れてしまうことも多い。

典型的な症状では、発熱や全身倦怠，頭痛を伴った気分不快が数日続き、乾性の咳に始まり、以後は悪化すると痰がからみ血痰になることもある。咳は解熱後も３〜４週にわたり続く。

マイコプラズマ肺炎は間質の肺炎であり、重症化することは少ないとされるが、長期化することによって気管支炎や肺炎を併発し、さらに気管支喘息を起こすこともある。稀に重症肺炎になり、胸水が貯留することもある。

患者の中には、吐き気，嘔吐，下痢の消化器症状を起こし、中耳炎や副鼻腔炎、鼓膜炎，さらには筋肉痛・関節痛・発疹などが出現する場合もある。

合併症として、中枢神経の異常（無菌性髄膜炎、脳炎、ギラン・バレー症候群）、皮膚病変、肝炎、膵炎、溶血性貧血、心筋炎、関節炎など様々な症例が報告されている。これらの症状には個人差があり、数日で治る人から１ヶ月以上続く人もある。

肺炎球菌による老人に特有な肺炎とは異なり、マイコプラズマ・ニューモニエによる肺炎は、幅広い年齢層で罹患し、特に幼児期、学童期、青年期に多く見られる。潜伏期間は、２〜３週間とかなり長いため、その間の周囲への感染拡大にも注意が必要である。重症化することは一般的には少ないと言われるが、十分な免疫が出来にくいために、何度も繰り返し感染することがある。

マイコプラズマ・ニューモニエは、他の細菌と異なり細胞壁を持たないため、ベータラクタム系（ペニシリン系およびセファム系）の抗生物質に感受性を示さない。

そのため、治療薬としては、マクロライド系抗生物質が第一選択肢あり、エリスロマイシン、リカマイシン、クラリス、ミオカマイシン、ジョサマイシン、クラリシッド、ジスロマック等がよく使用される。

最近では、このマクロライド系の抗生物質が効かない耐性菌が増えてきて問題となっており、このような耐性菌には、ミノマイシンなどのテトラサイクリン系抗生物質、ニューキノロン系抗生物質が使用される。

マイコプラズマ・ニューモニエの診断は、一般的な感染症の指標である白血球や、ＣＲＰ（炎症反応）の上昇が少なく、これらの一般的な血液検査では困難である。診断の一つとしては、マイコプラズマ・ニューモニエに感染することで体内に作られる抗体を利用して、採血してこれを調べる方法がある。

正確な検査方法は、ペア血清を用いて比較する方法であり、症状が現れ始めた頃（急性期）と、約２週間後の回復した頃（回復期）の２回採血して、この間の抗体価の上昇の程度を見て診断する方法である。通常、４倍以上抗体が上昇していればマイコプラズマ・ニューモニエと診断できる。急性期の１回だけの採血では、３２０倍以上などの高力価をもって診断する。

しかし、この方法は、適正な時期に採血出来ないと正確な結果が得られず、また、結果がわかるまで長期間がかかるという欠点がある。

より信頼できる診断方法としては、分離培養法と遺伝子検査法がある。分離培養は、確定診断法でもあり、専用のＰＰＬＯ培地に咽頭ぬぐい検体や喀痰検体を播いて２〜４週間の期間、培養することで判定するが、数パーセントの割合でうまく育たないことがある。

遺伝子検査としては、マイコプラズマのＤＮＡを抽出・増幅して検出することが出来るＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）やＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法があり（特許文献１：特開２００９−１３１１７４号公報参照）、培養法とよく相関することが知られている。

これらは高感度で特異性の高い方法として非常に有用であるが、特別な装置を必要とし、試料の前処理などが煩雑であるうえに、結果が出るまでに数時間を要する。更に検査コストも高いことから、開業医などで広く検査に採用することはできない。

マイコプラズマ・ニューモニエを免疫反応により検出しようとする試みは早くから行われており、古くは１９８８年に同定用及び診断用試薬のためのモノクローナル抗体の製造法、およびこれを用いた酵素免疫測定法や凝集法による検出が開示されている（特許文献２：特開昭６３−１８４０６４号公報）。

さらに、１９９３年には、マイコプラズマ・ニューモニエに特異性の高いＰ１タンパクに対するモノクローナル抗体の作製とこれを用いた検出法（特許文献３：特開平５−３０４９９０号公報）、２００１年にはマイコプラズマ・ニューモニエのＲｉｂｏｓｏｍａｌ ＰｒｏｔｅｉｎＬ７／Ｌ１２タンパクに対して特異的なモノクローナル抗体と検出法（特許文献４：国際公開第２００１／５７１９９号公報）も開示されている。

そして最近では、マイコプラズマ・ニューモニエ抗原を免疫的に検出する簡易迅速検査法として、Ｐ１タンパクに対するモノクローナル抗体を用いたイムノクロマト法（特許文献５：特開２０１３−７２６６３号公報）、Ｄｎａｋに対するモノクローナル抗体を用いたイムノクロマト法（特許文献６：国際公開第２０１１／０６８１８９号公報）、Ｐ３０タンパクに対するモノクローナル抗体を用いたイムノクロマト法（特許文献７：国際公開第２０１５／０２５９６８号公報）も開示されている。

