JP7403733B2 - インフルエンザｈａスプリットワクチンの製造方法 - Google Patents

インフルエンザｈａスプリットワクチンの製造方法 Download PDF

Info

Publication number
JP7403733B2
JP7403733B2 JP2018137952A JP2018137952A JP7403733B2 JP 7403733 B2 JP7403733 B2 JP 7403733B2 JP 2018137952 A JP2018137952 A JP 2018137952A JP 2018137952 A JP2018137952 A JP 2018137952A JP 7403733 B2 JP7403733 B2 JP 7403733B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
influenza
split vaccine
vaccine
split
lah
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2018137952A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2019043937A5 (ja
JP2019043937A (ja
Inventor
宜聖 高橋
悠 安達
学 阿戸
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
DIRECTOR-GENERAL NATIONAL INSTITUTE OF INFECTIOUS DISEASES
Original Assignee
DIRECTOR-GENERAL NATIONAL INSTITUTE OF INFECTIOUS DISEASES
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by DIRECTOR-GENERAL NATIONAL INSTITUTE OF INFECTIOUS DISEASES filed Critical DIRECTOR-GENERAL NATIONAL INSTITUTE OF INFECTIOUS DISEASES
Priority to AU2018325899A priority Critical patent/AU2018325899B2/en
Priority to KR1020207009033A priority patent/KR20200047629A/ko
Priority to EA202090587A priority patent/EA202090587A1/ru
Priority to SG11202001937TA priority patent/SG11202001937TA/en
Priority to PCT/JP2018/032537 priority patent/WO2019045090A1/ja
Priority to CN201880070955.0A priority patent/CN111372605A/zh
Priority to CA3074581A priority patent/CA3074581A1/en
Priority to EP18852584.4A priority patent/EP3679948A4/en
Priority to US16/292,065 priority patent/US11732031B2/en
Publication of JP2019043937A publication Critical patent/JP2019043937A/ja
Priority to PH12020500414A priority patent/PH12020500414A1/en
Publication of JP2019043937A5 publication Critical patent/JP2019043937A5/ja
Priority to US18/341,960 priority patent/US20230406910A1/en
Application granted granted Critical
Publication of JP7403733B2 publication Critical patent/JP7403733B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

