TW202100180A - 流感ha裂解疫苗之製造方法 - Google Patents

Abstract

本發明係提供一種流感HA裂解疫苗之製造方法，係產生與不易引起抗原變異之流感HA幹區域結合之抗體。於流感HA裂解疫苗實施酸性處理。藉由實施酸性處理而得流感HA裂解疫苗，係產生與HA幹區域之LAH結合之抗體。該流感HA裂解疫苗對於抗原性不同的其他流感病毒感染具有優異防禦能力。

Description

流感HA裂解疫苗之製造方法

本發明係關於流感HA裂解疫苗之製造方法。

現行流感血球凝集素(以下稱為「HA」。)疫苗係藉由誘發HA抗體而發揮防禦感染之效果。HA抗體雖結合於被稱為球狀部區域(head region)之由病毒包膜露出於外側的部分，但該部分為病毒株間構造變化最豐富的區域。其結果存在以下情形：HA抗體無法與疫苗株不同的抗原變異病毒結合，疫苗無法奏效。

近年來已很明確：結合於不易引起抗原變異之幹區域(stem region)的抗體中包括防禦感染的抗體(專利文獻1)。為了高效率地誘發幹抗體，係藉由人工變異或使連接子(linker)結合，已開發出一種HA幹蛋白，該HA幹蛋白成功地使不穩定幹部分穩定化，並已實施人類臨床試驗。

但面向實用化而製造時存在問題，期待開發可更簡便地誘發幹抗體之HA疫苗抗原。

【先前技術文獻】

【專利文獻】

專利文獻1：日本特表2016-516090號公報。

本發明係鑑於該問題點而研究者，目的在於提供一種流感HA裂解疫苗之製造方法，係產生與流感HA之不易引起抗原變異之幹區域結合之抗體。

本發明之HA裂解疫苗之製造方法係對流感HA裂解疫苗實施酸性處理，藉此產生與HA幹區域之LAH(long alpha helix)結合之抗體，該流感HA裂解疫苗對抗原變異流感病毒亦有效。

亦即本發明係與以下所述相關。

[項1]

流感HA裂解疫苗之製造方法，係對流感HA裂解疫苗實施酸性處理，藉此產生與HA幹區域之LAH結合之抗體。

[項1a]

一種流感HA裂解疫苗之製造方法，係對未經福爾馬林處理之流感HA裂解疫苗實施酸性處理，藉此產生與HA幹區域之LAH結合之抗體。

[項1b]

一種流感HA裂解疫苗之製造方法，係具備對流感HA裂解疫苗實施酸性處理之步驟、及其後實施福爾馬林處理之步驟，產生與HA幹區域之LAH結合之抗體。

[項1c]

一種流感HA裂解疫苗之製造方法，係具備對未經福爾馬林處理之流感HA裂解疫苗實施酸性處理之步驟、及其後實施福爾馬林處理之步驟，產生與HA幹區域之LAH結合之抗體。

[項2]

如項1、1a~1c中任一項所記載之製造方法，其中該流感HA裂解疫苗對抗原變異流感病毒亦有效。

[項3]

一種流感HA裂解疫苗之製造方法，該流感HA裂解疫苗係針對抗原變異流感病毒，對流感HA裂解疫苗實施酸性處理，藉此產生與HA幹區域之LAH結合之抗體。

[項4]

如項1~3、1a~1c中任一項所記載之流感HA裂解疫苗之製造方法，其中前述酸性處理係在pH4.4~5.8下實施。

[項5]

如項1~4、1a~1c中任一項所記載之流感HA裂解疫苗之製造方法，其中前述流感HA裂解疫苗為H3N2型或H1N1型。

[項5a]

如項1~5、1a~1c中任一項所記載之流感HA裂解疫苗之製造方法，其中前述流感HA裂解疫苗為單獨HA亞型流感HA裂解疫苗。

[項5b]

如項1~5、1a~1c中任一項所記載之流感HA裂解疫苗之製造方法，其中具備混合二種或二種以上流感HA裂解疫苗抗原之步驟，該流感HA裂解疫苗抗原係藉由分別對單獨亞型流感HA裂解疫苗實施酸性處理而製得者。

[項6]

一種流感HA裂解疫苗，係產生與HA幹區域之LAH結合之抗體。

[項7]

如項6所記載之流感HA裂解疫苗，其中該流感HA裂解疫苗對抗原變異流感病毒亦有效。

[項8]

如項6或7所記載之流感HA裂解疫苗，其中該流感HA裂解疫苗的形狀為HA幹區域露出於外部。

[項9]

