KR102517114B1 - 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 h5 아형에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 진단 키트 - Google Patents

고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 h5 아형에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 진단 키트 Download PDF

Info

Publication number
KR102517114B1
KR102517114B1 KR1020200109669A KR20200109669A KR102517114B1 KR 102517114 B1 KR102517114 B1 KR 102517114B1 KR 1020200109669 A KR1020200109669 A KR 1020200109669A KR 20200109669 A KR20200109669 A KR 20200109669A KR 102517114 B1 KR102517114 B1 KR 102517114B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
monoclonal antibody
influenza virus
subtype
avian influenza
highly pathogenic
Prior art date
Application number
KR1020200109669A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20220028545A (ko
Inventor
여선주
박현
덩단바오
친티튀디엔
덩단둑
Original Assignee
원광대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 원광대학교산학협력단 filed Critical 원광대학교산학협력단
Priority to KR1020200109669A priority Critical patent/KR102517114B1/ko
Priority to PCT/KR2021/011436 priority patent/WO2022045792A1/ko
Publication of KR20220028545A publication Critical patent/KR20220028545A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102517114B1 publication Critical patent/KR102517114B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5 아형에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 진단 키트에 관한 것으로, 구체적으로는 기탁번호가 KCTC14277BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 또는 기탁번호가 KCTC14278BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체를 이용한 H5 아형 인플루엔자 바이러스의 검출방법에 관한 것이다.