本発明は、インフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法に関する。
現行のインフルエンザヘマグルチニン（以下、ヘマグルチニンを「HA」と記載することがある。）ワクチンは、HA抗体を誘導することで感染防御効果を発揮する。HA抗体は、球状部領域（head region）と呼ばれるウイルス膜から外側に露出した部分に結合するが、この部分はウイルス株間で最も構造変化に富む領域となる。その結果、ワクチン株と異なる抗原変異ウイルス感染に対して、HA抗体が結合できずワクチンが奏功しないケースがある。
近年、抗原変異を起こしにくい幹領域（stem region）に結合する抗体の中に、感染防御抗体が含まれることが明らかにされた(特許文献１)。ステム抗体を効率的に誘導するため、人工的な変異やリンカーを結合させることで、不安定なステム部分の安定化に成功したHAステムタンパクが開発され、ヒト臨床試験が実施されている。
しかし、実用化に向けた製造面での課題も残されており、より簡便にステム抗体を誘導可能なHAワクチン抗原の開発が期待されている。
特表２０１６－５１６０９０号公報
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、抗原変異を起こしにくいインフルエンザのHA幹領域に結合する抗体を産生する、インフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法を提供することを目的とする。
本発明にかかるHAスプリットワクチンの製造方法は、インフルエンザHAスプリットワクチンに酸性処理を施すことにより、HA幹領域のLAH(long alpha helix)に結合する抗体を産生する、抗原変異インフルエンザウイルスに対しても有効なインフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法である。
すなわち、本発明は、以下のものに関する。
［項１］
インフルエンザHAスプリットワクチンに酸性処理を施すことにより、HA幹領域のLAHに結合する抗体を産生する、インフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法。
［項２］
該インフルエンザHAスプリットワクチンが、抗原変異インフルエンザウイルスに対しても有効である、項１に記載の製造方法。
［項３］
インフルエンザHAスプリットワクチンに酸性処理を施すことにより、HA幹領域のLAHに結合する抗体を産生する、抗原変異インフルエンザウイルスに対するインフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法。
［項４］
前記酸性処理はpH4.4～5.8にて処理を行うことを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載のインフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法。
［項５］
前記インフルエンザHAスプリットワクチンはH3N2型又はH1N1型であることを特徴とする
請求項１～４のいずれかに記載のインフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法。
［項６］
HA幹領域のLAHに結合する抗体を産生する、インフルエンザHAスプリットワクチン。
［項７］
該インフルエンザHAスプリットワクチンが、抗原変異インフルエンザウイルスに対しても有効である、項６に記載のインフルエンザHAスプリットワクチン。
［項８］
該インフルエンザHAスプリットワクチンが、ＨＡ幹領域が外部に露出した形状である、項６または７に記載のインフルエンザHAスプリットワクチン。
［項９］
インフルエンザＨＡスプリットワクチン抗原のＨＡ幹領域が外部に露出した形状であることにより、ＨＡ幹領域のＬＡＨの抗原性が高められており、かつ、ＨＡ幹領域のＬＡＨに結合する抗体を産生することができる、項６～８のいずれかに記載のインフルエンザHAスプリットワクチン。
［項１０］
インフルエンザHAスプリットワクチンに酸性処理を施すことにより製造される、HA幹領域のLAHに結合する抗体を産生する、インフルエンザHAスプリットワクチン。
［項１１］
インフルエンザHAスプリットワクチンに酸性処理を施すことにより製造される、HA幹領域のLAHに結合する抗体を産生する、抗原変異インフルエンザウイルスに対しても有効なインフルエンザHAスプリットワクチン。
本発明によれば、簡易な手法により、抗原変異を起こしにくいインフルエンザのHA幹領域に結合する抗体を産生する、インフルエンザHAスプリットワクチンが得られる。そのため抗原変異インフルエンザウイルスに対しても有効なインフルエンザHAスプリットワクチンが得られる。
インフルエンザウイルスを説明する模式図である。 H3N2型の膜融合型HAスプリットワクチンを接種したマウスの血清中のLAH抗体価の上昇を示す図である。 H3N2型の膜融合型HAスプリットワクチンを接種したマウスの抗原変異株に対する交差防御能の向上を示す図である。 H1N1型の膜融合型HAスプリットワクチンを接種したマウスの血清中のLAH抗体価の上昇を示す図である。 H1N1型の膜融合型HAスプリットワクチンを接種したマウスの抗原変異株に対する交差防御能の向上を示す図である。 LAH結合性モノクローナル抗体が、現行HAスプリットワクチンよりも膜融合型HAスプリットワクチンに対して強く結合することを示す図である。
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
本実施形態にかかるインフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法では、インフルエンザHAスプリットワクチンに酸性処理を施す工程を有する。
インフルエンザHAスプリットワクチンは、エーテルで全粒子ワクチンを処理して発熱物質となる脂質成分を除いたものであり、また、免疫に必要なウイルス粒子表面のHA蛋白を密度勾配遠沈法により回収して製造するためHA蛋白が主成分となっている。
インフルエンザウイルスの表面には、スパイクタンパクという糖タンパク質が突き出ている(図１)。Ａ型インフルエンザウイルスには、HAとNA(ノイラミニダーゼ)の二種類のスパイクタンパクがあり、ウイルスが感染を起こすための役割を果たす。HAは感染しようとする細胞に結合し、ウイルスを細胞の中に取り込む役割をする。HAは頻繁に抗原変異を起こす。NAは、感染した細胞とHAの結合を切って、複製されたウイルスを細胞から放出させる役割を持つ。
インフルエンザＡ型ウイルスのHAは、球状部領域と幹領域の２つに分けられる(図１)。球状部領域は、ウイルスが標的細胞に結合するためのレセプター結合部位を含んでいる。
また幹領域は、ウイルス膜と標的細胞の細胞膜との膜融合に必要な融合ペプチド配列を含んでいる。
インフルエンザHAスプリットワクチンに酸性処理を施すことにより、HAタンパクは膜融合型と呼ばれる構造に変化する。膜融合型HAタンパクでは、抗原ステム立体構造の大きな構造変化を伴いながら、球状部領域に代わり幹領域がウイルス膜から外部に露出した形状となる。本発明者は、膜融合型HAをワクチンとして使用したとき、幹領域のLAHに結合する抗体が誘導され、この抗体が抗原変異ウイルス株への防御効果を有することをin vivoで新知見として見出し、かかる事実に基づいて本発明を完成させた。
酸性処理は、特に限定されるものではないが、例えばｐＨ3.0～6.5、好ましくは4.0～6.0、更に好ましくは4.4～5.8である。酸性処理を施すために使用される酸は、特に限定されるものではないが、例えばリン酸、クエン酸、マレイン酸等を使用することが可能である。
抗原性の違いからＡ型インフルエンザウイルスのHAは18の亜型(Ｈ１～Ｈ１８)に、NAは９の亜型(Ｎ１～Ｎ９)に分けられるが、本発明のインフルエンザHAスプリットワクチンはこれら全ての亜型を対象とすることが可能である。また本発明にかかるインフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法ではＡ型のみならず、ＨＡを有するＢ型のワクチンも製造可能である。
本発明にかかる製造方法で得られたインフルエンザHAスプリットワクチンは、変異の少ないLAHに結合する抗体を産生することから、同一のHAの亜型内であれば、抗原変異株として知られるインフルエンザウイルスに対しても交差防御が可能であり得る。さらに、LAHのアミノ酸配列が類似しているHA亜型間（例えば、H3型とH7型）では交差反応性を示しうる。