如項6~8中任一項所記載之流感HA裂解疫苗，其形狀為流感HA裂解疫苗抗原之HA幹區域露出於外部，藉此可提高HA幹區域之LAH之抗原性，且產生與HA幹區域之LAH結合之抗體。

[項10]

一種流感HA裂解疫苗，係藉由對流感HA裂解疫苗實施酸性處理而製造，產生與HA幹區域之LAH結合之抗體。

[項10a]

一種流感HA裂解疫苗，係藉由對未經福爾馬林處理之流感HA裂解疫苗實施酸性處理而製造，產生與HA幹區域之LAH結合之抗體。

[項10b]

一種流感HA裂解疫苗，係藉由具備對流感HA裂解疫苗實施酸性處理之步驟、及其後實施福爾馬林處理之步驟的製造製程而製造，產生與HA幹區域之LAH結合之抗體。

[項10c]

一種流感HA裂解疫苗，係藉由具備對未經福爾馬林處理之流感HA裂解疫苗實施酸性處理之步驟、及其後實施福爾馬林處 理之步驟的製造製程而製造，產生與HA幹區域之LAH結合之抗體。

[項10d]

一種流感HA裂解疫苗，係藉由對含單獨亞型之流感HA裂解疫苗實施酸性處理而製造，產生與HA幹區域之LAH結合之抗體。

[項10e]

一種流感HA裂解疫苗，係混合二種或二種以上流感HA裂解疫苗抗原之疫苗抗原，產生與HA幹區域之LAH結合之抗體，該流感HA裂解疫苗抗原分別係藉由對含單獨亞型之流感HA裂解疫苗實施酸性處理而製造。

[項10f]

如項10~10e中任一項所記載之流感HA裂解疫苗，其中該流感HA裂解疫苗對抗原變異流感病毒亦有效。

[項11]

一種流感HA裂解疫苗，係藉由對流感HA裂解疫苗實施酸性處理而製造，產生與HA幹區域之LAH結合之抗體，且對抗原變異流感病毒亦有效。

根據本發明，可以簡易手法而得流感HA裂解疫苗，係產生與流感的不易引起抗原變異之HA幹區域結合之抗體。因此可得對抗原變異流感病毒亦有效之流感HA裂解疫苗。

圖1之示意圖係說明流感病毒。

圖2係表示接種H3N2型膜融合型HA裂解疫苗之小鼠血清中LAH抗體效價的提升。

圖3係表示接種H3N2型膜融合型HA裂解疫苗之小鼠相對於抗原變異株之交叉防禦能力的提高。

圖4係表示接種H1N1型膜融合型HA裂解疫苗之小鼠血清中LAH抗體效價的提升。

圖5係表示接種H1N1型膜融合型HA裂解疫苗之小鼠相對於抗原變異株之交叉防禦能力的提高。

圖6係表示相較於現行HA裂解疫苗，LAH結合性單株抗體與膜融合型HA裂解疫苗結合得強。

圖7係表示LAH結合性單株抗體與酸性處理後實施了福爾馬林處置之膜融合型HA裂解疫苗結合得強。

圖8係表示接種H3N2型膜融合型HA裂解疫苗((pre-fix)及(post-fix))之小鼠血清中LAH抗體效價的提升。

以下參照所附圖面具體說明本發明之實施形態，但該實施形態係用以容易理解本發明原理，本發明之範圍並不限定於下述實施形態，本發明之範圍亦包括所屬技術區域中具有通常知識者適宜取代以下實施形態構成所成其他實施形態。

本實施形態之流感HA裂解疫苗之製造方法具有對流感HA裂解疫苗實施酸性處理之步驟。

流感HA裂解疫苗係以醚處理全顆粒疫苗且從經醚處理之全顆粒疫苗中去除成為發熱物質之脂質成分所得者，而且，係 以密度梯度離心法回收免疫所需病毒顆粒表面之HA蛋白而製造，故HA蛋白為主要成分。

於流感病毒表面突出有被稱為突刺蛋白之糖蛋白質(圖1)。A型流感病毒有HA與NA(神經胺酸酶)二種類突刺蛋白，其係具有引起病毒感染之作用。HA係與欲感染細胞結合，具有使病毒進入細胞中之作用。HA會頻繁引起抗原變異。NA之作用如下：切斷已感染細胞與HA的結合，並自細胞釋放複製病毒。

流感A型病毒之HA分為球狀部區域及幹區域兩個區域(圖1)。球狀部區域含有受體結合部位，該受體結合部位係用以使病毒與目標細胞結合。幹區域包括融合肽序列，其係病毒包膜與目標細胞之細胞膜進行膜融合所需。

