KR102469481B1 - 인플루엔자 a형 바이러스 검출용 단클론항체 및 폴리도파민-멜라닌 나노 입자를 이용한 신속 진단 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 단클론항체 및 폴리도파민-멜라닌 나노 입자를 이용한 신속 진단 키트에 관한 것으로, 구체적으로는 기탁번호가 KCTC14276BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 F6H8, 기탁번호가 KCTC14275BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 E8C3 및 폴리도파민 나노 입자에 멜라닌 셸이 코팅되어 있는 나노 입자를 이용한 인플루엔자 A형 바이러스 검출 키트에 관한 것이다.
Description
본 발명은 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 단클론항체 및 폴리도파민-멜라닌 나노 입자를 이용한 신속 진단 키트에 관한 것이다.
인플루엔자 A형 바이러스(Influenza A virus)는 오르토믹소바이러스과를 이루는 속(屬)의 하나이다. 이 속으로 분류되는 바이러스는 A형 인플루엔자 바이러스 하나뿐이다. 포유류와 조류를 숙주로 삼으며, 대부분의 경우 비병원성이지만 일부 아종의 경우 숙주에게 유행성 감기를 일으킨다. 인플루엔자 A형 바이러스는 보통 큰 병으로 확산되지 않는데, 특정 변이가 닭이나 오리 등의 가정 가금류와 인간에게 심각한 질병을 가져오는 경우가 있다. 때때로 바이러스는 야생 수생 조류에서 가금류로 전염되고, 이는 인플루엔자 전염병을 일으킬 수 있다. 이들은 유전물질로 단일가닥, 분절형의 RNA를 가지고 있다.
인플루엔자 A형 바이러스에 속하는 바이러스는 외피에 있는 당단백질인 헤마글루티닌(H)과 뉴라미니다아제(N)의 구조에 따라 다양한 혈청형(serotype)으로 분류된다. 아종명을 표기할 때에는 H1N1과 같은 형태로 표기한다. 인간에게 인플루엔자를 일으키는 인플루엔자 A형 바이러스의 아종으로는 주로 H1, H2, H3과 N1, N2와의 조합으로 이루어진 것이 많다. 각각의 바이러스 아형은 상이한 병원성 프로파일을 갖는 다양한 균주로 변이되었다. 일부는 특정 아종에 병원성이 있지만, 다른 종에서는 병원성이 없고, 일부는 여러 종에서 병원성을 갖는다. 사람에게 발병되어 사망자가 발생한 인플루엔자 A형 바이러스의 아종으로는, 1918년 스페인 독감을 일으킨 H1N1, 1950년대 말에 아시아 독감을 일으킨 H2N2, 1960년대 말에 홍콩 독감을 일으킨 H3N2, 2000년대 중반까지 인플루엔자 범유행을 일으킨 H5N1, 2013년 중국에서 발병한 H7N9 외에, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H5N2, H10N7 등이 있다.
멜라닌은 대부분의 동물 조직에서 발견되는 천연 색소 고분자로, 가시광선 전 영역 대에서 빛을 흡수하여 주로 흑갈색을 띤다. 멜라닌은 가시광선뿐만 아니라 해로운 자외선을 강하게 흡수하여 자유 라디칼 생성을 억제함으로써 주변 조직의 손상을 막는다. 일부 파충류들은 멜라닌을 이용해 빛을 열에너지로 변환하여 체온을 조절하는 것으로 보고되었다. 따라서, 멜라닌은 색소, 자외선 차단 및 광열 요법을 포함한 광범위한 응용 분야에 활용 가능하다.
천연 멜라닌은 멜라노사이트(Melanocyte) 세포 내 멜라노솜(Melanosome)이라는 세포소기관에서 합성된다. 주요 아미노산 전구체인 티로신은 효소인 티로시나아제(Tyrosinase)에 의해 도파(DOPA)로 전환된 후, 산화 과정을 통해 멜라닌으로 전환된다. 멜라닌 중 가장 흔한 유멜라닌(Eumelanin)은 5,6-dihydroxyindole(DHI)과 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid(DHICA)의 사슬구조 형태의 중합체다. DHICA의 카복실기(carboxyl group)는 다른 소재와 결합하여 멜라닌의 기능성을 향상할 수 있다.