Description

고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5 아형에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 진단 키트{Monoclonal antibody specific to highly pathogenic avian influenza virus H5 subtype and rapid diagnostic kit using the same}
본 발명은 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5 아형에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 진단 키트에 관한 것이다.
조류 인플루엔자의 원인체는 오르소믹소비리대(Orthomyxoviridae)의 인플루엔자 바이러스 타입 A(Infuenza virus type A)이다. A형 인플루엔자의 아형(subtype)은 두 가지 단백질 즉, 혈구응집(Hemagglutinin, HA) 및 뉴라미니다아제(Neuraminidase, NA)의 종류에 따라 구분된다. 인플루엔자 바이러스의 아형은 각각의 HA 아형과 NA 아형으로 표시하며(예: H5N1), 조류 인플루엔자 바이러스는 H1형으로부터 H16형까지 16가지 HA 아형과, N1형으로부터 N9형까지 9가지 NA 아형이 있어, 산술적으로 존재 가능한 인플루엔자 바이러스의 종류는 144가지이다. 현재까지 발생한 고병원성 조류 인플루엔자는 모두 H5 및 H7 아형에 속한다.
1996년에, 아시안계 고병원성 조류인플루엔자(Highly Pathogenic Avian Influenza, HPAI) H5N1가 처음 중국에서 발생하여 과거 100년 내에 세계 최대의 유행성 국경을 넘는 동물 질환이 시작되었다. 그 후 아시안계 H5N1 바이러스는 아시아, 중동, 유럽 및 아프리카에 확산되어 4억 마리 이상의 가금의 죽음 또는 강제적 폐기를 야기하였다. 근래에는 가금류에 있어서의 H5N1 아형 바이러스 감염에 의한 인플루엔자의 발생으로부터, 사람에의 감염 사례가 연달아 보고되고 있다. 이러한 상황으로부터, H5N1 아형 조류 인플루엔자 바이러스가 사람에서 사람으로 효율적으로 감염될 수 있도록 변이하여 신형 인플루엔자 바이러스가 되는 것이 염려되고 있다. 따라서, 고병원성인 H5 아형 조류 인플루엔자 바이러스의 가금류, 야생 조류에의 감염 및 조류로부터 사람에의 감염을 조기에 발견하여 적절히 대응하는 것이, 신형 인플루엔자의 발생을 미리 막는 데 있어서 매우 중요한 과제가 되고 있다.
한편, 한국공개특허 제2012-0010222호에는 '고병원성 조류 인플루엔자 H5N1 아형 바이러스의 검출 키트'가 개시되어 있으나, 상기 키트는 H5 아형의 다른 바이러스에는 반응하지 않는 특성을 보였으며, 한국등록특허 제2113302호에는 '상보성결정부 기반 조류 인플루엔자 바이러스의 H5 아형에 특이적으로 결합하는 펩티드 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5 아형에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 진단 키트'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 reverse genetic 방법으로 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 H5N6 HA(2.3.4.4) delete polybasic cleavage site를 이용하여 만든 인플루엔자 바이러스 PR8-H5N6 바이러스를 불활화하고 상기 불활화한 바이러스를 면역원으로 하여 인플루엔자 H5 아형 바이러스의 헤마글루티닌 단위체 HA1에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 2종을 제조하였다. 또한, 상기 하이브리도마 세포주로부터 생산되는 단클론항체를 활용한 형광 면역진단키트를 통해 H5 아형 인플루엔자 바이러스를 신속하게 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5 아형의 헤마글루티닌(hemagglutinin)에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5 아형 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 포함하는 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5 아형 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에서 개발된 단클론항체는 고병원성 조류 인플루엔자인 H5N6과 H5N8을 신속하게 진단할 수 있는 키트에 사용될 수 있으며, 이런 항원-항체 진단키트는 국내 뿐 아니라 해외에서 인플루엔자가 발생하고 있거나 발생 가능성이 있는 국가에 보급함으로써 선두 주자로서의 시장 경쟁력을 확보할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 다양한 조류 인플루엔자 아형에 대한 단세포군 항체 23.2 및 23.3의 반응성을 확인한 웨스턴 블랏 결과이다. Anti-influenza A NP: 양성 대조군(KCTC 13069BP인 하이브리도마 세포주로부터 생산되는 단클론항체).
도 2는 다양한 조류 인플루엔자 아형에 대한 단세포군 항체 23.2 및 23.3의 반응성을 확인한 ELISA 결과이다.
도 3은 단세포군 항체 23.2 및 23.3을 도입한 신속 형광 면역진단시스템의 모식도이다.
도 4A는 단세포군 항체 23.2 및 23.3을 도입한 신속 형광 면역진단시스템을 이용한 H5N6 검출 결과이고, 도 4B는 신속 형광 면역진단시스템의 원시 결과(raw data)이고, 도 4C는 상용화된 인플루엔자 A 진단키트를 이용한 검출 결과이다.
도 5A는 단세포군 항체 23.2 및 23.3을 도입한 신속 형광 면역진단시스템을 이용한 H5N8 검출 결과이고, 도 5B는 신속 형광 면역진단시스템의 원시 결과(raw data)이고, 도 5C는 상용화된 인플루엔자 A 진단키트를 이용한 검출 결과이다.
도 6은 단세포군 항체 23.2 및 23.3을 도입한 신속 형광 면역진단시스템을 이용한 다양한 조류 인플루엔자 아형에 대한 검출 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5 아형의 헤마글루티닌(hemagglutinin)에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 제공한다.
헤마글루티닌(HA)은 인플루엔자 바이러스의 표면에서 발견되는 항원성 당단백질이다. HA는 인플루엔자 바이러스 표면에 있는 주요 단백질로 3개의 단량체로 구성된 삼량체 형태이다. 각 단량체는 이황화결합으로 연결된 HA1과 HA2의 두 개의 도메인으로 구성되어 있으며, 구조적으로 둥근 머리 부분과 줄기 부분으로 나누어 볼 수 있다. HA1은 시알릭산(sialic acid)을 포함하는 수용체와 결합하여 숙주 세포를 인식하고, HA2는 수용체를 포함하는 숙주세포 막과 HA1을 포함하는 바이러스 막의 융합을 일으켜 숙주 세포에 바이러스 게놈을 삽입하는 역할을 수행한다. 본 발명에 따른 단클론항체는 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5 아형의 HA1 단량체에 반응하는 것으로 사료된다.