對流感HA裂解疫苗實施酸性處理，藉此使HA蛋白變成被稱為膜融合型之構造。伴隨著抗原幹立體構造的大幅變化，膜融合型HA蛋白的形狀變成幹區域取代球狀部區域而從病毒包膜露出於外部。本案發明人以膜融合型HA作疫苗使用時，誘發了結合於幹區域之LAH之抗體，在in vivo中該抗體對抗原變異病毒株具有防禦效果，此乃新發現，根據該新發現而完成本發明。

酸性處理並無特別限定，例如pH為2.0~6.5，較佳為3.0~6.5，更佳為4.0~6.0，更加佳為4.4~5.8。具體而言，例如為：pH2.0~2.9、2.0~4.0、2.0~5.0、2.0~6.0、3.0~4.0、3.0~5.0、3.0~6.0、4.0~5.8、4.0~6.5、5.0~6.5或6.0~6.5。實施酸性處理所使用酸並無 特別限定，例如可使用磷酸、檸檬酸、馬來酸、鹽酸等。

實施酸性處理之際的溫度，例如為0℃~75℃，較佳為10℃~60℃，更佳為20℃~45℃，更加佳為25℃~42℃。具體而言，例如為0℃~20℃、5℃~25℃、10℃~30℃、15℃~35℃、20℃~37℃、25℃~37℃、30℃~50℃、38℃~55℃、38℃~60℃、38℃~65℃、38℃~70℃、38℃~75℃、40℃~55℃、40℃~60℃、40℃~65℃、40℃~70℃、40℃~75℃、42℃~55℃、42℃~60℃、42℃~65℃、42℃~70℃、42℃~75℃、45℃~55℃、45℃~60℃、45℃~65℃、45℃~70℃或45℃~75℃。作為處理時間，例如為5分鐘~120分鐘，較佳為15分鐘~60分鐘，更佳為20分鐘~45分鐘。具體而言，例如為5分鐘~60分鐘、20分鐘~60分鐘、15分鐘~120分鐘、15分鐘~45分鐘、20分鐘~60分鐘、20分鐘~120分鐘、45分鐘~120分鐘或60分鐘~120分鐘。

根據抗原性差異，A型流感病毒之HA亞型分18種(H1~H18)，NA亞型分9種(N1~N9)，但本發明之流感HA裂解疫苗能以該等所有亞型為對象。而且，利用本發明之流感HA裂解疫苗之製造方法，不僅能夠製造A型疫苗，還能夠製造具有HA之B型疫苗。

以本發明之製造方法所得流感HA裂解疫苗會產生結合於變異較少之LAH之抗體，故若在同一種HA亞型內，對於已知為抗原變異株的流感病毒也能夠實現交叉防禦。而且，在LAH之胺基酸序列相似之HA亞型間(例如H3型與H7型)亦可能顯示交 叉反應性。

本案中「單獨HA亞型即流感HA裂解疫苗」係含有自A型流感病毒之18種亞型(H1~H18)或B型流感病毒所選擇之一種HA亞型的流感HA裂解疫苗。若為單獨HA亞型，則NA亞型可相同或相異。較佳之HA亞型可舉出H1型、H3型及B型。

含有二種以上HA亞型之混合疫苗，係能夠分別對單獨HA亞型所構成流感HA裂解疫苗實施酸性處理，並混合複數種(二種或二種以上)所得流感HA裂解疫苗而製造。而且，含有二種以上HA亞型之混合疫苗，還能夠藉由對一開始便混合了二種以上HA亞型之流感HA裂解疫苗實施酸性處理來製造。作為含有複數種亞型之疫苗而接種時，較佳為含有由H1型、H3型及B型所成群組中所選擇的1~3種亞型。

較佳為，本發明之製造方法所得流感HA裂解疫苗與LAH結合性單株抗體之結合，較現行HA裂解疫苗更強。例如與LAH結合性單株抗體之結合較現行HA裂解疫苗強1.05倍以上，較佳為強1.1倍以上，更佳為強1.5倍以上，更加佳為強2倍以上。在此，較現行HA裂解疫苗強1.05倍、1.1倍、1.5倍或2倍以上，例如係意味著以迴歸所求吸光度顯示0.7時，抗體濃度倒數分別為現行HA裂解疫苗之抗體濃度倒數的1.05倍、1.1倍、1.5倍或2倍以上。與現行HA裂解疫苗相比，本發明之流感HA裂解疫苗與LAH結合性單株抗體之結合性較高，則較佳，上限並無特別限定，例如為1.05~200倍、1.1~150倍、1.5~100倍、2~50倍之範圍。或者，與現行HA裂解疫苗相比，本發明之流感HA裂解疫苗與LAH 結合性單株抗體之結合性範圍可為自1.05、1.1、1.5、2、3、4、及5所選擇下限值及自200、150、100、50、30、及20所選擇上限值的組合。流感HA裂解疫苗與LAH結合性單株抗體之結合性測量方法並無特別限定，可以所屬技術區域中具有通常知識者所知一般方法進行，例如可根據本案實施例之方法而測量。