なお、特許文献７には、Ｐ３０タンパクに対するモノクローナル抗体が概念的に記載されているものの、「エピト−プはアミノ酸配列ＡＡ７４−２７４に存在する」という漠然とした記載しかない。もとより、２７４個あるアミノ酸の配列のうち、７４個から２７４個までという範囲は、全体の約７３パーセントに及び、エピトープを具体的に特定しているとは言えない。結局、当業者といえども、特許文献７を実用に供することはできない。

これらのイムノクロマト法を用いた試薬は既にいくつかが販売されており、咽頭患部を綿棒で拭って緩衝液などに溶出させ、テストデバイスに滴下するだけの簡単な操作で十数分以内に出現するラインの有無による判定で感染の有無を知ることが出来るため、抗生物質の選択のため感染初期の診断を望む臨床現場に取り入れられるようになってきた。

しかしながら、マイコプラズマ肺炎では抗原量が比較的少ないために、これらの方法では感度が不十分であり、感染患者の取りこぼしが大きな問題となっている。

また、Ｄｎａｋを標的にした場合には、近縁種のマイコプラズマ・ジェニタリウムとも交差反応し（特許文献６）、Ｌ７／Ｌ１２タンパクを標的とした市販キットでもマイコプラズマ・ジェニタリウムとの交差反応性が記載されている。このように標的の配列によっては、近縁種の細菌と交差反応性を有する問題がある。

一方、標的の配列部分にアミノ酸の置き換えの変異や欠損が発生すると反応性が変化して、抗体の特異性に合致せず、その結果免疫反応ができなくなり感染者を陰性と判断してしまう可能性もある。

ここで免疫反応の標的タンパクとなるＰ１タンパク、及びＰ３０タンパクは、細胞吸着器官の先端部に存在しており、気道上皮に付着して感染する際の接着タンパク（ａｄｈｅｓｉｎ）として非常に重要な役割を果たしている。

そのうちＰ３０タンパクは、一般的には２７４個のアミノ酸からなり、様々な変異株の配列分析や、マイコプラズマ属の他の近縁種細菌（Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍやＭ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）との類似配列の比較分析もなされている（非特許文献１：ＪＯＵＮＡＬ ＯＦ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ、ＡＰＲ．２０１１、ｐ１７２６−１７３３）。

Ｐ３０タンパクの配列中には、近縁種のマイコプラズマ属のジェニタリウムに存在する同様の接着タンパクであるＰ３２に全く同じ配列が存在しており、Ｎ末端から５０〜１３０番目あたりには全体的に高い相同性が認められている。

７３〜１２５番目の配列については、以下に示すようにマイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）のＰ３２タンパクの６８〜１２０番目の配列と非常によく似ていて、Ｐ３０の８１番目ＣがＰ３２の７６番目Ｓに、Ｐ３０の１１７番目ＬがＰ３２の１１２番目Ｉに換わっているだけである。

マイコプラズマ・ニューモニエ Ｐ３０ アミノ酸配列 ７３〜１２５
「ＷＦＩＰＴＶＡＧＣＦＧＦＳＡＬＡＩＩＬＧＬＡＩＧＬＰＩＶＫＲＫＥＫＲＬＬＥＥＫＥＲＱＥＱＬＡＥＱＬＱＲＩＳ」

マイコプラズマ・ジェニタリウム Ｐ３２ アミノ酸配列 ６８〜１２０
「ＷＦＩＰＴＶＡＧＳＦＧＦＳＡＬＡＩＩＬＧＬＡＩＧＬＰＩＶＫＲＫＥＫＲＬＬＥＥＫＥＲＱＥＱＩＡＥＱＬＱＲＩＳ」

このように、Ｐ３０に対するモノクローナル抗体であっても、マイコプラズマ・ジェニタリウムなど他の種類の菌と相同性の高い部分の配列にエピトープを持つ場合には、交差反応の影響が大きくなることが考えられる。

サンドイッチ反応においては、固相化抗体、標識抗体の両方に交差反応があればマイコプラズマ・ニューモニエでなくとも近縁種細菌の存在で偽陽性判定となり、いずれか一方の抗体のみに交差反応性がある場合にはマイコプラズマ・ニューモニエが存在していても、近縁種細菌の共存の影響でサンドイッチ結合を阻害されるために偽陰性判定となることが考えられる。

Ｐ３０タンパクは、Ｎ末端から１７７番目以降の配列（Ｃ末端側）に特徴的な繰り返し配列を持つことが知られており、この繰り返し配列の結合ペプチドを合成して免疫原としたポリクローナル抗体も作製されている。

しかしながら、ヒトの組織タンパクであるケラチン、ミオシン、フィブリノーゲンと免疫的な交差反応性を示すなど、その好ましくない性質についても報告されている（非特許文献２：ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＩＴＹ、Ｊｕｌｙ、１９９６、ｐ２５９５−２６０１）。
特開２００９−１３１１７４号公報 特開昭６３−１８４０６４号公報 特開平５−３０４９９０号公報 国際公開第２００１／５７１９９号公報 特開２０１３−７２６６３号公報 国際公開第２０１１／０６８１８９号公報 国際公開第２０１５／０２５９６８号公報 ＪＯＵＮＡＬ ＯＦ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ、ＡＰＲ．２０１１、ｐ１７２６−１７３３ ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＩＴＹ、Ｊｕｌｙ、１９９６、ｐ２５９５−２６０１

