KR101297784B1 - 인간 ｂ 세포에서 생산된 인플루엔자 ａ 바이러스 중화 활성을 가지는 인간 단일클론 항체 - Google Patents
인간 ｂ 세포에서 생산된 인플루엔자 ａ 바이러스 중화 활성을 가지는 인간 단일클론 항체 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인간 B 세포에서 생산된 인플루엔자 A 바이러스 중화 활성을 가진 인간 단일클론 항체에 관한 것으로, 본 발명의 단일클론 항체는 인플루엔자 A 바이러스에 감염되었으나 회복된 환자의 혈액에서 선별된 B 세포에서 생산하는 단일클론 항체로서 인플루엔자 A 바이러스 H1, H2 및 H5 서브타입으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에 대하여 중화 활성을 가지고 있으므로 인플루엔자 A 바이러스 유래 질환의 예방 및 치료에 유용하며, 본 발명의 단일클론 항체를 이용하여 인플루엔자 A 바이러스의 진단에도 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 인플루엔자 A 바이러스에 감염된 후 회복된 환자의 혈액에서 선별된 인간 B 세포가 생산하는, 인플루엔자 A 바이러스에 대하여 중화 활성을 가지는 인간 단일클론 항체에 관한 것이다.
독감은 인플루엔자 바이러스(Influenza virus)가 호흡기에 감염되며 나타나는 질병으로 겨울철에 흔하게 나타나며, 감염성이 매우 높아 전 연령층을 대상으로 쉽게 전파되는데 특히 노약자층이 취약한 것으로 알려져 있다(Treanor J, 2004, N Engl J Med . 350(3):218-20). 오르쏘믹소바이러스(Orthomyxoviridae)에 속하는 외피 보유 바이러스(enveloped virus)로 8개의 분절로 된 음성-극성 및 단일 가닥(Negative-sense, single-strand)의 RNA(ribonucleic acid)를 유전체로 가지는 인플루엔자 바이러스는 A, B 및 C 그룹으로 분류되며 인플루엔자 A 바이러스(influenza A virus)의 경우 주요 표면 단백질인 HA(hemaggutinin)와 NA(neuraminidase)에 따라 다시 여러 서브타입(subtype)으로 나뉜다. 현재까지 16 종의 HA와 9 종의 NA가 알려져 있다(Cheung TK and Poon LL 2007, Ann N Y Acad Sci . 1102:1-25). 인플루엔자 바이러스는 종류에 따라 조류, 돼지 및 사람에 감염될 수 있다는 특성과 RNA 분절로 되어 있는 유전체로 인하여 다양한 유전자의 조합과 돌연변이로 계속해서 변종 바이러스가 발생한다(Treanor J, 2004. N Engl J Med. 350(3):218-20). 이런 지속적인 변이로 인하여 영구적인 면역력을 얻기가 힘들므로 현재 가장 효과적이라고 생각되는 예방법은 매년 유행할 것으로 예측되는 인플루엔자 바이러스에 대한 백신(vaccine)을 접종하여 특정 타입(type)에 맞는 면역력을 매년 형성시키는 것이다.
인플루엔자 바이러스에 대한 백신은 일반적으로 계란을 이용하여 생산되는데, 이는 많은 시간을 요하게 되는 비효율적 방법이다. 그러므로 거의 매년 짧은 시간에 충분한 양의 백신을 생산하는데 문제점이 발생한다. 이러한 문제를 해결하고자 세포 배양(cell culture)을 이용한 백신 생산 방법이 여러 제약회사(GSK, Baxter)에서 활발히 진행되고 있는 실정이다. 또한 인플루엔자 바이러스의 유행성 감염(pandemic infection)이 유발될 경우 이에 대한 신속한 백신 개발은 시간상 극히 어려움을 초래하고 있는 실정이다. 항 바이러스제(antiviral drug) 또한 돌연변이로 저항성을 갖는 바이러스의 출현 문제로 인하여 100% 신뢰할 수 없다.
이러한 문제점을 보완하기 위하여 인플루엔자 바이러스에 대한 항체의 사용 및 개발이 수행되었으며, 근래에 활발하게 진행되고 있다(Throsby et al, 2008, PloS One 3 (e3942); Sui et al., 2009, Nature structural & molecular biology . 16 (265-273); Simmons et al, 2007, PloS Medicine 4 (e178)).
회복된 환자의 혈액 생산물은 다양한 바이러스에 감염된 환자의 치료에 이용되어 왔으며 유행성 독감 감염(pandemic flu infection)의 치료에도 쓰여왔다. 예로서, 스페인 독감 바이러스(Spanish influenza virus)에 감염된 환자들이 폐렴 증상을 수반한 경우 상기 독감에 감염된 후 회복된 환자들로부터 채취한 혈액 생산물(blood product)을 치료에 사용하였다(Luke et al., 2006. Annals of internal medicine. 145:599). 이처럼 하이퍼 면역글로블린(Hyper immune globulin:IgIv)은 인간 혈장에서 정제되어 다양한 바이러스에 감염된 환자의 치료에 이용되나, 상기와 같이 제조된 생산물은 잠정적 감염원에 대하여 안전하지 않고, 대량 생산에 비효율적이다.
인간 B 세포는 특이적 인간 단일클론 항체의 선별에 이용된다. 그러나 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus)에 의한 인간 B 세포의 불멸화(immortalization)는 불멸화의 효율이 낮고 시간이 오래 걸리는 등 비효율적이다. 이를 보완하기 위하여 새로운 기술들이 개발 및 이용되고 있다. 그 중 하나는 RT-PCR 방법을 이용하여 B 세포에서 직접 항체의 유전자 정보를 획득하는 것이다. 예로서 특정 항원에 반응하는 항체를 발현하는 B 세포를 염색한 후 FACS 분석기(FACS-sorter)를 이용하여 분리하고, 이들 단일 B 세포로부터 항체의 유전 정보를 RT-PCR 방법에 의하여 획득하여 발현 벡터에 삽입 후 다시 동물세포에서 형질 감염하여 대량생산하는 방법이 있다. 이를 좀더 용이하고 신속하게 진행하기 위하여 하기와 같은 기술을 이용할 수 있다. 신 기술인 ISAAC(immunospot Array Assay on a Chip)은 특이 단일클론 항체를 분비하는 단일 B 세포를 몇 주 이내 스크리닝하여 항체 유전자를 획득할 수 있다(Jin et al ., 2009 Nat Med . 15, 1088-1092). 이렇게 획득된 항체는 자연적인 인간항체로서 면역원성 문제에서 더욱 효과적일 수 있다.
Reed L.J. and Muench H (1938). A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene, 27 (493-497)
본 발명의 목적은 인간 B 세포에서 생산되며, 인플루엔자 A 바이러스에 대하여 중화 활성을 가지는 인간 단일클론 항체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 단일클론 항체를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 단리된 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 발현 벡터가 형질 감염된 항체 생산 세포주를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 인간 단일클론 항체의 선별 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 인간 단일클론 항체를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 인간 단일클론 항체를 이용한 인플루엔자 A 바이러스 유래 질환 치료 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 인간 단일클론 항체를 이용한 인플루엔자 A 바이러스 유래 질환 예방 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 인간 단일클론 항체를 이용한 인플루엔자 A 바이러스 감염 여부 진단 방법을 제공하는 것이다.
아울러 본 발명의 다른 목적은 상기 인간 단일클론 항체를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 진단용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 H1, H2 및 H5 서브타입으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에 대하여 중화 활성을 가지는 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단일클론 항체를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단리된 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터가 형질 감염된 항체 생산 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 인간 단일클론 항체의 선별 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 단일클론 항체를 포함하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 단일클론 항체를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스로 인해 유래된 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 단일클론 항체를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 단일클론 항체를 이용한 인플루엔자 A 바이러스 유래 질환 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 단일클론 항체를 이용한 인플루엔자 A 바이러스 유래 질환 예방 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 단일클론 항체를 이용한 인플루엔자 A 바이러스 감염 여부 진단 방법을 제공한다.
아울러 본 발명은 상기 인간 단일클론 항체를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체는 인플루엔자 A 바이러스 H1, H2 및 H5 서브타입으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스에 대하여 결합 및 중화 활성을 가지므로 상기 인플루엔자 A 바이러스로 인한 질환에 대하여 예방 및 치료에 유용하며, 인플루엔자 A 바이러스의 감염 여부 진단 방법에도 유용하다.
도 1은 CT109, CT111-1 및 CT14-2 항체를 대상으로 한 단량체 헤마글루티닌(Hemaglutinin; 이하 "HA"라 칭함) 및 삼량체 HA에 대한 항체 결합력을 나타내는 그래프이다.
도 2는 CT104, CT120 및 CT123 항체를 대상으로 한 단량체 HA 및 삼량체 HA에 대한 항체 결합력을 나타내는 그래프이다.
도 3은 CT137, CT151 및 CT165 항체를 대상으로 한 단량체 HA 및 삼량체 HA에 대한 항체 결합력을 나타내는 그래프이다.
도 4는 pCT145(A)와 pCT147(B)의 벡터 지도이다:
A: pCT145 벡터;
B; pCT147 벡터;
pac: gene which encodes a Puromycin N-acetyl-tranferase (PAC); 및
DS: dyad symmetry sequence (EBNA1 binds to the dyad symmetry (DS) element in oriP).
도 5는 본 발명의 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체를 발현하는 발현 벡터 지도이다.