本案中，LAH結合性單株抗體是指結合於LAH之單株抗體，其製造方法無特別限定，可藉由所屬技術區域中具有通常知識者所知一般方法而製造。測量流感HA裂解疫苗與LAH結合性單株抗體之結合性時，LAH結合性單株抗體是指可與肽結合者，該肽相當於該流感HA裂解疫苗之來源即流感病毒之LAH的至少一部分。

本案中，現行HA裂解疫苗是指以醚處理全顆粒疫苗並從已經過醚處理之全顆粒疫苗中去除成為發熱物質之脂質成分而獲得者，例如能夠藉由本案實施例1之方法而製造。而且，相對於以具有實施以下酸性處理之步驟之方法而製造之本發明之流感HA裂解疫苗而言，現行HA裂解疫苗為不實施酸性處理而製造之流感HA裂解疫苗。

製造本發明之流感HA裂解疫苗時，亦可進行福爾馬林處理。對流感HA裂解疫苗實施酸性處理時的時間點較佳為實施福爾馬林處理之前。製造本發明之流感HA裂解疫苗抗原(能夠產生與HA幹區域之LAH結合之抗體)時，對現行流感HA裂解疫苗所使用HA部分實施酸性處理並於其後實施福爾馬林處理之步驟，藉此可得流感HA裂解疫苗抗原，其產生交叉反應性抗體之 作用較強，因此作為全球性流感疫苗抗原更佳。亦即，本案中，較佳為對於以醚等處理病毒顆粒並去除脂溶劑之HA部分實施酸性處理後，再實施福爾馬林處理。

本案中，實施酸性處理前之流感HA裂解疫苗較佳為未經福爾馬林處理之裂解疫苗。

市售流感HA疫苗(商品名)係如生物學製劑基準(2004年3月30天、日本厚生勞動省告示第155號、最終改正：2018年11月30天、日本厚生勞動省告示第409號)所記載，以醚等分解病毒後，去除脂溶劑後，經過以甲醛或與其具有同等作用之物質而處理之步驟。市售流感HA疫苗(商品名)雖然為流感HA裂解疫苗，但已經實施了甲醛等處理，故較佳為不使用市售流感HA疫苗製造本發明之流感HA裂解疫苗。

對已實施過酸性處理之流感HA裂解疫苗實施福爾馬林處理時，福爾馬林處理液中福爾馬林濃度例如為0.0005v/v%~10v/v%，較佳為0.001v/v%~1v/v%，更佳為0.003v/v%~0.5v/v%，更加佳為0.005v/v%~0.1v/v%。實施福爾馬林處理的時間例如為1小時~10天。較佳為2小時~5天，更佳為12小時~3天。福爾馬林處理溫度例如為0℃~75℃。較佳為1℃~37℃，更佳為1℃~30℃。

所使用福爾馬林等級較佳為可用於醫療之等級。

本發明之流感HA裂解疫苗之製造方法可具有包含佐劑之 步驟。佐劑並無特別限定，例如可使用氫氧化鋁、磷酸鋁等鋁鹽、殼聚糖、寡聚去氧核苷酸、水中油型乳液等。較佳為氫氧化鋁，藉由使用氫氧化鋁作為佐劑而可提高免疫原性。

本發明之製造方法所得流感HA裂解疫苗例如可以在初次接種後經過特定期間後進行追加接種之方式使用。初次接種後到追加接種的期間並無特別限定，例如20日~3年，較佳為3月~2年，更佳為6月~1年。初次接種及追加接種之流感HA裂解疫苗量並無特別限定，1次用量例如為1μg~200μg，較佳為10μg~30μg，更佳為15μg。1次用量例如為0.5mL。進行初次接種及追加接種時，投入方法並無特別限定，例如為經鼻、皮下、皮內、經皮、眼內、黏膜、或經口投入，較佳為肌肉內投入。