本発明にかかる製造方法で得られたインフルエンザHAスプリットワクチンは、LAH結合性モノクローナル抗体に対して、現行HAスプリットワクチンよりも強く結合することが好ましい。例えば、LAH結合性モノクローナル抗体に対して、現行HAスプリットワクチンよりも1.05倍以上、好ましくは1.1倍以上、より好ましくは1.5倍以上、更に好ましくは2倍以上強く結合することが好ましい。ここで、現行HAスプリットワクチンよりも1.05倍、1.1倍、1.5倍、または2倍以上強く結合するとは、例えば、回帰によって求めた吸光度が0.7を示した時の抗体濃度の逆数が、現行HAスプリットワクチンの抗体濃度の逆数の、それぞれ1.05倍、1.1倍、1.5倍、または2倍以上であることをいう。現行HAスプリットワクチンと比較した本発明のインフルエンザHAスプリットワクチンのLAH結合性モノクローナル抗体に対する結合性は高い方が好ましく、上限は特に限定されるものではないが、例えば1.05～200倍、1.1～150倍、1.5～100倍、2～50倍の範囲が例示される。あるいは現行HAスプリットワクチンと比較した本発明のインフルエンザHAスプリットワクチンのLAH結合性モノクローナル抗体に対する結合性の範囲は、1.05、1.1、1.5、2、3、4、および5から選択される下限値と200、150、100、50、30、および20から選択される上限値との組合せにより示されうる。LAH結合性モノクローナル抗体に対するインフルエンザHAスプリットワクチンの結合性の測定方法は特に限定されず、当業者に知られる一般的な方法で行うことができるが、例えば本願実施例の方法に従って測定することができる。
本願において、LAH結合性モノクローナル抗体とは、LAHに結合するモノクローナル抗体を意味し、その製造方法は特に限定されず、当業者に知られる一般的な方法により製造することができる。LAH結合性モノクローナル抗体に対するインフルエンザHAスプリットワクチンの結合性の測定においては、LAH結合性モノクローナル抗体は当該インフルエンザHAスプリットワクチンが由来するインフルエンザウイルスのLAHの少なくとも一部に相当するペプチドに結合することができるものであることを意味する。
本願において、現行HAスプリットワクチンとは、エーテルで全粒子ワクチンを処理して発熱物質となる脂質成分を除いたものを意味し、例えば本願実施例１の方法により製造することができる。また、現行HAスプリットワクチンは、以下の酸性処理を施す工程を有する方法により製造された本発明のインフルエンザHAスプリットワクチンに対して、酸性処理を施さずに製造されたインフルエンザHAスプリットワクチンであり得る。
本発明にかかるインフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法では、アジュバントを包含させる工程を有することが可能である。アジュバントとしては、特に限定されるものではないが、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム等のアルミニウム塩、キトサン、オリゴデオキシヌクレオチド、水中油型エマルジョン等を用いることが可能である。好ましくは水酸化アルミニウムであり、水酸化アルミニウムをアジュバントとして用いることにより、免疫原性を高めることができる。
本発明にかかる製造方法で得られたインフルエンザHAスプリットワクチンは、例えば、初回接種の後、所定期間の経過後に追加接種するように使用されることが可能である。初回接種の後、追加接種されるまでの期間は、特に限定されるものではないが、例えば20日～３年であり、好ましくは３月～２年であり、より好ましくは６月～１年である。初回接種及び追加接種のインフルエンザHAスプリットワクチンの量は、特に限定されるものではないが、１用量あたり例えば１μｇ～２００μｇであり、好ましくは１０μｇ～３０μｇであり、より好ましくは１５μｇである。１用量は例えば０．５ｍＬである。初回接種及び追加接種では、投与方法は特に限定されるものではないが、例えば経鼻、皮下、皮内、経皮、眼内、粘膜、又は、経口投与であり、好ましくは、筋肉内投与である。
本発明にかかる製造方法で得られたインフルエンザHAスプリットワクチンは、抗原変異ウイルス株への防御効果を有する。例えば、H3N2型インフルエンザウイルス粒子(A/Fujian/411/02(H3N2))から現行HAスプリットワクチンを調整し、酸性処理を施した場合、A/Fujian/411/02(H3N2)のみならず、例えば、A/Guizhou/54/89(H3N2)、A/OMS/5389/88(H3N2)、A/Beijing/32/92(H3N2)、A/England/427/88(H3N2)、A/Johannesburg/33/94(H3N2)、A/Leningrad/360/86(H3N2)、A/Mississippi/1/85(H3N2)、A/Philippines/2/82(H3N2)、A/Shangdong/9/93(H3N2)、A/Shanghai/16/89(H3N2)、A/Shanghai/24/90(H3N2)、A/Sichuan/2/87(H3N2)、A/Kitakyushyu/159/93(H3N2)、A/Akita/1/94(H3N2)、A/Panama/2007/99(H3N2)、A/Wyoming/03/03(H3N2)、A/New York/55/2004(H3N2)又はA/Hiroshima/52/2005(H3N2)等に対しても感染防御効果を有しうる。また例えばH1N1型インフルエンザウイルス粒子(A/Puerto Rico/8/34(H1N1))から現行HAスプリットワクチンを調整し、酸性処理を施した場合、A/Puerto Rico/8/34(H1N1)のみならず、例えば、A/Narita/1/09（H1N1）、A/Beijing/262/95（H1N1）、A/Brazil/11/78（H1N1）、A/Chile/1/83（H1N1）、A/New Jersey/8/76（H1N1）、A/Taiwan/1/86（H1N1）、A/Yamagata/32/89（H1N1）、A/New Caledonia/20/99（H1N1）、A/Solomon Islands/3/2006（H1N1）、A/Brisbane/59/2007（H1N1）又はA/Mexico/4108/2009（H1N1）等に対しても感染防御効果を有しうる。
1.HAスプリットワクチンの調整
リン酸緩衝生理食塩水に懸濁したH3N2型インフルエンザウイルス粒子（X31株）もしくはH1N1型インフルエンザウイルス粒子（A/Puerto Rico/8/34株）に、最終濃度が0.2%になるようTween80を添加し懸濁した。ジエチルエーテルを加えさらに懸濁し、水層とジエチルエーテル層が完全に分離するまで静置した後、ジエチルエーテル層を取り除いた。このエーテル抽出を繰り返した後、回収した水層に残存するジエチルエーテルを常圧で留去し、HAスプリットワクチンとした。
2.酸性処理
HAスプリットワクチンをリン酸緩衝生理食塩水で懸濁後、酸性処理として0.15Mクエン酸緩衝液（pH 3.5）を添加しpHを5.0にした。室温で30分静置した後、1M Tris緩衝液 (pH8.0)を加えて、pHを7.3に戻した。その後、遠心分離を行い、膜融合型HAスプリットワクチンとした。作製した膜融合型HAスプリットワクチンに、最終濃度0.05%になるようホルマリンを加えて数日静置した。
なお、現行HAスプリットワクチンの場合は、1.で調整したHAスプリットワクチンに対して酸性処理を施さない以外は上記と同様の処理を行った。
3.ELISA法によるLAH抗体価の測定
3-1.H3N2型インフルエンザワクチンの接種
BALB/cマウス（♀、6～12週令）に、H3N2型の現行HAスプリットワクチン又は膜融合型HAスプリットワクチン（10 μgワクチン + 20 μg AddaVaxアジュバント（InvivoGen）をリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、液量200 μlにする）を腹腔内接種した。初回ワクチン接種28日後に、膜融合型HAワクチン（10 μgワクチンのみをリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、液量200 μlにする）を腹腔内接種した。追加ワクチン接種から14日後以降に、ワクチンを接種したマウスより採血を行い、血清を回収した。
3-2.ELISA法による測定
下記に示す手法により、ELISA法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)にて、H3N2型の現行HAスプリットワクチン又は膜融合型HAスプリットワクチンを腹腔内接種したBALB/cマウスの血清中のLAH抗体濃度を測定した。