도 6은 본 발명의 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체를 이용한 동물실험 결과이다:
A: H5N1 서브타입 바이러스(A/Vietnam/1203/04) 처리 24시간 전 항체 처리군;
B: H5N1 서브타입 바이러스(A/Vietnam/1203/04) 처리 48시간 후 항체 처리군;
C: 유행성 H1N1 서브타입 바이러스(A/California/07/2009) 처리 24시간 전 항체 처리군; 및
D: 계절성 H1N1 서브타입 바이러스(A/puertoRico/8/1934) 처리 24시간 전 항체 처리군.
도 7은 본 발명의 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체를 이용한 페렛 실험 중 비강세척액에서의 바이러스 역가 변화 결과이다.
도 8은 본 발명의 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체를 이용한 페렛 실험 중 폐 조직 내에서의 바이러스 역가 변화 결과이다.
도 2는 CT104, CT120 및 CT123 항체를 대상으로 한 단량체 HA 및 삼량체 HA에 대한 항체 결합력을 나타내는 그래프이다.
도 3은 CT137, CT151 및 CT165 항체를 대상으로 한 단량체 HA 및 삼량체 HA에 대한 항체 결합력을 나타내는 그래프이다.
도 4는 pCT145(A)와 pCT147(B)의 벡터 지도이다:
A: pCT145 벡터;
B; pCT147 벡터;
pac: gene which encodes a Puromycin N-acetyl-tranferase (PAC); 및
DS: dyad symmetry sequence (EBNA1 binds to the dyad symmetry (DS) element in oriP).
도 5는 본 발명의 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체를 발현하는 발현 벡터 지도이다.
도 6은 본 발명의 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체를 이용한 동물실험 결과이다:
A: H5N1 서브타입 바이러스(A/Vietnam/1203/04) 처리 24시간 전 항체 처리군;
B: H5N1 서브타입 바이러스(A/Vietnam/1203/04) 처리 48시간 후 항체 처리군;
C: 유행성 H1N1 서브타입 바이러스(A/California/07/2009) 처리 24시간 전 항체 처리군; 및
D: 계절성 H1N1 서브타입 바이러스(A/puertoRico/8/1934) 처리 24시간 전 항체 처리군.
도 7은 본 발명의 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체를 이용한 페렛 실험 중 비강세척액에서의 바이러스 역가 변화 결과이다.
도 8은 본 발명의 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체를 이용한 페렛 실험 중 폐 조직 내에서의 바이러스 역가 변화 결과이다.
이하 본 발명의 단어를 다음과 같이 정의한다.
"인플루엔자 A 바이러스(influenza A virus)"는 오르쏘믹소바이러스(Orthomyxoviridae)에 속하는 외피 보유 바이러스(enveloped virus)로 8개의 분절로 된 음성-극성 및 단일 가닥(Negative-sense, single-strand)의 RNA(ribonucleic acid)를 유전체로 가지고, A, B 및 C 그룹으로 분류되며, 주요 표면 단백질인 HA(hemaggutinin)와 NA(neuraminidase)에 따라 다시 여러 서브타입(subtype)으로 나뉜다. 현재까지 16종의 HA와 9종의 NA가 알려져 있다.
본 발명에 기재된 "H1 서브타입"에는 H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8 및 H1N9이 포함된다.
본 발명에 기재된 "H2 서브타입"에는 H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N6, H2N7, H2N8 및 H2N9이 포함된다.
본 발명에 기재된 "H5 서브타입"에는 H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8 및 H5N9이 포함된다.
"헤마글루티닌(hemaggutinin, 이하 "HA"라 칭함)"은 인플루엔자 바이러스의 외피(envelope) 당단백질을 나타낸다. HA는 인플루엔자 바이러스가 숙주 세포에 흡착하여 관통하는 것을 매개한다. 현재까지 16 종류의 서브타입이 보고되어 있다.
"회복된 환자 또는 완치 환자"는 인플루엔자 A 바이러스에 감염되어 인플루엔자 A 바이러스에 양성 반응을 보였으나, 치유되어 혈액 내에서 인플루엔자 A 바이러스가 음성 반응을 보이는 환자이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 발명자들은 인플루엔자 A 바이러스에 감염된 후 회복된 환자의 채혈된 혈액으로부터 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)를 분리하고 상기 분리된 PBMC를 대상으로 단일클론 항체를 생산하는 B 세포를 ISAAC 방법을 이용하여 선별하였다. 상기 선별된 B 세포에서 단일클론 항체를 생산하는 유전자 정보를 RT-PCR 방법에 의하여 수득하였으며 이를 pcDNA 벡터에 삽입하여서 CHO 세포주에 형질 감염 후 생산된 항체들을 1차로 82개 선별하였다. HA와의 반응성을 보다 면밀히 측정하기 위하여 pcDNA 벡터에 삽입된 모든 항체들을 인간 세포인 F2N 세포에 형질 감염하고 이로부터 생산된 항체들을 단랑체 HA 및 삼량체 HA를 항원으로 이용한 HA-ELISA를 통해 비교 분석을 수행하여 삼량체 HA와 높은 비율로 반응하는 35개의 항체를 2차 선별하였다. 상기 2차 선별된 pcDNA 벡터에 포함된 35개의 항체 유전자를 항체 발현 효율이 높은 MarEx 발현 벡터에 삽입한 후 F2N 세포에 형질 감염하여 생산된 항체들로 여러 종류의 독감 바이러스에 대한 중화 활성을 확인하기 위해 마이크로 중화 시험법(microneutralization test: 이하 "MN 테스트"라 칭함) 및 혈구응집 억제 시험법(hemagglutination inhibition test: 이하 "HI 테스트"라 칭함)을 수행하였다. 다수의 항체들이 여러 독감 바이러스에 높거나 낮은 중화 활성을 보였으나, 모든 항체들이 HI 테스트에서 불응 반응을 보여 주었다. MN 테스트를 통해 최종적으로 여러 바이러스에 복합적인 중화 활성을 보이는 3개의 단일클론 항체(CT104, CT120 및 CT123 항체)를 선별하였다. 상기 선별된 3개의 단일클론 항체 중 CT104 항체는 인플루엔자 A 바이러스 H1 및 H5 서브타입에, CT120 항체는 인플루엔자 A 바이러스 H1, H2 및 H5 서브타입에, CT123 항체는 H1 서브타입에 중화 활성을 가짐을 확인하였다(표 1 참조). 또한 H1과 H5 서브타입 인플루엔자 바이러스를 이용한 동물실험에서 CT104 항체 및 C120 항체는 H5N1 감염에 대한 예방과 치료에 탁월한 효과를 보였으며 모든 3개의 항체는 유행성(pandemic) 및 계절성(seasonal) H1N1 감염에 대한 탁월한 예방 효과를 보였다(도 6 참조). CT120 항체를 이용한 페렛 동물실험에서는 H1N1 감염에 대한 치료 효과를 확인하였다(도 7 및 8 참조). 상기 결과를 통해 본 발명자들은 인플루엔자 A 바이러스 감염에 대처하는 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체의 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 H1, H2 및 H5 서브타입으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상에 대하여 중화 활성을 가지는 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 단일클론 항체는 인플루엔자 A 바이러스 표면의 HA에 결합하는 것을 특징으로 한다. 또한 상기 단일클론 항체는 인플루엔자 A 바이러스 H1N1 서브타입에 감염된 후 회복된 환자의 혈액에서 존재하는 B 세포에서 생산되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 인플루엔자 A 바이러스는 H1N1 서브타입인 것을 특징으로 하며, 상기 인플루엔자 A 바이러스 H1N1 서브타입은 A/Texas/05/2009-RG15, A/New York/18/2009-RG15, A/Solomon Islands/2006 및 A/Ohio/83으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상이다. 또한, 상기 인플루엔자 A 바이러스는 H2N2 서브타입인 것을 특징으로 하며, 상기 인플루엔자 A 바이러스 H2N2 서브타입은 A/Ann Arbor/6/60 ca이다. 아울러 상기 인플루엔자 A 바이러스는 H5N1 서브타입인 것을 특징으로 하며, 상기 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 서브타입은 A/Vietnam/1203/04 및 A/Anhui/1/05 중 어느 하나이다.
또한 본 발명에 있어서, 상기 단일클론 항체는 인플루엔자 A 바이러스 H3N2 서브타입에 대하여 중화 활성을 가지지 않는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 하기 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드 서열을 포함하는 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체, 이의 단편 및 기능적 변이체를 제공한다: 서열번호 1, 서열번호 7 및 서열번호 12로 기재되는 폴리펩티드 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 CDR1 영역; 서열번호 2로 기재되는 폴리펩티드 서열인 CDR2 영역; 및 서열번호 3, 서열번호 8 및 서열번호 13으로 기재되는 폴리펩티드 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 및 서열번호 4, 서열번호 9 및 서열번호 14로 기재되는 폴리펩티드 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 CDR1 영역; 서열번호 5, 서열번호 10 및 서열번호 15로 기재되는 폴리펩티드 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 CDR2 영역; 및 서열번호 6, 서열번호 11 및 서열번호 16으로 기재되는 폴리펩티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄.
또한, 본 발명은 하기의 폴리펩티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체, 이의 단편 및 기능적 변이체를 제공한다: 서열번호 1로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 2로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 3으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 및 서열번호 4로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 5로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 6으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄로 구성되는 단일클론 항체; 서열번호 7로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 2로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 8로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 및 서열번호 9로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 10으로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 11로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄로 구성되는 단일클론 항체; 및 서열번호 12로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 2로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 13으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 및 서열번호 14로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 15로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 16으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄로 구성되는 단일클론 항체.