하지만, 자연계에서 얻은 멜라닌은 크기 및 광특성이 균일하지 않고 물에 대한 용해도가 낮으며, 생성된 순수한 멜라닌을 얻는 과정이 미흡해 응용이 어렵다. 따라서, 천연 멜라닌 합성을 모방하여 티로신 또는 도파 전구체를 이용한 합성법을 연구한 사례가 있다. 하지만, 합성된 입자의 크기가 제한되어 있고, 합성에 필요한 도파와 티로시나아제도 여전히 경제성이 떨어진다.
한편, 한국공개특허 제2014-0112495호에는 '인플루엔자 A 바이러스 특이적 항체'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제1972238호에는 '인플루엔자 A 바이러스 특이적 항체 또는 그의 항원 결합 단편'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '인플루엔자 A형 바이러스 검출용 단클론항체 및 폴리도파민-멜라닌 나노 입자를 이용한 신속 진단 키트'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 Influenza-A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (H1N1)의 재조합 핵 단백질(nucleoprotein; NP)을 면역원으로 하여 다양한 아형의 인플루엔자 A형 바이러스(H1N1, H3N2, H5N3, H5N6, H5N8, H7N1, H7N7 및 H9N2)에 반응성을 나타내는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 2종을 제조하였다. 그 후, 상기 단클론항체와 폴리도파민 나노 입자에 멜라닌 셸이 코팅되어 있는 나노 입자를 이용하여 신속 면역진단키트를 제조하고, 상기 키트를 사용하여 인플루엔자 A형 바이러스를 신속하게 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 인플루엔자 A형 바이러스의 핵 단백질(nucleoprotein; NP)에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스의 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단클론항체를 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에서 개발된 단클론항체와 폴리도파민 나노 입자에 멜라닌 셸이 코팅되어 있는 나노 입자를 이용한 진단 키트는 인플루엔자 A형 바이러스를 신속하게 진단할 수 있는 면역진단키트에 사용될 수 있으며, 이런 항원-항체 진단키트는 국내 뿐 아니라 해외에서 조류 인플루엔자가 발생하고 있거나 발생 가능성이 있는 국가에 보급함으로써 시장 경쟁력을 확보할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명에 따른 진단 키트는 폴리도파민 나노 입자 사용을 통해 육안으로 검출 결과를 확인할 수 있으므로, 종래 금 나노 입자 소재를 대체할 수 있어 경제적인 효과도 기대할 수 있다.
도 1은 다양한 아형의 인플루엔자 A형 바이러스(H1N1, H3N2, H5N3, H5N6, H5N8, H7N1, H7N7 및 H9N2)에 대한 단세포군 항체 E8C3 및 F6H8의 반응성을 확인한 ELISA 결과(A)와 웨스턴 블랏 결과(B)이다. Anti-influenza A NP: 양성 대조군(KCTC 13069BP인 하이브리도마 세포주로부터 생산되는 단클론항체).
도 2A는 단세포군 항체 E8C3 및 F6H8을 순수 분리정제하여 SDS-PAGE를 통해 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain)를 확인한 결과이고, 도 2B는 IsoStrip™ Mouse Monoclonal Antibody Isotyping 키트로 단세포군 항체의 아이소타입(isotype)을 확인한 결과이다.
도 3은 폴리도파민-멜라닌 코어-셸 나노 입자의 모식도이다.
도 4는 폴리도파민 나노 입자(PDA) 또는 폴리도파민-멜라닌 코어-셸 나노 입자(PDA@Melanin)를 증류수에 분산시킨 분산액의 제타 전위 측정 결과와 주사전자현미경 사진이다.
도 5는 단세포군 항체 E8C3 및 F6H8와 폴리도파민 나노 입자 또는 폴리도파민-멜라닌 코어-셸 나노 입자를 적용한 신속 면역진단키트의 모식도이다.
도 6A는 상용화된 인플루엔자 A 진단키트를 이용한 H1N1 바이러스의 검출 한계 실험 결과이고, 도 6B는 본 발명의 신속 면역진단키트를 이용한 H1N1 바이러스의 검출 한계 실험 결과이다.
도 7은 H3N2에 대한 상용화된 인플루엔자 A 진단키트 및 본 발명의 신속 면역진단키트(평균 입자 크기 200 nm의 폴리도파민@멜라닌 나노 입자 적용)의 검출 한계 확인 결과이다.