即ち、ステム部分の一部（long alpha helix）に相当する合成ペプチド（H3; Ac-RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENADYKDDDDKC）（配列番号１）を10 μg/mlにてリン酸緩衝生理食塩水（pH 7.3）に溶解し、96ウェルプレートに100 μlずつ添加した。4℃で一晩静置した後、リン酸緩衝生理食塩水にて各ウェルを３回洗浄し、1%牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水を150 μlずつ添加した。室温で２時間静置後、リン酸緩衝生理食塩水にて各ウェルを３回洗浄し、Tween20を0.05%と1%牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液にて段階希釈したマウス血清と、濃度既知の標準モノクローナル抗体（H3; クローン名V15-5）を各ウェルに100 μlずつ添加した。室温で２時間静置後、リン酸緩衝生理食塩水（Tween20を0.05%含む）にて各ウェルを３回洗浄し、0.05%Tween20と1%牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水にて希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体（Southern Biotech）を各ウェルに100 μlずつ添加した。室温で２時間静置後、リン酸緩衝生理食塩水（Tween20を0.05%含む）にて各ウェルを３回洗浄し、基質としてクエン酸緩衝液（pH 5.0） 60 mlにo-phenylendiamine tablet (シグマ) 30 mgと24 μlの30%過酸化水素水(30%w/w; シグマ)を加えたものを調整し、それを各ウェルに100 μlずつ添加した。発色後50 μlの2N硫酸(和光純薬工業)で反応を止め、Microplate Reader 450型(Biorad)を用いて490 nmの吸光値を測定した。
図２に示されるように、膜融合型HAスプリットワクチンを腹腔内接種したBALB/cマウスの血清中のLAH抗体価は、現行HAスプリットワクチンを腹腔内接種したBALB/cマウスの血清中のLAH抗体価よりも、有意に上昇していた。
4.抗原変異株に対する交差防御
H3N2型ウイルス感染防御実験では、ワクチン非接種マウス、又は、H3N2型の現行HAスプリットワクチン若しくは膜融合型HAスプリットワクチン接種後のマウスより回収した血清を、BALB/cマウス（♀、6～12週令）に200 μlずつ腹腔内投与した。
血清投与から3時間後、ワクチン株とは抗原性の異なる別のH3N2型インフルエンザウイルス (A/Guizhou/54/89)を5マウスlethal dose50 (50%のマウスに致死性感染をおこすウイルス量の5倍)にて麻酔下において経鼻投与することでウイルス感染を行った。
ウイルス感染から21日間、毎日マウスの体重測定及び観察を行い、体重の推移と生存率を調べた。25%の体重減少が認められたマウスが生じた場合は、安楽殺処分とした。
図３に示されるように、膜融合型HAスプリットワクチンを接種したBALB/cマウスでは、抗原性の異なる別のH3N2型インフルエンザウイルス感染後９日目から有意に生存率低下を抑制できた。
5.ELISA法によるLAH抗体価の測定
5-1.H1N1型インフルエンザウイルス粒子
C57BL/6マウス（♀、6～12週令）に、H1N1型の現行HAスプリットワクチン又は膜融合型HAスプリットワクチン（10 μgワクチン + 10 μg CpG-ODN1760をリン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、等量のFreund’s incomplete adjuvant (ROCKLAND) と混合して液量200 μlにする）を腹腔内接種した。初回ワクチン接種28日後に、膜融合型HAスプリットワクチン（初回ワクチン接種と同様に、10 μgワクチン + 10 μg CpG-ODNをリン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、等量のFreund’s incomplete adjuvant (ROCKLAND) と混合して液量200 μlにする）を腹腔内接種した。追加ワクチン接種から14日後以降に、ワクチンを接種したマウスより採血を行い、血清を回収した。
5-2.ELISA法による測定
下記に示す手法により、ELISA法にて、H1N1型の現行HAスプリットワクチン又は膜融合型HAスプリットワクチンを腹腔内接種したC57BL/6マウスの血清中のLAH抗体濃度を測定した。
ステム部分の一部（long alpha helix）に相当する合成ペプチド（H1; Ac-RIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNADYKDDDDKC）（配列番号２）を使用し、濃度既知の標準モノクローナル抗体（H1; クローン名F2）を使用した以外は、上記と同様の手法を用いた。
図４に示されるように、膜融合型HAスプリットワクチンを腹腔内接種したC57BL/6マウスの血清中のLAH抗体価は、現行HAスプリットワクチンを腹腔内接種したC57BL/6マウスの血清中のLAH抗体価よりも、有意に上昇していた。
6.抗原変異株に対する交差防御
H1N1型ウイルス感染防御実験では、ワクチン非接種マウス、又は、H1N1型の現行HAスプ
リットワクチン若しくは膜融合型HAスプリットワクチン接種後のマウスより回収した血清を、C57BL/6マウス（♀、6～12週令）に200 μlずつ腹腔内投与した。
血清投与から3時間後、ワクチン株とは抗原性の異なる別のH1N1型インフルエンザウイルス (A/Narita/1/09)を5マウスlethal dose50 (50%のマウスに致死性感染をおこすウイルス量の5倍)にて麻酔下において経鼻投与することでウイルス感染を行った。
ウイルス感染から20日間、毎日マウスの観察を行い、生存率を調べた。図５に示されるように、膜融合型HAスプリットワクチンを接種したC57BL/6マウスでは、抗原性の異なる別のH1N1型インフルエンザウイルス感染後９日目から有意に生存率低下を抑制できた。
7.LAH epitopeに対する抗体結合性
ELISA法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)により、X31株を感染させたマウスもしくはヒト末梢血より作製したLAH結合性モノクローナル抗体の、現行HAスプリットワクチンまたは膜融合型HAスプリットワクチンに対する結合を測定した。H3N2型インフルエンザウイルス（X31株）の現行HAスプリットワクチンまたは膜融合型HAスプリットワクチンをリン酸緩衝生理食塩水（pH 7.3）に溶解し、96ウェルプレートに50 μlずつ添加した。4℃で一晩静置した後、リン酸緩衝生理食塩水にて各ウェルを３回洗浄し、1%牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水を150 μlずつ添加した。室温で2時間静置後、リン酸緩衝生理食塩水（Tween20を0.05%含む）にて各ウェルを３回洗浄し、1%牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液にて段階希釈したLAH結合性のモノクローナル抗体を50μlずつ添加した。4℃で一晩静置した後、リン酸緩衝生理食塩水（Tween20を0.05%含む）にて各ウェルを3回洗浄し、0.05%Tween20と1%牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水にて希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体（Southern Biotech）を各ウェルに100μlずつ添加した。室温で２時間静置後、リン酸緩衝生理食塩水（Tween20を0.05%含む）にて各ウェルを３回洗浄し、基質としてクエン酸緩衝液（pH 5.0） 60 mlにo-phenylendiamine tablet (シグマ) 30 mgと24 μlの30%過酸化水素水(30%w/w; シグマ)を加えたものを調製し、それを各ウェルに50μlずつ添加した。発色後25μlの１mol/L硫酸(和光純薬工業)で反応を止め、Microplate Reader 450型(Biorad)を用いて490 nmの吸光値を測定した。測定した現行HAスプリットワクチンまたは膜融合型HAスプリットワクチンに対するそれぞれの吸光値より、結合性の変化を算出した。
図６に示されるように、LAH結合性モノクローナル抗体が膜融合型HAスプリットワクチンに対して現行HAスプリットワクチンよりも1.05～21倍強く結合した。これらの結果は、HAスプリットワクチンの酸性処理により、LAH epitopeに対する抗体結合性が亢進することを示すものである。
インフルエンザワクチンの製造に利用できる。
配列番号１、２：合成ペプチド