본 발명에 있어서, 상기 단일클론 항체는 서열번호 36으로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 37로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄로 구성되는 것을 특징으로 한다. 상기 단일클론 항체는 인플루엔자 A 바이러스 H1 및 H5 서브타입에 대하여 중화 활성을 가지는 것을 특징으로 하며, 인플루엔자 A 바이러스 H3 서브타입에 중화 활성을 가지지 않은 것을 특징으로 한다. 상기 H1 서브타입으로는 H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8 및 H1N9가 포함되며, 상기 H5 서브타입으로는 H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8 및 H5N9가 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 단일클론 항체는 서열번호 40으로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 41로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄로 구성되는 것을 특징으로 한다. 상기 단일클론 인플루엔자 A 바이러스 H1, H2 및 H5 서브타입에 대하여 중화 활성을 가지는 것을 특징으로 하며, 인플루엔자 A 바이러스 H3 서브타입에 중화 활성을 가지지 않은 것을 특징으로 한다. 상기 H1 서브타입으로는 H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8 및 H1N9가 포함되며, 상기 H2 서브타입으로는 H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N6, H2N7, H2N8 및 H2N9가 포함되며, 상기 H5 서브타입으로는 H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8 및 H5N9가 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 단일클론 항체는 서열번호 44로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 45로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄로 구성되는 것을 특징으로 한다. 상기 단일클론 항체는 인플루엔자 A 바이러스 H1 서브타입에 대하여 중화 활성을 가지는 것을 특징으로 하며, 인플루엔자 A 바이러스 H3 서브타입에 중화 활성을 가지지 않은 것을 특징으로 한다. 상기 H1 서브타입으로는 H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8 및 H1N9가 포함된다.
본 발명의 인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체의 단편은 전체 항체가 아니라 항체의 일부분으로써 인플루엔자 A 바이러스 HA에 결합할 능력을 가지며 본 발명의 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체와 경쟁적으로 HA에 결합하는 단편 모두를 포함한다.
아울러 본 발명은 상기 단일클론 항체의 기능적 변이체를 포함한다. 항체들은 변이체들이 인플루엔자 A 바이러스 H1, H2 및 H5 서브타입 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하기 위해 본 발명의 단일클론 항체와 경쟁할 수 있다면 본 발명의 단일클론 항체의 기능적 변이체로 간주된다. 상세하게는 기능적 변이체가 인플루엔자 A 바이러스 H1, H2 및 H5 서브타입 또는 그의 단편에 결합할 수 있고, 이에 대하여 중화 활성을 가진다면 본 발명의 기능적 변이체로 간주된다. 기능적 변이체는 1차 구조적 서열이 실질적으로 유사한 유도체를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들면, 생체외(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 변형, 화학약품 및/또는 생화학 약품을 포함하며, 이들은 본원 발명의 부모 단일클론 항체에서는 발견되지 않는다. 이와 같은 변형으로는 예를 들어 아세틸화, 아실화, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합, 가교, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 수산화, 메틸화, 산화, 페길화, 단백질 분해 및 인산화 등이 포함된다. 기능적 변이체는 선택적으로 부모 단일클론 항체의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입, 결실 또는 그들의 조합을 함유하는 아미노산 서열을 포함하는 단일클론 항체일 수 있다. 더욱이 기능적 변이체는 아미노 말단 또는 카르복시 말단 중 하나 또는 모두에서 아미노산 서열의 절단체(truncated form)를 포함할 수 있다. 본 발명의 기능적 변이체는 본 발명의 부모 단일클론 항체와 비교하여 동일하거나 다르거나, 더 높거나 낮은 결합 친화력을 가질 수 있지만, 여전히 인플루엔자 A 바이러스 H1, H2 및 H5 서브타입 또는 그의 단편에 결합할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 기능적 변이체는 본 발명의 부모 단일클론 항체와 비교하여 인플루엔자 A 바이러스 H1, H2 및 H5 서브타입 또는 그의 단편에 대하여 증가된 또는 감소된 결합 친화력을 가질 수 있다. 바람직하게는 골격구조, 초가변(Hypervariable) 영역, 특히 CDR3 영역을 포함하나 이에 한정되는 것은 아닌 가변 영역의 아미노산 서열이 변형된다. 일반적으로 경쇄 또는 중쇄 영역은 3개의 CDR 영역을 포함하는, 3개의 초가변 영역 및 더욱 보존된 영역, 즉 골격 영역(FR)을 포함한다. 초가변 영역은 CDR로부터의 아미노산 잔기와 초가변 루프로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 범위에 속하기 위한 기능적 변이체는 본 명세서의 부모 단일클론 항체와 적어도 약 50%~99%, 바람직하게는 적어도 약 60%~99%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 80%~99%, 더욱 바람직하게는 약 90%~99%, 특히 적어도 약 95%~99%, 및 특히 적어도 약 97%~99% 아미노산 서열 동질성을 갖는다. 비교될 아미노산 서열을 최적으로 배열하고 유사하거나 또는 동일한 아미노산 잔기를 정의하기 위해 컴퓨터 알고리즘 중 당업자에게 알려진 Gap 또는 Bestfit를 사용할 수 있다. 기능적 변이체는 부모 단일클론 항체 또는 그것의 일부를 PCR 방법, 올리고머 뉴클레오티드를 이용한 돌연변이 생성 및 부분 돌연변이 생성을 포함하는 공지의 일반 분자생물학적 방법에 의해 변화시키거나 유기합성 방법으로 얻을 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 하기 경쇄 및 중쇄 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체, 이의 단편 및 기능적 변이체를 제공한다: 서열번호 17, 서열번호 23 및 서열번호 28로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 CDR1 영역; 서열번호 18 또는 서열번호 29로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나의 CDR2 영역; 및 서열번호 19, 서열번호 24 및 서열번호 30으로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 및 서열번호 20, 서열번호 25 및 서열번호 31로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 CDR1 영역; 서열번호 21, 서열번호 26 및 서열번호 32로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 CDR2 영역; 및 서열번호 22, 서열번호 27 및 서열번호 33으로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄.
또한, 본 발명은 하기의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체, 이의 단편 및 기능적 변이체를 제공한다: 서열번호 17로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 18로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 19로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 및 서열번호 20으로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 21로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 22로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄로 구성되는 단일클론 항체; 서열번호 23으로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 18로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 24로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 및 서열번호 25로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 26으로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 27로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄로 구성되는 단일클론 항체; 및 서열번호 28로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 29로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 30으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 및 서열번호 31로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 32로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 33으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄로 구성되는 단일클론 항체.
본 발명에 있어서, 상기 단일클론 항체는 서열번호 34로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 35로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 중쇄로 구성되는 것을 특징으로 한다. 상기 단일클론 항체는 인플루엔자 A 바이러스 H1 및 H5 서브타입에 대하여 중화 활성을 가지는 것을 특징으로 하며, 인플루엔자 A 바이러스 H3N2 서브타입에 중화 활성을 가지지 않은 것을 특징으로 한다. 상기 H1 서브타입으로는 H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8 및 H1N9가 포함되며, 상기 H5 서브타입으로는 H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8 및 H5N9가 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 단일클론 항체는 서열번호 38로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 39로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 중쇄로 구성되는 것을 특징으로 한다. 상기 단일클론 인플루엔자 A 바이러스 H1, H2 및 H5 서브타입에 대하여 중화 활성을 가지는 것을 특징으로 하며, 인플루엔자 A 바이러스 H3N2 서브타입에 중화 활성을 가지지 않은 것을 특징으로 한다. 상기 H1 서브타입으로는 H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8 및 H1N9가 포함되며, 상기 H2 서브타입으로는 H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N6, H2N7, H2N8 및 H2N9가 포함되며, 상기 H5 서브타입으로는 H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8 및 H5N9가 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 단일클론 항체는 서열번호 42로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 43으로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 중쇄로 구성되는 것을 특징으로 한다. 상기 단일클론 항체는 인플루엔자 A 바이러스 H1 서브타입에 대하여 중화 활성을 가지는 것을 특징으로 하며, 인플루엔자 A 바이러스 H3 서브타입에 중화 활성을 가지지 않은 것을 특징으로 한다. 상기 H1 서브타입으로는 H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8 및 H1N9가 포함된다.
또한, 본 발명은 상기 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 핵산 분자는 본 발명에서 제공하는 항체의 아미노산 서열을 당업자에게 알려진 바와 같이 폴리뉴클레오티드 서열로 번역된 핵산 분자 모두를 포함한다. 그러므로 ORF(open reading frame)에 의한 다양한 폴리뉴클레오티드 서열이 제조될 수 있으며 이 또한 모두 본 발명의 핵산 분자에 포함된다.
또한, 본 발명은 상기 단리된 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터를 제공한다. 상기 발현 벡터로는 셀트리온 고유의 발현 벡터인 MarEx 벡터 및 상업적으로 널리 사용되는 pCDNA 벡터, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti 벡터; 코스미드; 람다, 람도이드(lambdoid), M13, Mu, p1 P22, Qμ, T-even, T2, T3, T7 등의 파아지; 식물 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나에서 선택된 발현 벡터를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 발현 벡터로 알려진 모든 발현 벡터는 본 발명에 사용 가능하며, 발현 벡터를 선택할 때에는 목적으로 하는 숙주 세포의 성질에 따른다. 숙주세포로의 벡터 도입시 인산칼슘 트랜스펙션, 바이러스 감염, DEAE-덱스트란 조절 트랜스펙션, 리포펙타민 트랜스펙션 또는 전기천공법에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자는 사용하는 발현 벡터 및 숙주 세포에 알맞은 도입 방법을 선택하여 이용할 수 있다. 바람직하게 벡터는 하나 이상의 선별 마커를 함유하나 이에 한정되지 않으며, 선별 마커를 포함하지 않은 벡터를 이용하여 생산물 생산 여부에 따라 선별이 가능하다. 선별 마커의 선택은 목적하는 숙주 세포에 의해 선별되며, 이는 이미 당업자에게 알려진 방법을 이용하므로 본 발명은 이에 제한을 두지 않는다.