도 8은 본 발명의 폴리도파민-멜라닌 코어-셸 나노 입자와 금 나노 입자를 동시에 적용한 이중(dual) 컬러 면역진단키트의 모식도 및 인플루엔자 A형 바이러스인 H5N3 바이러스의 검출 결과이다.
도 2A는 단세포군 항체 E8C3 및 F6H8을 순수 분리정제하여 SDS-PAGE를 통해 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain)를 확인한 결과이고, 도 2B는 IsoStrip™ Mouse Monoclonal Antibody Isotyping 키트로 단세포군 항체의 아이소타입(isotype)을 확인한 결과이다.
도 3은 폴리도파민-멜라닌 코어-셸 나노 입자의 모식도이다.
도 4는 폴리도파민 나노 입자(PDA) 또는 폴리도파민-멜라닌 코어-셸 나노 입자(PDA@Melanin)를 증류수에 분산시킨 분산액의 제타 전위 측정 결과와 주사전자현미경 사진이다.
도 5는 단세포군 항체 E8C3 및 F6H8와 폴리도파민 나노 입자 또는 폴리도파민-멜라닌 코어-셸 나노 입자를 적용한 신속 면역진단키트의 모식도이다.
도 6A는 상용화된 인플루엔자 A 진단키트를 이용한 H1N1 바이러스의 검출 한계 실험 결과이고, 도 6B는 본 발명의 신속 면역진단키트를 이용한 H1N1 바이러스의 검출 한계 실험 결과이다.
도 7은 H3N2에 대한 상용화된 인플루엔자 A 진단키트 및 본 발명의 신속 면역진단키트(평균 입자 크기 200 nm의 폴리도파민@멜라닌 나노 입자 적용)의 검출 한계 확인 결과이다.
도 8은 본 발명의 폴리도파민-멜라닌 코어-셸 나노 입자와 금 나노 입자를 동시에 적용한 이중(dual) 컬러 면역진단키트의 모식도 및 인플루엔자 A형 바이러스인 H5N3 바이러스의 검출 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인플루엔자 A형 바이러스의 핵 단백질(nucleoprotein; NP)에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 제공한다.
본 발명에서 용어 '단클론항체(monoclonal antibody)'란 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 단클론항체는 '단세포군 항체' 또는 '단일클론항체'라고 불리기도 한다. 통상적으로, 상이한 에피토프(항원결정기)들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체(polyclonal antibody)와는 다르게, 단클론항체는 항원상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 단클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마(hybridoma) 배양에 의해 합성되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.
상기한 하이브리도마가 생산하는 단클론항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토 그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액(ascite fluid)으로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 단클론항체는 한국생명공학연구원에 2020년 8월 24일자로 기탁된, 기탁번호가 KCTC14276BP인 하이브리도마 세포주(Hybridoma cell clone: #F6H8-lgG3 kappa light chain)에 의하여 생산되는 단클론항체 F6H8 또는 기탁번호가 KCTC14275BP인 하이브리도마 세포주(Hybridoma cell clone: #E8C3-lgG3 kappa light chain)에 의하여 생산되는 단클론항체 E8C3인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 단클론항체는 Influenza-A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (H1N1)의 재조합 핵 단백질(nucleoprotein; NP)을 면역원으로 사용하여 면역된 마우스 비장세포로부터 세포융합기술에 의해 획득한 하이브리도마 세포로부터 생산되는 항체 2종을 제작하였으며, 이를 각각 F6H8, E8C3으로 명명하였다.
본 발명의 단클론항체에 있어서, 상기 인플루엔자 A형 바이러스는 H1N1, H3N2, H5N3, H5N6, H5N8, H7N1, H7N7 또는 H9N2일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.
본 발명의 하이브리도마 세포주는 기탁번호가 KCTC14276BP 또는 KCTC14275BP인 하이브리도마 세포주이다. 본 발명의 단클론항체 F6H8은 한국생명공학연구원에 2020년 8월 24일자로 기탁된 수탁번호 KCTC14276BP인 하이브리도마 세포주로부터 제조된 것이며, 또 다른 단클론 항체 E8C3은 한국생명공학연구원에 2020년 8월 24일자로 기탁된 수탁번호 KCTC14275BP인 하이브리도마 세포주로부터 제조된 것이다.