Claims (12)

  1. ホルマリン処理をしていないインフルエンザHAスプリットワクチンに酸性処理を施すことを含む、HA幹領域のLAHに結合する抗体を産生する、インフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法であって、前記酸性処理はpH3.0～6.5にて処理を行う、製造方法。
  2. 該インフルエンザHAスプリットワクチンが、抗原変異インフルエンザウイルスに対しても有効である、請求項１に記載の製造方法。
  3. ホルマリン処理をしていないインフルエンザHAスプリットワクチンに酸性処理を施すことを含む、HA幹領域のLAHに結合する抗体を産生する、抗原変異インフルエンザウイルスに対するインフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法であって、前記酸性処理はpH3.0～6.5にて処理を行う、製造方法。
  4. 前記酸性処理はpH4.0～6.0にて処理を行うことを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載のインフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法。
  5. 前記酸性処理はpH4.4～5.8にて処理を行うことを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載のインフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法。
  6. 前記インフルエンザHAスプリットワクチンはH3N2型又はH1N1型であることを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載のインフルエンザHAスプリットワクチンの製造方法。
  7. ホルマリン処理をしていないインフルエンザHAスプリットワクチンに酸性処理を施すことを含む方法により製造される、HA幹領域のLAHに結合する抗体を産生する、インフルエンザHAスプリットワクチンであって、前記酸性処理はpH3.0～6.5にて処理を行う、インフルエンザHAスプリットワクチン。
  8. ホルマリン処理をしていないインフルエンザHAスプリットワクチンに酸性処理を施すことを含む方法により製造される、HA幹領域のLAHに結合する抗体を産生する、抗原変異インフルエンザウイルスに対しても有効なインフルエンザHAスプリットワクチンであって、前記酸性処理はpH3.0～6.5にて処理を行う、インフルエンザHAスプリットワクチン。
  9. 前記酸性処理はpH4.0～6.0にて処理を行うことを特徴とする請求項７または８に記載のインフルエンザHAスプリットワクチン。
  10. 前記酸性処理はpH4.4～5.8にて処理を行うことを特徴とする請求項７～９のいずれかに記載のインフルエンザHAスプリットワクチン。
  11. 前記インフルエンザHAスプリットワクチンはH3N2型又はH1N1型であることを特徴とする請求項７～１０のいずれかに記載のインフルエンザHAスプリットワクチン。
  12. 請求項７～１１のいずれかに記載のインフルエンザＨＡスプリットワクチンを含む、インフルエンザ感染の予防剤。
JP2018137952A 2017-09-04 2018-07-23 インフルエンザｈａスプリットワクチンの製造方法 Active JP7403733B2 (ja)