本發明之製造方法所得流感HA裂解疫苗對抗原變異病毒株具有防禦效果。例如由H3N2型流感病毒顆粒(A/Fujian/411/02(H3N2))調製現行HA裂解疫苗並實施酸性處理時，不僅對A/Fujian/411/02(H3N2)具有防禦感染之效果，對例如A/Guizhou/54/89(H3N2)、A/OMS/5389/88(H3N2)、A/Beijing/32/92(H3N2)、A/England/427/88(H3N2)、A/Johannesburg/33/94(H3N2)、A/Leningrad/360/86(H3N2)、A/Mississippi/1/85(H3N2)、A/Philippines/2/82(H3N2)、A/Shangdong/9/93(H3N2)、A/Shanghai/16/89(H3N2)、A/Shanghai/24/90(H3N2)、A/Sichuan/2/87(H3N2)、A/Kitakyushyu/159/93(H3N2)、A/Akita/1/94(H3N2)、A/Panama/2007/99(H3N2)、A/Wyoming/03/03(H3N2)、A/New York/55/2004(H3N2)或A/Hiroshima/52/2005(H3N2)等亦具有防禦 感染之效果。而且，例如由H1N1型流感病毒顆粒(A/Puerto Rico/8/34(H1N1))調製現行HA裂解疫苗並實施酸性處理時，不僅對A/Puerto Rico/8/34(H1N1)具有防禦感染之效果，對例如A/Narita/1/09(H1N1)、A/Beijing/262/95(H1N1)、A/Brazil/11/78(H1N1)、A/Chile/1/83(H1N1)、A/New Jersey/8/76(H1N1)、A/Taiwan/1/86(H1N1)、A/Yamagata/32/89(H1N1)、A/New Caledonia/20/99(H1N1)、A/Solomon Islands/3/2006(H1N1)、A/Brisbane/59/2007(H1N1)或A/Mexico/4108/2009(H1N1)等亦具有防禦感染之效果。

【實施例】

1.調製HA裂解疫苗

於懸浮於磷酸緩衝生理食鹽水之H3N2型流感病毒顆粒(X31株)或H1N1型流感病毒顆粒(A/Puerto Rico/8/34株)以最終濃度成為0.1v/v%之方式添加Tween80並懸浮。加入二乙醚進一步懸浮，靜置至水層與二乙醚層完全分離後，去除了二乙醚層。重複該醚萃取後，以常壓蒸餾去除殘存於所回收水層之二乙醚，並以其做HA裂解疫苗。

2.酸性處理

使HA裂解疫苗懸浮於磷酸緩衝生理食鹽水後，作為酸性處理而添加0.15M檸檬酸緩衝液(pH3.5)使pH為5.0。在室溫靜置30分鐘後，加入1M Tris緩衝液(pH8.0)使pH回到7.3。其後進行離心分離，並以其做膜融合型HA裂解疫苗。於所製作膜融合型HA裂解疫苗以最終濃度成為0.05v/v%之方式加入福爾馬林並靜置數日。

需要說明的是，現行HA裂解疫苗的情形，除了不對在1.所調製HA裂解疫苗實施酸性處理以外，進行了與上述相同之處理。

3.以ELISA法測量LAH抗體效價

3-1.接種H3N2型流感疫苗

對BALB/c小鼠(雌性，6~12週大)於腹腔內接種了H3N2型現行HA裂解疫苗或膜融合型HA裂解疫苗(將10μg疫苗+10v/v% AddaVax佐劑(InvivoGen)溶解於磷酸緩衝生理食鹽水並使液量為200μl)。在初次疫苗接種28天後於腹腔內接種了膜融合型HA疫苗(僅將10μg疫苗溶解於磷酸緩衝生理食鹽水並使液量為200μl)。在追加疫苗接種14天後，對接種疫苗小鼠採血並回收了血清。

3-2.以ELISA法測量

如下所述，以ELISA法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)測量腹腔內接種H3N2型現行HA裂解疫苗或膜融合型HA裂解疫苗之BALB/c小鼠血清中之LAH抗體濃度。

亦即，將相當於幹部分之一部分(long alpha helix)之合成肽(H3；Ac-RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENADYKDDDDKC)(序列編號1)以10μg/ml溶解於磷酸緩衝生理食鹽水(pH7.3)，對96孔盤中之每個孔分別添加了100μl。以4℃靜置一夜後，以磷酸緩衝生理食鹽水清洗各孔3次， 分別添加了含有1v/v%牛血清白蛋白之磷酸緩衝生理食鹽水150μl。在室溫靜置2小時後，以磷酸緩衝生理食鹽水清洗各孔3次，以含有0.05v/v%之Tween20及1v/v%牛血清白蛋白之磷酸緩衝液階段稀釋而得到小鼠血清，分別於各孔添加100μl之該小鼠血清及濃度已知之標準單株抗體(H3；複製名V15-5)。在室溫靜置2小時後，以磷酸緩衝生理食鹽水(含有0.05v/v%之Tween20)清洗各孔3次，以含有0.05v/v%Tween20及1v/v%牛血清白蛋白之磷酸緩衝生理食鹽水稀釋而得到過氧化酶標識抗小鼠IgG抗體(Southern Biotech)，於各孔添加100μl之過氧化酶標識抗小鼠IgG抗體。在室溫靜置2小時後，以磷酸緩衝生理食鹽水(含有0.05v/v%之Tween20)清洗各孔3次，調製於作為基質之檸檬酸緩衝液(pH5.0)60ml加入o-phenylendiamine tablet(SIGMA)30mg與24μl之30%過氧化氫水(30%w/w；SIGMA)者，並於各孔分別添加100μl。顯色後以50μl之1mol/L硫酸(和光純藥工業)讓反應停止，使用Microplate Reader 450型(Biorad)測量490nm下之吸光值。