본 발명은 또한, 상기 단클론항체를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스의 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 검출방법에 있어서, 상기 인플루엔자 A형 바이러스는 H1N1, H3N2, H5N3, H5N6, H5N8, H7N1, H7N7 또는 H9N2일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란, 시료 중의 인플루엔자 A형 바이러스의 핵 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단클론항체 또는 이의 절편의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체는 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.
본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.
검출 표지체로서 사용되는 바람직한 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 β-락타마제가 있으며, 바람직한 형광물로는 양자점, 플루오레세인, Eu3+, Eu3+ 킬레이트 또는 크립테이트가 있으며, 바람직한 리간드로는 바이오틴 유도체가 있고, 바람직한 발광물로는 아크리디늄 에스테르 또는 이소루미놀 유도체가 있으며, 바람직한 미소입자로는 콜로이드 금 또는 착색된 라텍스가 있고, 바람직한 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I 또는 125I-볼톤(Bolton) 헌터(Hunter) 시약이 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
항원-항체 복합체를 검출하는 방법은 바람직하게는 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 효소면역흡착법은 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
상기 단클론항체 또는 이의 절편은 검출 표지체를 가질 수 있으며, 검출 표지체를 가지지 않을 경우는 이들 단클론항체 또는 이의 절편을 포획할 수 있고, 검출 표지체를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 단클론항체를 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 키트에 있어서, 상기 인플루엔자 A형 바이러스는 H1N1, H3N2, H5N3, H5N6, H5N8, H7N1, H7N7 또는 H9N2일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 키트에 포함되는 단클론항체는 기탁번호가 KCTC14276BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 F6H8 및 기탁번호가 KCTC14275BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 E8C3일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
본 발명의 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 키트는 본 발명의 단클론항체와 폴리도파민 나노 입자에 멜라닌 셸이 코팅되어 있는 나노 입자가 결합된 결합체를 포함하여 목적하는 항원을 면역반응을 통해 육안으로 검출할 수 있고, 바람직하게는 스트립 형태의 면역 진단 키트가 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 상기 인플루엔자 A형 바이러스 키트는, 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로부터 일정 간격이 이격된 지점에 위치하는 기탁번호가 KCTC14276BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 F6H8이 멜라닌 셸이 코팅되어 있는 폴리도파민 나노 입자에 결합된 나노 입자-항체 복합체를 포함하는 결합부; 상기 결합부로부터 일정 간격이 이격된 위치에 기탁번호가 KCTC14275BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 E8C3이 고정된 검사선(test line); 및 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 순차적으로 구비되는 것일 수 있고, 또는
시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로부터 일정 간격이 이격된 지점에 위치하는 기탁번호가 KCTC14276BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 F6H8이 멜라닌 셸이 코팅되어 있는 폴리도파민 나노 입자에 결합된 나노 입자-항체 복합체, 또는 인플루엔자 A형 바이러스의 공통 항원에 결합하는 단클론항체가 결합된 금 나노 입자-항체 복합체를 포함하는 결합부; 상기 결합부로부터 일정 간격이 이격된 위치에 기탁번호가 KCTC14275BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 E8C3이 고정된 검사선(test line) 1; 상기 검사선 1로부터 일정 간격이 이격된 위치에 인플루엔자 A형 바이러스의 공통 항원에 결합하는 단클론항체가 고정된 검사선 2; 및 항-마우스 IgG가 고정된 대조선이 순차적으로 구비되는 것일 수 있다.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 멜라닌 셸이 코팅되어 있는 폴리도파민 나노 입자는 평균 입경이 나노미터 수준으로 매우 작은 입자를 의미하며, 평균 직경은 100 nm에서 300 nm 사이인 나노 입자일 수 있으며, 바람직하게는 입자 직경이 190 내지 220 nm인 나노 입자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 폴리도파민 나노 입자에 멜라닌 셸이 코팅되어 있는 나노 입자는 도파민의 농도를 조절함으로써 입자의 직경이 조절될 수 있고, 나노 입자의 평균 직경이 커질수록 입자의 크기가 비교적 불균일할 수 있다. 또한, 멜라닌 셸을 코팅하는 단계 전후로 멜라닌 나노 입자의 크기 및 모양을 비교했을 때 유의미한 차이가 없는 것으로 확인되었다.