Priority Applications (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2018/032537 WO2019045090A1 (ja) 2017-09-04 2018-09-03 インフルエンザｈａスプリットワクチンの製造方法
EP18852584.4A EP3679948A4 (en) 2017-09-04 2018-09-03 PROCESS FOR THE PRODUCTION OF A FRAGMENTED VACCINE AGAINST HA INFLUENZA VIRUS
SG11202001937TA SG11202001937TA (en) 2017-09-04 2018-09-03 Method for producing influenza ha split vaccine
KR1020207009033A KR20200047629A (ko) 2017-09-04 2018-09-03 인플루엔자 ha 스플릿 백신의 제조 방법
CN201880070955.0A CN111372605A (zh) 2017-09-04 2018-09-03 用于产生流感ha裂解疫苗的方法
CA3074581A CA3074581A1 (en) 2017-09-04 2018-09-03 Method for producing influenza ha split vaccine
AU2018325899A AU2018325899B2 (en) 2017-09-04 2018-09-03 Method for producing influenza HA split vaccine
EA202090587A EA202090587A1 (ru) 2017-09-04 2018-09-03 Способ получения сплит-вакцины с на гриппа
US16/292,065 US11732031B2 (en) 2017-09-04 2019-03-04 Method for producing influenza HA split vaccine
PH12020500414A PH12020500414A1 (en) 2017-09-04 2020-03-02 Method for producing influenza ha split vaccine
US18/341,960 US20230406910A1 (en) 2017-09-04 2023-06-27 Method for producing influenza ha split vaccine