본 발명의 핵산 분자를 정제를 용이하게 하기 위하여 태그 서열을 발현 벡터 상에 삽입하여 융합시킬 수 있다. 상기 태그로는 헥사-히스티딘 태그, 헤마글루티닌 태그, myc 태그 또는 flag 태그를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자에게 알려진 정제를 용이하게 하는 태그는 모두 본 발명에서 이용 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터가 형질 감염된 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체 생산 세포주를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포주는 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 상기 포유동물 세포로는 CHO 세포, F2N 세포, CSO 세포, BHK 세포, 바우스(Bowes) 흑색종 세포, HeLa 세포, 911 세포, AT1080 세포, A549 세포, HEK 293 세포 및 HEK293T 세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 숙주 세포로 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 알려진 포유동물 숙주세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
또한, 본 발명은 하기와 같은 단계를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스에 감염되어 회복된 환자에서 항-인플루엔자 A 바이러스에 중화 활성을 가지는 항체 선별 방법을 제공한다: 1) 인플루엔자 A 바이러스에 감염된 환자들을 대상으로 완치 여부를 확인하고, 이 중 혈액 내 인플루엔자 A 바이러스 음성 환자를 선별하는 단계; 2) 상기 단계 1)에서 선별된 완치 환자에게서 혈액을 채취하여 수집하는 단계; 3) 상기 단계 2)에서 수집된 환자의 혈액에서 B 세포를 분리하는 단계; 4) 상기 단계 3)에서 HA와 결합하는 항체를 생산하는 B 세포를 선별하는 단계; 5) 상기 단계 4)에서 선별된 B 세포에서 RNA를 추출하는 단계; 6) 상기 단계 5)의 추출된 RNA를 대상으로 항체 유전자를 증폭하는 단계; 7) 상기 단계 6)에서 증폭된 유전자를 발현 벡터에 클로닝하는 단계; 8) 상기 단계 7)의 발현 벡터를 숙주세포에 형질 감염하는 단계; 9) 상기 단계 8)에서 제작된 형질 감염된 세포에서 생산하는 항체들에서 HA와 결합하는 항체를 선별하는 단계; 10) 선별된 항체에 대한 세포주를 제작하고 배양하는 단계; 11) 상기 단계 10)의 숙주세포의 배양액에서 인플루엔자 A 바이러스의 HA에 결합하는 항체를 정제하는 단계; 12) 상기 단계 11)에서 정제된 항체를 대상으로 인플루엔자 A 바이러스 중화 활성을 재확인하는 단계; 및 13) 상기 단계 12)의 중화 활성 실험에서 인플루엔자 A 바이러스 중화 활성을 가진 항체를 재선별하는 단계.
또한, 본 발명은 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체 이외에 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 당업자에게 이미 잘 알려져 있다.
또한, 본 발명은 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 유래 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체 이외에 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 당업자에게 이미 잘 알려져 있다.
또한 본 발명의 예방 및 치료용 조성물은 적어도 5개의 다른 치료제를 포함할 수 있다. 본 발명의 예방 및 치료용 조성물은 인플루엔자 A 바이러스 H1, H2 및 H5 서브타입 및 그의 단편에 결합하는 여러 종류의 단일클론 항체를 포함할 수 있으며, 이를 통해 중화 활성에 상승 작용을 나타낼 수 있다.
아울러 본 발명의 예방 및 치료용 조성물을 추가로 적어도 하나의 다른 치료제 또는 진단제를 포함할 수 있다. 상기 치료제로는 항-바이러스 약제를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 약제로는 항체, 소분자, 유기 또는 무기 화합물, 효소, 폴리뉴클레오티드 서열, 항-바이러스성 펩티드 등일 수 있다.
본 발명의 예방 및 치료용 조성물은 제조 및 저장 조건하에서 무균하고 안정하며, 전달시 또는 전달 전에 적절한 약제학적으로 허용 가능한 부형제 중에 재구성을 위해 분말 형태로 존재할 수 있다. 살균성 주사용액 제조를 위한 살균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 구성성분의 분말과 이의 미리 살균-여과된 용액으로부터 추가의 원하는 구성성분을 생산하는 진공 건조 및 동결 건조이다. 본 발명의 조성물은 용액 상태일 수 있고, 적절한 약제학적으로 허용 가능한 부형제가 단위 투여량 주사형을 제공하기 위해 전달되기 전 또는 전달 시에 첨가 및/또는 혼합될 수 있다. 바람직하게 본 발명에 사용되는 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 고 약물농도에 알맞고, 알맞은 흐름성을 유지할 수 있고, 필요에 따라 흡수가 지연될 수 있다.
본 발명의 예방 및 치료용 조성물 투여의 최적 경로 선택은 조성물 내의 활성 분자들의 물리-화학적 특성, 임상적 상황의 긴급성 및 원하는 치료용 효과에 대한 활성 분자의 플라즈마 농도의 관계를 포함하는 여러 인자들에 의해 영향을 받는다. 예를 들어 본 발명의 단일클론 항체는 임플란트 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는, 조절된 방출 제형과 같은 그들의 신속한 방출을 막은 담체와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 폴리머가 본 발명에 사용될 수 있다. 또한 단일클론 항체는 항체의 불활성화를 막은 물질 또는 화합물로 코팅되거나 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 단일클론 항체는 적합한 담체-리포좀 또는 희석제-와 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 예방 및 치료용 조성물의 투여 방법은 경구 및 비경구로 나뉠 수 있으며, 바람직한 투여 경로는 정맥 내이나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 경구 형태로는 정제, 트로키제, 약용 드롭스제, 수성 또는 유성 현탁제, 산제 또는 분산과립제, 에멀젼제, 강성 캡슐제, 연성 젤라틴 캡슐제, 시럽제 또는 엘릭서제, 필제, 당의정, 액제, 겔제 또는 슬러리제로서 제제화될 수 있다. 이들 제형은 불활성 희석제, 과립화 또는 붕해제, 결합제, 광택제, 보존제, 착색제, 풍미제 또는 감미제, 식물성유 또는 미네랄유, 습윤제 및 점증제를 함유하는 약제학적 부형제를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 비경구 형태로는 수성 또는 비수성 등장성 살균 비독성 주사 또는 주입 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 용액 또는 현탁액은 적용된 투여량 및 농도에서 수용체에 비독성인 1,3-부탄디올, 링거스 용액, 행크스 용액, 등장성 염화나트륨 용액과 같은 약제, 오일, 지방산, 국소마취제, 보존제, 완충액, 점도 또는 용해도 증가제, 수용성 항산화제, 유용성 항산화제 및 금속 킬레이트화제를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체에 표지 물질을 접합한 컨쥬게이트를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 진단용 조성물은 검출 가능한 모이어티/약제와 같은 적어도 하나의 검출 가능한 표지 물질을 포함한다. 본 발명의 표지 물질은 본 발명의 단일클론 항체에 비-공유적으로 연결될 수 있으며, 또한 공유결합으로 단일클론 항체에 직접적으로 연결될 수 있다. 선택적으로 하나 이상의 연결화합물에 의해 단일클론 항체에 연결될 수도 있다. 이러한 기술은 당업자들에게 이미 잘 알려져 있다. 이러한 표지 물질로는 검출 가능한 모이어티/약제로는 효소, 보결분자단, 형광물질, 발광물질, 생물발광물질, 방사성 물질, 양전자 방출금속 및 비방사성 파라마그네틱 금속이온으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 하기와 같은 단계를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 유래 질환 치료 방법을 제공한다: 인플루엔자 A 바이러스로 인하여 발생하는 질환을 가진 대상에 본 발명의 인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체를 투여하는 단계.
본 발명의 치료 방법에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스는 H1, H2 및 H5 서브타입으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다. 상기 H1 서브타입으로는 H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8 및 H1N9가 포함되며, 상기 H2 서브타입으로는 H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N6, H2N7, H2N8 및 H2N9가 포함되며, 상기 H5 서브타입으로는 H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8 및 H5N9가 포함된다.
본 발명의 치료 방법에 있어서, 당업자에게 알려진 치료제를 함께 투여할 수 있다.
본 발명의 치료 방법에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스 유래 질환은 신종 독감, 유행성 독감 및 계절성 독감으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 치료 방법에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체 투여량은 최적의 반응을 제공하도록 조절될 수 있다. 투여량의 범위는 예를 들어 0.01~200 mg/kg이고, 바람직하게는 0.1~150 mg/kg이고, 더욱 바람직하게는 1 ~ 100 mg/kg이나 이에 한정되지 않는다. 투여 회수는 여러 시간에 걸쳐 나누어 투여될 수 있고 투여량은 치료적 상황의 긴급사태에 의해 나타나는 바에 따라 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있으며 이는 본 발명에서 한정하는 것이 아니라 담당하는 의사의 권한에 따라 변화될 수 있다.
본 발명의 치료 방법에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체 투여 방법은 경구 및 비경구로 나뉠 수 있으며, 바람직한 투여 경로는 정맥 내이나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 하기와 같은 단계를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 유래 질환의 예방 방법을 제공한다: 대상에게 본 발명의 인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체를 투여하는 단계.
본 발명의 예방 방법에 있어서, 당업자에게 알려진 예방제를 함께 투여할 수 있다.