본 발명에서 용어 '단클론항체(monoclonal antibody)'란 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 단클론항체는 '단세포군 항체' 또는 '단일클론항체'라고 불리기도 한다. 통상적으로, 상이한 에피토프(항원결정기)들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체(polyclonal antibody)와는 다르게, 단클론항체는 항원상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 단클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마(hybridoma) 배양에 의해 합성되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.
상기한 하이브리도마가 생산하는 단클론항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토 그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액(ascite fluid)으로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 단클론항체는 한국생명공학연구원에 2020년 8월 24일자로 기탁된, 기탁번호가 KCTC14277BP인 하이브리도마 세포주(Hybridoma cell clone: #23.2-lgG2a kappa light chain)에 의하여 생산되는 단클론항체 23.2 또는 기탁번호가 KCTC14278BP인 하이브리도마 세포주(Hybridoma cell clone: #23.3-lgG2a kappa light chain)에 의하여 생산되는 단클론항체 23.3인 것을 특징으로 한다.
상기 단클론항체는 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5 아형의 HA에 특이적으로 결합할 수 있으며, 바람직하게는 H5N6 및 H5N8 바이러스의 HA에 특이적으로 결합할 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 단클론항체는 reverse genetic 방법으로 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 H5N6 HA(2.3.4.4) delete polybasic cleavage site를 이용하여 만든 인플루엔자 바이러스 PR8-H5N6 바이러스를 불활화하고 상기 불활화한 바이러스를 사용하여 면역된 마우스 비장세포로부터 세포융합기술에 의해 획득한 하이브리도마 세포로부터 생산되는 항체 2종을 제작하였으며, 이를 각각 23.2, 23.3으로 명명하였다.
본 발명은 또한, 상기 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.
본 발명의 하이브리도마 세포주는 기탁번호가 KCTC14277BP 또는 KCTC14278BP인 하이브리도마 세포주이다. 본 발명의 단클론항체 23.2는 한국생명공학연구원에 2020년 8월 24일자로 기탁된 수탁번호 KCTC14277BP인 하이브리도마 세포주로부터 제조된 것이며, 또 다른 단클론 항체 23.3은 한국생명공학연구원에 2020년 8월 24일자로 기탁된 수탁번호 KCTC14278BP인 하이브리도마 세포주로부터 제조된 것이다.
본 발명은 또한, 상기 단클론항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5 아형 검출방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란, 시료 중의 H5 아형 인플루엔자 바이러스 HA 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단일클론 항체 또는 이의 절편의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체는 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.
본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.
검출 표지체로서 사용되는 바람직한 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 β-락타마제가 있으며, 바람직한 형광물로는 양자점, 플루오레세인, Eu3+, Eu3+ 킬레이트 또는 크립테이트가 있으며, 바람직한 리간드로는 바이오틴 유도체가 있고, 바람직한 발광물로는 아크리디늄 에스테르 또는 이소루미놀 유도체가 있으며, 바람직한 미소입자로는 콜로이드 금 또는 착색된 라텍스가 있고, 바람직한 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I 또는 125I-볼톤(Bolton) 헌터(Hunter) 시약이 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
항원-항체 복합체를 검출하는 방법은 바람직하게는 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 효소면역흡착법은 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
상기 단클론항체 또는 이의 절편은 검출 표지체를 가질 수 있으며, 검출 표지체를 가지지 않을 경우는 이들 단일클론 항체 또는 이의 절편을 포획할 수 있고, 검출 표지체를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 단클론항체를 포함하는 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5 아형 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에 포함되는 단클론항체는 기탁번호가 KCTC14277BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 23.2 또는/및 기탁번호가 KCTC14278BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 23.3일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
본 발명의 H5 아형 인플루엔자 바이러스 검출용 키트는 본 발명의 단클론항체와 형광물질이 결합된 결합체를 포함하여 목적하는 항원을 면역검출할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 스트립 형태의 FICT(fluorescent immunochromatographic test) 키트가 될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 H5 아형 인플루엔자 바이러스 검출용 키트는, 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로부터 일정 간격이 이격된 지점에 위치하는 기탁번호가 KCTC14277BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 23.2가 결합된 형광체-항체 복합체를 포함하는 결합부; 상기 결합부로부터 일정 간격이 이격된 위치에 기탁번호가 KCTC14278BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 23.3이 고정된 검사선(test line); 및 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 순차적으로 구비되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 키트에 사용될 수 있는 형광체는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에서, 본 발명의 단클론항체는 유로피움(europium)으로 표지될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 '시료'는 검출 대상체로 샘플 또는 검체와 동일한 의미로 혼용되어 사용되었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 고위험성 조류 인플루엔자 바이러스 H5에 특이적인 단클론항체의 제조