본 발명에서 용어 '시료'는 검출 대상체로 샘플 또는 검체와 동일한 의미로 혼용되어 사용되었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 인플루엔자 A형 바이러스에 특이적인 단클론항체의 제조
본 발명자는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Influenza-A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (H1N1)의 핵 단백질(nucleoprotein; NP)의 재조합 단백질을 배큘로바이러스 발현 벡터 시스템을 이용하여 생산하였다. 그 후, 상기 재조합 단백질을 마우스의 복강에 50 ㎍/mice로 면역시킨 후, 2주 간격으로 25 ㎍/mice의 재조합 단백질을 추가 주입하여 총 3회 부스팅시켰다. 이때, 마지막 3회차 주입시는 복강이 아닌 정맥으로 면역원을 주사하였다. 마지막 면역원 정맥 주사 2주 후, 면역된 마우스를 희생시켜 비장세포(splenocytes)를 얻은 다음, 골수종 세포(myeloma cells)와 세포융합기술(cell fusion technique)을 시행하고, HAT(hypoxanthine/aminopterin/thymidine) 배지에서 생존한 융합세포(하이브리도마) 클론의 세포 배양 상징액(supernatant)을 이용하여 ELISA 실험을 통해 다양한 아형의 인플루엔자 A형 바이러스에 반응하는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 클론을 선별하였다(도 1A).
면역된 마우스의 단클론항체의 대량생산은 최종적으로 선별된 하이브리도마 클론 각각을 마우스 복강 내로 주입하여 복수가 생성되면 채취하였고, 단백질 A 칼럼(protein A column)을 이용하여 단클론항체를 정제하였다.
제조예 2. 폴리도파민-멜라닌 나노 입자의 제작
2-1. 폴리도파민 나노 입자 및 폴리도파민@멜라닌 나노 입자의 제조
단계 1: 폴리도파민 나노 입자를 제조하는 단계:
도파민 히드로 클로라이드 (Dopamine hydrochloride, Sigma-Aldrich제) 300 mg을 50℃에서 150 ㎖ 증류수와 50 ㎖ 에탄올 혼합물에 용해시키고, 1 M NaOH (Junsei제) 용액 1.056 ㎖를 첨가하였다. 첨가 직후 무색 투명한 혼합 용액은 즉시 주황색으로 변하고, 혼합 용액을 3시간 동안 연속적으로 교반시켜 용액이 주황색에서 짙은 갈색으로 변하면 폴리도파민 나노 입자가 형성된다. 반응 후 얻은 생성물을 상온하에서 12,000 rpm에서 약 30분간 원심 분리하고 증류수에 재분산시켜 세척하였다. 상기 용액에 분산된 폴리도파민 나노 입자의 평균 직경은 약 100 nm였다.
단계 2: 폴리도파민 나노 입자에 멜라닌 셸을 코팅하는 단계:
L-도파 (3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine, Sigma-Aldrich제) 100 mg을 50 ㎖ 증류수에 용해시킨다. 단계 1에서 생성된 폴리도파민 나노 입자를 0.03 중량%의 농도가 되도록 150 ㎖ 증류수에 분산시키고, 1 M NaOH (Junsei제) 용액 528 ㎕를 첨가하였다. 혼합 용액을 상온에서 교반 시키면서 시린지 펌프 (Legato 100, KD Scientific)를 사용하여 상기 50 ㎖의 L-도파 수용액을 혼합 용액에 12.5 ㎖·h-1의 유속으로 4시간 주입하였다. 총 18시간 후 상기 용액을 12,000 rpm에서 40분 동안 원심 분리하고 증류수에 재분산시켜 세척하였다. 상기 용액에 분산된 폴리도파민@멜라닌 나노 입자의 평균 직경은 약 100 nm였다.
상기 제조예 2의 단계 1에서 도파민 히드로 클로라이드의 양을 450 mg으로 변경하고, 그 외에는 동일하게 반응을 수행하여, 그에 따른 폴리도파민 및 폴리도파민@멜라닌 나노 입자를 제조하였고, 각각 평균 직경이 약 210 nm인 것을 확인하였다.
2-2. 폴리도파민 나노 입자 및 폴리도파민@멜라닌 나노 입자의 특성
상기의 방법으로 제조된 폴리도파민 및 폴리도파민@멜라닌 나노 입자를 주사 전자 현미경(SEM,S-4800, 히타치)으로 측정하여 분석한 결과, 멜라닌 셸을 코팅하는 단계 전후로 나노 입자의 크기 및 모양을 비교했을 때 유의미한 차이가 없는 것으로 확인되었다(도 4).