본 발명의 예방 방법에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체 투여량은 최적의 반응을 제공하도록 조절될 수 있다. 투여량의 범위는 예를 들어 0.01~200 mg/kg이고, 바람직하게는 0.1~150 mg/kg이고, 더욱 바람직하게는 1 ~ 100 mg/kg이나 이에 한정되지 않는다. 투여 회수는 여러 시간에 걸쳐 나누어 투여될 수 있고 투여량은 상황의 긴급사태에 의해 나타나는 바에 따라 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있으며 이는 본 발명에서 한정하는 것이 아니라 담당하는 의사의 권한에 따라 변화될 수 있다.
본 발명의 예방 방법에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체 투여 방법은 경구 및 비경구로 나뉠 수 있으며, 바람직한 투여 경로는 정맥 내이나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 하기와 같은 단계를 포함하는 환자의 인플루엔자 A 바이러스 감염 여부 진단 방법을 제공한다: 1) 샘플과 본 발명의 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체를 접촉시키는 단계; 및 2) 상기 단일클론 항체와 샘플의 반응을 검출하는 단계, 또는 1) 샘플과 본 발명의 진단용 조성물을 접촉시키는 단계; 및 2) 상기 진단용 조성물과 샘플의 반응을 검출하는 단계.
본 발명의 진단 방법에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스는 H1, H2 및 H5 서브타입으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다. 상기 H1 서브타입으로는 H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8 및 H1N9가 포함되며, 상기 H2 서브타입으로는 H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N6, H2N7, H2N8 및 H2N9가 포함되며, 상기 H5 서브타입으로는 H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8 및 H5N9가 포함된다.
본 발명의 진단 방법에 있어서, 본 발명의 단일클론 항체는 진단 검출을 위하여 필요에 따라 표지 물질을 접합시킬 수 있으며 이는 당업자에게 이미 공지된 사항이다.
본 발명의 진단 방법에 있어서, 상기 샘플은 대상의 가래, 침, 혈액, 땀, 폐 세포, 폐 조직의 점액, 호흡기 조직 및 타액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며 당업자에게 알려진 통상적인 방법으로 샘플 준비가 가능하다.
본 발명의 진단 방법에 있어서, 상기 반응 검출 방법으로는 방사면역측정법(RIA), 효소 결합 면역흡수 분석법(ELISA), 면역형광법, 면역세포화학, FACS, BIACORE 및 웨스턴 블롯 분석과 같은 균질 및 이종성 결합면역분석으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 알려진 검출 방법이라면 본 발명에 사용 가능하다.
또한, 본 발명은 1) 본 발명의 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체; 및 2) 용기를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
아울러 본 발명은 1) 본 발명의 인플루엔자 A 바이러스 진단용 조성물; 및 2) 용기를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 진단용 키트에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스는 H1, H2 및 H5 서브타입으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다. 상기 H1 서브타입으로는 H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8 및 H1N9가 포함되며, 상기 H2 서브타입으로는 H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N6, H2N7, H2N8 및 H2N9가 포함되며, 상기 H5 서브타입으로는 H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8 및 H5N9가 포함된다.
본 발명의 진단용 키트에 있어서, 상기 2)의 용기에는 고체 담체가 포함된다. 본 발명의 단일클론 항체는 고체 담체에 부착될 수 있고, 이와 같은 고체 담체로는 다공성 또는 비다공성, 평면 또는 비평면일 수 있다.
실시예
실시예
1: 독감 회복 환자로부터 혈액으로부터
PBMC
분리 준비
회복 환자군은 신종독감 확진 후 2-4주 된 환자로서 혈액 내에 신종독감 바이러스(H1N1)가 존재하지 않음이 확인되고 신종독감 바이러스에 대한 항체를 보유한 지원자들로 구성되었으며 이는 임상시험심사 위원회(IRB)의 승인을 받고 이루어졌다. 이들 환자군의 특징은 다음과 같다. (1) 계절 독감에 대한 백신을 접종 받지 않았다. (2) 다른 전염성 바이러스 즉 HBsAg 에 대하여 음성 반응을, anti-HCV 항체 및 anti-HIV 항체에 대하여 음성 반응을 보인다. (3) 혈장(plasma)에서 인플루엔자 A 바이러스 H1N1 서브타입의 RT-PCR에 음성 반응을 나타낸다. (4) 혈청에서 인플루엔자 A 바이러스 H1N1 서브타입의 단량체(monomeric) HA(H1N1)에 대한 ELISA에서 1:160 이상의 타이터(titer)를 혈청에서 보인다. 지원자들로부터 약 100 ㎖의 전혈을 수득하여 lymphoprepTM(Axis-Shield, Norway, 1114545) 방법을 사용하여 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)를 분리하였다. 분리된 PBMC는 인산 완충용액으로 3회 세척한 후, KM banker II(Cosmobio, Japan, KOJ-16092010) 냉동 배지(freezing medium)로 2x107 cells/㎖ 농도로 맞추어 액체질소탱크(Liquid Nitrogen Tank)에 보관되었다.
실시예
2: 단일클론 항체 1차 선별
항원 특이 항체를 분비하는 B 세포의 선별 방법은 Jin 등(Jin A. et al ., 2009. Nat Med . 15, 1088-1092)에 의해 설명된 방법을 이용하였다. 간략하게, 상기 실시예 1에서 분리된 PBMC를 준비된 마이크로어레이 칩 상의 각각의 웰에 1개씩 첨가하였다. 단일 세포로부터 분비된 항체는 미리 코팅(precoated)된 항-인간 IgG 항체에 의해 확인되었다. 이를 통해 선별된 항체 분비 세포(antibody secreting cell)를 대상으로 표지된 HA 항원을 이용하여 HA에 결합하는 항체의 분비 여부를 ELISPOT(enzyme linked immunospot assay: Sedgwick J.D., 2005, Methods Mol Biol . Vol.302, pp.314)으로 확인하였다. 확인된 개별 항체 분비 세포로부터 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 방법을 이용하여 항체의 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain) 유전자의 전체 서열을 확보하였다. 확보된 중쇄 및 경쇄 DNA를 pcDNA 3.1(+) 발현 벡터(invitrogen, USA, V790-20)에 삽입하여 항체의 경쇄 및 중쇄를 각각 생산하는 발현 벡터를 제조한 후, 상기 제조된 경쇄 및 중쇄 생산 발현 벡터를 CHO 세포에 형질 감염시켰다. 그 후, 형질 감염된 CHO 세포에서 생산된 항체를 이용하여 하기 실시예 3에 기재된 HA-ELISA 방법을 통해 HA에 결합을 하는 항체 82개를 1차적으로 선별하였다. 이때에는 항체 샘플을 연속적으로 희석하지 않고 HA와의 반응을 보여주는 모든 항체를 1차적으로 선별하였다.
실시예
3: 단일클론 항체의 2차 선별 및 항체 생산
1차적으로 선별된 82개의 항체에서 인플루엔자 HA에 결합력이 높은 단일클론 항체를 2차적으로 선별하기 위하여, 단량체 HA와 삼량체 HA를 확보하여 HA-ELISA를 진행하였다. 인플루엔자 A 바이러스의 재조합 단량체 HA(11055-V08H)는 Sino Biological Inc.(China)에서 구입하였다. 구입된 단량체 HA는 C-말단에 10개의 히스티딘(polyhistidine) 잔기를 포함하는 HA의 세포외 도메인(met1 - gln529)으로 구성되어 있으며, 형질 감염된 인간 세포에서 생산되었다. 재조합 삼량체 HA(FR-180)는 IRR(Influenza Reagent Resource, USA)에서 제공하였다. 상기 삼량체 HA는 C-말단 펩티드에 트롬빈(thrombin) 절단 자리, 삼량체 형성 유도 도메인(trimerizing domain; foldon) 및 6개의 히스티딘 잔기를 포함하는 구조이며, 바큘로 바이러스 시스템(baculovirus system)을 이용하여 생산되었다.
항체의 항원(HA)과의 반응성은 항원(HA)과 항체를 이용한 효소결합 면역흡수 분석법(ELISA)에 의해 측정되었다. 자세한 방법은 하기와 같다. 먼저 50 ㎕의 단량체 HA 및 삼량체 HA 항원(250 ng/㎖)을 각각 96-웰 마이크로타이터 플레이트(Nunc, Denmark, 449824)의 웰에 흡착시켰다. 상기 플레이트를 1 % 소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)이 함유된 인산 완충용액(Teknova, USA, D5120)으로 처리하여 블로킹한 후, 3 배씩 연속적으로 희석한 항체 샘플(starting concentration: 1 ㎍/㎖)을 플레이트의 각 웰에 추가하였다. 이 후, 실온에서 1 시간 반응(incubation)시킨 다음, 과산화효소가 표지된 염소의 항-인간 감마 항체(Zymed, USA, 62.8420)로 감지하였다. 실온에서 1시간 반응 후 테트라메틸벤즈이딘(Tetramethylbenzydine: TMB, Sigma-Aldrich, USA, T0440)과 반응시키고, 본 반응을 1 N HCl로 중지시켰다. 플레이트 리더기(Spectramax plus 384, Molecular Device)를 사용해 450/570 nm에서 흡광도를 측정하고, 그래프패드 프리즘 프로그램(GraphPad Software Inc. USA)을 이용하여 항원-항체간 반응성을 그래프로 나타내었다.
