KR101782862B1 - 메르스바이러스 진단용 단세포군 항체 및 면역크로마토그래피 진단키트 - Google Patents

메르스바이러스 진단용 단세포군 항체 및 면역크로마토그래피 진단키트 Download PDF

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김미현
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Abstract

본 발명은 메르스 코로나바이러스(MERS-CoV) 뉴클레오캡시드(nucleocapsid, NP)에 대한 단클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포주에 관한 것으로, 본 발명의 MERS-CoV NP 항원 특이 단클론항체는 민감도 및 특이도가 우수하여 신속진단이 가능한 검출용 키트에 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

메르스바이러스 진단용 단세포군 항체 및 면역크로마토그래피 진단키트{Monoclonal antibody for diagnosing MERS virus and immunochromatographic diagnostic kit}
본 발명은 메르스바이러스 진단용 단세포군 항체 및 면역크로마토그래피 진단키트에 관한 것이다.
메르스 코로나바이러스(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV, 중동호흡기증후군 코로나바이러스)는 2012년 사우디아라비아에서 처음 발견된 뒤 중동 지역에서 집중적으로 발생한 바이러스로, 코로나바이러스(Coroviridae) 군에 속하며 사스 코로나바이러스(SARS-CoV, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스)와 유사한 바이러스로 알려져 있다.
메르스(MERS, 중동호흡기증후군)는 잠복기가 1주일 가량이며 발열을 동반한 기침, 호흡곤란, 숨가쁨, 가래 등 호흡기 증상을 주로 보이며 그 이외에도 두통, 오한, 콧물, 근육통뿐만 아니라 식욕부진, 메스꺼움, 구토, 복통, 설사 등 소화기 증상도 나타날 수 있다. 다만 사스와는 달리 급성 신부전증을 동반한다. 사스보다 치사율이 6배가량 높다는 조사 결과가 나오기도 하는 등 더 치명적인 양상을 보이고 있다. 연령대에 따라 치사율은 50%가 넘는다. 현재까지 중동호흡기증후군 바이러스 치료를 위한 항바이러스제는 개발되지 않았고 증상에 대한 치료를 위주로 하게 되며 중증의 경우 인공호흡기나 인공혈액투석 등을 받아야 되는 경우도 있다.
명확한 감염원과 감염경로는 확인되지 않았으나, 중동 지역의 낙타와의 접촉을 통해 감염될 가능성이 높고 사람 간 밀접접촉에 의한 전파가 가능하다고 보고되었다.
MERS-CoV는 코로나바이러스 중에서 베타코로나바이러스의 일종으로, 유전자 길이는 다양하지만 약 30 kb에 해당하며, 11개의 ORF(open reading frame)를 지닌다. MERS-CoV의 구조 단백질은 S(spike), E(envelope), M(matrix) 및 NP(nucleocapsid) 단백질이 존재한다.
MERS-CoV의 진단은 유전자 진단과 항원-항체 진단으로 분류되는데, 현재 WHO가 추천하는 표준 진단법은 콧물(nasal swap) 검체로부터의 바이러스 유전자 특이적 프라이머(primer)를 이용한 PCR이나 유전자 염기서열 분석에 의한 것이다. MERS-CoV의 항체 진단법은 NP 항원에 대한 항체 진단 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay, 효소면역흡착법)법이 시행되고 있으며, Euroimmun사(독일)에서 개발된 항체 진단 키트는 낙타의 MERS-CoV를 진단하는 용도로 사용되고 있다. 그러나 아직까지 인간 항원-항체 진단 키트로 개발된 제품은 없다.