본 발명에 따른 폴리도파민@멜라닌 나노 입자는 폴리도파민 나노 입자와 비교했을 때 카복실기를 포함한다. 상기에서 제조한 폴리도파민 및 폴리도파민@멜라닌 나노 입자를 증류수에 분산시킨 분산액의 제타 전위를 제타 전위 측정기(Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments Ltd)으로 측정하여 분석한 결과, 멜라닌 셸을 코팅하는 단계를 수행한 후 제타 전위가 크게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 4).
제조예 3. 단세포군 항체 F6H8 및 E8C3을 이용한 신속 진단 키트 제작
3-1. 나노입자-항체 복합체 제조
단세포군 항체 F6H8을 상기 제조예 2에서 제조한 멜라닌 나노 입자 또는 폴리도파민@멜라닌 나노 입자에 결합시켜 나노 입자-항체 복합체를 만들었다. 간단하게, 0.5M MES 버퍼(pH 6.1) 100 ㎕를 838 ㎕의 증류수와 혼합한 뒤 폴리도파민@멜라닌(OD350=32.4) 62 ㎕를 추가한다. 이후 0.5M의 NHS (N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt) 18 ㎕와, 0.5M EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride) 15 ㎕를 추가하고 한시간 동안 반응시킨 후, 원심분리하였다(17,000 rpm). 상층액은 버리고 펠렛에 950 ㎕의 인산완충액(pH 8.0)과 1 mg/mL 농도의 항체 50 ㎕를 혼합한다. 약 두시간 동안 반응시키고 원심분리 후 상층액을 제거한다. 펠렛에 저장 버퍼 (100 ㎕ of 2mM Borax, pH 9.0 및 0.1% BSA)를 섞어 4℃에서 보관하였다.
3-2. 신속 면역진단키트용 스트립 제조
상기 제조한 나노 입자-항체(F6H8) 복합체를 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 키트를 제작하였다. 이때 E8C3 단클론항체는 검사선(test line)에 점적하는(coating) 항체이고, F6H8 단클론항체는 나노 입자와 축합된 항체 복합체로서 시료 내 인플루엔자 A형 바이러스 검출(detection)용으로 사용되었다.
구체적으로는 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인의 일 말단에 유리섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 검체 패드를 결합시켜서 검체 시료를 투입할 수 있는 시료 주입부를 구비시켰다. 상기 검체 패드와 일정 간격을 두고, 상기 나노 입자-항체(F6H8) 복합체 6 ㎕를 가한 다음 일정 간격을 두고, 검사선(T)을 설정한 다음, 상기 검사선에 인플루엔자 바이러스에 대한 항체(E8C3)를 3 ㎎/㎖ 가하여 고정시켰다. 상기 검사선으로부터 일정 간격을 두고, 대조선(control line; C)을 설정한 다음, 상기 대조선에 인플루엔자 바이러스와 특이적으로 결합하는 항체에 대한 이차항체(마우스 IgG에 대한 항체) 0.5 ㎎/㎖을 가하여 고정시켰다. 최종적으로, 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인 위에 검체패드, 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물, 검사선 및 대조선이 순차적으로 정렬된 형태의 검출 키트를 제작하였다(도 5). 스트립에 시료(검체)를 적용한 후 20분 안에 육안으로 검출 결과를 확인할 수 있다.
실시예 1. 단세포군 항체의 인플루엔자 A형 바이러스 진단 성능 특성
상기 제조예 1을 통해 다양한 하이브리도마 클론을 확보하였고, 각 클론의 배양 상징액(supernatant)를 이용하여 인플루엔자 A형 바이러스에 대한 반응성을 indirect ELISA를 통해 확인하였다. 간단하게, 1,000 HAU/㎖의 H1N1, H3N2, H5N3, H5N6, H5N8, H7N1, H7N7 및 H9N2 바이러스를 각 웰에 넣고 37℃에서 2시간 동안 코팅한 뒤 5% BSA로 블로킹한 뒤 각 배양 상징액을 처리하여 반응성을 검정하였다. 그 결과, 다양한 아형의 인플루엔자 A형 바이러스에 반응성을 나타내는 하이브리도마 클론 2종을 확보하였다(도 1A). 또한, 열로 불활화한 H1N1, H3N2, H5N3, H7N1, H7N7 및 H9N2 바이러스를 각각 1,000 HAU/lane으로 웨스턴 블롯용 겔에 로딩시킨 이후 1차 항체로 E8C3 및 F6H8을 각각 1 ㎍/㎖로 반응시킨 결과, E8C3 및 F6H8 항체 모두 인플루엔자 A형 바이러스에는 반응하지 않음을 확인할 수 있었다(도 1B). 이는 E8C3 및 F6H8 항체가 구조적(conformational) 에피토프를 인식하는 것임을 시사하였다.