도 1에서 보여지는 바와 같이 CT109, CT111-1 및 CT154-2 항체는 삼량체 HA에 대하여 매우 높은 반응을 보여줄 뿐만 아니라, 단량체 HA에 대해서도 높은 반응을 보여주고 있으나, 삼량체 HA에 대한 반응보다는 낮은 반응을 보여주고 있다. 다른 형태의 반응은 CT104, CT120 및 CT123 항체처럼 삼량체 HA와는 높은 반응을 나타내고 있으나, 단량체 HA와는 거의 반응을 나타내지 않았다(도 2). 또 다른 형태의 항체들(CT137, CT151 및 CT165 항체)은 두 가지 항원 모두에 대해서 거의 반응을 하지 않았다(도 3).
이에 상기 도 1 내지 3에서의 결과를 근거하여, 1차적으로 선별된 82개의 항체 중에서 삼량체 HA에 높은 반응성을 보여주는 항체 35개를 2차적으로 선별하였으며, 이들 항체의 발현량을 높이기 위해 이들 항체 유전자를 pcDNA 벡터에서 셀트리온 고유의 발현 벡터인 MarEx 발현 벡터에 다음과 같이 재클로닝(recloning)을 진행하였다. 재클로닝 후, 이들 항체 유전자를 포함하는 MarEx 발현 벡터를 이용하여 마이크로 중화시험법(Microneutralization test; MN test) 및 혈구응집 억제시험(Hemagglutination inhibition test: HI test)에 필요한 항체를 생산하였다.
2차적으로 선정된 35개 항체의 중쇄 유전자와 경쇄 유전자를 각각 포함하는 original pcDNA 벡터에 제한효소 Nhe I과 Pme I을 처리하여 중쇄 유전자와 경쇄 유전자를 확보한 후, 확보된 중쇄 유전자와 경쇄 유전자를 각각 동일한 제한효소로 처리된 pCT145 벡터와 pCT147 벡터에 삽입하였다. pCT145 및 pCT147 벡터는 각각 항체의 중쇄와 경쇄를 클로닝하기 위해 제작된 셀트리온 고유의 벡터이다(도 4). 이후, 중쇄 전사단위(프로모터-중쇄 유전자-폴리에이)와 경쇄 전사단위(프로모터-경쇄 유전자-폴리에이)를 함께 같이 포함하는 발현 벡터를 제작하기 위하여, 중쇄 유전자를 포함하는 pCT145 벡터에 제한효소 Pac I과 Asc I을 처리하여 중쇄 전사단위를 확보한 다음, 경쇄 유전자를 포함하는 pCT147 벡터에 동일한 제한효소를 처리하여 중쇄 전사단위를 삽입하였다. 이후 제한효소를 이용하여, 중쇄 전사단위와 경쇄 전사단위를 동시에 포함하는 벡터를 선별하였다(도 5). 선별된 벡터는 Endofree plasmid maxi kit(QIAGEN, Germany, 12362)를 이용하여 추출되었으며, 추출된 DNA 중 일부를 이용하여 염기서열 분석을 통해 최종적으로 항체의 염기서열을 확인하였다.
이후, 추출된 항체의 DNA를 이용하여 부유배양 중인 셀트리온에서 제작한 F2N 세포주에 형질 감염하여 단일 클론 항체를 생산하는 일시적 세포주를 제조하였으며, 방법은 하기와 같다. 세포내 일시적 형질 감염을 위하여 양이온성 폴리머(cationic polymer)인 FreeStyleTM Max(Invitrogen, USA, 16447-100)를 사용하였으며, 제조사의 사용설명서에 따라 형질 감염을 수행하였다. 형질 감염 전날, EX-CELL 293 Serum free media(SAFC, LIK, 14571C, 이하 "EX-CELL 293 배지"라 칭함)에서 배양된 F2N 세포를 원심분리를 수행하여 Modified EX-CELL 293 배지(SAFC, LIK, 65237, 맞춤 주문 생산)를 이용하여, ㎖ 당 1x106 개의 세포 농도로 250 ㎖ Erlenmeyer Flask에 80 ㎖ 또는 1 ℓ Erlenmeyer Flask에 200 ㎖ 접종하였다. 형질 감염 당일, 80 ㎖ 접종한 경우, 단일클론 항체를 코딩하는 DNA 100 ㎍와 FreeStyleTM Max 시약 100 ㎕을 각각 OptiPRO SFM II(Invitrogen, USA, 12309) 배지를 이용하여 1.6 ㎖ volume으로 희석한 후, 가볍게 혼합하여 주었다. 200 ㎖ 접종한 경우, DNA 250 ㎍와 FreeStyleTM Max 시약 250 ㎕를 각각 OptiPRO SFM II 배지를 이용하여 4 ㎖ volume으로 희석한 후, 가볍게 혼합하여 주었다. 각각 혼합한 후, 즉시 희석된 FreeStyleTM Max 시약 용액을 DNA가 희석되어 있는 용액과 혼합한 다음, 상온에서 19분 반응하였다. 상온에서 19분 반응하는 동안, 전날 접종된 F2N 세포를 신선한 Modified EX-CELL 293 배지를 이용하여 0.8x106 개의 세포 농도로 희석하였으며, 19분 반응 후, DNA와 FreeStyleTM Max 시약 혼합 용액을 F2N 세포에 처리함으로써 형질 감염을 진행하였다. 형질 감염 다음날, 동량의 EX-CELL 293 배지를 형질 감염된 세포에 첨가하여 7~8일 동안 배양함으로써 단일클론 항체를 생산하였다.
실시예
4: 바이러스에 대한
생체외
(
in
vitro
) 중화 활성 조사
선별된 항체 중 HA-ELISA에서 삼량체 HA에 대해 높은 결합력을 보인 11개의 항체를 골라 다양한 독감 바이러스에 대한 생체외 중화 활성를 확인하기 위하여 MN (microneutralization) 분석을 수행하였다.
실시예
4-1:
MDCK
세포주 배양과 바이러스 농도 결정
MDCK(Madin-Darby canine kidney)는 London line(MDCK-L)을 사용하였다. MDCK 세포주는 10%의 FBS(Atlas Biologicals, USA, F0500A), 1X 페니실린/스트렙토마이신(pecinillin/streptomycin; Gibco, USA, 15140), 25 mM 헤페스(HEPES; Gibco, USA, 15630) 및 2 mM L-글루타민(glutamine; Gibco, USA, 25030)이 포함된 DMEM(Gibco, USA, 11965) 배지를 이용하여 37℃의 5% CO2 습윤(humidified) 세포배양기에서 배양되었다.
바이러스 농도는 세포 기반 ELISA 방법으로 정량하여, TCID50(Median tissue culture infective dose)를 구하였다. 상기 방법은 아래와 같이 진행되었다. 먼저 바이러스 저장액(Virus stock)을 바이러스 희석제(virus diluent)[DMEM(Gibco, USA), 3% BSA(Gibco, USA, 15260), 1X 페니실린/스트렙토아미신(pecinillin/streptomycin, Gibco, USA), 25 mM 헤페스(HEPES, Gibco, USA)]로 10배씩 연속 희석하여 96 웰 플레이트의 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 음성 대조군(Negative control)으로는 바이러스가 포함되어 있지 않은 바이러스 희석제(virus diluent)를 첨가하였다. 이후 배양 중인 MDCK 세포주에 트립신(trypsin)을 처리하여 배양 용기에서 분리한 후, MDCK 배양 배지를 처리하여 트립신을 중화하였다. 인산 완충용액을 이용하여 2번 세척한 후, 바이러스 희석제로 세포 펠렛(pellet)을 희석하여 5×105 cells/㎖ 농도로 맞추었다. 바이러스가 들어있는 96 웰 플레이트에 3-4 ㎍/㎖ TPCK-트립신(Sigma, USA)을 넣은 이후 즉시 상기 MDCK 세포주 100 ㎕씩 첨가하여 37℃의 5% CO2 습윤(humidified) 세포배양기에서 20시간 반응시켰다. 반응시킨 플레이트를 인산 완충용액으로 1회 세척한 다음 냉각시킨 아세톤(acetone): 인산 완충용액(PBS)(80:20) 혼합액을 각 웰에 200 ㎕ 씩 첨가해서 8분간 고정(fix)한 후 상온에서 20분간 건조하였다. 각 플레이트에 인산 완충용액을 웰 당 200 ㎕ 첨가해서 2회 세척하고 비오틴화(biotinylated)된 anti-NP(nuclear protein) 단일클론 항체(Milipore, USA, MAB8257B)를 1% BSA가 포함된 인산 완충용액(인산 완충용액, 0.1% Tween-20)으로 2,000배 희석하여 웰 당 100 ㎕를 첨가하고 상온에서 1시간 반응시켰다. 웰 당 200 ㎕의 인산 완충용액으로 3회 세척한 후 1% BSA가 포함된 인산 완충용액에 20,000배 희석된 스트렙토아비딘(streptoavidin)-HRP 접합 항체를 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 상온에서 1시간 반응시켰다. 인산 완충용액으로 4회 세척한 후 OPD(Sigma, USA, P8287) 용액을 웰 당 100 ㎕ 첨가하고 상온에서 10분간 발색시키고, 3 M HCl을 웰 당 50 ㎕ 처리하여 반응을 종료시킨 후, OD490를 측정하였다. Reed & Muench(The American 1938)에 의한 방법을 이용하여 측정된 OD490에서 TCID50을 계산하였다.