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017169230 2017-09-04
JP2017169230 2017-09-04

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2019043937A JP2019043937A (ja) 2019-03-22
JP2019043937A5 JP2019043937A5 (ja) 2021-09-02
JP7403733B2 true JP7403733B2 (ja) 2023-12-25

Family

ID=65815411

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018137952A Active JP7403733B2 (ja) 2017-09-04 2018-07-23 インフルエンザｈａスプリットワクチンの製造方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US11732031B2 (ja)
EP (1) EP3679948A4 (ja)
JP (1) JP7403733B2 (ja)
KR (1) KR20200047629A (ja)
CN (1) CN111372605A (ja)
AU (1) AU2018325899B2 (ja)
CA (1) CA3074581A1 (ja)
EA (1) EA202090587A1 (ja)
PH (1) PH12020500414A1 (ja)
SG (1) SG11202001937TA (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7403733B2 (ja) 2017-09-04 2023-12-25 国立感染症研究所長 インフルエンザｈａスプリットワクチンの製造方法
EA202192398A1 (ru) * 2019-03-04 2021-11-23 Джэпэн Эз Репризентид Баи Директор Дженерал Оф Нэшнл Инститьют Оф Инфекшес Дизизис Способ приготовления сплит-вакцины против гриппа на основе гемагглютинина

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013173256A2 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Kj Biosciences, Llc New and improved influenza vaccines
JP2014513680A (ja) 2011-04-21 2014-06-05 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド ワクチンから抗原を単離し定量する方法
WO2016028776A1 (en) 2014-08-18 2016-02-25 Sanofi Pasteur Biologics Llc Alkylated influenza vaccines