Reverse genetic 방법으로 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 H5N6 HA(2.3.4.4) delete polybasic cleavage site를 이용하여 만든 인플루엔자 바이러스 PR8-H5N6 바이러스를 열로 불활화하고, 상기 불활화한 바이러스를 면역원으로 하여 마우스의 복강에 1주 간격으로 총 4회 면역시켰다. 면역된 마우스의 비장세포(splenocytes)를 얻은 다음, 골수종 세포(myeloma cells)와 세포융합기술(cell fusion technique)을 시행하고, HAT(hypoxanthine/aminopterin/thymidine) 배지에서 생존한 융합세포(하이브리도마) 클론 중 세포 배양 상징액(supernatant)을 이용한 ELISA 실험에서 H5 아형 바이러스인 H5N6 바이러스와 특이적으로 반응하는 단클론항체를 생산하는 23.2 및 23.3 클론을 선별하였다.
단클론항체의 대량생산을 위해 23.2와 23.3 클론 각각을 마우스 복강 내로 주입하여 복수가 생성되면 채취하였고, 단백질 A 칼럼(protein A column)을 이용하여 단클론항체를 정제하였다.
제조예 2. 단세포군 항체 23.2 및 23.3을 이용한 신속 진단 키트 제작
2-1. 형광체-항체 복합체 제조
단세포군 항체 23.2를 PS-COOH 유로피움 나노파티클(이하, Eu NP) 비드(0.1 μm)에 결합시켜 Eu NP-항체 복합체를 만들었다. 간단하게, 20㎕의 Eu NP를 754㎕의 0.05M MES 버퍼(pH 6.1, Sigma-Aldrich)에 첨가하고, Eu NP 표면의 -COOH기를 활성화하기 위해 26㎕의 5mM EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride)와 200㎕의 50mM sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt) 존재하에, 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 후, 과량의 EDC와 sulfo-NHS는 27,237xg에서 5분 동안 원심분리하여 제거하였다. 활성화된 Eu NP는 0.1M 인산나트륨 버퍼(pH 8.0) 940㎕ 및 60㎕의 1 ㎎/㎖ 농도의 23.2 항체와 혼합한 후 25℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 27,237xg에서 5분 동안 원심분리하여 침전물을 수거하고, 세척한 후, 0.1% 소혈청알부민을 포함하고 있는 400㎕의 2mM Borax 버퍼(pH 8.0)에 현탁시켜, 4℃ 암실에서 보관하였다.
2-2. 신속 형광 면역진단키트용 스트립 제조
상기 제조한 유로피움-항체(23.2) 복합체를 포함하는 H5 아형 특이 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 제작하였다. 이때 23.3 단클론항체는 검사선(test line)에 점적하는(coating) 항체이고, 23.2 단클론항체는 유로피움과 축합된 항체 복합체로서 시료 내 H5 아형 특이적 인플루엔자 바이러스 검출(detection)용으로 사용되었다.
구체적으로는 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인의 일 말단에 유리섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 검체 패드를 결합시켜서 검체 시료를 투입할 수 있는 시료 주입부를 구비시켰다. 상기 검체 패드와 일정 간격을 두고, 상기 유로피움-항체(23.2) 복합체 6 ㎕를 가한 다음 일정 간격을 두고, 검사선(T)을 설정한 다음, 상기 검사선에 인플루엔자 바이러스에 대한 항체(23.3)를 3 ㎎/㎖을 가하여 고정시켰다. 상기 검사선으로부터 일정 간격을 두고, 대조선(control line; C)을 설정한 다음, 상기 대조선에 인플루엔자 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체에 대한 이차항체(마우스 IgG에 대한 항체) 0.5 ㎎/㎖을 가하여 고정시켰다. 최종적으로, 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인 위에 검체패드, 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물, 검사선 및 대조선이 순차적으로 정렬된 형태의 형광 검출 키트를 제작하였다(도 3). 스트립에 시료(검체)를 적용한 후 20분 안에 소형 형광측정장비로 형광을 측정할 수 있고, 유로피움 형광체의 파장은 하기와 같다: Excitation: 355 nm, Emission: 612 nm.
실시예 1. 단세포군 항체의 고위험성 조류 인플루엔자 H5 아형 바이러스 진단 성능 특성
상기 제조예 1을 통해 제조한 23.2 및 23.3 클론 유래 단클론항체의 H5 아형 바이러스에 대한 반응성을 웨스턴 블랏과 ELISA를 통해 검증하였다.
먼저, 열로 불활화한 H1N1, H9N2, H5N8 및 H5N6 바이러스를 각각 500 HAU/lane으로 웨스턴 블롯용 겔에 로딩시킨 이후 1차 항체로 23.2 및 23.3을 각각 1㎍/㎖로 반응시킨 결과, 23.2 및 23.3은 H5N8 및 H5N6 바이러스에만 특이적으로 반응하고, H1 및 H9 아형 인플루엔자 바이러스에는 반응하지 않음을 확인할 수 있었다(도 1). 또한, 검출된 항원의 크기를 통해 유추한 결과, 23.2 및 23.3 클론 유래 단클론항체는 선형 에피토프(linear epitope)를 인식하고 HA1을 인식할 것으로 예상되었다.
또한, 상기 각 바이러스를 96-웰 플레이트에 256 HAU/well의 농도로 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 코팅한 뒤 5% BSA로 블로킹하였다. 이후 1차 항체로 23.2와 23.3을 각각 10 ㎍/㎖로 넣은 뒤에 37℃에서 약 한시간 동안 반응시킨 뒤 3회 PBS-T로 세척하였다. 이후 항-마우스 IgG HRP(anti-mouse IgG HRP)로 37℃에서 45분 동안 반응시켜 세척하고 TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)를 넣어 발색을 측정하였다. 그 결과 두 항체 모두 H5 아형 바이러스에 대해 다른 아형 바이러스보다 강한 결합력을 보임을 확인하였다(도 2).
실시예 2. 23.2 및 23.3 단클론항체가 이용된 진단 키트를 활용한 인플루엔자 바이러스 H5 아형 검출능
본 발명자는 상기 제조예 2에서 제조한 신속 형광 면역진단키트를 이용하여 H5N6 바이러스의 검출한계를 분석하였다. 현재, 상용화된 H5 특이 신속 진단키트는 존재하지 않아, 인플루엔자 A 신속 진단키트를 비교 대조군으로 사용하였다.