如圖2所示，相較於腹腔內接種現行HA裂解疫苗之BALB/c小鼠血清中的LAH抗體效價，於腹腔內接種膜融合型HA裂解疫苗之BALB/c小鼠血清中的LAH抗體效價有意義的提升。

4.對抗原變異株之交叉防禦

在H3N2型病毒感染防禦實驗中，將自未接種疫苗小鼠、或接種H3N2型現行HA裂解疫苗或膜融合型HA裂解疫苗後的小鼠所回收之血清，分別以200μl腹腔內投入於BALB/c小鼠(雌性，6~12週大)。

自血清投入3小時後，在麻醉狀態下，以lethal dose50(50%小鼠產生致死性感染之病毒量5倍)將抗原性與疫苗株相異之其他H3N2型流感病毒(A/Guizhou/54/89)經鼻投入給5只小鼠，藉此進行了病毒感染。

自病毒感染起21天為止這段時間內，每天進行小鼠之體重測量及觀察，分析體重變化與生存率。觀察到小鼠產生25%體重減少時，對小鼠實施安樂死。

如圖3所示，接種了膜融合型HA裂解疫苗之後的BALB/c小鼠，自抗原性相異之其他H3N2型流感病毒感染後第9天起，能夠有意義地抑制生存率降低。

5.以ELISA法測量LAH抗體效價

5-1.H1N1型流感病毒顆粒

對C57BL/6小鼠(雌性，6~12週大)於腹腔內接種了H1N1型現行HA裂解疫苗或膜融合型HA裂解疫苗(將10μg疫苗+10μg CpG-ODN1760懸浮於磷酸緩衝生理食鹽水並與等量Freund’s incomplete adjuvant(ROCKLAND)混合而為液量200μl)。初次接種疫苗28天後，於腹腔內接種了膜融合型HA裂解疫苗(與初次疫苗接種同樣地，將10μg疫苗+10μg CpG-ODN懸浮於磷酸緩衝生理食鹽水並與等量Freund’s incomplete adjuvant(ROCKLAND)混合而為液量200μl)。自追加疫苗接種起14天後，自接種疫苗小鼠採血並回收了血清。

5-2.以ELISA法測量

如下所述，以ELISA法測量了腹腔內接種H1N1型現行HA裂解疫苗或膜融合型HA裂解疫苗之C57BL/6小鼠血清中之LAH抗體濃度。

除了使用相當於幹部分之一部分(long alpha helix)之合成肽(H1；Ac-RIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNADYKDDDDKC)(序列編號2)，並使用濃度已知之標準單株抗體(H1；複製名F2)以外，係使用了與上述相同手法。

如圖4所示，相較於腹腔內接種了現行HA裂解疫苗之C57BL/6小鼠血清中之LAH抗體效價，腹腔內接種了膜融合型HA裂解疫苗之C57BL/6小鼠血清中之LAH抗體效價係有意義提升。

6.對抗原變異株之交叉防禦

在H1N1型病毒感染防禦實驗中，將自未接種疫苗小鼠或接種H1N1型現行HA裂解疫苗或膜融合型HA裂解疫苗接種後之小鼠所回收血清，分別以200μl腹腔內投入於C57BL/6小鼠(雌性，6~12週大)。

自血清投入3小時後，在麻醉下以lethal dose50((50%小鼠產生致死性感染之病毒量5倍)將抗原性與疫苗株相異之其他H1N1型流感病毒(A/Narita/1/09)經鼻投入給5只小鼠，藉此進行了病毒感染。

自病毒感染起20天內這段時間內，每天觀察小鼠並調查生存率。如圖5所示，接種了膜融合型HA裂解疫苗之C57BL/6小鼠自抗原性相異之其他H1N1型流感病毒感染後第9天起，能夠有意義抑制生存率降低。