本発明は、マイコプラズマ・ニューモニエに対する反応性の高いモノクローナル抗体及び、これを用いる検出装置を提供することを目的とする。

第１の発明に係るモノクローナル抗体は、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＰ３０タンパクにおける、Ｎ末端より１７７番目から２７４番目までのＣ末端側に複数回出現するアミノ酸配列に特異的に反応するが、Ｎ末端から１７６番目までには反応しない。

より具体的には、アミノ酸配列ＰＧＭＡＰＲＰに反応性を有する第一のモノクローナル抗体である。

また、別のアミノ酸配列ＰＨＰＧＭＡＰに反応性を有する第二のモノクローナル抗体である。

そして本発明は、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を第一のモノクローナル抗体、第二のモノクローナル抗体を用いてサンドイッチ反応により免疫学的に検出する装置を提供する。

第一のモノクローナル抗体、第二のモノクローナル抗体のいずれかが、当該発明のモノクローナル抗体であり、より好ましい形態においては、第一のモノクローナル抗体と第二のモノクローナル抗体の両方に当該モノクローナル抗体を組み合わせて使用する。

好ましくは、免疫学的検出方法はイムノクロマト法である。

マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＰ３０タンパクのＮ末端より１７７番目以降のＣ末端側に複数存在するアミノ酸配列を検出することでＰ３０タンパクを認識しマイコプラズマ肺炎を診断する方法を提供する。

Ｐ３０タンパクに繰り返し配列が存在することは、同一タンパク中に複数存在する標的を検出する方法を作ることによって、その数に対応して感度を上げることが出来るため非常に有用である。

更に、標的部位の一部に欠損が発生したり部分的に変異が発生したりしても取り逃しなく検出できるという大きなメリットがある。

本発明者らは、以下に述べるように、Ｐ３０タンパク中に複数存在する配列に対するモノクローナル抗体を作製することに成功し、効率よくマイコプラズマ・ニューモニエを検出できる技術を確立するに至ったものである。

本発明におけるモノクローナル抗体を用いると、簡便かつ迅速にマイコプラズマ・ニューモニエを検出できるイムノクロマト法による検出装置を提供できる。また、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパクと、マイコプラズマ・ジェニタリウムのＰ３２タンパクとを弁別できるし、更に、標的タンパク中において一部に欠損が発生したり部分的に変異が発生したりしても取り逃しなく検出することができ、正しい診断が可能となる。

（開発の経緯）
まず本発明者らが本願発明の完成に達するまでの経緯を述べる。

モノクローナル抗体の作製は、免疫原にマイコプラズマ・ニューモニエＦＨ株菌体の可溶化物を用いて常法に従って行った。

すなわち、マイコプラズマ・ニューモニエＦＨ株可溶化抗原と完全フロインドアジュバンドを混合して、エマルジョンを調製し、これをマウスの腹腔内に免疫した。

免疫から二週間後、同じくマイコプラズマ・ニューモニエＦＨ株可溶化抗原と不完全フロインドアジュバンドを混合してエマルジョンを調製し、前記マウスの腹腔内に追加免疫を３回行った。

最終免疫の３日後に、マウスから脾臓を摘出し、その中に含まれる免疫細胞を取り出し、ポリエチレングリコールの存在下で、骨髄腫ミエローマ細胞と細胞融合を行い、ハイブリドーマを調製した。各ハイブリドーマから産生される培養上清中の抗体を、抗原結合プレート、及び抗マウスＰＯＤ（西洋わさびペルオキシダーゼ）標識ポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法で確認することにより抗原に反応するモノクローナル抗体生産株２３種を選別した。

選別されたモノクローナル抗体は、それぞれ腹水化を行った後に、プロテインＧアフィニティークロマトカラムを用いてＩｇＧとして精製し、これらを用いてイムノクロマト法の試作を行い反応性の確認を行った。

すなわち、それぞれのモノクローナル抗体を１ｍｇ／ｍｌ濃度でＰＢＳ緩衝液にて調製し、ニトロセルロースメンブレン（ミリポア社：ＨＦ０１３５ハイフローメンブレン）に１．３μＬ／ｃｍをライン状に塗布して結合させた。これを十分に乾燥させたのちに約５ｍｍ幅の短冊状に裁断してテストストリップを作製した。

一方、それぞれのモノクローナル抗体は金コロイド粒子（平均粒径６０μｍ）に結合させることで標識物を作製した。

これらを組み立ててイムノクロマト法の抗原サンドイッチによる検出試薬として作製し、マイコプラズマ・ニューモニエ抗原との反応性を確認した。

ここで、本発明者らは、Ｐ３０タンパクに反応性を有する、特に検出感度の高い２種のモノクローナル抗体を選定し、これらをそれぞれ抗マイコプラズマ モノクローナル抗体＃００４（以下、抗体＃００４）、と抗マイコプラズマ モノクローナル抗体＃００６（以下、抗体＃００６）と名付けた。