간단하게, H5N6 바이러스를 5, 10, 40, 80, 640 HAU/㎖로 단계희석해서 신속 형광 면역진단키트용 스트립에 테스트한 결과, H5N6 바이러스의 5 HAU/㎖ 까지 검출가능함을 확인할 수 있었고, 이 범위에서 r2=0.95로서 매우 정확한 검출을 할 수 있음을 알 수 있었다(도 4A). 그러나 상용화된 진단키트는 약 10 HAU/㎖의 검출한계를 보여(도 4C), 본 발명에 따른 H5 아형 특이 신속 형광 면역진단키트가 H5N6 검출에 매우 우수함을 확인할 수 있었다. 또한, H5N8 바이러스에 대해 검출한계를 분석한 결과, H5N6 바이러스와 동일하게 5 HAU/㎖ 까지 검출가능함을 확인할 수 있었고(r2=0.94), 상용화된 진단키트의 20 HAU/㎖ 검출한계에 비해 본 발명의 진단 키트가 우수한 검출능을 보임을 알 수 있었다(도 5).
또한, 본 발명자는 제조예 2에서 제조한 23.2 및 23.3 단클론항체가 이용된 본 발명의 진단키트를 이용하여 다른 아형의 인플루엔자 바이러스를 테스트하였으나, H1N1, H7N1 및 H9N2 바이러스의 높은 역가(1,280 HAU/㎖)에서도 반응성이 확인되지 않아, 본 발명의 단클론항체 및 이를 이용한 진단키트는 H5 아형에 특이성이 매우 높음을 알 수 있었다(도 6).
한국생명공학연구원 KCTC14277BP 20200824 한국생명공학연구원 KCTC14278BP 20200824
<110> Wonkwang University Center for Industry-Academy Cooperation <120> Monoclonal antibody specific to highly pathogenic avian influenza virus H5 subtype and rapid diagnostic kit using the same <130> PN20231 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 564 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Influenzavirus H5N6 <400> 1 Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser 1 5 10 15 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 20 25 30 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 35 40 45 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asn Gly Val Lys 50 55 60 Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Arg Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 85 90 95 Glu Arg Asp Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Leu Asn 100 105 110 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 115 120 125 Lys Ile Leu Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Pro Asn His Glu Thr Ser 130 135 140 Leu Gly Val Ser Thr Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Ala Pro Ser Phe Phe 145 150 155 160 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Ile 165 170 175 Lys Ile Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Arg Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp 180 185 190 Gly Ile His His Ser Asn Asn Ala Glu Glu Gln Thr Asn Leu Tyr Lys 195 200 205 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 210 215 220 Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Gln Val Asn Gly Gln Arg Gly 225 230 235 240 Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile His 245 250 255 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 260 265 270 Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Gly Val Glu Tyr Gly 275 280 285 His Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Val Gly Ala Ile Asn Ser Ser 290 295 300 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320 Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 325 330 335 Pro Leu Arg Glu Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile 340 345 350 Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His 355 360 365 Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln 370 375 380 Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys 385 390 395 400 Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu 405 410 415 Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp 420 425 430 Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg 435 440 445 Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val 450 455 460 Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe 465 470 475 480 Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn 485 490 495 Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg 500 505 510 Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr Tyr Gln Ile 515 520 525 Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met 530 535 540 Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys 545 550 555 560 Arg Ile Cys Ile