실시예
4-2:
MN
분석법
각 항체는 바이러스 희석제를 이용하여 1차적으로 10 ㎍/㎖ 농도로 맞추었다. 이 농도를 초기 농도로 하여, 다시 바이러스 희석제를 이용하여 연속적으로 2배씩 희석하여 96 웰 플레이트의 웰 당 50 ㎕씩 첨가하고 100 TCID50에 해당하는 농도의 바이러스를 웰 당 50 ㎕씩 첨가하여 37℃의 5% CO2 습윤(humidified) 세포 배양기에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 3-4 ㎍/㎖ 농도의 TPCK-trypsin(Sigma, USA, T1426)을 각 웰에 넣고 다시 100 ㎕씩의 처리된 MDCK 세포주를 넣은 후, 37℃의 5% CO2 습윤(humidified) 세포 배양기에서 20시간 반응시켰다. 20 시간 반응시킨 후부터의 과정은 실시예 4-1에 언급된 바이러스 정량화에 사용된 방법과 동일한 방법으로 MN 분석을 진행하여, OD490 수치를 측정하였다. 세포만 넣은 웰의 OD490 수치보다 높은 수치를 보이는 웰은 바이러스가 감염된 것으로 판단하였다. 각 항체별로 바이러스 항원이 검출되지 않는 여러 OD490 수치 중에서 항체의 제일 낮은 농도(㎍/㎖)를 표 1에 나타내었으며, 이 항체의 농도가 낮으면 낮을수록 바이러스의 중화 활성이 높음을 의미한다.
| mab ID | H1 Pandemic | H1 Seasonal | H2 | H5 | H3 | |||
| (A/ Texas /05/2009- RG15 ) | (A/ New York /18/2009- RG18 ) | (A/ Solomon Islands /2006) | (A/ Ohio /83) | (A/ Ann Arbor /6/60 ca ) | (A/ Vietnam /1203/04) | (A/ Anhui /1/05) | (A/ Wisconsin /67/2005) | |
| CT104 | 0.313 | 0.625 | 0.625 | 0.313 | >10 | 1.25 | 0.625 | >10 |
| CT105 | 1.25 | 5.0 | >10 | 2.5 | >10 | >10 | 10 | >10 |
| CT109 | >10 | >10 | >10 | >10 | >10 | >10 | >10 | >10 |
| CT111 -1 | >10 | >10 | >10 | >10 | >10 | >10 | >10 | >10 |
| CT112 -1 | 0.625 | 1.25 | 5.0 | 0.625 | >10 | 5 | 2.5 | >10 |
| CT113 | 1.25 | 1.25 | 1.25 | 0.625 | >10 | 5 | 2.5 | >10 |
| CT117 | 2.5 | 2.5 | 5.0 | 2.5 | >10 | 10 | 10 | >10 |
| CT119 | 1.25 | 2.5 | 5.0 | 1.25 | >10 | 10 | 2.5 | >10 |
| CT120 | 0.313 | 0.313 | 0.625 | 0.156 | 2.5 | 1.25 | 0.625 | >10 |
| CT122 -1 | 2.5 | 10 | >10 | >10 | >10 | >10 | >10 | >10 |
| CT123 | 0.313 | 0.625 | 1.25 | 0.313 | >10 | >10 | >10 | >10 |
* 단위: ㎍/㎖
H1, H2, H3 및 H5 서브타입 독감 바이러스에 대한 11개 후보 항체의 MN 분석 결과, CT104 항체는 저농도(0.313-0.625 ㎍/㎖)에서 두 종의 유행성 H1N1 서브타입 바이러스(A/Texas/05/2009 및 A/New York/18/2009)와 두 종의 계절성 H1N1 서브타입 바이러스(A/Solomon Islands/3/2006 및 A/Ohio/83)에 대하여 중화 활성을 나타내었으며, 또한 2 종류의 H5N1 서브타입 바이러스(A/Vietnam/1203/04 및 A/Anhui/1/05)를 1.25 ㎍/㎖과 0.625 ㎍/㎖에서 중화시켰다. 그러나 H2N2 서브타입 바이러스(A/Ann Arbor/6/60ca)와 H3N2 서브타입 바이러스(A/Wisconsin/67/2005), 두 종의 인플루엔자 바이러스 대해서는 중화 활성을 나타내지 않았다. CT123 항체는 실험한 4가지의 H1N1 서브타입 바이러스에만 중화 활성을 보였다. 특히 CT120 항체는 4종류의 H1N1 서브타입, 한 종류의 H2N2 서브타입(A/Ann Arbor/6/60 ca) 및 2 종류의 H5N1 서브타입 인플루엔자 바이러스에 모두 민감한 중화 활성을 보였다. 그러나 상기 항체 모두 H3 clade에 속하는 H3N2 서브타입에 대해서는 중화 활성을 나타내지 않았다.
여기서 선별된 3개의 중화 활성을 가진 항체들은 다음과 같이 IC50를 측정하여 비교하였으며 본 결과는 하기 표 2에 기재하였다. 여기서 IC50은 항체가 바이러스에 대해 최대 중화 활성의 50%를 나타내는 항체의 농도로서, 수치가 낮으면 낮을수록 항체의 중화 활성이 높음을 의미한다.
| antibody | A/Texas/05/2009-RG15 | A/New Yock/18/2009-RG18 | ||
| 마이크로 중화시험법에서의 항체 농도 | IC50 | 마이크로 중화시 험법에서의 항체 농도 |
IC50 | |
| CT104 | 0.313 ㎍/㎖ | 0.29 ㎍/㎖ | 1.25 ㎍/㎖ | 0.56 ㎍/㎖ |
| CT120 | 0.156 ㎍/㎖ | 0.15 ㎍/㎖ | 0.313 ㎍/㎖ | 0.31 ㎍/㎖ |
| CT123 | 0.625 ㎍/㎖ | 0.068 ㎍/㎖ | 1.25 ㎍/㎖ | 0.29 ㎍/㎖ |
표 2에서 보듯이, 3가지 항체의 IC50 수치가 매우 낮음을 알 수 있으며, 결과적으로 표 2에 언급된 2가지 바이러스에 대한 중화 활성이 높음을 알 수 있다.
실시예
5: 바이러스에 의한 적혈구 응집반응에 대한 항체의 억제 능력 조사
v-bottom 96-웰 플레이트 상에서 항체를 2배씩 연속적으로 희석하고 4배의 HA 유니트의 바이러스를 첨가하여 혼합시켰다. 혼합한 플레이트를 상온에서 30분간 반응시킨 후, 각각의 웰에 1% avian red blood cell를 첨가하였다. 혈구응집 억제 엔드 포인트(end point)는 응집 반응이 관찰되지 않는 가장 낮은 항체 농도로 결정하였다.
그 결과, 실험하였던 모든 항체들이 2 종류의 유행성 H1N1 서브타입 바이러스 (A/Texas/05/2009-RG15 및 A/New York/18/2009-RG18)에 대해 혈구응집을 고농도(>20 ㎍/㎖)에서도 억제하지 못하였다(표 3).
| antibody | A/ Texas /05/2009- RG15 | A/New Yock/18/2009-RG18 |
| CT104 | > 20 ㎍/㎖ | > 20 ㎍/㎖ |
| CT105 | > 20 ㎍/㎖ | > 20 ㎍/㎖ |
| CT109 | > 20 ㎍/㎖ | > 20 ㎍/㎖ |
| CT111 -1 | > 20 ㎍/㎖ | > 20 ㎍/㎖ |
| CT112 -1 | > 20 ㎍/㎖ | > 20 ㎍/㎖ |
| CT113 | > 20 ㎍/㎖ | > 20 ㎍/㎖ |
| CT119 | > 20 ㎍/㎖ | > 20 ㎍/㎖ |
| CT120 | > 20 ㎍/㎖ | > 20 ㎍/㎖ |
| CT122 -1 | > 20 ㎍/㎖ | > 20 ㎍/㎖ |
| CT123 | > 20 ㎍/㎖ | > 20 ㎍/㎖ |
실시예
6: 동물실험을 통한 항체의 인플루엔자 독감바이러스의 예방 및 치료 효과 조사
실시예
6-1: 마우스 실험
상기 실시예들에서 선정된 CT104, CT120 및 CT123 항체들이 마우스에서 H1N1 및 H5N1 서브타입 바이러스에 대한 예방 및 치료 효과를 가지는지 조사하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행하였다. 5마리로 구성된 마우스의 각 그룹에 비강을 통하여 10 LD50의 바이러스 감염시켰다. 3개의 선별된 항체(CT-104, CT-120 및 CT123 항체)와 음성대조용 항체(CT-P6 항체)는 kg 당 10 ㎎의 양을 바이러스 감염 24시간 전, 또는 바이러스 감염 후 48시간에 복강 내 주사를 통해 마우스에 투여되었다.
실험 결과, 도 6에서와 같이 10 LD50의 H5N1 서브타입 바이러스(A/Vietnam/1203/2004)를 감염시키기 24시간 전에 CT-104 항체 또는 CT-120 항체를 주사하였을 경우 모든 마우스가 생존하였으나 CT-123 항체를 처리했을 경우에는 12일 후에 20 %의 마우스가 사망하였다. 음성대조용 항체(CT-P6 항체)의 경우, 7일 후에 주사한 모든 마우스가 사망하였다(도 6A). 항체의 치료효과를 확인하기 위하여 바이러스 감염 2일 후에 항체를 주사하였을 경우 CT-104 항체와 CT-120 항체를 주사한 마우스는 관찰 기간인 14일까지 모두 생존하였으나 음성대조용 항체(CT-P6 항체)나 CT-123 항체를 주사한 마우스는 모두 사망하였다(도 6B).
항체의 예방 효과를 확인하기 위하여 유행성 H1N1 서브타입 바이러스(A/California/07/2009)를 감염시키기 24시간 전에 항체를 주사하였을 경우 CT-120 항체와 CT-123 항체를 주사한 마우스는 관찰기간인 14일까지 모두 살아있었으며, CT-104 항체를 주사한 경우 80%의 마우스가 생존하였으나 CT-P6를 주사한 음성대조군의 경우 모두 사망하였다(도 6C).