또한, 상기 E8C3 및 F6H8 단클론항체를 순수 분리정제하고, IsoStrip™ Mouse Monoclonal Antibody Isotyping 키트로 면역글로불린의 이소타입을 분석한 결과, 두 항체 모두 IgG3a 중쇄 및 Kappa 경쇄로 구성되어 있음을 알 수 있었다(도 2).
실시예 2. E8C3 및 F6H8 단클론항체와 폴리도파민@멜라닌 나노 입자가 이용된 진단 키트를 활용한 인플루엔자 바이러스 검출능
본 발명자는 상기 제조예 3에서 제조한 신속 면역진단키트를 이용하여 H1N1 바이러스의 검출한계를 분석하였다. 비교 대조군으로는 상용화된 인플루엔자 A 신속 진단키트를 사용하였다.
간단하게, H1N1 바이러스를 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5 HAU/㎖로 단계희석해서 신속 면역진단키트용 스트립에 테스트한 결과, 상용화된 진단키트와 본 발명에 따른 키트 모두 H1N1 바이러스에 대해 80 HAU/㎖의 검출 한계를 보여주었다(도 6). 다만, F6H8 항체를 평균 입자 크기 200 nm의 폴리도파민@멜라닌 나노 입자와 결합시켜 제조한 결합체를 적용한 키트에서는 40 HAU/㎖ 농도의 H1N1 바이러스 적용시에 육안으로 반응성이 확인되어, 다른 크기의 폴리도파민 나노 입자 또는 폴리도파민@도파민 나노 입자에 비해 성능이 우수함을 알 수 있었다. 또한, F6H8 항체를 평균 입자 크기 200 nm의 폴리도파민@멜라닌 나노 입자와 결합시켜 제조한 결합체를 적용한 키트를 사용하여 H3N2 바이러스의 검출 한계를 확인한 결과, 상용화된 진단키트는 40 HAU/㎖의 검출 한계를 나타낸 반면, 본 발명의 진단 키트는 H3N2 바이러스에 대해 20 HAU/㎖의 검출 한계를 보여 보다 우수한 검출능을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명자는 상기 폴리도파민-멜라닌 코어-셸 나노 입자와 금 나노 입자를 동시에 하나의 스트립에 적용하여 두 개의 검사선을 가진 이중(dual) 컬러 면역진단키트를 고안하였다(도 8A). 상기 이중 면역진단키트는 예컨대, 인플루엔자 A형 바이러스의 공통 항원과 결합능을 보이는 항체와 인플루엔자 A형 바이러스에서 아형 특이적 항원과 결합능을 보이는 항체를 금 나노 입자 및 폴리도파민-멜라닌 코어-셸 나노 입자와 각각 결합시키고 이를 이용하여 진단키트를 제조할 경우 인플루엔자 감염 의심 시료 내의 바이러스가 A형 인플루엔자 바이러스인지, 어떤 아형의 인플루엔자 A형 바이러스인지 동시에 검출가능하다. 본 발명자는 상기와 같은 이중 컬러 면역진단키를 제조한 후, H5N3 바이러스를 이용하여 테스트한 결과 2개의 검사선에서 각기 다른 컬러의 반응색이 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 8B).