한국등록특허 제1593641호에서는 '중동호흡기증후군 코로나바이러스 뉴클레오캡시드를 인식하는 항체 및 그의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0832870호에서는 '사스 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단클론항체 및 이것의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 '메르스바이러스 진단용 단세포군 항체 및 면역크로마토그래피 진단키트'에 대해서는 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 MERS-CoV NP 항원에 특이도가 매우 높은 단클론항체 및 상기 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제조함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 기탁번호가 KCTC 13003BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되고, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 메르스 코로나바이러스(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV) 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 기탁번호가 KCTC 13002BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되고, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 메르스 코로나바이러스(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV) 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 기탁번호가 KCTC 13003BP인 하이브리도마 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 기탁번호가 KCTC 13002BP인 하이브리도마 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 포함하는 메르스 코로나바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 메르스 코로나바이러스 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 포함하는 메르스 코로나바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 MERS-CoV NP 항원 특이 단클론항체는 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity)가 우수하여 메르스 신속진단이 가능한 검출용 키트에 사용될 수 있으며, 상기 항원-항체 진단 키트는 국내뿐 아니라 해외 메르스가 발생하고 있거나 발생 가능성이 있는 국가에 보급함으로써 선두 주자로서의 시장 경쟁력을 확보할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 MERS-CoV NP 항원으로 면역된 마우스(M)의 혈청내 항체가(antibody titer)를 ELISA법으로 측정한 결과이다. 음성 대조군으로는 PBS(인산완충액, pH 7.4)와 건강한 마우스의 혈청(Normal, 1:200 희석)을 사용하였다.
도 2는 세포융합 후 96-웰 플레이트(MERS-96w)와 75T 배양 플라스크(MERS-75T)에서 배양된 5종의 하이브리도마 세포(hybridoma cell)로부터 분비한 항체가를 ELISA법으로 측정한 결과이다. 양성대조군(positive)으로 면역된 마우스의 혈청(1:200으로 희석)을 사용하였으며, 음성대조군으로 PBS(인산완충액, pH 7.4)와 건강한 마우스의 혈청(Normal, 1:200 희석)을 사용하였다.
도 3은 제한개수희석법(limiting dilution)을 수행한 후 96-웰 플레이트(MERS-96w)와 75T 배양 플라스크(MERS-75T)에서 배양된 단클론세포주(A, 2DE9-BC1(2C1); B, 2DE12-AE6(2E6))로부터 분비한 항체가 측정 결과이다. 양성대조군으로 면역된 마우스의 혈청(1:200으로 희석)을 사용하였으며, 음성대조군으로 PBS(인산완충액, pH 7.4)와 건강한 마우스의 혈청(Normal, 1:200 희석)을 사용하였다.
도 4는 정제된 단클론항체(A, 2C1; B, 2E6)의 중사슬(heavy chain) 및 경사슬(light chain) 양상을 SDS-PAGE(전기영동법)으로 확인한 결과이다. M은 단백질 마커를 나타낸다.
도 5는 단클론항체(A, 2C1; B, 2E6)의 MERS-CoV NP 항원에 대한 반응성을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다. M은 단백질 마커를 나타낸다.
도 6은 단클론항체의 MERS-CoV 바이러스에 대한 최소검출한계를 확인한 결과이다.
도 7은 단클론항체의 타호흡기 바이러스에 대한 교차반응을 분석한 결과이다.
도 8은 단클론항체(A, 2C1; B, 2E6)의 항원에 대한 친화도를 확인한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호가 KCTC 13003BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되고, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 메르스 코로나바이러스(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV) 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)에 특이적으로 결합하는 단클론항체(2C1)를 제공한다.
또한, 본 발명은 기탁번호가 KCTC 13002BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되고, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 메르스 코로나바이러스(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV) 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)에 특이적으로 결합하는 단클론항체(2E6)를 제공한다.
본 발명에 따른 단클론항체는 IgG1-카파의 면역글로불린 아이소타입(isotype)일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 '단클론항체'란 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 단클론항체는 단세포군 항체라고 불리기도 한다. 통상적으로, 상이한 에피토프(항원결정기)들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 다르게, 단클론항체는 항원상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 단클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마 배양에 의해 합성되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.
상기한 하이브리도마가 생산하는 단클론항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토 그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액으로부터 분리될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체(2C1)를 생산하는 기탁번호가 KCTC 13003BP인 하이브리도마 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체(2E6)를 생산하는 기탁번호가 KCTC 13002BP인 하이브리도마 세포주를 제공한다.
본 발명의 단클론항체(2C1)는 한국생명공학연구원에 2016년 04월 08일자로 기탁된 KCTC 13003BP인 하이브리도마 세포주로부터 제조되며, 단클론항체(2E6)는 한국생명공학연구원에 2016년 04월 08일자로 기탁된 KCTC 13002BP인 하이브리도마 세포주로부터 제조된 것이다.
항원을 검출하는데 단클론항체를 사용하는 경우의 이점은 단일 에피토프를 인지함으로써 특정한 상호작용을 갖는다는 것이다.
상기 항체는 항원에 대한 친화도(affinity)가 증가된 항체이다. 용어 "친화도"는 항원의 특정부위를 특이적으로 인식하고 결합하는 능력으로, 항체의 항원에 대한 특이도와 함께 고도의 친화도는 면역 반응에서 중요한 요소이다. 항원에 대한 친화도를 측정하기 위한 다양한 방법을 사용할 수 있고, 표면 플라즈몬 공명 기술(surface plasmon resonance technology)이 그의 예이다.
본 발명에 사용되는 용어 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수(dissociation constant)를 의미하며, 항체의 항원에 대한 친화도를 측정하는 척도로 사용되었다. Kd 값이 낮으면 낮을수록 항체의 항원에 대한 친화력이 높음을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 포함하는 메르스 코로나바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 유효성분으로 기탁번호가 KCTC 13003BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되거나 또는 기탁번호가 KCTC 13002BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 메르스 코로나바이러스(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV) 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)에 특이적으로 결합하는 단클론항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단클론항체를 포함하며, 상기 항체를 이용하여 MERS-CoV NP 항원에 대해 형성된 항원-항체 복합체를 검출함으로써 메르스 코로나바이러스를 면역학적으로 검출할 수 있는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 메르스 코로나바이러스 검출방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란, 시료 중의 MERS-CoV NP 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단일클론 항체 또는 이의 절편의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체는 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.
본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.
검출 표지체로서 사용되는 바람직한 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 β-락타마제가 있으며, 바람직한 형광물로는 플루오레세인, Eu3 +, Eu3 + 킬레이트 또는 크립테이트가 있으며, 바람직한 리간드로는 바이오틴 유도체가 있고, 바람직한 발광물로는 아크리디늄 에스테르 또는 이소루미놀 유도체가 있으며, 바람직한 미소입자로는 콜로이드 금 또는 착색된 라텍스가 있고, 바람직한 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I 또는 125I-볼톤(Bolton) 헌터(Hunter) 시약이 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
항원-항체 복합체를 검출하는 방법은 바람직하게는 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 효소면역흡착법은 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
상기 단클론항체 또는 이의 절편은 검출 표지체를 가질 수 있으며, 검출 표지체를 가지지 않을 경우는 이들 단일클론 항체 또는 이의 절편을 포획할 수 있고, 검출 표지체를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 포함하는 메르스 코로나바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 검출용 키트는 상기 단클론항체, 기질과 반응하여 발색하는 표지체와 축합된 항체 및 발색기질을 포함한다. 본 발명의 검출용 키트에서 상기 단클론항체는 기판에 흡착된 상태로 제공될 수 있다. 상기 기판으로는 PVDF 막, 플레이트 및 슬라이드가 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 표지체로는 HRP, 발색기질로는 TMB가 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 검출용 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다. 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 메르스 코로나바이러스 NP 항원에 특이적인 단클론 항체를 이용하여 사람에서 메르스를 진단하기 위한 검출용 키트를 제공한다. 검출용 키트의 최종 검출방법으로는 면역크로마토그래피법 래피드 진단법, 효소면역흡착법(ELISA) 또는 웨스턴 블롯이 이용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 본 발명의 검출용 키트에 사용되는 검출방법은 면역크로마토그래피법(immunochromatography) 및 효소면역흡착법일 수 있다.
상기 면역크로마토그래피법을 이용한 메르스 코로나바이러스 검출용 키트는 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로부터 일정 간격이 이격된 지점에 위치하는 메르스 코로나바이러스 뉴클레오캡시드에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론항체(2E6)가 결합된 금 축합체를 포함하는 결합부; 상기 결합부로부터 일정 간격이 이격된 위치에 메르스 코로나바이러스 뉴클레오캡시드에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론항체(2C1)가 고정된 검사선(test line); 및 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 순차적으로 구비되는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 검출용 키트는 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인에 유리섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 패드를 결합시켜서 시료를 투입할 수 있는 시료주입부이 구비되고, 상기 시료 주입부로부터 일정 간격을 유지하면서 콜로이드 골드(Colloidal gold)-메르스 코로나바이러스 항체(2E6)가 축합된 복합체가 건조된 축합 패드, 상기 메르스 코로나바이러스 항체와 동일한 항원을 검출할 수 있는 다른 항체(2C1)가 고정된 검사선 및 상기 축합 패드에 존재하는 단클론항체를 검출할 수 있는 이차 항체가 고정된 대조선이 순차적으로 구비된 면역스트립일 수 있다.
상기 면역크로마토그래피법 진단법은 상기 메르스 코로나바이러스 검출용 건조 조성물을 적용한 키트를 제작하여 사용하는 것으로 안정하여 장기간 보관하는 것이 가능하다.
상기 메르스 코로나바이러스 검출용 키트에 메르스 코로나바이러스를 함유하는 것으로 의심되는 시료를 투입하여 상기 테스트 스트립의 검사선과 대조선에 붉은 자주빛띠가 나타나면 메르스 코로나바이러스 감염을 양성으로 판정하고, 대조선에만 붉은 자주빛띠가 나타나면 메르스 코로나바이러스 감염을 음성으로 판정할 수 있다.
본 발명에서 바이러스에 대한 최소검출한계는 감별검사에서 실제로 국내 분리주 MERS-CoV/KOR/NIH/002_2015에 감염된 시료 중에서 검사결과가 양성으로 나오는 최종 바이러스 역가로, 진단 성능을 확인할 수 있다.
또한, 교차반응(cross reaction) 검사에서 타호흡기바이러스 바이러스를 적용하여 검사결과가 음성으로 나오는 것을 판독하여, 검사가 타호흡기바이러스와 얼마나 교차성이 없는지를 확인할 수 있다.
효소면역항체법을 이용한 키트의 경우, 본 발명의 단클론 항체가 코팅된 플레이트의 각 웰에 메르스 의심환자로부터 채취된 검체를 반응시키고, HRP(Horseradish peroxidase)-축합 MERS-CoV NP 항원 특이 단클론항체를 첨가한 후, TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 기질용액을 각 웰에 처리하여 발색반응을 흡광도로 측정하는 것으로 구성된다. 바람직하게는, 본 발명의 검출용 키트는 사람 코로나바이러스로부터 메르스의 감별진단을 위한 특이적인 단클론 항체를 이용하며 양성대조군 및 정량적 분석이 가능하도록 재조합 NP 항원을 추가로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. MERS-CoV NP 항원의 마우스 면역
MERS-CoV의 NP 단백질(GenBank:AFS88943.1, Sino biological Inc.)을 면역원으로 사용하였다. MERS-CoV NP 항원(50ul 및 25ul)을 마우스에 2주 간격으로 3회 면역시켜 마우스 혈청 내에서 높은 항체가를 ELISA(면역효소검사법)로 확인하였다(도 1).
실시예 2. 하이브리도마 세포주 제작
면역된 마우스의 비장세포(splenocytes)을 얻은 다음, 암세포의 일종인 F/O 세포들과 세포융합기술(cell fusion technique)을 수행하여 5개의 하이브리도마 세포 클론(hybridoma cell clone)을 확보하였으며, 96-웰 플레이트로부터 75T 배양 플라스크로 점차 수를 늘려 배양하였고 항체를 분비하고 있음을 확인하였다(도 2).
양성 대조군으로는 면역된 마우스의 혈청(1:200으로 희석)을 사용하였으며, 음성 대조군으로는 PBS(인산완충액, pH 7.4)와 건강한 마우스의 혈청(Normal, 1:200 희석)을 사용하였다.
실시예 3. 2종의 MERS - CoV NP 항원 특이 단클론항체 제조
단클론항체를 분비하는 단클론세포주 확보
그 중 높은 항체를 분비하는 2개의 클론 즉, 2DE9 및 2DE12 세포를 택하여 각각 96-웰 플레이트에서 제한개수희석법(limiting dilution)을 수행하였다.
그 결과 2DE9 세포의 경우, 각 웰에서 항체가가 가장 높은 단클론세포주인 2DE9-BC1(ELISA O.D value, 2.243)을 선택하였다(도 3A). 단클론세포주(monoclone) 2C1(2DE9-BC1를 2C1으로 명명)를 75T 배양 플라스크에서 대량으로 배양한 후 항체를 분비함을 확인하였는데, 2C1 단클론세포주가 분비하는 단클론항체(monoclonal antibody)의 항체가는 2.253(ELISA OD value) 이었다(도 3A).
2DE12 세포의 경우 제한개수희석법(limiting dilution)을 수행하여 각각 웰에서 항체가가 가장 높은 단클론세포주인 2DE12-AE6(ELISA O.D value, 2.264)을 선택하였다(도 3B). 단클론세포주 2E6(2DE12-AE6를 2E6로 명명)를 75T 배양 플라스크에서 대량으로 배양한 후 항체를 분비함을 확인하였는데, 2E6 단클론세포주가 분비하는 단클론항체의 항체가는 2.253(ELISA OD value)이었다(도 3B).
단클론항체의 대량생산과 정제
대량생산을 위해 2C1 단클론세포주를 마우스 복강내로 주입하여 복수가 생성되면 채취하였고, 단백질 A 컬럼(protein A column)을 이용하여 단클론항체를 정제하였다(도 4A).
2E6 단클론세포주도 동일한 방법으로 단클론항체를 정제하였다(도 4B).
단클론항체의 MERS-CoV NP 항원과의 반응성
최종적으로 2C1의 단클론항체가 MERS-CoV NP 항원에 특이성을 갖는가 보기 위해 웨스턴 블롯팅(Western blotting)을 수행한 결과 도 5A과 같이 약 53kDa에서 뚜렷한 반응대가 관찰되었다.
2E6의 단클론항체의 경우에도 웨스턴 블롯팅(Western blotting)을 수행한 결과 약 53kDa에서 뚜렷한 반응대가 관찰되었다(도 5B).
단클론항체의 아이소타입(isotype)
단클론항체가 어떤 형태의 면역글로블린(Immunoglobulin; Ig)인지 알아보기 위해 isotyping kit를 이용하여 실험한 결과, 2C1 및 2E6 모두 IgG1-카파(IgG1-kappa)였다.
실시예 4. 메르스 코로나바이러스 검출용 면역크로마토그래피법 키트의 제작
콜로이드 골드(Colloidal gold)-메르스 코로나바이러스 뉴클레오캡시드(NP)에 대한 항체(2E6) 복합체가 메르스 코로나바이러스 검출용 키트에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 상기 메르스 코로나바이러스 검출용 조성물을 포함하는 메르스 코로나바이러스 검출용 키트를 제작하였다.
구체적으로는 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인의 일 말단에 유리섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 검체 패드를 결합시켜서 비후강 검체 시료를 투입할 수 있는 시료 주입부를 구비시켰다. 상기 검체 패드와 일정 간격을 두고, 메르스 코로나바이러스 검출용 조성물(mouse monoclonal anti-MERS CoV-Gold conjugate) 6㎕를 건조시키고(축합 패드), 일정 간격을 두고 검사선(Test line; T)을 설정한 다음, 상기 검사선에 메르스 코로나바이러스에 대한 항체(2C1) 1㎍을 가하여 고정시켰다. 상기 검사선에 고정한 메르스 코로나바이러스에 대한 항체는 메르스 코로나바이러스의 NP에 대한 항체이다.
상기 검사선으로부터 일정 간격을 두고, 대조선(Control line; C)을 설정한 다음, 상기 대조선에 메르스 코로나바이러스와 특이적으로 결합하는 항체에 대한 이차 항체(마우스 IgG에 대한 항체) 0.18㎍을 가하여 고정시켰다.
그 결과로서, 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인 위에 검체패드, 메르스 코로나바이러스 검출용 조성물, 검사선 및 대조선이 순차적으로 정렬된 형태의 검출용 키트를 제작하였다.
실시예 5. 단클론항체의 MERS-CoV에 대한 반응 확인
MERS-CoV 바이러스에 대한 최소검출한계 확인
메르스 코로나바이러스의 최소검출한계를 확인하기 위해 메르스 코로나바이러스의 NP 항원을 검출할 수 있는 샌드위치 ELISA의 원리를 이용하여 시제품용 면역크로마토그래피법을 이용한 래피드 키트(rapid kit)를 제작하였다. 이때 2C1 단클론항체는 검사선에 점적하는(coating) 항체이고, 2E6 단클론항체는 콜로이드 골드(colloidal gold)와 축합된 항체로 검출(detection)용으로 사용한 항체로써, 두 개를 한 셋트로 만든 래피드 키트이다.
검체 시료가 스왑(swab)인 경우는 하나의 스왑을 0.5mL 검체 추출액에 넣고 8-10회 이상 돌려서 섞어준다. 이 중에서 검체 드롭퍼(dropper)를 활용하여 3 방울(약 100㎕)을 면역크로마토그래피법래피드에 적하하여 15분 후에 검사선 및 대조선의 발색결과를 눈으로 확인한다.
메르스 코로나바이러스(MERS-CoV/KOR/KNIH/002_2015(한국형))를 검체 추출액(0.1 M carbonate, 0.4% casein, 1% Triton X-100, 0.1% NaN3)으로 10배씩 희석하여 이 중에서 100㎕를 면역크로마토그래피법래피드에 적하하여 15분 뒤에 검사선 및 대조선의 발색 결과를 눈으로 확인하였다. 반응시킨 결과, 4X10 PFU/100㎕(400 PFU/mL)에서 최소검출한계를 보였다(도 6).
그외 타호흡기 바이러스와 교차 반응 확인
앞서 제작한 시제품용 래피드 키트(2C1 및 2E6 단클론항체 사용)를 이용하여 동일한 방법으로 타호흡기 바이러스와의 교차반응을 관찰하였다. 100㎕의 타 호흡기 바이러스를 반응시킨 결과, 사용한 바이러스(1x106 PFU/mL)에서 모두 음성으로 판독되어 이들과 교차반응이 없음을 확인하였다(도 7).
실시예 6. 단클론항체의 항원에 대한 친화도 결정
항원에 대한 단클론항체의 친화도는 하기 표 1의 샘플을 토대로 Reichert SR7500DC system(Reichert사, 미국), Scrubber2 software를 이용하여 분석하였다. 2C1 및 2E6 항원에 대한 친화도는 해리상수(Kd)를 구하여 비교하였는데, 각각 127.06 및 12.14nM로 그 중 2E6 항체가 항원에 대해 더 높은 친화도를 보였다(도 8).
타입 샘플 농축액(stock) 완충액 M.W.(kDa) 실험용 농도
리간드1(항원) MERS NP Ag 0.225 mg/mL 1XPBS, pH 7.4 46.4 <9㎍
항체1 MERS 2C1 1mg/mL 1XPBS, pH 7.4 150 <400nM
항체2 MERS 2E6 1mg/mL 1XPBS, pH 7.4 150 <1.6nM
한국생명공학연구원 KCTC13003BP 20160408 한국생명공학연구원 KCTC13002BP 20160408
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Claims (9)

  1. 기탁번호가 KCTC 13003BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되고, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 메르스 코로나바이러스(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV) 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)에 특이적으로 결합하는 단클론항체.
  2. 기탁번호가 KCTC 13002BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되고, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 메르스 코로나바이러스(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV) 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)에 특이적으로 결합하는 단클론항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단클론항체는 IgG1-카파의 면역글로불린 아이소타입(isotype)인 단클론항체.
  4. 제1항의 단클론항체를 생산하는 기탁번호가 KCTC 13003BP인 하이브리도마 세포주.
  5. 제2항의 단클론항체를 생산하는 기탁번호가 KCTC 13002BP인 하이브리도마 세포주.
  6. 제1항의 단클론항체 및 제2항의 단클론항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단클론항체를 포함하는 메르스 코로나바이러스 검출용 조성물.
  7. 제1항의 단클론항체 및 제2항의 단클론항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단클론항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 메르스 코로나바이러스 검출방법.
  8. 제1항의 단클론항체 및 제2항의 단클론항체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단클론항체를 포함하는 메르스 코로나바이러스 검출용 키트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 메르스 코로나바이러스 검출용 키트는 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로부터 일정 간격이 이격된 지점에 위치하는, 기탁번호가 KCTC 13002BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되고, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 메르스 코로나바이러스(MERS-CoV) 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)에 특이적으로 결합하는 단클론항체가 결합된 금 축합체를 포함하는 결합부; 상기 결합부로부터 일정 간격이 이격된 위치에 기탁번호가 KCTC 13003BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되고, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 메르스 코로나바이러스 뉴클레오캡시드에 특이적으로 결합하는 단클론항체가 고정된 검사선(test line); 및 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 순차적으로 구비되는 것을 특징으로 하는 메르스 코로나바이러스 검출용 키트.
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