7.相對於LAHepitope之抗體結合性

藉由ELISA法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)，測量了已感染X31株之小鼠或人類末梢血液所製作LAH結合性單株抗體(圖6中的#1~#5)相對於現行HA裂解疫苗或膜融合型HA裂解疫苗之結合。將H3N2型流感病毒(X31株)之現行HA裂解疫苗或膜融合型HA裂解疫苗溶解於磷酸緩衝生理食鹽水(pH7.3)，並於96孔盤之每個孔中分別添加了50μl。在4℃靜置一夜後，以磷酸緩衝生理食鹽水清洗各孔3次，分別添加了含有1v/v%牛血清白蛋白之磷酸緩衝生理食鹽水150μl。在室溫靜置2小時後，以磷酸緩衝生理食鹽水(含有0.05v/v%之Tween20)清洗各孔3次，分別添加了50μl之以含有1v/v%牛血清白蛋白之磷酸緩衝液階段稀釋之LAH結合性之單株抗體。在4℃靜置一夜後，以磷酸緩衝生理食鹽水(含有0.05v/v%之Tween20)清洗各孔3次，以含有0.05v/v%的Tween20及1v/v%的牛血清白蛋白之磷酸緩衝生理食鹽水稀釋而得到過氧化酶標識抗小鼠IgG抗體(Southern Biotech)，於各孔添加了100μl之過氧化酶標識抗小鼠IgG抗體。在室溫靜置2小時後，以磷酸緩衝生理食鹽水(含有0.05v/v%之Tween20)清洗各孔3次，調製出於作為基質之檸檬酸緩衝液(pH5.0)60ml加入o-phenylendiamine tablet(SIGMA)30mg與24μl之30%過氧化氫水(30%w/w；SIGMA)者，並於各孔添加50μl。顯色後以25μl之1mol/L硫酸(和光純藥工業)讓反應停止， 使用Microplate Reader 450型(Biorad)測量了490nm的吸光值。由相對於所測量現行HA裂解疫苗或膜融合型HA裂解疫苗各自的吸光值，計算了結合性變化。

如圖6所示，膜融合型HA裂解疫苗與LAH結合性單株抗體之結合，較現行HA裂解疫苗強1.05~21倍。該等結果表示藉由HA裂解疫苗之酸性處理而可促進相對於LAH epitope之抗體結合性。

8.福爾馬林處理順序對抗體結合性及抗體誘發能力的影響

8-1.調製福爾馬林前處理HA裂解疫苗

於懸浮於磷酸緩衝生理食鹽水之H3N2型流感病毒顆粒(X31株)以最終濃度成為0.1v/v%之方式添加Tween80並懸浮。添加二乙醚進一步懸浮，靜置至水層與二乙醚層完全分離後，去除二乙醚層。重複該醚萃取後，以常壓蒸餾去除殘存於所回收水層之二乙醚。以最終濃度成為0.05v/v%之方式添加福爾馬林並靜置數日，並以其作福爾馬林前處理HA裂解疫苗。

8-2.福爾馬林前處理HA裂解疫苗之酸性處理

將福爾馬林前處理HA裂解疫苗以磷酸緩衝生理食鹽水懸浮後，作為酸性處理添加了0.15M檸檬酸緩衝液(pH3.5)使pH為5.0。在室溫靜置30分鐘後，添加了1M Tris緩衝液(pH8.0)，使pH回到7.3。其後進行了離心分離。

9.相對於LAH epitope之抗體結合性

對LAH epitope之抗體結合性係實施與上述7相同操作，並 計算結合性變化。在此，單株抗體使用與圖6中的#2、#4及#5相同之抗體，及控制組使用結合於HA頭區域之單株抗體#6。

10.以ELISA法測量LAH抗體效價Tween

10-1.接種H3N2型流感疫苗

對BALB/c小鼠(雌性，6~12週大)於腹腔內接種了H3N2型現行HA裂解疫苗或膜融合型HA裂解疫苗(將10μg疫苗+10v/v% AddaVax佐劑(InvivoGen)溶解於磷酸緩衝生理食鹽水，使液量為200μl)。自接種起12天後，對接種疫苗小鼠採血並回收了血清。

10-2.以ELISA法測量

LAH抗體效價係實施與上述3-2.相同操作而測量。

如圖7所示，膜融合型HA裂解疫苗之調製步驟中，相較於實施酸性處理前之疫苗(Pre-fix)，在酸性處理後實施福爾馬林處理之疫苗(Post-fix)與LAH結合性單株抗體結合得更強。該等結果顯示以HA裂解疫苗之酸性處理促進相對於LAHepitope之抗體結合性時，實施福爾馬林處理之時間點會影響其作用，較佳為福爾馬林處理在酸性處理後。在此，圖7及圖8中，將藉由上述8.之順序在福爾馬林處理後對HA裂解疫苗實施了酸性處理之膜融合型裂解疫苗稱為「(Pre-fix)」；將藉由實施例1之順序在酸性處理後對HA裂解疫苗實施了福爾馬林處理之膜融合型裂解疫苗稱為「(Post-fix)」。