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Korea Advanced Institute of Science and Technology
<120> Rapid diagnostic kit using monoclonal antibody for detecting
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<212> PRT
<213> Unknown
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<223> Influenza A H1N1 (A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai)
<400> 1
Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp
1 5 10 15
Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Lys Met
20 25 30
Ile Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys
35 40 45
Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu
50 55 60
Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu
65 70 75 80
Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile
85 90 95
Tyr Arg Arg Val Asn Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp
100 105 110
Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Asp Asp
115 120 125
Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Met Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn
130 135 140
Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp
145 150 155 160
Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser
165 170 175
Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu
180 185 190
Leu Val Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg
195 200 205
Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn
210 215 220
Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Lys Ala Met Met Asp
225 230 235 240
Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Phe Glu Asp Leu
245 250 255
Thr Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His
260 265 270
Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Pro Ala Val Ala Ser Gly
275 280 285
Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe
290 295 300
Arg Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Tyr Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu
305 310 315 320
Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala
325 330 335
Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Leu Ser Phe Ile Lys Gly Thr Lys Val
340 345 350
Leu Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn
355 360 365
Glu Asn Met Glu Thr Met Glu Ser Ser Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg
370 375 380
Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg
385 390 395 400
Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Ile Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg
405 410 415
Asn Leu Pro Phe Asp Arg Thr Thr Ile Met Ala Ala Phe Asn Gly Asn
420 425 430
Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Ile Ile Arg Met Met
435 440 445
Glu Ser Ala Arg Pro Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe
450 455 460
Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Ala Ser Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp
465 470 475 480
Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr
485 490 495
Asp Asn
Claims (9)
- 인플루엔자 A형 바이러스의 핵 단백질(nucleoprotein; NP)에 특이적으로 결합하는 단클론항체로서,
상기 단클론항체는 기탁번호가 KCTC14276BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 F6H8 또는 기탁번호가 KCTC14275BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 E8C3인 것을 특징으로 하는 단클론항체. - 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 인플루엔자 A형 바이러스는 H1N1, H3N2, H5N3, H5N6, H5N8, H7N1, H7N7 또는 H9N2인 것을 특징으로 하는 단클론항체.
- 제1항의 단클론항체를 생산하는, 기탁번호가 KCTC14276BP 또는 KCTC14275BP인 하이브리도마 세포주.
- 삭제
- 기탁번호가 KCTC14276BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 F6H8 또는 기탁번호가 KCTC14275BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 E8C3를 시료 샘플과 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스의 검출방법.
- 기탁번호가 KCTC14276BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 F6H8 및 기탁번호가 KCTC14275BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 E8C3를 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 키트.
- 제7항에 있어서, 상기 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 키트는 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로부터 일정 간격이 이격된 지점에 위치하는 기탁번호가 KCTC14276BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 F6H8이 멜라닌 셸이 코팅되어 있는 폴리도파민 나노 입자에 결합된 나노 입자-항체 복합체를 포함하는 결합부; 상기 결합부로부터 일정 간격이 이격된 위치에 기탁번호가 KCTC14275BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 E8C3이 고정된 검사선(test line); 및 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 순차적으로 구비되는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제7항에 있어서, 상기 인플루엔자 A형 바이러스 검출용 키트는 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로부터 일정 간격이 이격된 지점에 위치하는 기탁번호가 KCTC14276BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 F6H8이 멜라닌 셸이 코팅되어 있는 폴리도파민 나노 입자에 결합된 나노 입자-항체 복합체, 또는 인플루엔자 A형 바이러스의 공통 항원에 결합하는 단클론항체가 결합된 금 나노 입자-항체 복합체를 포함하는 결합부; 상기 결합부로부터 일정 간격이 이격된 위치에 기탁번호가 KCTC14275BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단클론항체 E8C3이 고정된 검사선(test line) 1; 상기 검사선 1로부터 일정 간격이 이격된 위치에 인플루엔자 A형 바이러스의 공통 항원에 결합하는 단클론항체가 고정된 검사선 2; 및 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 순차적으로 구비되는 것을 특징으로 하는 키트.
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| KR1020200110142A KR102469481B1 (ko) | 2020-08-31 | 2020-08-31 | 인플루엔자 a형 바이러스 검출용 단클론항체 및 폴리도파민-멜라닌 나노 입자를 이용한 신속 진단 키트 |
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| KR101821956B1 (ko) * | 2016-07-28 | 2018-01-26 | 원광대학교산학협력단 | 인플루엔자 a 바이러스의 뉴클레오단백질에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 형광면역 진단키트 |
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2020
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101821956B1 (ko) * | 2016-07-28 | 2018-01-26 | 원광대학교산학협력단 | 인플루엔자 a 바이러스의 뉴클레오단백질에 특이적인 단클론항체 및 이를 이용한 신속 형광면역 진단키트 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20220028743A (ko) | 2022-03-08 |
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