以下にＰ３０タンパクの代表的な全配列を示す。
［Ｐ３０タンパク（Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ：Ｍ１２９株）のアミノ酸２７４個全配列］
ＭＫＬＰＰＲＲＫＬＫＬＦＬＬＡＷＭＬＶＬＦＳＡＬＩＶＬＡＴＬＩＬＶＱＨＮＮＴＥＬＴＥＶＫＳＥＬＳＰＬＮＶＶＬＨＡＥＥＤＴＶＱＩＱＧＫＰＩＴＥＱＡＷＦＩＰＴＶＡＧＣＦＧＦＳＡＬＡＩＩＬＧＬＡＩＧＬＰＩＶＫＲＫＥＫＲＬＬＥＥＫＥＲＱＥＱＬＡＥＱＬＱＲＩＳＡＱＱＥＥＱＱＡＬＥＱＱＡＡＡＥＡＨＡＥＡＥＶＥＰＡＰＱＰＶＰＶＰＰＱＰＱＶＱＩＮＦＧＰＲＴＧＦＰＰＱＰＧＭＡＰＲＰＧＭＰＰＨＰＧＭＡＰＲＰＧＦＰＰＱＰＧＭＡＰＲＰＧＭＰＰＨＰＧＭＡＰＲＰＧＦＰＰＱＰＧＭＡＰＲＰＧＭＰＰＨＰＧＭＡＰＲＰＧＦＰＰＱＰＧＭＡＰＲＰＧＭＱＰＰＲＰＧＭＰＰＱＰＧＦＰＰＫＲ

（エピトープの解析）
抗体＃００４および抗体＃００６をリガンド固定用カラムに結合させてアフィニティークロマトカラムを作製し、マイコプラズマ・ニューモニエ菌体の可溶化溶液からのＰ３０タンパクを精製したところ、Ｎ末端のアミノ酸配列は「ＡＥＥＤＴＶＱＩＱＧＫＰＩＴＥ」であることがアミノ酸分析の結果より明らかとなった。

これはＰ３０の全アミノ酸配列２７４個のうちＮ末端から５５個迄のアミノ酸が欠損して、配列番号の５６番目のＡ（アラニン）から並んでいるものであることが分かった。

すなわち、抗体＃００４および抗体＃００６は、マイコプラズマ・ニューモニエの接着タンパク（Ａｄｈｅｓｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ）として知られているＰ３０抗原（接着因子）の５６番目〜２７４番目の配列のうち、いずれかの配列をエピトープとして認識するモノクローナル抗体である。

エピトープをさらに詳細に調べるために、以下に示すＰ３０を断片化した発現タンパクを作製した。これらの発現蛋白は、一般的な遺伝子組み換えの手法によりそれぞれの配列に該当する遺伝子配列をプラスミドＤＮＡに組み入れた大腸菌を培養することで作製した。

これらの組み換えタンパク配列を用いて、ウエスタンブロッティングを行い、その結果により抗体＃００４および抗体＃００６との反応性を確認した。

断片化フラグメント名とＰ３０のアミノ酸配列の番号
ＳＳ− ：配列番号５２−２７４
Ｎｏ．４：配列番号５２−１５５
Ｎｏ．５：配列番号８１−１７５
Ｎｏ．６：配列番号１０１−１９５
Ｎｏ．７：配列番号１２１−２１５
Ｎｏ．８：配列番号１４１−２３５
Ｎｏ．９：配列番号１６１−２５５
Ｎｏ．１０：配列番号１８１−２７４
Ｎｏ．５′：配列番号５２−１７５
Ｎｏ．６′：配列番号５２−１９５
Ｎｏ．７′：配列番号５２−２１５
Ｎｏ．８′：配列番号５２−２３５
Ｎｏ．９′：配列番号５２−２５５

その結果、抗体＃００４および抗体＃００６は、断片化フラグメントＮｏ．４，Ｎｏ．５には反応せず、Ｎｏ．６〜Ｎｏ．１０、および、Ｎｏ．６’〜Ｎｏ．９’までに反応性が認められた。

これらの共通の配列を確認したところ、Ｐ３０の１８１〜１９５番目のアミノ酸配列ＰＲＰＧＭＰＰＨＰＧＭＡＰＲＰを認識することが分かった。

＜実施例１＞
［合成ペプチドによるイムノクロマト競合法による測定］
Ｐ３０のアミノ酸配列ＰＲＰＧＭＰＰＨＰＧＭＡＰＲＰの中から以下に示すペプチドを作製した。これらを検体として使用し、マイコプラズマ・ニューモニエ抗原を固相に用いたイムノクロマト競合法による測定を行った。

（合成ペプチド）
ペプチド１−１：ＰＲＰＧＭＰＰＨＰＧＭＡＰＲＰ
ペプチド１−２：ＰＧＭＰＰＨＰＧＭＡＰＲＰ
ペプチド１−３：ＧＭＰＰＨＰＧＭＡＰＲＰ
ペプチド１−４：ＭＰＰＨＰＧＭＡＰＲＰ
ペプチド１−５：ＰＨＰＧＭＡＰＲＰ
ペプチド１−６：ＰＧＭＡＰＲＰ
ペプチド１−７：ＰＧＭＡＰＲ
ペプチド１−８：ＰＧＭＡＰ
ペプチド１−９：ＭＰＰＨＰＧＭ
ペプチド１−１０：ＧＭＰＰＨＰＧＭＡＰ
ペプチド１−１１：ＭＰＰＨＰＧＭＡＰ
ペプチド１−１２：ＧＭＰＰＨＰＧＭ
ペプチド１−１３：ＰＰＨＰＧＭ

図１を参照しながら、以下検出装置の作製方法を示す。ここで、図１（ａ）は本発明の一実施の形態における検出装置の側面図、図１（ｂ）、（ｂ’）は同検出装置の正面図である。

図１に示すように、この検出装置は、滴下部１１、標識区域１２、多孔質担体１３、検出区域１４、対象区域１５、吸液部１６を有する。

また図中、Ａは、マイコプラズマ・ニューモニエ、Ｂは、本発明のモノクローナル抗体を標識したモノクローナル抗体標識物、Ｃは複合体、Ｘは合成ペプチドである。

この検出装置は、イムノクロマト競合法を利用した、モノクローナル抗体標識物の、種々の合成ペプチドへの反応性を確認するための装置であるが、他の要素は、イムノクロマト競合法を利用した検出装置として、通常使用されるもので差し支えない。以下、更に詳しく説明する。

（標識成分の調製）
Ｇ．Ｆｒｅｎｓ（Ｎａｔｕｒｅ、２４１、２０−２２、１９７３）の方法に従い金コロイド粒子を作製した。この金コロイド１０ｍＬに対し、抗体♯００４を４０μｇ室温にて混合し、金コロイド標識抗体♯００４を調製した。同様にして金コロイド標識抗体♯００６も調製した。

（標識区域１２の調製）
金コロイド標識抗体♯００４をＯＤ５２０ｎｍ＝１．０となるように調製し、反応確認のために対照として金コロイド標識ウサギγグロブリンをＯＤ５２０ｎｍ＝０．２となるように調製したものを混合し調製液を作製した。

この調製液をガラス繊維パッドにテスト当たり３６μＬずつそれぞれ塗布した後、凍結乾燥させ、標識区域１２である金コロイド標識抗体♯００４＃塗布パッドを調製した。抗体♯００６についても同様に金コロイド標識抗体♯００６塗布パッドを調製した。

（検出区域１４の調製）
マイコプラズマ・ニューモニエ ＦＨ株（ＡＴＣＣ♯１５５３１）を８．１ｘ１０⁸ＣＦＵ／ｍＬとなるようにＰＢＳ緩衝液で調製し、多孔質坦体１３であるニトロセルロースメンブレン（ミリポア社）の所定位置に、テスト当たり０．７３μＬでライン状に塗布し検出区域１４を形成した。

また、検出区域１４の下流側に、抗ウサギ抗体をテスト当たり０．７３μＬで塗布し、反応確認のための対照区域１５を形成した。乾燥作業を経て、マイコプラズマ・ニューモニエ抗原固相化メンブレン（検出区域１４の配置された多孔質担体１３）を調製した。

（検出装置の作製）
滴下部１１としてのＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｇｒａｄｅ６０（商標）濾紙を用い、金コロイド標識抗体♯００４塗布パッド、マイコプラズマ・ニューモニエ抗原固相化メンブレン、吸液部１６としての濾紙とをそれぞれ重ね合わせ、粘着剤付きの台紙に貼付してイムノクロマト競合法を利用した検出装置を作製した。同様に抗体♯００４の代わりに抗体♯００６を用いた検出装置も作製した。

（検体試料液の調製）
抽出液としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用い、この抽出液にて各ペプチドをそれぞれ１．０ｍｇ／ｍＬとなるように調製し、検体試料液として用いた。対照として、抽出液のみを用いた。

（反応性試験）
作製した２種の検出装置に検体試料液をピペットで１００μＬ滴下した後、１５分後の検出区域１４のライン発色を確認した。ここで、マイコプラズマ・ニューモニエ抗原固相化メンブレンと、各モノクローナル抗体（抗体＃００４、抗体＃００６）は免疫反応して、金コロイドの赤紫色の発色ラインを形成するが、エピトープに対応するペプチドが存在すると競合的に阻害がかかり、発色ラインが形成されない。

すなわち、発色の阻害があることで、モノクローナル抗体のエピトープを含むペプチドであることが確認される。

（モノクローナル抗体＃００４の検討結果）
発色に阻害がかかったもの：ペプチド１−１、ペプチド１−２、ペプチド１−３、ペプチド１−４、ペプチド１−５、ペプチド１−６

発色したもの：ペプチド１−７、ペプチド１−８、ペプチド１−９
以上の結果より、モノクローナル抗体♯００４は「ＰＧＭＡＰＲＰ（Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ）」であることが判明した。

（モノクローナル抗体＃００６の検討結果）
発色に阻害がかかったもの：ペプチド１−１、ペプチド１−２、ペプチド１−３、ペプチド１−４、ペプチド１−５、ペプチド１−１０、ペプチド１−１１

発色したもの：ペプチド１−６、ペプチド１−９、ペプチド１−１２、ペプチド１−１３

以上の結果より、モノクローナル抗体＃００６は「ＰＨＰＧＭＡＰ（Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ）」のペプチド配列に反応性を有することが確認された。

さらに、抗体＃００６については、「ＰＨＰＧＭＡＰ」の２つめのアミノ酸がＲに置換された「Ｐ“Ｒ”ＰＧＭＡＰ」および６番目がＰに置換された「ＰＨＰＧＭ“Ｐ”Ｐ」にも反応性を有することが確認された。

これらのエピトープであるアミノ酸配列について、Ｐ３０タンパク中の存在位置を調べた。まず、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＰｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴにて、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパクを検索したところ２７種のデータが得られた。（２０１５年１２月１０日時点）

ここで、ＡＡＤ４０１９８は、極めて特殊な変異株（ｃｌａｓｓ２−３ ｍｕｔａｎｔ）であり目的の配列を持たないため分析対象から外し、他の株の配列を調べると、Ｎ末端から１７７番目以降に、エピトープに該当する配列が含まれることが分かる。

この配列はＰ（プロリン）を多く含む繰り返し配列構造があることがよく知られており、非特許文献１にも記載されているように、主に３種の繰り返し配列を含んでいる。これらの１７７番目以降の配列をまとめると次の５種のグループに分類される。

なお、ＷｉｌｄタイプであるＭ１２９株はグループ１、ＦＨ株はグループ２に分類され、ほとんどの株はグループ１、またはグループ２に属する。

（グループ１）
ＡＡＤ４０１９９、Ｐ７５３３０、ＷＰ＿０１０８７４８０９、ＡＧＣ０４３５３、ＮＰ＿１１０１４１、ＡＬＡ３０３３０、ＡＬＡ３５２５８、ＡＬＡ３４５５７、ＡＬＡ３３８４１、ＡＬＡ３３１３６、ＡＬＡ３２４３５、ＡＡＢ９６０３６、ＡＡＢ３６６０３

（グループ２）
ＢＡＬ２２０３１、ＷＰ＿０１４３２５５４６、ＡＬＡ３７３７２、ＡＬＡ３９４７４、ＡＬＡ３８７７６、ＡＬＡ３８０７３、ＡＬＡ３６６６２、ＡＬＡ３５９５３、ＡＬＡ３０６２０、ＡＢＲ０９２１５

（グループ３）
ＷＰ＿０３８５３４４２２

（グループ４）
ＣＡＢ５６６１３

（グループ５）
ＡＡＣ４５４６７

そして、非特許文献２にならって６個のアミノ酸からなる繰り返し配列ＰＧＭＡＰＲ（Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）を配列Ａ、繰り返し配列ＰＧＭＰＰＨ（Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ）を配列Ｂ、繰り返し配列ＰＧＦＰＰＱ（Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ）を配列Ｃとそれぞれ表すと、各グループは次のように表現される。

グループ１
「配列Ａ・配列Ｂ・配列Ａ・配列Ｃ・配列Ａ・配列Ｂ・配列Ａ・配列Ｃ・配列Ａ・配列Ｂ・配列Ａ・配列Ｃ・配列Ａ＋ＰＭＧＱＰＰＲＰＭＧＰＰＱＰＧＦＰＰＫＲ」

グループ２
「配列Ａ・配列Ｂ・配列Ａ＋ＳＧＦＰＰＱ＋配列Ａ・配列Ｂ・配列Ａ・配列Ｃ・配列Ａ・配列Ｂ・配列Ａ・配列Ｃ・配列Ａ＋ＰＭＧＱＰＰＲＰＭＧＰＰＱＰＧＦＰＰＫＲ」

グループ３
「配列Ａ・配列Ｂ・配列Ａ・配列Ｃ＋ＰＧＭＡＬＲＱＧＭＰＰＨ＋配列Ａ・配列Ｃ・配列Ａ＋ＰＭＧＱＰＰＲＰＭＧＰＰＱＰＧＦＰＰＫＲ」

グループ４
「配列Ａ・配列Ｂ・配列Ａ・配列Ｃ・配列Ａ＋ＰＭＧＱＰＰＲＰＭＧＰＰＱＰＧＦＰＰＫＲ」

グループ５
「配列Ａ＋ＰＭＧＱＰＰＲＰＭＧＰＰＱＰＧＦＰＰＫＲ」

抗体♯００４のエピトープと考えられる配列ＰＧＭＡＰＲＰについては、配列Ａに配列Ｂ、配列ＣまたはＰ（Ｐｒｏ）が続いている部分となるため、グループ１に７か所、グループ２に６か所、グループ３に４か所、グループ４に３か所、グループ５に１か所存在していることが分かる。

抗体＃００６のエピトープと考えられる配列ＰＨＰＧＭＡＰについては、配列Ｂに配列Ａが続くか、ＰＨ（Ｐｒｏ−Ｈｉｓ）に配列Ａが続く部分となるため、グループ１に３か所、グループ２に３か所、グループ３に２か所、グループ４に１か所存在し、グループ５には存在していないことが分かる。

ここで抗体＃００６は、「Ｐ“Ｒ”ＰＧＭＡＰ」および「ＰＨＰＧＭ“Ｐ”Ｐ」にも反応するため、配列Ａと配列Ｂの連続部分、および各配列のＣ末端側にある配列中の「ＰＲＰＧＭＰＰ」にも反応すると考えられる。

この配列は他のエプトープと重なることもあるが、グループ１に４か所、グループ２に４か所、グループ３に２か所、グループ４に１か所、グループ５に１か所存在していることが分かる。そのため、グループ５のような特殊な変異株でも検出可能となる。

また、グループ２において、配列Ｃである「ＰＧＦＰＰＱ」が「”Ｓ”ＧＦＰＰＱ」に変換されている部分があり、グループ３では配列Ａである「ＰＧＭＡＰＲ」が「ＰＧＭＡ“Ｌ”Ｒ」に、配列Ｂである「ＰＧＭＰＰＨ」が「”Ｑ“ＧＭＰＰＨ」に変換されている部分がある。

このように、株によって部分的に変異することに対して、繰り返し構造を捕まえることで他の配列部分でも検出可能となり、偽陰性をなくす上でも大変重要なのである。

すなわち、このような繰り返し配列を認識することは、反応の機会を増やすことが出来るため高感度化につながるのみならず、種々の変異や欠損に対しても取りこぼしなく検出できる大きなメリットがあることが分かった。

＜実施例２＞
続いて検出装置の実施例について述べるが、装置はＥＬＩＳＡ法や免疫凝集法など、当該モノクローナル抗体を用いて確立される免疫測定系は種々考えられ、ここに記載するイムノクロマト法に限定されるものではない。

また、装置に使用するモノクローナル抗体は、当該発明の２種のモノクローナル抗体を組み合わせて使用することが望ましいが、いずれか１種を他のＰ３０タンパクに反応する抗体と組み合わせて使用することも当然可能であり、これも本発明に含まれる。

また、他の抗体についてはモノクローナル抗体のみならずポリクローナル抗体も使用することが出来る。

［イムノクロマトサンドイッチ法による測定］
図２（ａ）は本発明の一実施の形態における検出装置の側面図、図２（ｂ）は同検出装置の正面図である。また、図中、Ａはマイコプラズマ・ニューモニエ、Ｂは本発明のモノクローナル抗体を標識したモノクローナル抗体標識物、Ｃは複合体、Ｄは本発明のモノクローナル抗体、Ｙは検査対象物中のマイコプラズマ・ニューモニエ（Ｐ３０タンパク）である。この検出装置は、モノクローナル抗体に特徴を有するが、他の要素は、イムノクロマトサンドイッチ法を利用した検出装置として通常使用されるもので差し支えない。ここで、モノクローナル抗体標識物Ｂから標識物を除いたものを、第一のモノクローナル抗体（ＰＧＭＡＰＲＰ反応性）とし、モノクローナル抗体Ｄを第二のモノクローナル抗体（ＰＨＰＧＭＡＰ反応性）とするのが好ましい。一方、反応性は低下するものの、両方とも第一のモノクローナル抗体としたり、両方とも第二のモノクローナル抗体にしたり、さらには、上記と第一、第二を入れ替えたりするなど、種々変更することもでき、このような場合も本発明の保護範囲に包含される。以下、更に詳しく説明する。ここでは、実施例１の（標識成分の調整）と（標識区域１２の調整）と同じ方法で、金コロイド標識抗体＃００４塗布パッドを調整した。

（検出区域１４の調製）
本発明の抗体♯００６を１．０ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ緩衝液で調製し、多孔質坦体１３であるニトロセルロースメンブレン（ミリポア社）の所定位置に、テスト当たり０．７３μＬでライン状に塗布し検出区域１４を形成した。また、検出区域１４の下流側に、抗ウサギ抗体を同様にテスト当たり０．７３μＬで塗布し、反応確認のための対照区域１５を形成した。乾燥作業を経て、抗体♯００６固相化メンブレン（検出区域１４の配置された多孔質担体１３）を調製した。

（検出装置の作製）
滴下部１１としてのＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｇｒａｄｅ６０（商標）濾紙を用い、金コロイド標識抗体♯００４塗布パッドと、抗体♯００６固相化メンブレンと、吸液部１６としての濾紙とをそれぞれ重ね合わせ、粘着剤付きの台紙に貼付してイムノクロマトサンドイッチ法を利用した検出装置を作製した。

（検体試料液の調製）
抽出液には実施例１と同じ抽出液を用いた。

［反応性確認試験］
抽出液にて以下に示すマイコプラズマ属菌を、表中の濃度に調製したものを検体試料液とした。対照として抽出液のみを使用した。

ｉ）マイコプラズマ・ニューモニエ（各１×１０⁶ ＣＦＵ／ｍＬ）
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＦＨ （ＡＴＣＣ１５５３１）
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｍ１２９−Ｂ７（ＡＴＣＣ２９３４２）
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｍ２２（ＡＴＣＣ３９５０５）
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｍ５２（ＡＴＣＣ１５２９３）
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｍａｃ（ＡＴＣＣ１５４９２）
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＰＩ １４２８（ＡＴＣＣ２９０８５）
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＵＴＭＢ−１０Ｐ（ＡＴＣＣ４９８９４）
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｂｒｕ（ＡＴＣＣ１５３７７）

ｉｉ）近縁種細菌 マイコプラズマ・ジェニタリウム
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａlｉｕｍ（１×１０⁶ ＣＦＵ／ｍＬ）

（反応性試験）
作製した検出装置に検体試料液をピペットで１００μＬ滴下した後、１５分後の検出区域１４のライン発色を確認した。

（測定結果）
８種類のマイコプラズマ・ニューモニエ株が全て検出できた。一方、近縁種であるマイコプラズマ・ジェニタリウムについては反応性を示さなかった。

これは当該モノクローナル抗体が、マイコプラズマ・ニューモニエの株間で保存された配列を検出することで広く様々な株と反応するが、異なる近縁種では交差反応を示さない有用な認識部位を持っているためである。

（交差反応性試験）
非特許文献２によるとＰ３０の繰り返し配列は、構造タンパクであるケラチン、フィブリノーゲン、ミオシンなどに免疫的に強い交差反応性を示すことが記載されている。

そこで、検体としてマイコプラズマ・ニューモニエの入っていない陰性測定試料と０．２μｇ／ｍＬにて添加した陽性測定試料を準備し、これにケラチン、フィブリノーゲンをそれぞれ１００μｇ／ｍＬになるように添加して反応性を確認した。

本検出系において、１００μｇ／ｍＬ濃度のケラチン、フィブリノーゲンは陰性判定であり、交差反応による偽陽性はなかった。また、本来の陽性反応を示すマイコプラズマ・ニューモニエ陽性試料（ＦＨ株）を測定し、ケラチンおよびフィブリノーゲンを添加して反応性を確認したが、陽性判定に阻害はかからず反応への影響はなかった。

したがって、抗マイコプラズマ・ニューモニエ モノクローナル抗体＃００４、および＃００６は、ケラチン、フィブリノーゲンとの交差反応を示さず、陰性反応、陽性反応共に影響を受けないことが確認された。

＜実施例３＞
［イムノクロマトサンドイッチ法とＰＣＲ法による測定の比較］
臨床的にマイコプラズマ・ニューモニエ感染が疑われる患者の１８４名の咽頭拭い検体を用い、イムノクロマトサンドイッチ法とＰＣＲ法による比較を行った。

（イムノクロマトサンドイッチ法を利用した検出装置での測定）
実施例２の（標識成分の調製）から（検出装置の作製）までと同様の方法でイムノクロマトサンドイッチ法を利用したマイコプラズマ・ニューモニエ検出装置を作製した。

（検体試料液の調製）
抽出液には実施例１と同じ抽出液を用いた。滅菌済みの咽頭用綿棒で患者の咽頭を拭い、その綿棒を抽出液にて抽出し、検体試料液とした。

（反応性試験）
作製した検出装置に検体試料液をピペットで１００μＬ滴下した後、１５分後の検出区域１４のライン発色を確認した。ライン発色が認められたものを陽性とした。

（ＰＣＲ法での測定）
イムノクロマトサンドイッチ法に用いた検体試料液の一部を用い、ＤＮＡ抽出、リアルタイムＰＣＲ測定を実施した。ＤＮＡ抽出にはＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（商品名）を使用した。

リアルタイムＰＣＲは「外来診療を目的としたＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法によるＭｙｃｏｐｌａｓｍａ・ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ肺炎迅速診断のための検査体系の構築（日本臨床微生物学会誌 Ｖｏｌ．１９、Ｎｏ．３、２００９）」の手順に従って行った。検出機器にはタカラバイオ社製のＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ ＲｅａｌＴｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＴＰ８００を用い、検出試薬にはタカラバイオ社製のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ １（ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＤｉｍｅｒＥｒａｓｅｒ）（商品名）を用いた。

（測定の結果）
それぞれの方法の測定結果をまとめると次の通りである。

以上より、本法においてはＰＣＲ法に対する陽性一致率は７０．４％であった。

既に市販されているリボゾームタンパクＬ７／Ｌ１２を標的としたイムノクロマトキット「リボテスト マイコプラズマ」では、添付文書にＰＣＲ法との相関性は５７．６％と記載されている。

また、別のマイコプラズマ抗原キットである「プロラスト Ｍｙｃｏ」の添付文書では、ＰＣＲ法との相関性は４４．９％と記載されている。

これらに対して、本法はマイコプラズマ抗原を高感度に検出できることが確認された。一方、陰性検体１０３例については全てが発色を認めず陰性判定であり特異性についても良好であった。

（ａ）本発明の一実施の形態における検出装置の側面図、（ｂ）本発明の一実施の形態における検出装置の正面図、（ｂ’）本発明の一実施の形態における検出装置の正面図 図２（ａ）は本発明の一実施の形態における検出装置の側面図、図２（ｂ）は同検出装置の正面図

１１ 滴下部
１２ 標識区域
１３ 多孔質担体
１４ 検出区域
１５ 対象区域
１６ 吸液部
Ａ マイコプラズマ・ニューモニエ
Ｂ モノクローナル抗体標識物
Ｃ 複合体
Ｄ 本発明のモノクローナル抗体
Ｘ 合成ペプチドＹ 検査対象物中のマイコプラズマ・ニューモニエ（Ｐ３０タンパク）

Claims (7)

1. マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＰ３０タンパクにおける、Ｎ末端より１７７番目から２７４番目までのＣ末端側に複数回出現するアミノ酸配列に特異的に反応するが、Ｎ末端から１７６番目までには反応しないモノクローナル抗体。
2. 前記アミノ酸配列は、７個のアミノ酸からなる請求項１記載のモノクローナル抗体。
3. 前記アミノ酸配列の先頭と末尾が、Ｐ（Ｐｒｏ）である請求項１又は２記載のモノクローナル抗体。
4. 前記アミノ酸配列は、ＰＧＭＡＰＲＰ（Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ）である請求項３記載のモノクローナル抗体。
5. 前記アミノ酸配列は、ＰＨＰＧＭＡＰ（Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ）である請求項３記載のモノクローナル抗体。
6. 請求項１から５のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いて、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）に反応性を示さず、マイコプラズマ・ニューモニエを特異的に検出する検出方法。
7. 多孔質担体と、請求項１から５のいずれかに記載のモノクローナル抗体が固相化される検出区域とを有し、イムノクロマト法による免疫学的検出を行う検出装置。

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