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008054481A2 (en) 2006-03-24 2008-05-08 Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, National Institutes Of Health Improved inactivated influenza virus compositions
WO2008114819A1 (ja) 2007-03-20 2008-09-25 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. 新規アデニン化合物
JP5607620B2 (ja) 2008-07-25 2014-10-15 インスティテュート・フォー・リサーチ・イン・バイオメディシン 抗ａ型インフルエンザウイルス中和抗体およびその使用
WO2010047509A2 (ko) 2008-10-24 2010-04-29 아주대학교 산학협력단 친화도와 안정성이 향상된 항 ｄｒ5 항체, 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물
CN101524538A (zh) * 2009-03-26 2009-09-09 成都康华生物制品有限公司 一种流感-大流行流感二价联合疫苗及其制备方法
MX338758B (es) 2010-03-08 2016-04-29 Celltrion Inc Anticuerpos monoclonales humanos, derivados de celulas b humanas, y que tienen actividad neutralizante contra el virus de la influenza a.
KR20130075732A (ko) 2010-03-30 2013-07-05 마운트 시나이 스쿨 오브 메디슨 인플루엔자 바이러스 백신 및 이의 용도
KR20140118682A (ko) 2013-03-29 2014-10-08 (주)셀트리온 2 이상의 인플루엔자 ａ 바이러스 중화 결합 분자를 포함하는 조성물
AU2015373928B2 (en) 2014-12-31 2019-10-17 The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Novel multivalent nanoparticle-based vaccines
JP7403733B2 (ja) 2017-09-04 2023-12-25 国立感染症研究所長 インフルエンザｈａスプリットワクチンの製造方法
SG11202100706UA (en) 2018-07-23 2021-03-30 Japan As Represented By Director General Of Nat Institute Of Infectious Diseases Composition containing influenza vaccine

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014513680A (ja) 2011-04-21 2014-06-05 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド ワクチンから抗原を単離し定量する方法
WO2013173256A2 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Kj Biosciences, Llc New and improved influenza vaccines
WO2016028776A1 (en) 2014-08-18 2016-02-25 Sanofi Pasteur Biologics Llc Alkylated influenza vaccines

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BYRD L.L. et al.，Journal of Virology，2015年04月，vol.89, no.8，p.4504-4516
Curr. Opin. Immunol. (2016) vol.42, p.83-90
DOMS R.W. et al.，Journal of Virology，1986年12月，vol.60, no.3，p.833-839
長倉三郎ほか編, 岩波 理化学辞典 第５版, 2003年11月, 株式会社 岩波書店, p.327

Also Published As

Publication number Publication date
EP3679948A1 (en) 2020-07-15
SG11202001937TA (en) 2020-04-29
EA202090587A1 (ru) 2020-08-24
US11732031B2 (en) 2023-08-22
EP3679948A4 (en) 2021-04-28
JP2019043937A (ja) 2019-03-22
AU2018325899B2 (en) 2023-04-20
PH12020500414A1 (en) 2021-03-08
CN111372605A (zh) 2020-07-03
US20190345231A1 (en) 2019-11-14
KR20200047629A (ko) 2020-05-07
CA3074581A1 (en) 2019-03-07
AU2018325899A1 (en) 2020-04-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Deng et al. Double-layered protein nanoparticles induce broad protection against divergent influenza A viruses
Kim et al. Multiple heterologous M2 extracellular domains presented on virus-like particles confer broader and stronger M2 immunity than live influenza A virus infection
KR101665141B1 (ko) 인플루엔자 항원 수송 벡터 및 구조물
US11793871B2 (en) Stabilized group 2 influenza hemagglutinin stem region trimers and uses thereof
Ben-Yedidia et al. Towards an epitope-based human vaccine for influenza
Gao et al. Enhanced Influenza VLP vaccines comprising matrix-2 ectodomain and nucleoprotein epitopes protects mice from lethal challenge
JP7382634B2 (ja) 交差免疫抗原ワクチン及びその調製方法
JP2023052092A (ja) 免疫原性組成物
JP7403733B2 (ja) インフルエンザｈａスプリットワクチンの製造方法
WO2009152518A1 (en) Novel peptide adjuvant for influenza vaccination
WO2011024748A1 (ja) インフルエンザm2由来の改変ペプチドワクチン
JPWO2009123119A1 (ja) 合成ペプチドを含有する抗原薬物ビークルとこれを用いる粘膜ワクチン
WO2020179797A1 (ja) インフルエンザｈａスプリットワクチンの製造方法
US20230406910A1 (en) Method for producing influenza ha split vaccine
JP4053587B2 (ja) 不活性化レスピラトリーシンシシャルウイルスワクチン
Mardanova et al. High immunogenicity of plant-produced influenza based on the M2e peptide fused to flagellin
EA045852B1 (ru) Способ получения сплит-вакцины с ha гриппа
TW202100180A (zh) 流感ha裂解疫苗之製造方法
EA045912B1 (ru) Способ приготовления сплит-вакцины на основе гемагглютинина гриппа
JP2006513273A (ja) ウイルス感染を防止または処置するための組成物および方法

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180806

RD01 Notification of change of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426

Effective date: 20180827

RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20200430

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20200511

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20200430

A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20201125

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20201125

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210719

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210719

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220809

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20221006

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221206

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230221

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230421

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230621

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20230816

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20230912

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7403733

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

S631 Written request for registration of reclamation of domicile

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R314631

S633 Written request for registration of reclamation of name

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R314633

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350