Claims (8)

  1. 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N6의 헤마글루티닌(hemagglutinin)에 특이적으로 결합하는 단클론항체로서,
    상기 단클론항체는 기탁번호가 KCTC14277BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 23.2 또는 기탁번호가 KCTC14278BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 23.3인 것을 특징으로 하는 단클론항체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항의 단클론항체를 생산하는 기탁번호가 KCTC14277BP 또는 KCTC14278BP인 하이브리도마 세포주.
  5. 삭제
  6. 제1항의 단클론항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N6의 검출방법.
  7. 제1항의 단클론항체를 포함하는 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N6의 검출용 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 H5N6의 검출용 키트는 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로부터 일정 간격이 이격된 지점에 위치하는 기탁번호가 KCTC14277BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 23.2가 결합된 형광체-항체 복합체를 포함하는 결합부; 상기 결합부로부터 일정 간격이 이격된 위치에 기탁번호가 KCTC14278BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 23.3이 고정된 검사선(test line); 및 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 순차적으로 구비되는 것을 특징으로 하는 키트.
KR1020200109669A 2020-08-28 2020-08-28 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 h5 아형에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 진단 키트 KR102517114B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200109669A KR102517114B1 (ko) 2020-08-28 2020-08-28 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 h5 아형에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 진단 키트
PCT/KR2021/011436 WO2022045792A1 (ko) 2020-08-28 2021-08-26 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 h5 아형에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 진단 키트