如圖8所示，相較於腹腔內接種了現行HA裂解疫苗之BALB/c小鼠血清中之LAH抗體效價，腹腔內接種了膜融合型HA 裂解疫苗之BALB/c小鼠血清中之LAH抗體效價更為提升。相較於膜融合型裂解疫苗(Pre-fix)，膜融合型HA裂解疫苗(post-fix)的LAH抗體效價更為提升。

11.HA裂解疫苗之調製

用H3N2型流感病毒顆粒(X31株)，按照上述1.所記載之方法調製HA裂解疫苗。

12.使用攪拌槽之酸性處理条件的事先檢討

於酸性處理步驟中，向磷酸緩衝生理食鹽水中添加0.15M的檸檬酸緩衝液(pH為3.5)或稀鹽酸來調節pH。利用已添加了pH指示劑之攪拌槽中檸檬酸緩衝液添加後之攪拌速度與經過了反應時間後的色調變化，測試了添加檸檬酸緩衝液後達到均勻之条件。於100mL、20L之攪拌槽中使用pH指示劑甲基紅，觀察色調在以攪拌速度100rpm、200rpm、300rpm、400rpm、500rpm添加後至10分鐘為止這段時間內之變化狀況，並以影片記錄下來。

13.酸性處理

以磷酸緩衝生理食鹽水讓HA裂解疫苗懸浮後，作為酸性處理，添加了0.15M的檸檬酸緩衝液(pH為3.5)或稀鹽酸而將pH調整為5個不同的值(2.0、3.0、4.0、5.0或6.0)。於五個溫度条件(10℃、25℃、35℃、45℃或55℃)下靜置3種時間(10分鐘、30分鐘或1小時)後，添加1M的Tris緩衝液(pH為8.0)，讓pH回到7.3。之後，進行離心分離，以其作為膜融合型HA裂解疫苗。向該膜融合型HA裂解疫苗中添加福爾馬林使最終濃度達到0.05v/v%，且 靜置數日。

需要說明的是，於現行HA裂解疫苗之情形，除了不對已按上述11.調製之HA裂解疫苗實施酸性處理以外，所實施之其它處理皆與上述相同。

14.對LAH epitope的抗體結合性

使用H3N2型流感病毒X31株，採用按照上述7.的ELISA法，檢測已感染了X31株的小鼠或用人類末梢血液製得的LAH結合性單株抗體(圖6中的#1~#5)對現行HA裂解疫苗或膜融合型HA裂解疫苗的結合狀況。

-產業利用性-

能夠用於製造流感疫苗。

【序列表】

序列編號1、2：合成肽

<110> 公益財團法人日本健康科學振興財團

<120> 流感HA裂解疫苗之製造方法

<130> H19-109TW2

<150> 108107147

<151> 2019-03-04

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 64

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> 乙醯化

<400> 1

<210> 2

<211> 64

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> 乙醯化

<400> 2

Claims (7)

1. 一種流感HA裂解疫苗之製造方法，係對未經福爾馬林處理之流感HA裂解疫苗實施酸性處理，藉此產生與HA幹區域之LAH結合之抗體。
2. 一種流感HA裂解疫苗之製造方法，係具備對流感HA裂解疫苗實施酸性處理之步驟、及其後實施福爾馬林處理之步驟，產生與HA幹區域之LAH結合之抗體。
3. 一種流感HA裂解疫苗之製造方法，係具備對未經福爾馬林處理之流感HA裂解疫苗實施酸性處理之步驟、及其後實施福爾馬林處理之步驟，產生與HA幹區域之LAH結合之抗體。
4. 一種流感HA裂解疫苗之製造方法，前述流感HA裂解疫苗係針對抗原變異流感病毒，對流感HA裂解疫苗實施酸性處理，藉此產生與HA幹區域之LAH結合之抗體。
5. 如請求項1~4中之任一項所記載之流感HA裂解疫苗之製造方法，其中

   前述酸性處理係在pH4.4~5.8下實施。
6. 如請求項1~5中之任一項所記載之流感HA裂解疫苗之製造方法，其中

   前述流感HA裂解疫苗為H3N2型或H1N1型。
7. 一種流感HA裂解疫苗，前述流感HA裂解疫苗係針對抗原變異流感病毒，前述流感HA裂解疫苗係藉由對流感HA裂解疫苗實施酸性處理而製造，產生與HA幹區域之LAH結合之抗體。

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