CT-104 항체 또는 CT-123 항체를 계절성 H1N1 서브타입 바이러스(A/puerto Rico/8/1934) 감염 24시간 전에 투여한 모든 마우스가 관찰 기간 동안 살아있었으며, CT-120 항체의 경우 80 %의 생존율을 나타내었으나 CT-P6 항체를 주사한 음성대조군은 모두 사망하였다(도 6D).
실시예
6-2:
페렛
실험
독감바이러스에 대하여 선별된 CT120항체의 치료효과를 검증하기 위하여 인간과 유사한 감수성과 증상을 보이는 페렛 동물실험 모델에서 실험을 진행하였다.
각 시험군은 9마리의 페렛으로 구성되었으며 음성 대조군은 초기 바이러스 감염 농도를 측정하기 위한 4마리를 포함하여 13마리로 구성되었다. 페렛은 순화기간을 거친 뒤 신종독감 바이러스를 [A/California/04/09 (H1N1)] 1 x 106 EID50/㎖로 비강 및 기관에 1 ml을 접종하였다. 바이러스 접종 24시간 뒤 시험군 1 은 15 mg/kg의 CT120 항체를, 시험군 2는 30 mg/kg의 CT120 항체를 1회 정맥으로 투여하였으며 시험군 3은 3일간 매 24시간 마다 30 mg/kg의 CT120 항체를 투여하였다. 음성대조군의 경우 바이러스 접종 24시간 뒤 30 mg/kg의 CT-P6 항체를 1회 정맥 투여하였다.
각 실험 동물에서 바이러스의 농도를 측정하기 위하여 바이러스 접종 후 1, 3, 5, 8 일째 각 시험군에서 비강 세척액을 채취하고 채취된 샘플 내에서의 바이러스 농도를 유정란을 이용하여 측정하였다. 폐조직에서의 바이러스 농도를 측정하기 위해서는 바이러스 접종 후 1, 3, 5, 8 일째 각 시험군에서 각각 3마리씩의 페렛을 희생시켜 폐조직 내에서의 바이러스 농도를 유정란을 이용하여 측정하였다.
바이러스의 농도 측정을 위하여 폐조직의 경우 항생제를 포함한 PBS 용액 1 ㎖ 당 폐조직 1 g의 비율로 채취한 페조직을 분쇄기를 이용하여 파쇄 후, 원심 분리 후 상등액을 확보하였다. 비강 세척액은 항생제를 포함한 PBS 용액 1 ml을 이용하여 채취한 뒤 원심 분리 하여 상등액을 확보하여 바이러스 농도 측정에 사용하였다. 바이러스 농도 측정을 위한 폐조직 파쇄 상등액과 비강 세척 상등액은 항생제를 포함한 PBS 용액으로 10배씩 단계별로 희석한 후 10-13일령 유정란에 접종하고 48 시간 배양하였다. 배양한 유정란의 요막액 50 ㎕를 취하여 동량의 0.5 % 적혈구(칠면조)와 혼합하고 30분간 반응시킨 다음 혈구응집 반응 여부를 통해 바이러스를 적정하였다.
실험결과 비강세척액에서의 바이러스 역가 변화에 있어서 대조군의 경우는 바이러스 접종 후 5일째까지 log10 4 EID50/㎖ 이상으로 높은 바이러스 역가가 유지되었다가, 그 이후에는 감소되는 경향을 보이는 반면, 시험물질 투여군은 대조군에 비하여 바이러스 역가가 현저히 감소되었으며, 8일째에는 바이러스가 검출되지 않아, 대조군에 비하여 매우 빠르게 바이러스 제거(clearance)가 빨리 일어남을 확인하였다. 특히 시험군 3에서 좀더 현저한 바이러스의 감소가 관찰되었다(도 7).
폐 조직 내에서의 바이러스 역가 변화에 있어서 대조군의 경우는 챌린지 후 5일째까지 log 4.5 EID50/㎖ 이상으로 비교적 높은 바이러스 역가가 유지되다가. 그 이후에는 감소되는 경향을 보이는 반면, 시험물질 투여군은 대조군에 비하여 바이러스 역가 현저히 감소되었으며, 챌린지 후 8일째에는 바이러스가 전혀 검출되지 않았다. 특히 시험군 2와 3에서 현저한 바이러스 역가감소 관찰되어, CT120 항체 15 ㎎/㎏ 보다는 CT120 항체 30 ㎎/㎏이 페럿을 이용한 효능검증에서 좀 더 효과적인 인플루엔자 바이러스에 대한 증식억제 기능을 나타내었다(도 8).
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- 하기의 폴리펩티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 폴리펩티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체, 또는 이의 단편:
서열번호 1로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 2로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 3으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 및 서열번호 4로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 5로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 6으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄로 구성되는 단일클론 항체;
서열번호 7로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 2로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 8로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 및 서열번호 9로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 10으로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 11로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄로 구성되는 단일클론 항체; 및
서열번호 12로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 2로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 13으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 및 서열번호 14로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 15로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 16으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄로 구성되는 단일클론 항체.
- 제 5항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 서열번호 36으로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 37로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄로 구성되는 것을 특징으로 하는 항-인플루엔자 A 단일클론 항체.
- 제 6항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 인플루엔자 A 바이러스 H1 및 H5 서브타입에 대하여 중화 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체.
- 제 5항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 서열번호 40으로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 41로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄로 구성되는 것을 특징으로 하는 항-인플루엔자 A 단일클론 항체.
- 제 8항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 인플루엔자 A 바이러스 H1, H2 및 H5 서브타입에 대하여 중화 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체.
- 제 5항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 서열번호 44로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 45로 기재되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄로 구성되는 것을 특징으로 하는 항-인플루엔자 A 단일클론 항체.
- 제 10항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 인플루엔자 A 바이러스 H1 서브타입에 중화 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체.
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- 하기의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체, 또는 이의 단편:
서열번호 17로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 18로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 19로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 및 서열번호 20으로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 21로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 22로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄로 구성되는 단일클론 항체;
서열번호 23으로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 18로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 24로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 및 서열번호 25로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 26으로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 27로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄로 구성되는 단일클론 항체; 및
서열번호 28로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 29로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 30으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 및 서열번호 31로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 32로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 33으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄로 구성되는 단일클론 항체.
- 제 13항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 서열번호 34로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 35로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 중쇄로 구성되는 것을 특징으로 하는 항-인플루엔자 A 단일클론 항체.
- 제 14항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 인플루엔자 A 바이러스 H1 및 H5 서브타입에 대하여 중화 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체.
- 제 13항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 서열번호 38로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 39로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 중쇄로 구성되는 것을 특징으로 하는 항-인플루엔자 A 단일클론 항체.
- 제 16항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 인플루엔자 A 바이러스 H1, H2 및 H5 서브타입에 대하여 중화 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체.
- 제 13항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 서열번호 42로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 43으로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 중쇄로 구성되는 것을 특징으로 하는 항-인플루엔자 A 단일클론 항체.
- 제 18항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 인플루엔자 A 바이러스 H1 서브타입에 중화 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체.
- 제 5항의 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체를 암호화하는 단리된 핵산 분자.
- 제 20항의 단리된 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터.
- 숙주 세포에 제 21항의 발현 벡터가 형질 감염된 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체 생산 세포주.
- 제 22항에 있어서, 숙주 세포는 CHO 세포, F2N 세포 및 HEK 293 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체 생산 세포주.
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- 제 5항 또는 제 13항의 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체를 포함하는 조성물.
- 제 5항 또는 제 13항의 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 유래한 질환의 예방 및 치료용 조성물.
- 제 5항 또는 제 13항의 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체에 표지 물질을 접합한 컨쥬게이트를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 진단용 조성물.
- 제 27항에 있어서, 상기 표지물질은 효소, 루시퍼레이즈 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스 진단용 조성물.
- 인플루엔자 A 바이러스로 인하여 발생하는 질환을 가진 인간을 제외한 대상체에 제 5항 또는 제 13항의 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체를 투여하는 단계를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 유래 질환 치료 방법.
- 제 29항에 있어서, 상기 인플루엔자 A 바이러스는 H1, H2 및 H5 서브타입으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 질환치료 방법.
- 인간을 제외한 대상체에 제 5항 또는 제 13항의 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체를 투여하는 단계를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 유래 질환의 예방 방법.
- 1) 샘플과 제 5항 또는 제 13항의 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체를 접촉시키는 단계; 및
2) 상기 단일클론 항체와 샘플의 반응을 검출하는 단계를 포함하는
인간을 제외한 대상체의 인플루엔자 A 바이러스 감염 여부 진단 방법.
- 1) 샘플과 제 27항의 진단용 조성물을 접촉시키는 단계; 및
2) 상기 단일클론 항체와 샘플의 반응을 검출하는 단계를 포함하는
인간을 제외한 대상체의 인플루엔자 A 바이러스 감염 여부 진단 방법.
- 제 32항에 있어서, 상기 인플루엔자 A 바이러스는 H1, H2 및 H5 서브타입으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 감염 여부 진단 방법.
- 1) 제 5항 또는 제 13항의 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체; 및
2) 용기
를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 진단용 키트.
- 1) 제 27항의 인플루엔자 A 바이러스 진단용 조성물; 및
2) 용기
를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 진단용 키트.
- 제 35항에 있어서, 상기 인플루엔자 A 바이러스는 H1, H2 및 H5 서브타입으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스 진단용 키트.
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