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200109669A KR102517114B1 (ko) 2020-08-28 2020-08-28 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 h5 아형에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 진단 키트

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220028545A KR20220028545A (ko) 2022-03-08
KR102517114B1 true KR102517114B1 (ko) 2023-04-03

Family

ID=80353628

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200109669A KR102517114B1 (ko) 2020-08-28 2020-08-28 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 h5 아형에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 진단 키트

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR102517114B1 (ko)
WO (1) WO2022045792A1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8540994B2 (en) 2007-05-11 2013-09-24 Temasek Life Sciences Laboratory Limited H5 subtype-specific binding proteins useful for H5 avian influenza diagnosis and surveillance
US10696737B2 (en) 2016-09-12 2020-06-30 Siec Badawcza Lukasiewicz—Instytut Biotechnologii I Antybiotykow Monoclonal antibodies against hemagglutinin of h5-serotype influenza viruses and their uses, hybridomas producing said antibodies, compositions and diagnostic kits

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013089496A1 (ko) * 2011-12-15 2013-06-20 (주)에이프로젠 H1n1-감염된 환자들로부터 유도된 매우 잠재력 있는 넓은-스펙트럼 중화 단일클론 항체 및 이를 포함하는 바이러스의 치료용 조성물
KR101849101B1 (ko) * 2016-07-28 2018-04-17 원광대학교산학협력단 H5 아형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 형광면역 진단키트

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8540994B2 (en) 2007-05-11 2013-09-24 Temasek Life Sciences Laboratory Limited H5 subtype-specific binding proteins useful for H5 avian influenza diagnosis and surveillance
US10696737B2 (en) 2016-09-12 2020-06-30 Siec Badawcza Lukasiewicz—Instytut Biotechnologii I Antybiotykow Monoclonal antibodies against hemagglutinin of h5-serotype influenza viruses and their uses, hybridomas producing said antibodies, compositions and diagnostic kits

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PLOS One, 2017년, 12권, 8호, e0182228, 내부페이지 1-11*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220028545A (ko) 2022-03-08
WO2022045792A1 (ko) 2022-03-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101625979B1 (ko) 항 ｈ5 아형 ａ형 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 모노클로날 항체
JPWO2007043582A1 (ja) Ｓａｒｓウイルスヌクレオカプシドタンパク質を測定するための測定方法、測定用試薬キット、試験具、ｓａｒｓウイルスヌクレオカプシドタンパク質に対するモノクローナル抗体及び前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
WO2005007697A1 (ja) 抗インフルエンザａ型ウイルスモノクローナル抗体及び該抗体を用いる免疫測定器具
CA2687147A1 (en) H5 subtype-specific binding proteins useful for h5 avian influenza diagnosis and surveillance
JP5827701B2 (ja) インフルエンザウイルスｈ５亜型の免疫検出法
JP5435844B2 (ja) インフルエンザウイルスｈ５亜型の免疫検出法
KR101835682B1 (ko) H7 아형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 형광면역 진단키트
CN110240635B (zh) 检测新城疫病毒抗体的多肽及其elisa检测试剂盒
KR101849101B1 (ko) H5 아형 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 형광면역 진단키트
WO2011096302A1 (ja) 薬剤耐性インフルエンザウイルス特異的抗体及びその用途
KR101821956B1 (ko) 인플루엔자 a 바이러스의 뉴클레오단백질에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 형광면역 진단키트
KR101792860B1 (ko) 인플루엔자 a 바이러스의 뉴클레오단백질에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 민감도가 증진된 신속 형광면역 진단키트
KR102517114B1 (ko) 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 h5 아형에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 진단 키트
KR20220028548A (ko) 조류 인플루엔자 바이러스 h9n2에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 진단 키트
CN108956986B (zh) 新城疫病毒抗体检测试剂盒
KR20210114923A (ko) 항 열대열 말라리아 원충 hrp-ii 항체
CN113215106B (zh) 杂交瘤细胞、抗SARS-CoV-2的单克隆抗体及其应用
KR101329344B1 (ko) 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 검출용 항체 및 이의 용도
KR102605065B1 (ko) 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 h5n1에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 진단 키트
CN117715931A (zh) 针对SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的抗体及其用途
KR102554233B1 (ko) 조류 인플루엔자 바이러스 h9n2에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도
JP5782690B2 (ja) 抗ｎｐ−ｈ２８９抗体の作製方法
KR102601835B1 (ko) 말 인플루엔자 바이러스 h3n8형에 특이적인 단일클론항체 및 이를 이용한 말인플루엔자 바이러스 검출용 조성물
KR102469481B1 (ko) 인플루엔자 a형 바이러스 검출용 단클론항체 및 폴리도파민-멜라닌 나노 입자를 이용한 신속 진단 키트
KR102113302B1 (ko) 상보성결정부 기반 조류 인플루엔자 바이러스의 h5 아형에 특이적으로 결합하는 펩티드 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant