KR101557191B1 - 넓은 범위의 방어능력을 갖는 인플루엔자 단독 또는 보강 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 넓은 범위의 방어능력을 갖는 인플루엔자 단독 백신 또는 이를 이용한 인플루엔자 보강 백신에 관한 것이다.
본 발명의 인플루엔자 단독 백신 또는 인플루엔자 보강 백신은 다양한 혈청형의 인플루엔자 바이러스 감염에 대하여 M2e단백질에 대한 면역력을 증가시킴으로써 전국적 유행병과 같이 예측하지 못한 바이러스의 확산에 효과적으로 대처할 수 있는 광범위한 방어 능력을 가진다.

Description

넓은 범위의 방어능력을 갖는 인플루엔자 단독 또는 보강 백신{Monovalent or supplementary influenza vaccine having broad protective activity}

본 발명은 넓은 범위의 방어능력을 갖는 인플루엔자 단독 백신 또는 이를 이용한 인플루엔자 보강 백신에 관한 것이다.

인플루엔자는 인플루엔자 바이러스(Influenza virus)에 의해 사람 및 동물(조류, 돼지, 개, 말 등)의 호흡기를 통해 전파되는 호흡기성 질병이다. 사람 인플루엔자(Human influenza)의 경우 감염에 의한 매년 전 세계 10-20% 인구에서 발생한다. 또한 조류 인플루엔자(Avian Influenza)는 닭, 칠면조, 오리 및 야생 조류 등 여러 종류의 조류에 감염되며, 주로 닭과 칠면조의 가금류에 상당히 많은 피해를 주는 급성 바이러스성 전염병이다. 조류 인플루엔자는 전파가 빠르고 병원성이 다양한 질병으로 세계동물보건기구(OIE)에서 병원성에 따라 고병원성과 저병원성 조류인플루엔자로 분류하고 있다.

사람 및 동물의 인플루엔자의 원인체는 오소믹소바이러스과(Orthomyxoviridae)의 A형 인플루엔자 바이러스(Influenza virus type A)로서, A형 인플루엔자의 혈청형은 두 가지 표면 단백질인 헤마글루티닌(Hemagglutinin)과 뉴라미니다제(Neuraminidase)의 종류에 따라 구분되는 H 혈청형과 N 혈청형이 있다. 인플루엔자 바이러스의 혈청형은 17개의 H 혈청형과 9개의 N 혈청형이 있어, 각각의 H 혈청형과 N 혈청형의 조합에 의해 산술적으로 존재 가능한 인플루엔자 바이러스의 혈청형은 153가지로 나타낼 수 있다 (예: H1N1, H3N2, H5N1, H7N3, H9N2형).

사람 인플루엔자 백신의 경우 그 해에 유행할 것으로 예상되는 균주를 미리 예측하고 이를 이용하여 백신을 제작해야 한다. 따라서 유행 균주에 맞춰 백신을 매년 반복적으로 제작해야 할 뿐 아니라 실제 유행하는 균주가 백신 제작 시 사용한 균주와 일치하지 않거나, 변이가 큰 새로운 균주가 유행할 경우 기존의 백신은 효과가 현저히 낮다는 문제점을 갖고 있다. 최근 가장 좋은 예가 전 세계적으로 2009년 대유행한 신종 플루였다. 또한 조류 및 다른 동물 인플루엔자의 경우 다양한 혈청형 및 동일한 혈청형(H3, H5, H7, H9형)내 서로 다른 아형들이 존재하고 있어 기존 하나의 백신으로 다양한 아형의 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하는데 어려움이 있는 실정이다. 현재 사람의 경우 2종의 치료제가 개발되어 사용되고 있으나 공급 수량이 제한되어 있고 내성균이 발생하고 있는 실정이며, 또한 동물을 위한 치료제가 개발되어 있지 않은 실정이다. 따라서 이를 극복하기 위해 사람 및 동물에 대한 넓은 범위의 방어능력을 갖는 광범위 인플루엔자 백신을 개발하고자 많은 연구가 진행되고 있다.

인플루엔자 A 바이러스는 바이러스 표면에 M2 단백질이 존재하여 바이러스 생장에 필수적인 역할을 한다. 이 M2 단백질의 앞쪽 24개 아미노산은 바이러스 외부로 노출되어 있고(M2 세포외부 영역, M2e), 이는 인플루엔자 A 바이러스의 공통 항원으로서의 특징을 가지고 있지만 종 특이성을 나타내고 있다. 즉, 사람, 돼지, 조류 등의 M2e 단백질은 인플루엔자 바이러스 사이에서 그 구조가 유사하지만, 개체에 따라 항원성이 다르게 관찰된다. 기존 연구에서는 사람 인플루엔자 유래 M2 단백질을 이용한 바이러스 유사입자를 백신으로 제작한 후, 이를 비강접종을 하여 백신효과를 확인한 바 있지만, M2e에 대한 항체가가 높지 않았으며 다른 종 유래인플루엔자바이러스의 M2e 단백질에 반응할지 의문시되고 있다.

백신을 접종한 종의 바이러스 공격에 대한 방어능력을 높이기 위해 면역향상 조절제인 콜레라 톡신, 열 민감성 엔도톡신 유도체, 사포닌 QS21, 프로인트 항원보강제, 박테리아 단백질 등이 사용되고 있다. 하지만, 이들의 사용은 임상에서 체중감소를 동반한 부작용을 보이고 있는 실정이며, 혈청형이 다른 인플루엔자 바이러스의 공격에 대해서는 심한 체중 감소 및 높은 치사율이 관찰되고 있다. 또한 이러한 면역향상 조절제는 안정성의 문제로 사람에게 사용이 어렵다.

상기와 같은 문제점들을 검토해 볼 때, 기존의 M2 백신은 서브타입 간에 교차 방어능은 있으나, 이 자체만으로 충분히 방어능력이 형성될 수 없으며 항체 형성 역시 매우 낮은 효율을 나타내고 있음을 알 수 있다.

따라서 기존의 백신에 비해 면역력이 높고 또한 예측하지 못한 인플루엔자 바이러스의 발생에 효과적으로 대처할 수 있는 광범위 교차 방어능력을 갖는 백신의 개발이 요구되고 있다.

KR 10-2010-0051320, 2010.05.31 KR 10-2010-7021840, 2010.09.30

본 발명은 다양한 혈청형의 인플루엔자 바이러스 감염을 효과적으로 예방할 수 있는 넓은 범위의 교차방어능력을 가지는 단독 백신 또는 보강 백신을 제공하고자 한다.

본 발명자들은 다양한 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하고자 노력하였다. 이에 따라, 각 종 특이성에 적합한 다양한 M2e 유전자를 중첩시키고, 그 발현양을 증가시키고자 특정 유전자의 삽입 및 치환을 통해 바이러스 유사 입자 내 다중 중첩 M2e단백질의 발현이 증가된 바이러스 유사입자(M2e5x Virus like particle, VLP)를 제조하였다. 또한, 이렇게 제조된 바이러스 유사입자를 이용하여 인플루엔자 단독 백신 또는 시판 중인 사람 인플루엔자 백신과 혼합된 인플루엔자 보강 백신으로 마우스 근육에 접종함으로서 혈액 내 M2e 단백질 및 다양한 인플루엔자 바이러스에 대한 항체 수치를 확인하였다. 이들을 이용하여 마우스에 인플루엔자 감염 실험을 진행한 결과, 인플루엔자 단독 백신과 인플루엔자 보강 백신 모두 마우스에서 다양한 인플루엔자에 대해 뛰어난 방어 효과를 보이는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명자들은 상기 중첩 M2e5x VLP 백신이 다양한 혈청형의 인플루엔자 바이러스 감염에 대해 방어효과를 나타내는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 인간 유래 M2e, 돼지 유래 M2e 및 조류 유래 M2e로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질이 중첩된 재조합 M2e 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한 중첩된 종 특이적 M2e 단백질을 포함하는 바이러스 유사입자(VLP)를 제공한다.

본 발명은 또한 중첩된 종 특이적 M2e 단백질을 포함하는 바이러스 유사입자(VLP)를 함유하는 인플루엔자 단독 백신을 제공한다.

본 발명은 또한 중첩된 종 특이적 M2e 단백질을 포함하는 바이러스 유사입자(VLP); 및 불활성화 바이러스 백신, 약독화 바이러스 백신, 서브 유닛 백신 또는 이들의 혼합물을 포함하는 교차 방어 능력이 향상된 인플루엔자 바이러스 보강 백신을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 인플루엔자 바이러스 단독 백신을 함유하는, 교차 방어 기능을 갖는 인플루엔자 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 인플루엔자 바이러스 보강 백신을 함유하는, 교차 방어 기능을 갖는 인플루엔자 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 중첩된 종 특이적 M2e 단백질을 포함하는 바이러스 유사입자(VLP)를 제조하는 방법으로써,

(a) 하나 이상의 종 특이적 M2e 단백질을 포함하는 재조합 DNA 분자를 제조하는 단계;

(b) 숙주세포를 하나 이상의 재조합 DNA 분자로 형질감염, 감염 또는 형질전환시키고, 단백질의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하는 단계;

(c) 배양 상층액으로부터 VLP를 정제하는 단계를 포함하는,

중첩된 종 특이적 M2e 단백질을 포함하는 바이러스 유사입자(VLP)를 제조하는 방법을 제공한다.

본발명은 인간 유래 M2e, 돼지 유래 M2e 및 조류 유래 M2e로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질이 중첩된 재조합 M2e 단백질을 제공한다.

본 명세서에서, M2 단백질은 인플루엔자 바이러스의 입자 표면에 존재하며, 바이러스 성장에 필수적인 역할을 하여 서로 다른 아형의 인플루엔자 바이러스 간에 동일한 항원성을 지니고 있다. 인플루엔자 바이러스 M2 단백질은 4분자체로 이루어진 3형 막단백질의 일종이다. M2 단백질은 바이러스가 세포에 감염되었을 때 바이러스 입자 내부로 수소 이온을 공급하는 통로역할을 한다. 바이러스가 증식하는 과정 중에 세포 내에서 발현된 M2 단백질은 세포의 표면으로 이동하여 바이러스 조립과정에 참여하게 된다. 이때 M2 단백질에 대한 중화항체는 세포표면에 위치한 M2 단백질과 반응할 수 있으나 기존의 연구에 따르면 외부로 돌출되어 있는 단백질 부위가 작아 충분한 면역원성을 확보하기 어렵고, 다른 바이러스 단백질 (HA, NA)들이 세포 표면에 다수 존재하여 M2 단백질에 대한 중화항체만으로는 바이러스 감염을 방어하기에 충분하지 않음이 밝혀졌으며 최근에는 이를 극복하기 위한 다수의 연구가 이뤄지고 있다.

야생형 M2 단백질은 세포 밖 돌출 부위 (an amino-terminal extracellular domain: M2e), 막투과 부위 (Transmembrane domain: TM) 그리고 세포 안 말단부위 (cytoplasmic domain: CT)의 3개의 구조적 도메인으로 구성되며 각각 24, 19, 54개의 아미노산으로 이루어져 있다.

M2e 단백질은 인플루엔자 바이러스의 공통 항원으로서의 특징을 가지고 있지만 종 특이성을 나타내고 있다. 즉, 사람, 돼지, 조류 등의 M2e 단백질은 인플루엔자 바이러스 사이에서 그 구조가 유사하지만, 개체에 따라 항원성은 다른 특징을 보인다.

본 발명의 중첩된 M2e 단백질은 M2e의 외부 돌출범위를 높이기 위하여 M2e 부분을 중첩시켜 기존 야생형 M2 세포 밖 돌출부위보다 긴 세포 밖 돌출부위를 가진다.

즉, 면역원성이 높은 본 발명의 중첩된 M2e 단백질은 중첩에 의해 긴 세포 밖 돌출 부위를 가지고 있으며, M2e5x (5x는 5개의 M2e 단백질이 중첩됨을 의미한다.) 단백질의 예시적인 구조는 도 1(A)에 나타낸 바와 같다.

도 1(A)에 나타낸 바와 같이, 곤충세포에서 발현량을 증가시키기 위한 Melittin signal peptide가 N-말단부위, 다른 4종이 중첩된 5개의 M2e 도메인(M2e5x), 각 M2e 도메인 사이에 단백질 3, 4차 구조를 안정화 시키기 위한 7개의 아미노산으로 이루어진 연결부위(L), 세포 표면으로 노출된 다중융합 단백질 (GCN4), HA단백질의 막투과부위 (Transmembrane domain: TM) 및 C-말단부위 (cytoplasmic tail domain: CT)를 가지고 있다.

보다 상세하게, 곤충세포에서 발현량을 증가시키기 위한 melittin signal peptide를 N-말단부분에 연결하고 이에 세포표면으로 노출될 서로 다른 4종 M2e 단백질 5 도메인을 병렬로 연결하며, 다음으로 바이러스 유사 입자 내 발현을 증가시키고자 다중융합단백질 (GCN4)을 연결하며, 마지막으로 인플루엔자 HA단백질의 막투과부위 (transmembrane) 및 C-말단부위를 연결하여 재조합 단백질을 구성한다. 특히, M2e5x 단백질 3, 4차 구조의 형성이 잘 이루어질 수 있도록 M2e의 각 도메인 사이에 연결부위(L)를 포함한다. 상기 M2e 단백질은 다양한 종에 대한 M2e 단백질을 사용할 수 있으며, 예를 들어, hM2e (인간), sM2e (돼지), a1M2e, a2M2e (조류) 등이 사용될 수 있다. 바람직하게는 서열번호 25 내지 29의 M2e 단백질들을 사용할 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 이들을 순차적으로 병렬로 연결시켜 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 중첩 M2e단백질의 제조방법은 당업자의 기술 수준 범위 내에 있는 것이며, 상기 구조는 예시적인 구조에 불과할 뿐, 이에 국한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 중첩된 종 특이적 M2e 단백질을 포함하는 바이러스 유사입자(VLP)를 제공한다.

본 명세서에서, "바이러스 유사입자" 또는 "VLP"는 하나 이상의 바이러스 구조 단백질을 포함하며, 대표적으로 표면 단백질 (envelope protein)과 매트릭스 단백질(matrix protein)을 함유하는 반면, 바이러스의 유전물질은 함유하지 않는다. 이러한 VLP는 당 분야에 공지의 알려진 방법으로 제조할 수 있다. 예컨대, VLP의 조립은 해당 구조단백질을 암호화하는 재조합 DNA 분자를 이용하여 적당한 숙주세포에 형질전환시킨 후 배양하면 세포 안에서 발현된 구조단백질이 세포 표면에서 조립된 후 배양상층액으로 배출되는 과정을 거친다. 이 과정 중에 VLP에 포함된 표면단백질은 고정화 과정을 거치지 않고 자연 그대로의 형태를 유지하고 있어 바이러스와 유사한 형태를 지니고 있어 체내에서 바이러스에 대한 목적하는 면역반응을 도출할 수 있다.

VLP는 체내에서 항원으로 작용하며 수상돌기세포(dendritic cells)와 같은 항원 표지 세포와의 반응을 통해 T 또는 B 면역 세포에 항원을 표지하게 된다. VLP는 본래의 바이러스와 유사한 구조를 갖고 있으나 유전물질은 갖고 있지 않아 증식이 불가능하여 백신과 같은 용도로 사용함에 있어 안전성을 기대할 수 있다. VLP의 표면에 삽입된 바이러스 표면단백질은 순수하게 분리된 재조합단백질에 비해 높은 항원성을 갖고 있으며 효과적인 중화항체를 형성할 수 있다. VLP를 이용한 백신의 대표적인 예로 글락소스미스클라인(GSK) 에서 생산하고 있는 human papilloma virus type (HPV-16) L1 백신을 들 수 있다.

일반적으로 바이러스 단백질의 유전자 염기서열과 해당하는 아미노산 서열은 미국 유전자정보데이터베이스 (National Center for Biotechnology Information: NCBI) 에서 확보할 수 있으며, 바이러스 단백질의 변이체나 상동성을 갖는 유사단백질을 VLP에 삽입하여 더 좋은 면역원성을 확보할 수 있다.

목적하는 VLP는 여러 가지 단백질 발현시스템을 이용하여 제작할 수 있으며 대표적인 것으로 효모 발현시스템, 베큘로바이러스 발현시스템, 변형된 재조합 폭스바이러스 발현시스템, 재조합 수포성구내염 바이러스 발현시스템 (Vesicular Stomatitis Virus: VSV), 재조합 아데노바이러스 발현시스템 등이 있다.

통상적으로 VLP는 바이러스의 구조 단백질 및 표면 단백질 발현벡터와 추가적으로 면역보강물질의 발현벡터를 숙주세포 내로 형질전환시켜 제조된다. 이때 사용되는 숙주세포로는 곤충세포 (Spodoptera frugiperda Sf 9 and Sf21cells), 고등동물세포 (EL4 cells and HeLa cells) 등이 사용되나 여기에 국한되지는 않는다. 바이러스 단백질 및 면역보강물질을 발현시키는 벡터는 하나 또는 둘 이상의 벡터가 사용될 수 있다.

VLP 기술은 이미 연구되어 공지되었으며, 일반적으로 연구 및 백신 생산을 위해 많이 사용되는 방법이다. 이러한 관련 문헌의 예로는 [Kang et al., Influenza vaccines based on virus-like particles. Virus Res;143:140-6, 2009], [Kang et al., Influenza virus-like particles as pandemic vaccines. Curr Top Microbiol Immunol 2009; 333:269-89] 등이 있다.

이러한 VLP 기반 백신은 살아있는 복제가능한 바이러스와 같은 면역효능을 지닌 것으로 알려져 있다. 즉, 바이러스 유사입자는 면역 세포를 효과적으로 활성화시키는 능력을 갖고 있어 높은 항체형성 유도와 효과적인 보호면역을 유도한다 (Song JM, et al., Protective immunity against H5N1 influenza virus by a single dose vaccination with virus-like particles. Virology 405: 165-175, (2010); Sailaja G et al., Human immunodeficiency virus-like particles activate multiple types of immune cells. Virology 362: 331-341, (2007)).

이렇게 제조된 바이러스 유사입자는 면역 세포를 효과적으로 활성화시키는 능력을 갖고 있어 높은 항체 형성 유도와 효과적인 보호면역을 유도한다. 즉, 바이러스 단백질의 변이체나 상동성을 갖는 유사 단백질을 기존 유전자에 삽입 및 치환함으로써 서로 다른 면역원성을 보강할 수 있다. 또한, 인플루엔자에 대한 교차 방어 능력이 향상된 것으로 볼 수 있다.

본 명세서에서, 중첩된 종 특이적 M2e 단백질을 포함하는 바이러스 유사입자(VLP)는, 중첩된 종 특이적 M2e 단백질들을 통상의 VLP 기반 백신 제조방법으로 제조한다.

상기 중첩된 종 특이적 M2e 단백질들은 인간 유래 M2e, 돼지 유래 M2e 및 조류 유래 M2e로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함한다. 바람직하게는 서열번호 25 내지 29의 M2e 단백질을 순차적으로 연결부위(L)를 통해 연결할 수 있다. 보다 더 바람직하게는 중첩된 M2e 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 M2e VLP는 서로 다른 중첩 M2e 단백질을 포함하는 바이러스 유사입자 (M2e VLP) 백신을 뜻하며, 바람직하게 본발명의 M2e VLP는 5개의 M2e 유전자(M2e5x)가 중첩되어 있다.

바이러스 유사입자는 하나 이상의 바이러스 구조 단백질, 즉 표면 단백질 (envelope protein)과 중첩의 M2e 단백질을 함유하는 반면, 바이러스의 유전물질은 함유하지 않는다. 이러한 바이러스 유사 입자는 당 분야에 공지의 알려진 방법으로 제조할 수 있다. 예컨대, 바이러스 유사 입자의 조립은 해당 구조단백질을 암호화하는 재조합 DNA 분자를 이용하여 적절한 숙주세포에 형질전환 시킨 후 이를 배양하여 세포 안에서 발현된 구조 단백질이 세포 표면에서 조립되어 배양 상층액으로 배출되는 과정을 거침으로써 이루어진다. 이 과정 중에 바이러스 유사입자에 포함된 중첩 M2 표면단백질은 자연 그대로의 형태를 유지하여 바이러스와 유사한 형태를 지니고 있기 때문에, 체내에서 바이러스에 대한 면역반응을 도출할 수 있다.

본 발명의 M2e5x 바이러스 유사입자 (M2e5x VLP)는 인플루엔자 바이러스의 구조단백질(M1) 및 5개의 M2e 단백질이 중첩된 M2e5x 표면 단백질 유전자를 숙주세포 내로 형질전환시켜 제조된다.

또한, 본 발명은 상기 중첩된 종 특이적 M2e 단백질을 포함하는 바이러스 유사입자(VLP)를 함유하는 인플루엔자 단독 백신을 제공한다. 본 발명의 인플루엔자 단독 백신은 다양한 인플루엔자를 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명은 중첩된 종 특이적 M2e 단백질을 포함하는 바이러스 유사입자(VLP); 및 불활성화 바이러스 백신, 약독화 바이러스 백신, 서브 유닛 백신 또는 이들의 혼합물을 포함하는 교차 방어 능력이 향상된 인플루엔자 바이러스 보강 백신을 제공한다.

본 발명의 보강 백신은 단독 인플루엔자 백신 및 기존의 사람을 비롯한 다양한 인플루엔자 백신에 혼합된 여러 혈청형의 인플루엔자 바이러스에 대한 광범위 방어 효능을 나타내는 인플루엔자 보강 백신이다. 예컨대 본 발명 인플루엔자 바이러스 보강 백신과 혼합 투여되는 사람 인플루엔자 백신은 2009년 전 세계적으로 유행되었던 인플루엔자 바이러스(A/California/04/09) 백신으로서 이는 계면활성제를 사용하여 바이러스 입자를 파괴한 스플릿 백신이다. 인플루엔자 백신은 불활성화된 전체 인플루엔자 바이러스 백신 혹은 계면활성제를 사용해서 바이러스입자를 파괴한 스플릿 백신, 또는 약독화 인플루엔자 백신으로 헤마글루티닌에 대한 항체형성을 통해 숙주의 보호능력을 부여한다. 따라서 보호 기능은 백신 균주의 혈청형에 한정되어 있다. 현재 시판되고 있는 계절형 인플루엔자 백신은 식품의약품안전청 (Food and Drug Administration: FDA)의 허가를 받아 매년 백신균주로 지정된 H3N2 형과 H1N1형 그리고 B형, 총 3종의 균주가 혼합된 삼가(Trivalent) 불활성화 백신이다. 그리고 또 다른 불활성화 백신으로는 Green Flu-S(Green Cross), AGRIFLU (Novartis), FLUZONE (Sanofi Pasteur), AFLURIA (CS Limited), FLULAVAL (ID Biomedical Corporation of Quebec), FLUARIX (GlaxoSmithKline), FLUVIRIN (Novartis) 등이 있다.

60 여년 동안 인플루엔자 바이러스에 대한 백신을 접종하고 있지만, 매년 변이가 있는 혹은 변이가 예상되는 균주에 대해 새로운 균주의 백신을 새로이 제조해야 하는 단점이 있으며, 최근 동물유래 다른 혈청형의 인플루엔자 바이러스에 대한 감염의 위험성이 커지고 있어, 본 발명에서는 이러한 문제점을 해결하는 인플루엔자 보강 백신을 제공한다.

본 발명의 중첩된 M2e 항원 백신 (M2e5x VLP)을 기존 인플루엔자 백신에 보강함으로써, 하나의 혈청형의 헤마글루티닌 항체에 의존하는 기존 사람 인플루엔자 백신에 보강 접종이 가능하다. 따라서, 본 발명에서는 변이가 많은 헤마글루티닌 항원에 바탕을 둔 다양한 형태의 백신이 아닌 각 종에 특이적인 M2e 단백질을 다양하게 중첩시켜 M2e5x VLP를 제작하였으며, 이를 이용한 단독 및 기존 사람 인플루엔자 백신에 첨가된 보강 인플루엔자 백신을 제작함으로써 기존의 백신이 가지고 있던 문제점들을 해결할 수 있다.

본 발명의 인플루엔자 보강 백신은 추가적으로 면역향상 보조제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역향상 보조제로는 플라젤린, TLR 작동제(Toll-like receptor ligands), 사이토카인, 알럼(alum adjuvant) 등이 사용될 수 있다. 면역향상제(adjuvants)는 백신과 함께 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여 양으로 제제화하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 중첩된 종 특이적 M2e 단백질을 포함하는 바이러스 유사입자(VLP)를 포함하는, 교차 방어 기능을 갖는 인플루엔자 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 다양한 인플루엔자에 대하여 높은 교차 방어 능력을 가짐으로써, 다양한 인플루엔자를 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 인플루엔자 바이러스 보강 백신을 함유하는, 교차 방어 기능을 갖는 인플루엔자 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 다양한 인플루엔자에 대하여 높은 교차 방어 능력을 가짐으로써, 다양한 인플루엔자를 예방할 수 있다.

본 발명의 인플루엔자 단독 백신을 포함하는 인플루엔자 예방 또는 치료용 조성물, 또는 인플루엔자 보강 백신을 포함하는 인플루엔자 예방 또는 치료용 조성물 내 유효성분의 양은 개체에 따라 차이가 있으며 이는 종, 나이, 체중, 일반적인 건강상태 그리고 특히 접종하는 경로에 따라 적절히 선택되어야 한다.

일반적으로 인플루엔자 단독 백신의 경우, 성인에게 1일 체중 1kg 당 중첩된 M2e 항원 백신의 양 0.01-45mg의 양으로 1회 내지 수회 나누어 투여할 수 있다. 인플루엔자 보강 백신의 경우, 성인에게 1일 체중 1kg 당 중첩된 M2e 항원 백신의 양0.01-45mg 및 불활성화 또는 약독화 인플루엔자 백신 0.001-45mg의 양으로 1회 내지 수회 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 백신은 비경구 또는 경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 근육주사, 피하주사, 정맥주사, 미세바늘주사 및 비강스프레이 방식에 의한다. 적절한 투여경로는 당업자가 용이하게 채택할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 백신은 근육주사 또는 미세바늘주사를 통해 접종이 되어야 한다.

본 발명의 백신의 적용대상이 되는 환자 또는 대상체는 동물이다. 포유동물 및 새, 특히 가금류는 백신 접종을 위해 적합한 대상이다. 바람직하게 환자는 사람이다. 환자는 본 발명의 백신의 접종에 응답하여 면역 반응을 생성시킬 수 있는 임의의 연령일수 있다. 생성된 면역 반응은 인플루엔자 바이러스의 감염에 의해 발병된 질환 및 쇠약 증상으로부터 완전히 또는 부분적으로 보호해줄 수 있다.

투여 시점은 기술분야에 널리 공지된 인자에 의존한다. 예컨대, 초기 투여 후, 이어서 1회 이상의 부스터 용량을 투여하여 항체 역가를 유지할 수 있다. 투여 섭생의 예는 제1일 첫번째 투여후 1 또는 2개월에 2번째 투여, 이후 4, 6 또는 12개월에 3번째 투여하고, 추가의 부스터 투여는 필요에 따라 긴 투여 시점을 두고 투여될 수 있다.

본 발명의 인플루엔자 단독 백신 또는 인플루엔자 보강 백신은 다양한 혈청형의 인플루엔자 바이러스 감염에 대하여 M2e단백질에 대한 면역력을 증가시킴으로써 전국적 유행병과 같이 예측하지 못한 바이러스의 확산에 효과적으로 대처할 수 있는 광범위한 방어 능력을 가진다.

도 1은 본 발명에서 제조된 M2e5x 단백질의 구조 및 생성된 단백질을 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 2는 본 발명에서 개발된 중첩 M2e5x VLP 단독 백신 및 기존 개발된 야생형 M2 VLP(M2WT VLP)를 접종한 후 채취된 혈청을 ELISA 법을 통해 비교 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 중첩 M2e5x VLP를 근육접종 한 후 A/Philippines/2/82, H3N2, 또는 A/California/04/09, H1N1 인플루엔자 바이러스를 공격접종하여 체중변화 및 생존율을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 중첩 M2e5x VLP를 2차 근육접종 한 후 채취한 혈청과 바이러스(A/PR/8/34, H1N1 또는 A/Vietnam/1203/2004, H5N1)를 혼합한 후 Naive 마우스에 비강접종하여 체중변화 및 생존율을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 중첩 M2e5x VLP를 2차 근육접종 한 후 H3N2 A/Philippines 바이러스로 공격접종 한 후 5일째 채취된 폐 조직에서 바이러스 함량을 확인한 도이다.
도 6은 중첩 M2e5x VLP 백신 10ug을 4주 간격으로 1차 및 2차 근육 접종한지 8개월 후, 채취한 혈액에서 M2e 펩타이드 및 인플루엔자 바이러스에 대한 반응성을 ELISA법을 통해 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 7은 중첩 M2e5x VLP를 근육접종한지 8개월 후, 바이러스(A/Philippines/2/82, H3N2)를 공격접종하여 체중변화 및 생존율을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 중첩 M2e5x VLP를 2차 근육 접종한지 8개월 후 채취한 혈청과 바이러스(A/PR/8/34, H1N1 또는 A/Vietnam/1203/2004, H5N1)를 혼합한 후 Naive 마우스에 비강접종 후 관찰된 체중변화 및 생존율을 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명에서 개발된 M2e5x VLP백신 접종 혈청 또는 기존 발표된 사람 유래 중첩 4.M2e-tFliC VLP백신 접종 혈청과 2009년 유행한 돼지 유래 인플루엔자 바이러스를 이용한 체중변화 및 생존율 비교를 나타낸 도이다.
도 10은 2009 플루 스플릿 사람 백신(Green Flu-S, 0.24HAug, 녹십자) 및 2009 플루 스플릿 사람 백신(0.24HAug)에 중첩 M2e5x VLP 백신 10ug을 보강한 백신으로 1차 및 2차 근육접종 후 채취한 혈액에서 M2e 펩타이드 및 인플루엔자 바이러스에 대한 반응성을 ELISA법을 통해 확인한 도이다.
도 11은 2009 플루 스플릿 사람 백신(Green Flu-S, 0.24HAug) 및 2009 플루 스플릿사람 백신 (0.24HAug)에 중첩 M2e5x VLP 백신 10ug을 보강한 백신으로 1차 및 2차 근육접종 후 바이러스(A/Philippines/2/82, H3N2 또는 A/Vietnam/1203/2004, H5N1)를 공격접종하여 체중변화 및 생존율을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 2009 플루 스플릿 사람 백신(Green Flu-S, 0.24HAug) 및 2009 플루 스플릿사람 백신(0.24HAug)에 중첩 M2e5x VLP 백신 10ug을 보강한 백신으로 1차 및 2차 근육접종 후 H3N2 A/Philippines 바이러스로 공격접종 한 후 5일째 채취된 폐 조직에서 바이러스 함량을 확인한 도이다.
도 13은 2009 플루 스플릿 사람 백신(Green Flu-S, 0.24HAug) 및 2009 플루 스플릿사람 백신(0.24HAug)에 중첩 M2e5x VLP 백신접종 12개월후의 항지속능 및 방어능에 대한 도이다.
도 14는 2009 플루 스플릿 사람 백신(0.3HAug, Novartis) 및 2009 플루 스플릿 사람 백신 (0.3HAug, Novartis)에 중첩 M2e5x VLP 백신 10ug 보강백신을 마이크로니들(MN)에 코팅하여 1차 및 2차 피부 접종 후 채취한 혈액에서 M2e 펩타이드 및 인플루엔자 바이러스에 대한 반응성을 ELISA법을 통해 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 15는 2009 플루 스플릿 사람 백신(0.3HAug, Novartis) 및 2009 플루스플릿 사람 백신 (0.3HAug, Novartis)에 중첩 M2e5x VLP 백신 10ug 보강 백신을 각각 마이크로니들(Microneedle, MN)에 코팅하여 1차 및 2차 피부접종 후 H3N2형 인플루엔자 바이러스(A/Philippines/2/82)를 공격접종 하여 체중변화 및 생존율을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 2009 약독화 백신 [att.NL virus/2009, approximately 10⁵tissue culture infective dose (TCID) per mouse, att.NLvirus/2009obtained from Dr.Daniel R. Perez (University of Maryland, USA)] 또는 이 약독화 백신에 M2e5x VLP 백신을 보강 백신으로 사용하여, 4주 간격으로 1차 및 2차 백신 접종 후 M2e 펩타이드에 대한 항체반응 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 중첩 M2e5x VLP백신 접종 경로에 따른 항체형성 및 방어능을 확인한 도이다.
도 18은 2009 플루 스플릿 사람 백신(0.3HAug, Novartis) 및 2009 플루 스플릿 사람 백신(0.3HAug)에 보강백신으로 중첩 M2e5x VLP 백신을 사용하여, 피부 접종 후의 항체형성 및 방어능에 대한 도이다.
도 19는 2009 플루 스플릿 사람 백신 (0.24HAug, Green Cross)을 4주 간격으로 1차 및 2차 백신 근육 접종 후 중첩 M2e5x VLP 백신 10ug을 4주 간격으로 1차 및 2차 근육 접종하고 인플루엔자 바이러스 (A/Philippines/2/82, H3N2)로 공격 접종하여 체중변화 및 생존율을 확인한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 제조예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 제조예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<제조예 1> 중첩 M2 세포 외부(M2e5x) 단백질을 암호화하는 DNA의 디자인 및 제작

중첩 M2 세포 외부(M2e5x) 단백질을 암호화하는 DNA를 디자인하고 제작하였다.

사람, 돼지 및 조류 유래 세포외부 M2 단백질(M2e)이 중첩되어 결합된 구조로서, 각 M2 단백질(M2e) 영역 사이에 최적의 구조형성이 이루어지도록 연결부위(L)를 삽입하였다. 또한, VLP 내 M2e5x 단백질의 함량을 증가시키고자 M2e 단백질의 자연구조 형성에 도움을 주는 다중융합단백질인 Leucine zipper motif (GCN4) 및 인플루엔자 A/PR/8(H1N1) 바이러스의 HA 단백질의 막투과 부위(transmembrane)와 세포질 말단부위로 이루어지게 제작한 M2e5x DNA를 합성하였으며, 중첩된 M2e5x 단백질 발현을 위해 상기 디자인된 재조합 M2e5x 단백질을 암호화하는 DNA유전자를 다음과 같이 제작하였다.

종 특이적인 M2e 단백질 및 상기 중첩 융합 M2e5x 단백질의 전장 서열을 암호화하는 DNA를 먼저 아미노산 서열에 따라서 곤충세포 혹은 동물세포에서 최적 발현을 위해 코돈 최적화 DNA 서열을 작성하였다. 이를 서열번호 1에 나타내었으며, 이에 대응하는 아미노산 서열을 서열번호 2에 나타내었다. 코돈 최적화 과정에서 중첩의 융합 M2e 단백질의 전장 서열 DNA는 DNA 합성전문회사인 <GeneScript>(http://www.genscript.com)에서 주문하였다. 중첩 융합 M2e 단백질의 전장 서열을 운반하는 플라스미드의 제조를 위해서, 재조합 배큘로바이러스 셔틀 백터 플라즈미드(pFastBac vector plasmid, Invitrogen, Carlsbad, CA)에 클론하였다. 상기 중첩 M2e 구조 DNA는 제한효소 BamHI(NEB, Ipswich, MA)과 HindIII(NEB, Ipswich, MA) 서열에 클로닝 될 수 있도록 이들 제한효소가 인식할 수 있는 DNA서열을 포함하였다. 그리고 재조합된 플라스미드를 이용하여 제시된 박테리아 (DH10Bac competent cells, rAcNPV, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 거쳐 재조합 배큘로바이러스 유전체(recombinant Bacmid baculovirus) DNA를 얻을 수 있었으며, 이를 이용하여 중첩 M2e5x 단백질 발현을 위한 배큘로바이러스를 얻을 수 있었다. 또한 M2e5x VLP 구조 중 5도메인의 M2e5x 부분을 효모발현 시스템을 이용하여 발현시켜 단백질을 정제할 수 있었다. M2e5x 재조합단백질을 Pichia pastoris 균주에서 발현시키기 위하여 발현벡터 pPIC9-5M2e 를 제작하여 Pichia pastoris 균주에 서열번호 1의 5M2e 유전자를 형질전환시켰다. 발현벡터가 genome에 삽입되어 형성된 콜로니로부터 발현균주를 선별하였다. 선정된 균주를 플라스크 규모(50~100ml) 배양하고 메탄올 투입하여 M2e5x 발현을 유도한 다음 SDS-PAGE와 Western blot 분석으로 확인하였다.

본 발명 중첩 M2 세포 외부(M2e5x) 단백질의 DNA 및 아미노산 서열을 분석하면 하기 표 1과 같다.

[표 1] 중첩 M2 세포 외부(M2e5x) 단백질의 서열 분석

상기 서열을 서열번호 3 내지 서열번호 29에 나타내었다.

또한, 제조된 M2e5x 단백질의 대략적인 전장 서열은 도 1 (A)에 나타내었으며, 구체적인 아미노산 서열을 서열번호 2에 나타내었다.

<제조예 2> 중첩 M2e5x VLP 제조, 분리 및 발현효율 평가

재조합 M2e5x VLP를 생산하기 위하여, 상기 제조예 1의 M2e5x 단백질을 발현하기 위한 바이러스를 참조문헌(Song JM, et al. PLoS One. 2011 Jan 18;6(1):e14538)에 기술한 바와 같은 방법으로 제작하였다.

상기 제조예 1에서 얻어진 재조합 중첩 M2e5x 발현 배큘로바이러스와 인플루엔자 M1 단백질을 발현하는 배큘로바이러스를 각각 2 MOI와 1 MOI의 농도로 곤충세포(SF9 insect cells; CRL-1711; American Type Culture Collection)에 동시 감염시켜 27℃ 배양기에서 48시간 진탕배양하였다. 그 후 배양배지를 수거하여 고속 원심분리하였다 (4℃, 7000rpm에서 30분간). 침강된 세포를 제거하고 중첩의 M2e5x VLP를 포함하는 배양 상층액을 QuixStand hollow fiber (GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 사용하여 전체 부피를 1/5~1/10으로 농축하였다. 농축된 배양액으로부터 VLP를 분리하기 위해 수크로스 구배 초원심분리(Beckman ultracentrifuge, USA)를 수행하였다. 이를 위해 20-60% (wt/wt) 수크로스 상에 층을 형성시킨 다음 4℃, 28000rpm에서 1시간동안 원심분리시킨다. 원심분리 후 20/60% 층에 형성된 VLP 포함층을 수집하여 PBS로 투석 (Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes 10K MWCO, Pierce, 4℃, 24시간)한 후, 다시 다음 4℃, 28,000rpm에서 30분동안 원심분리시킨다. 펠렛은 PBS에 부유시켜 -80℃ 냉동 보관 후 M2e5x VLP 단백질 농도를 측정하였다. 효모 발현 시스템을 이용하여 생산된 단백질은 His-tag이 존재하고 있어 His-affinity column을 이용하여 정제할 수 있고, 정제된 단백질은 -80℃ 냉동 보관 후 단백질 농도를 측정하였다.

<제조예 3> 야생형 M2 VLP (M2 WT VLP)의 제조

M2e5x 재조합 단백질 대신 야생형 M2 단백질을 사용하여 상기 제조예 1 및 제조예 2의 방법과 동일하게 야생형 M2 VLP(M2 WT VLP)를 제조하였다. 야생형 M2 단백질의 서열은 서열번호 30에 나타내었다.

<실시예>

1. 중첩 M2e5x VLP 단독 백신의 효능 평가

<실시예 1> 중첩 M2e5x VLP의 발현효율 평가

인플루엔자 바이러스(A/Philippines H3N2) (1, 5, 10ug)와 M2e5x VLP (100 ng)를 이용하여 M2e5x 단백질 및 기존 개발된 M2WT VLP의 M2 단백질 발현양을 14C2 M2 단클론항체 (abcam, Cambridge, MA, USA)를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하였다. 대조군으로 H3N2형 A/Philippines/2/82 인플루엔자 바이러스 (바이러스 구성 성분인 M2) 및 M2WT VLP를 측정하였다. 그 결과를 도 1 (B)에 나타내었다.

도1 (B)의 1번, 2번, 3번 레인은 H3N2형 인플루엔자 바이러스 10ug, 5ug, 1ug을 시료로 하였고, 4번 레인은 M2e5x VLP 단백질 100ng, 5번 레인은 M2WT VLP단백질 1ug, 6번 레인은 음성 대조군을 검출한 도이다. 도1 (B)에서 확인되는 바와 같이, 레인 4의 M2e5x VLP(100ng)의 반응성은 레인 1의 인플루엔자 바이러스(10ug) 또는 레인 5의 M2WT VLP(1ug)의 반응성보다 최소 10배 이상 큰 것을 확인할 수 있었다. 이는 14C2 M2 단클론항체에 대해 M2e5x VLP가 인플루엔자 바이러스 또는 M2WT VLP의 M2 단백질보다 1000배 이상의 높은 반응성을 나타내는 것을 보여주는 결과이다.

또한, 제조예 1의 효모시스템을 이용하여 추출된 M2e5x단백질의 시간대별 M2e5x 단백질 발현양을 확인하였다. 그 결과를 도 1 (C)에 나타내었다.

도 1 (C)의 레인 1은 음성시료, 레인 2는 배양 상층액, 레인 3~5는 시간대별 배양상층액 정제(2.5L 9시간, 10시간, 17시간), 레인 6~8은 시간대별 배양 상층액 정제(2L, 9시간, 10시간, 17시간)을 나타내었으며, 시간이 증가됨에 발현양도 증가되는 것을 관찰할 수 있었다.

<실시예 2> 중첩 M2e5x VLP백신의 M2e peptide 및 바이러스에 대한 항체 생성 확인

제조예 2에서 제조한 중첩 M2e5x VLP 백신 또는 기존 개발된 M2WT VLP백신을 6-8주령 암컷 마우스 (BALB/C)에 각 10ug을 근육접종 방법으로 4주 간격, 2회 접종하였다. 각 백신 접종 후 3주가 지난 뒤 시료용 혈액을 채취하고 ELISA 법을 통해 혈액 내 존재하는 M2 단백질 및 바이러스에 대한 항체가를 검사하였다. 96웰을 M2e5x VLP(4ug/ml) 또는 바이러스(4ug/ml)를 포함하는 100ug의 코팅 버퍼(0.1 M sodium carbonate, pH 9.5)로 4℃ 에서 overnight 코팅하였다. 희석액 100 ul를 추가한 후, o-phenylenediamine (Zymed,San Francisco, CA)로 deveolop하고 450 nm에서 optical density를 측정함으로써 인플루엔자 바이러스 특이적 항체의 레벨을 측정하였다. 먼저 M2e VLP를 2차 백신 접종 후 채취한 혈액을 통해 각 종에 특이적인 M2e 펩타이드에 대한 반응성을 관찰하였다.

그 결과를 도 2 (A)에 나타내었다. 도 2 (A)에 나타낸 바와 같이, M2e5x VLP 백신 접종으로 생성된 항체를 비교해 볼 때 사람형의 펩타이드에 가장 높은 반응성이 관찰되었고, 돼지형과 조류 I형은 유사하게 관찰되었으며, 조류 II형은 다른 형 보다 낮게 관찰되었다.

또한 각각의 백신 접종 후 채취된 혈액을 통해 사람형 M2e 펩타이드와 인플루엔자 바이러스에 대한 반응성을 관찰하였다.

그 결과를 도 2 (B)에 나타내었다. 도2 (B)는 사람형 M2e peptide에 대한 반응성으로 중첩 M2e5x VLP 백신 1차 접종 후 혈청희석 100배에서 OD(450nm)가 1.5정도 관찰되었고 2차 추가접종 후 1차 백신 접종에 비해 64배 가량 급속도로 항체가가 증가되었다. 그러나 기존 개발된 M2 WT VLP 백신을 1차 및 2차 접종한 후 항체가는 매우 낮게 관찰되었다.

또한, 각각의 백신을 2차 접종 후 혈청에서 인플루엔자 바이러스에 존재하는 인플루엔자 바이러스의 M2단백질에 대한 반응성을 확인하였다.

그 결과를 도 2 (C)에 나타내었다. 도 2(C)에 나타낸 바와 같이, M2e5x VLP가 접종된 혈청형은 다양한 인플루엔자 바이러스에 동등하게 높은 반응성이 관찰되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 실험에 사용된 바이러스 중 A/Philippines/2/82(H3N2) 바이러스에 대해 상대적으로 높은 반응성이 관찰되었다. 그러나 기존 개발된 M2 WT VLP백신이 접종된 혈청은 M2e5x VLP백신 혈청보다 바이러스에 존재하는 M2단백질에 대한 반응성이 4-5배 가량 낮은것으로 관찰되었다.

<실시예 3> 중첩 M2e5x VLP 단독 백신의 광범위 인플루엔자에 대한 방어능 확인

중첩 M2e5x VLP 백신 또는 기존 개발된 M2 WT VLP백신에 대한 광범위 인플루엔자 바이러스에 대한 방어능을 마우스 실험을 통해 비교 확인하였다. 6-8주령 암컷 마우스(BALB/C)를 사용하였으며 10ug의 중첩 M2e5x VLP 백신 또는 M2 WT VLP 백신을 근육접종 경로로 4주 간격, 2회 투여 하였다. 2차 백신 접종 8 주 후, 다양한 혈청형의 인플루엔자 바이러스 H3N2 형 A/Philippines/2/82(Dr. Huan H. Nguyen 제공) 및 H1N1 2009 pandemic flu (A/California/04/09) 바이러스(Dr. Richard Webby 제공)를 각각 치사량의 4배 (200 plaque forming units)에 해당하는 양으로 공격접종 하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3의 (A) 및 (B)는 H3N2 형 A/Philippines/2/82 바이러스로 공격접종 후의 체중변화와 생존율을 각각 나타내었으며, 도 3의 (C) 및 (D)는 H1N1 2009 pandemic flu (A/California/04/09) 바이러스 공격접종 후 체중변화와 생존율을 각각 나타낸 도이다.

A/Philippines/2/82 바이러스 공격접종에 대해 중첩 M2e5x VLP백신이 투여된 그룹에서는 체중감소가 약 3% 정도 감소된 후 관찰 기간 내 정상으로 회복되었지만 M2WT VLP백신이 투여된 그룹에서는 체중감소가 17% 감소된 후 관찰기간 내 정상으로 회복되지 않았다. M2e5x VLP백신이 접종된 그룹에서는 모든 개체가 생존했지만 M2WT VLP백신이 접종된 그룹에서는 생존율이 75%로 관찰되었다. 또한 A/California/04/09 바이러스 공격접종에 대해 M2e5x VLP백신이 접종된 마우스의 경우 체중감소가 약 13% 정도 감소된 후 관찰기간 내 정상으로 회복되었지만 M2WT VLP백신이 투여된 그룹에서는 체중감소가 22% 감소된 후 관찰기간 내 정상으로 회복되지 않았다. M2e5x VLP백신이 접종된 그룹에서는 모든 개체가 생존했지만 M2WT VLP백신이 접종된 그룹에서는 생존율이 50%로 관찰되었다. M2e5x VLP백신 또는 M2WT VLP백신을 접종하지 않은 마우스의 경우 두 그룹 모두에서 체중감소가 25% 이상 관찰되었다. 동물보호법에 의거 체중감소가 25% 이상 되었을 경우 마우스를 안락사 시켰으며 이는 생존되지 않은 것으로 간주하였다.

또한, 각각의 2차 백신 접종 후 채취한 혈청을 이용하여 상기에서 사용하지 않은 인플루엔자 바이러스를 6-8주령 암컷 마우스(BALB/C)에 투여하여 방어능을 관찰하였다. 즉, 2차 백신 후 채취한 혈청과 감염되지 않은 마우스 혈청을 PBS에 4배 희석한 후 56℃에서 30분 동안 비동화 시킨다. 치사량의 8배(400 plaque forming units)에 해당하는 동량의 인플루엔자 바이러스(A/PR/8/34, H1N1; A/Vietnam/1203/2004, H5N1)를 각각 혼합하여 실온에서 1시간 반응한 후 감염되지 않은 마우스에 비강경로로 접종하여 체중변화 및 생존율을 확인한 것으로 이는 M2e5x VLP 백신 항체가 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 방어능을 간접적으로 나타냄을 제시하는 것이다.

그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4의 (A) 및 (B)는 H1N1 형 A/PR/8/34 바이러스를 이용하여 체중변화와 생존율을, 도 4의 (C) 및 (D)는 H5N1형 A/Vietnam/1203/2004 바이러스를 이용한 체중변화와 생존율을 각각 나타낸 도이다. 두 그룹 모두에서 M2e5x VLP 백신이 접종된 개체의 혈청 내 항체로도 A/PR/8/34(H1N1) 및 A/Vietnam/1203/2004(H5N1) 바이러스에 대해 방어적인 효과가 있는 것을 관찰할 수 있었지만, M2WT VLP백신 또는 감염되지 않은 혈청으로는 두 바이러스에 대한 방어적인 효과가 관찰되지 않아 M2e5x VLP백신이 M2WT VLP백신보다 뛰어남을 확인할 수 있었다.

<실시예 4> 공격 접종 후 마우스 폐 내 바이러스 함량 확인

중첩 M2e5x VLP 단독 백신으로 2차 접종 후, 치사량의 4배(200 plaque forming units)에 해당하는 양의 H3N2 A/Philippines/2/82 바이러스로 공격 접종하여 5일째 감염된 마우스의 폐를 채취하여 폐 내 바이러스 함량을 종란접종법을 통해 확인하였다.

채취된 폐조직을 갈아서 13,000rpm에서 1분 동안 원심분리한 후 상층액을 채취하여 PBS에 희석하고 이를 9-10일령 계태아에 접종하였다. 그 후 4일간 배양하고 배양된 계태아의 요막강액을 채취하여 닭 적혈구와 반응시켜 응집유무로 바이러스 감염유무를 조사하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, M2e5x VLP 백신이 접종된 마우스의 바이러스 함량은 백신이 접종되지 않은 마우스에 비해 약 100배, M2WT VLP백신이 접종된 마우스보다 8배 가량 폐 내 바이러스 함량이 감소된 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 5> 중첩 M2e5x VLP 단독 백신 접종 후 항체 지속성 확인

제조예 2에서 제조한 중첩 M2e5x VLP를 이용하여 6-8주령 암컷 마우스 (BALB/C)에 10ug의 M2e5x VLP 백신을 근육접종 방법으로 4주 간격, 2회 접종하였다. 2차 백신 접종 후 8개월이 지난 뒤 시료용 혈액을 채취하고 ELISA 법을 통해 혈액 내 존재하는 M2 단백질에 대한 항체 지속능을 확인하였다. 채취된 혈청을 이용하여 사람형 M2e peptide와 인플루엔자 바이러스에 대한 반응성을 관찰하였다.

그 결과를 도 6에 나타내었다. 도6 (A)는 사람형 M2e 펩타이드에 대한 반응성으로 중첩 M2e5x VLP 백신 2차 접종 후 8개월째 혈청으로 여전히 높은 항체가가 유지되는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 M2WT VLP백신의 경우 항체가가 감염되지 않은 마우스 혈청과 유사하게 관찰되었다. 도 6 (B)는 혈청 내 존재하는 M2e 항체와 인플루엔자 바이러스에 대한 반응성을 나타낸 도로써, 백신 직후의 혈청과 비교해 볼 때 반응성이 절반으로 감소되었지만 여전히 M2WT VLP백신 접종 그룹보다 높은 OD 0.4이상 관찰되었다.

<실시예 6> M2e5x VLP 단독 백신 접종 장기간 후 인플루엔자에 대한 방어능 확인

(1) 중첩 M2e5x VLP 단독 백신 접종 8개월 후 인플루엔자 바이러스에 대한 방어능을 확인하였다. 6-8주령 암컷 마우스(BALB/C)를 사용하였으며 10ug의 중첩 M2e5x VLP 백신을 근육접종 경로로 4주간격, 2회 투여 하였다. 2차 백신 접종 8개월 후, 다양한 혈청형의 인플루엔자 바이러스 H3N2 형 A/Philippines/2/82 바이러스를 각각 치사량의 4배에 해당하는 양으로 공격접종 하였다.

그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, H3N2형 A/Philippines/2/82 바이러스로 공격접종 후의 체중변화(A)와 생존율(B)을 확인할 수 있었다. M2e5x VLP로 백신 접종 장기간(8개월) 후 A/Philippines/2/82 바이러스 공격접종에 대해 여전히 체중변화는 5% 이내로 관찰되었으며, 관찰기간 내 체중은 정상상태로 회복되었다. 그러나 M2WT VLP백신이 접종된 그룹의 경우 체중감소는 22%까지 감소되었으며 생존율은 33%로 관찰되었다. 감염되지 않은 마우스의 경우 체중감소가 25% 이상 관찰되었다. 동물보호법에 의거 체중감소가 25% 이상 되었을 경우 마우스를 안락사 시켰으며 이는 생존되지 않은 것으로 간주하였다.

(2) 또한 2차 백신 접종 후 8개월째 채취한 각각의 혈청 및 다른 인플루엔자 바이러스를 이용하여 6-8주령 암컷 마우스(BALB/C)를 이용하여 방어능을 관찰하였다. 즉, 2차 백신 8개월째 채취한 혈청과 감염되지 않은 마우스 혈청을 PBS에 2배 희석한 후 56℃에서 30분 동안 비동화 시켰다. 치사량의 8배에 해당하는 동량의 인플루엔자 바이러스(A/PR/8/34, H1N1; A/Vietnam/1203/2004, H5N1)를 혼합하여 실온에서 1시간 반응한 후 감염되지 않은 마우스에 비강경로로 접종하여 체중변화 및 생존율을 확인한 것이다. 이는 M2e5x VLP 백신 항체가 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 방어능을 간접적으로 나타내는 것으로 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8의 (A) 및 (B)는 H1N1 형 A/PR/8/34 바이러스에 의한 체중변화와 생존율을, 도 8의 (C) 및 (D)는 H5N1형 A/Vietnam/1203/2004 바이러스에 의한 체중변화와 생존율을 각각 나타낸 도이다. 두 그룹 모두에서 M2e5x VLP 백신 2차 접종 직후 혈청보다 더 체중감소가 관찰되었지만 항체가가 2차 백신 직후보다 약 4배 감소되더라고 여전히 A/PR/8/34(H1N1) 및 A/Vietnam/1203/2004(H5N1) 바이러스에 대해 방어적인 효과가 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 M2WT VLP백신 또는 감염되지 않은 마우스의 혈청은 바이러스를 방어하지 못하는 것을 관찰하였다.

<실시예 7> M2e5x VLP 백신 또는 4.M2e-tFliC VLP백신 혈청에 대한 이종 인플루엔자 바이러스에 대한 방어능 확인

이종 중첩 M2e VLP백신의 이종 인플루엔자 바이러스에 대한 방어능을 확인하고자, 백신 접종 후 동일한 항체가의 각 혈청을 이용하여 2009년 유행한 돼지 유래 인플루엔자 바이러스에 대한 방어능을 확인하였다. 각 혈청을 PBS에 2배 희석한 후 56℃에서 30분 동안 비동화 시켰다. 치사량의 6배에 해당하는 동량의 인플루엔자 바이러스(A/PR/8/34, H1N1; A/Vietnam/1203/2004, H5N1)를 혼합하여 실온에서 1시간 반응한 후 감염되지 않은 마우스에 비강경로로 접종하여 체중변화 및 생존율을 확인하였다. 이는 다양항 종에 적합하게 제작된 M2e5x VLP 백신 항체가 사람 유래에 적합하게 제작된 4.M2e-tFliC VLP백신 항체보다 이종 바이러스인 돼지유래 인플루엔자 바이러스에 대해 뛰어난 방어능을 가짐을 확인하기 위함이다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9의 (A) 및 (B)는 2009년 유행한 돼지 유래 H1N1 형 A/california/04/09 바이러스 감염에 대한 체중변화와 생존율을 확인한 결과이다. M2e5x VLP 백신이 접종된 군은 바이러스 감염에 따라 체중이 13% 감소된 후 정상으로 회복하였고 모든 개체가 생존하였다. 그러나 M2WT VLP 백신이 접종된 군은 바이러스 감염에 따라 체중이 22% 감소되었으며 생존율이 75%로 관찰되었다. 백신이 접종되지 않은 마우스는 체중이 24% 가량 감소되었으며, 생존율은 25%로 관찰되었다.

2. 중첩 M2e5x VLP 보강백신으로서의 효능 확인

<실시예 8> 기존 상업백신에 M2e5x VLP 보강 백신에 대한 항체 생성확인

시판되고 있는 인플루엔자 백신(녹십자, Green Flu-S)과 제조예 2에서 제조한 중첩 M2e5x VLP를 이용하여 6-8주령 암컷 마우스(BALB/C)에 0.24HAug의 사람 백신과, 동량의 사람 백신에 10ug의 M2e5x VLP를 첨가한 백신을 근육접종 방법으로 각각 4주 간격, 2회 접종하였다. 각 백신 접종 후 3주가 지난 뒤 시료용 혈액을 채취하고 ELISA 법을 통해 혈액 내 존재하는 바이러스 및 M2 단백질에 대한 항체가 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10 (A)에 나타낸 바와 같이, 사람형 M2e 펩타이드에 대한 반응성은 분할(split) 상용 사람 백신을 1차 및 2차까지 접종된 마우스에서 전혀 관찰되지 않았지만 녹십자 백신에 M2e5x VLP를 첨가시킨 백신 1차 접종 후 혈청 100배 희석에서 OD(450nm)가 0.7정도 관찰되었고 2차 추가접종 후 1차 백신 접종에 비해 256배 가량 급속도로 항체가가 증가되었다.

또한, 도 10 (B)에 나타낸 바와 같이, 불활성화된 A/California/04/09(H1N1) 바이러스에 대한 반응성으로 분할 상용 사람 백신뿐만 아니라 사람 백신에 보강된 M2e5x VLP백신 1차 및 2차 접종 모두에서 항체가가 유사하게 나타나는 것을 관찰할 수 있었다.

<실시예 9> M2e5x VLP 보강 사람 인플루엔자 백신에 대한 방어능 확인

혈청형이 다른 인플루엔자바이러스에 대한 사람 인플루엔자 백신 및 M2e5x VLP 보강 인플루엔자 백신에 대한 방어능 효과를 마우스 실험을 통해 확인하였다. 6-8 주령 암컷 마우스(BALB/C)를 사용하였으며 사람 인플루엔자 백신(녹십자)은 0.24HAug, M2e5x VLP 보강백신은 상용 사람 백신 0.24HAug과 10ug의 M2e5x VLP 백신을 혼합하여 근육접종 경로로 4주 간격, 2회 투여 하였다. 2차 백신 접종 8 주 후, 다양한 혈청형의 인플루엔자 바이러스 H3N2 형 A/Philippines/2/82 (250 plaque forming units) 및 H5N1형 A/Vietnam/1203/2004 (1500 plaque forming units) 바이러스를 각각 치사량 5배에 해당하는 양으로 공격접종 하였다.

도 11의 (A) 및 (B)는 H3N2 형 A/Philippines/2/82 바이러스로 공격접종 후의 체중변화와 생존율을, 도 11의 (C) 및 (D)는 H5N1형 A/Vietnam/1203/2004 바이러스 공격접종 후 체중변화와 생존율을 각각 나타낸 도이다.

도 11의 (A)에 나타낸 바와 같이, H3N2형 A/Philippines/2/82 바이러스 공격접종에 대해 M2e5x VLP 백신이 보강된 그룹에서는 체중감소가 약 3% 정도 감소된 후 관찰 기간 내 정상으로 회복되었음을 확인할 수 있었고, 도 11의 (C)에 나타낸 바와 같이, A/Vietnam/1203/2004 바이러스로 공격 접종한 마우스의 경우 체중감소가 약 6% 정도 되었다가 관찰기간 내 정상으로 회복되었음을 확인할 수 있었다. 도 11의 (B)와 (D)에 나타낸 것처럼, 두 그룹 모두에서 생존율은 100%로 관찰되었다.

그러나 도 11의 (A)에 나타낸 바와 같이, 사람백신만 접종된 그룹의 경우 A/Philippines/2/82 바이러스 공격접종된 마우스의 경우 체중감소가 약 21%가 감소하였고, 도 11의 (C)에 나타낸 바와 같이 A/Vietnam/1203/2004 바이러스로 공격 접종한 마우스에경우 체중감소가 약 22% 정도 감소하였다. 또한, 각각에 대한 생존율은 75%와 50%로 관찰되었다.

마지막으로 백신이 전혀 접종되지 않은 모든 마우스 군의 경우 체중감소가 25% 이상 관찰되어 안락사를 시켰다.

<실시예 10> 공격 접종 후 마우스 폐 내 바이러스 함량 확인

사람 인플루엔자 백신 및 M2e5x VLP가 보강된 사람백신 2차 접종 8주 후 치사량의 5배에 해당하는 양의 H3N2 A/Philippines/2/82 바이러스로 공격접종 한 후 4일째 감염된 마우스의 폐를 채취하여 폐 내 바이러스 함량을 확인한 것으로 결과를 도 12에 나타내었다.

채취된 폐조직을 갈아서 13,000rpm에서 1분 동안 원심분리한 후 상층액을 채취하여 PBS에 희석하고 이를 9-10일령 계태아에 접종하였다. 그 후 4일간 배양하고 배양된 계태아의 요막강액을 채취하여 닭 적혈구와 반응시켜 응집 유무로 바이러스 감염유무를 조사하였다.

도 12에 나타낸 바와 같이, M2e5x VLP가 보강된 사람 백신이 접종된 마우스의 바이러스 함량은 백신이 M2e5x VLP가 보강되지 않은 사람백신을 접종한 마우스에 비해 약 10배 가랑 폐 내 바이러스 함량이 감소된 것을 관찰할 수 있었다. 백신이 전혀 접종되지 않은 마우스와 비교했을 때 약 60배 가량 폐 내 바이러스 함량이 감소된 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 11> M2e5x VLP 보강 사람 인플루엔자 백신 접종 후 항체 지속성 및 방어능 확인

(1) 기존 시판되고 있는 인플루엔자 백신(녹십자, Green Flu-S)과 제조예 2에서 제조한 중첩 M2e5x VLP를 이용하여 6-8주령 암컷 마우스 (BALB/C)에 0.24HAug의 사람 인플루엔자 백신과, 동량의 사람 인플루엔자 백신에 10ug의 M2e5x VLP를 첨가한 백신을 근육접종 방법으로 각각 4주 간격, 2회 접종하였다. 2차 백신 후 1년 지난 뒤 시료용 혈액을 채취하고 ELISA 법을 통해 혈액 내 존재하는 바이러스 및 M2 단백질에 대한 항체 결과를 도 13 (A) 및 (B)에 나타내었다.

도 13의 (A)는 사람형 M2e peptide에 대한 반응성을 나타낸다. 분할(split) 녹십자 백신 2차 접종 1년 후에도 여전히 마우스에서 전혀 반응성이 관찰되지 않았다. 하지만, 녹십자 백신에 M2e5x VLP를 첨가시킨 백신 2차 접종 1년 후 혈청은 2차 백신 직후보다 64배 감소되었지만 여전히 높은 항체가가 유지되는 것을 확인할 수 있었다.

도 13의 (B)는 불활화된 A/California/04/09(H1N1) 바이러스에 대한 반응성을 나타낸다. 분할 상용 사람 백신뿐만 아니라 상용 사람백신에 보강된 M2e5x VLP백신 2차 접종 1년 후 혈청 모두에서 항체가가 유사하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

(2) 또한, 사람 인플루엔자 백신 및 M2e5x VLP 보강 사람 인플루엔자 백신 접종 1년 후 인플루엔자 바이러스에 대한 방어능을 확인하였다. 6-8주령 암컷 마우스(BALB/C)를 사용하였으며 상용 사람인플루엔자 백신 0.24HAug및 10ug의 중첩 M2e5x VLP를 보강한 사람인플루엔자 백신을 근육접종 경로로 4주 간격, 2회 투여 하였다. 2차 백신 접종 1년 후, 인플루엔자 바이러스 H3N2 형 A/Philippines/2/82 바이러스를 치사량의 5배에 해당하는 양으로 공격 접종한 결과를 도 13 (C) 및 (D)에 나타내었다.

도 13의 (C) 및 (D)는 H3N2 형 A/Philippines/2/82 바이러스로 공격접종 후의 체중변화와 생존율을 각각 나타낸 도이다. H3N2형 A/Philippines/2/82 바이러스 공격접종에 대해 M2e5x VLP 백신이 보강된 그룹에서는 체중감소가 약 3%정도 감소된 후 관찰 기간 내 정상으로 회복되었고, 이는 2차 백신접종 직후 동일한 바이러스로 공격 접종한 결과와 비슷하게 확인되었고, 생존율은 100%로 관찰되었다. 그러나 사람백신만 접종된 그룹의 경우 A/Philippines/2/82 바이러스 공격 접종된 마우스의 경우 체중감소가 약 22% 정도 관찰되었다가 관찰기간 내 정상으로 회복되지 않았고 생존율은 50%로 관찰되었다. 백신이 전혀 접종되지 않은 마우스의 경우 체중감소가 25% 이상 관찰되어 안락사를 시켰다.

<실시예 12> 마이크로니들(MN) 이용 피부접종시 노바티스 인플루엔자백신 및 M2e5x VLP 보강 노바티스 인플루엔자백신 항체 생성 확인

시판되고 있는 인플루엔자 백신(노바티스, 2009 H1N1 1가 백신)과 제조예 2에서 제조한 중첩 M2e5x VLP를 이용하여 6-8주령 암컷 마우스(BALB/C)에 0.3HAug의 사람 백신과 동량의 사람 백신에 10ug의 M2e5x VLP를 첨가한 백신을 마이크로니들(MN)에 코팅한 후 피부접종 방법으로 각각 4주 간격, 2회 접종하였다. 각 백신 접종 후 3주가 지난 뒤 시료용 혈액을 채취하고 ELISA 법을 통해 혈액 내 존재하는 바이러스 및 M2 단백질에 대한 항체가 결과를 도 14에 나타내었다.

도 14 (A)는 사람형 M2e peptide에 대한 반응성을 나타낸다. 노바티스 인플루엔자 백신을 1차 및 2차까지 접종된 마우스에서 전혀 반응성이 관찰되지 않았지만 노바티스 백신에 M2e5x VLP를 첨가시킨 백신 1차 접종 후 혈청희석 100배에서 OD(450nm)가 0.6정도 관찰되었고 2차 추가접종 후 1차 백신 접종에 비해 64배 가량 급속도로 항체가가 증가되었다.

도 14 (B)는 불활화된 A/California/04/09(H1N1, 동일 혈청형) 바이러스에 대한 반응성을 나타낸다. 노바티스 백신뿐만 아니라 노바티스 백신에 보강된 M2e5x VLP백신 1차 및 2차 접종 모두에서 항체가가 유사하게 나타나는 것을 관찰할 수 있었다.

<실시예 13> M2e5x VLP 보강 노바티스 사람 인플루엔자 백신 방어능 확인

혈청형이 다른 인플루엔자바이러스에 대한 노바티스 사람인플루엔자 백신 및 M2e5x VLP 보강 노바티스 사람인플루엔자 백신에 대한 방어능 효과를 마우스 실험을 통해 확인하였다. 6-8 주령 암컷 마우스(BALB/C)를 사용하였으며 사람인플루엔자 백신(노바티스)은 0.3HAug, M2e5x VLP 보강백신은 녹십자 백신 0.24HAug과 10ug의 M2e5x VLP 백신을 마이크로 니들(MN)에 각각 코팅하여 피부 접종 경로로 4주 간격, 2회 투여 하였다. 2차 백신 접종 4 주 후, H3N2형 인플루엔자 바이러스(A/Philippines/2/82)를 치사량 5배에 해당하는 양으로 공격접종 하였다.

도 15는 H3N2 형 A/Philippines/2/82 바이러스로 공격접종 후의 체중변화(A)와 생존율(B)을 나타낸 도이다. 사람 인플루엔자 백신에 M2e5x VLP 백신이 보강된 그룹에서는 체중감소가 약 7% 정도 감소된 후 관찰 기간 내 정상으로 회복되었고 생존율은 100%로 관찰되었다. 반면, 사람인플루엔자 백신(노바티스)만 접종된 또는 백신이 접종되지 않은 마우스의 경우 체중감소가 25% 이상 관찰되어 안락사를 시켰다.

<실시예 14> 약독화 인플루엔자 백신에 대해 보강 백신 (LAIV att.NL virus/2009 +M2e5XVLP) 효과

약독화 인플루엔자 백신에 대하여 M2e VLP보강 백신으로 효과를 확인하였다. 생쥐 (BALB/c mice, Harlan company, 5 mice per group) 비강을 통해 백신을 1, 2차 투여하였다. 약독화 인플루엔자 백신(att.NL virus/2009, Dr. Daniel Perez, University of Maryland 제공)양은 대략 105 TCID 였다. (10⁵tissue culture infective dose (TCID) per mouse) 그 결과를 도 16에 나타내었다.

도 16에 나타낸 바와 같이, 2009 H1N1 신종 플루 약독화 인플루엔자 백신에 대한 보강 백신군에서 (10 ug of M2e5XVLP: 보강 백신군 LAIV + M2e5X), M2 에 대한 항체 형성 증가 효과를 확인할 수 있었다. 반면, 약독화 인플루엔자스플릿 백신 (LAIV NL)군에서는 M2 에 대한 항체 형성이 미미했다.

3. 백신 접종 방법의 비교 평가

<실시예 15> 중첩 M2e5x VLP 백신 접종 방법 비교

제조예에서 제조한 중첩 M2e5x VLP를 이용하여 6-8주령 암컷 마우스(BALB/C)에 10ug의 M2e5x VLP백신을 마이크로니들 이용 피부접종(MN)과 동량을 근육접종(IM) 방법으로 4주 간격, 2회 접종하였다. 각 백신 접종 후 3주가 지난 뒤 시료용 혈액을 채취하고 ELISA 법을 통해 혈액 내 존재하는 바이러스 및 M2 단백질에 대한 항체가 및 방어능 결과를 17에 나타내었다.

도 17 (A) 및 (B)는 각각 사람형 M2e peptide(A) 및 인플루엔자 바이러스(B)에 대한 반응성을 나타낸다. 백신접종 경로에 상관없이 각 항원에 대해 유사한 항체가가 생성되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 2차 백신 접종 4주 후 H3N2 형 A/Philippines/2/82 바이러스로 공격접종 후의 체중변화와 생존율를 확인하였다. 도 17의 (C) 및 (D)에 나타낸 바와 같이, 바이러스 공격접종에 대해 마이크로 니들(MN) 접종경로로 투여된 경우 근육으로 투여된 개체보다 체중감소는 적게 관찰되었지만 두 그룹사이에서 큰 차이는 관찰되지 않았고 접종 경로에 상관없이 백신 접종된 모든 개체가 생존하였다.

<실시예 16> 노바티스 인플루엔자백신 보강 M2e5x VLP 백신 접종 방법 비교

시판되고 있는 인플루엔자 백신(노바티스, 2009 H1N1 1가 백신)과 제조예 2에서 제조한 중첩 M2e5x VLP를 이용하여 6-8주령 암컷 마우스(BALB/C)에 0.3HAug의 사람 백신에 10ug의 M2e5x VLP 보강 백신을 마이크로니들(MN) 이용 피부접종과 동량을 근육접종방법으로 4주 간격, 2회 접종하였다. 각 백신 접종 후 3주가 지난 뒤 시료용 혈액을 채취하고 ELISA 법을 통해 혈액 내 존재하는 바이러스 및 M2 단백질에 대한 항체가 결과를 도 17에 나타내었다.

도 18은 각각 사람형 M2e 펩타이드(A) 및 인플루엔자 바이러스(B)에 대한 반응성으로 백신접종 경로에 상관없이 유사한 항체가가 생성되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 2차 백신 접종 4주 후 H3N2 형 A/Philippines/2/82 바이러스로 공격접종 후의 체중변화와 생존율을 확인하였다. 도 18의 (C) 및 (D)에 나타낸 바와 같이, 바이러스 공격접종에 대해 백신 접종경로에 상관없이 M2e5x VLP가 보강 접종된 사람인플루엔자 백신 접종그룹 모두에서 체중감소 약 7% 가량 감소된 후(C) 정상체중으로 회복하였고 모든 개체가 생존(D)하였다.

4. 보강 백신 접종 시기 평가

<실시예 17> 사람 인플루엔자 백신 및 M2e5x VLP백신 접종시기에 대한 방어능 확인

사람 인플루엔자 백신(녹십자, Green Flu-S) 접종 후 M2e5x VLP 백신을 접종시기를 달리하여 방어능 효과를 마우스 실험을 통해 확인하였다. 6-8 주령 암컷 마우스(BALB/C)를 사용하였으며 사람 인플루엔자 백신(녹십자)은 0.24HAug을 근육접종 경로로 4주 간격, 2회 투여 하였다. 그 후 M2e5x VLP백신 10ug을 근육접종 경로로 4주 간격, 2회 추가투여 하였다. 추가 2회 접종 후, 인플루엔자 바이러스 H5N1 형 A/Vietnam/1203/2004 바이러스를 치사량 5배에 해당하는 양으로 공격접종 하였다.

도 19 (A) 및 (B)는 바이러스로 공격접종 후의 체중변화와 생존율을 각각 나타내었다. M2e5x VLP 백신 추가로 접종된 그룹에서는 체중감소가 약 6%정도 감소된 후 관찰 기간 내 정상으로 회복되었고, 모든 개체가 생존하였다. 그러나 M2e5x VLP가 추가 접종되지 않고 사람 인플루엔자 백신만 접종된 그룹의 경우 22%정도 관찰되었다가 관찰기간 내 정상으로 회복되지 않았고 생존율은 25%로 관찰되었다. 백신이 전혀 접종되지 않은 모든 마우스의 경우 체중감소가 25% 이상 관찰되어 안락사를 시켰다.

<110> GEORGIA STATE UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION INC REPUBLIC OF KOREA (Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Monovalent or supplementary influenza vaccine having broad protective activity <130> P12-083-KSM <150> US US61/738,139 <151> 2012-12-17 <160> 30 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 747 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M2e5x DNA sequence <400> 1 atgaaattct tagtcaacgt tgcccttgtt tttatggtcg tgtacatttc ttacatctat 60 gcggacccga tcaacatgac cactagtgtc gacggtacca gccttctaac cgaggtcgaa 120 acacctatca gaaacgaatg ggggtccaga tccaacgatt caagtgacgc tgctgctggt 180 ggagcagcta gccttctaac cgaggtcgaa acacctatca gaaacgaatg ggggtccaga 240 tccaacgatt caagtgacgc tgctgcacca ggagcagcta gtcttctaac cgaggtcgaa 300 acgcctacca gaagcgaatg ggagtccaga tccagcgatt caagtgatgc tgctgctggt 360 ggagcagcta gtcttctaac cgaggtcgaa acgcctacca gaaacgaatg ggagtccaga 420 tccagcgatt caagtgatgc tgctgcacca ggagcagcta gtcttctaac cgaggtcgaa 480 acgcttacca gaaacggatg ggggtgcaga tgcagcgatt caagtgatgg tggactgaaa 540 cagattgaag ataaattgga agagattttg agcaaactct atcatattga aaacgaactg 600 gcgcgtatta aaaagctgct gggcgaactc gagattctgg cgatctactc aactgtcgcc 660 agttcactgg tgcttttggt ctccctgggg gcaatcagtt tctggatgtg ttctaatgga 720 tctttgcagt gcagaatatg catctga 747 <210> 2 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M2e5x protein sequence <400> 2 Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile 1 5 10 15 Ser Tyr Ile Tyr Ala Asp Pro Ile Asn Met Thr Thr Ser Val Asp Gly 20 25 30 Thr Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 35 40 45 Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ser 50 55 60 Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg 65 70 75 80 Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ala Ala Ala Pro Gly Ala Ala Ser Leu Leu 85 90 95 Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Ser Glu Trp Glu Ser Arg Ser Ser 100 105 110 Asp Ser Ser Asp Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ser Leu Leu Thr Glu 115 120 125 Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu Ser Arg Ser Ser Asp Ser 130 135 140 Ser Asp Ala Ala Ala Pro Gly Ala Ala Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu 145 150 155 160 Thr Leu Thr Arg Asn Gly Trp Gly Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp 165 170 175 Gly Gly Leu Lys Gln Ile Glu Asp Lys Leu Glu Glu Ile Leu Ser Lys 180 185 190 Leu Tyr His Ile Glu Asn Glu Leu Ala Arg Ile Lys Lys Leu Leu Gly 195 200 205 Glu Leu Glu Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val 210 215 220 Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly 225 230 235 240 Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 245 <210> 3 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Melittine signal <400> 3 atgaaattct tagtcaacgt tgcccttgtt tttatggtcg tgtacatttc ttacatctat 60 gcggacccga tcaacatgac c 81 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction enzyme 1 <400> 4 actagtgtcg acggtacc 18 <210> 5 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human M2e <400> 5 agccttctaa ccgaggtcga aacacctatc agaaacgaat gggggtccag atccaacgat 60 tcaagtgac 69 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Connecting segment <400> 6 gctgctgcac caggagcagc t 21 <210> 7 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human M2e <400> 7 agtcttctaa ccgaggtcga aacgcctacc agaagcgaat gggagtccag atccagcgat 60 tcaagtgat 69 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Connecting segment <400> 8 gctgctgctg gtggagcagc t 21 <210> 9 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Swine M2e <400> 9 agtcttctaa ccgaggtcga aacgcctacc agaaacgaat gggagtccag atccagcgat 60 tcaagtgat 69 <210> 10 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Avian1 M2e <400> 10 agtcttctaa ccgaggtcga aacgcctacc agaaacgaat gggagtccag atccagcgat 60 tcaagtgat 69 <210> 11 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Avian2 M2e <400> 11 agtcttctaa ccgaggtcga aacgcttacc agaaacggat gggggtgcag atgcagcgat 60 tcaagtgat 69 <210> 12 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCN4 <400> 12 ggtggactga aacagattga agataaattg gaagagattt tgagcaaact ctatcatatt 60 gaaaacgaac tggcgcgtat taaaaagctg ctgggcgaa 99 <210> 13 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Restrcition enzyme 2 <400> 13 ctcgag 6 <210> 14 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A/PR/8HA Transmenbrane domain <400> 14 attctggcga tctactcaac tgtcgccagt tcactggtgc ttttggtctc cctgggggca 60 atcagtttct ggatgtgttc t 81 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A/PR/8HA Cytoplasmic domain <400> 15 aatggatctt tgcagtgcag aatatgcatc 30 <210> 16 <211> 3 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stop codon <400> 16 tga 3 <210> 17 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Melittine signal <400> 17 Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile 1 5 10 15 Ser Tyr Ile Tyr Ala Asp Pro Ile Asn Met Thr 20 25 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction enzyme 1 <400> 18 Thr Ser Val Asp Gly Thr 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Connecting segment 1 <400> 19 Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala 1 5 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Connecting segment 2 <400> 20 Ala Ala Ala Pro Gly Ala Ala 1 5 <210> 21 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GCN4 <400> 21 Gly Gly Leu Lys Gln Ile Glu Asp Lys Leu Glu Glu Ile Leu Ser Lys 1 5 10 15 Leu Tyr His Ile Glu Asn Glu Leu Ala Arg Ile Lys Lys Leu Leu Gly 20 25 30 Glu <210> 22 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Restrction enzyme 2 <400> 22 Leu Glu 12 <210> 23 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A/PR/8 HA transmembrane domain <400> 23 Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val 1 5 10 15 Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser 20 25 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A/PR/8 HA cytoplasmic domain <400> 24 Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 1 5 10 <210> 25 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human M2e <400> 25 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser 1 5 10 15 Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 26 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human M2e <400> 26 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser 1 5 10 15 Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 27 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Swine M2e <400> 27 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Ser Glu Trp Glu Ser 1 5 10 15 Arg Ser Ser Asp Ser Ser Asp 20 <210> 28 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Avian1 M2e <400> 28 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu Ser 1 5 10 15 Arg Ser Ser Asp Ser Ser Asp 20 <210> 29 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Avian2 M2e <400> 29 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Leu Thr Arg Asn Gly Trp Gly Cys 1 5 10 15 Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp 20 <210> 30 <211> 97 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(97) <223> M2 protein <400> 30 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Pro Leu Val Ile Ala Ala Asn Ile 20 25 30 Ile Gly Ile Leu His Leu Ile Leu Trp Ile Leu Asp Arg Leu Phe Phe 35 40 45 Lys Cys Ile Tyr Arg Arg Phe Lys Tyr Gly Leu Lys Arg Gly Pro Ser 50 55 60 Thr Glu Gly Val Pro Glu Ser Met Arg Glu Glu Tyr Arg Lys Glu Gln 65 70 75 80 Gln Asn Ala Val Asp Val Asp Asp Gly His Phe Val Asn Ile Glu Leu 85 90 95 Glu

Claims (8)

1. 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29의 종 특이적 M2e 단백질을 모두 포함하는 중첩된 재조합 M2e 단백질.
2. 제1항에 있어서, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29의 종 특이적 M2e 단백질이 순차적으로 병렬 연결된 것을 포함하는 중첩된 재조합 M2e 단백질.
3. 제2항에 있어서, 중첩된 재조합 M2e 단백질의 3, 4차 구조를 안정화 시키기 위하여 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29의 종 특이적 M2e 단백질을 연결 부위를 통해 병렬적으로 연결시킨 중첩된 재조합 M2e 단백질로서, 상기 연결 부위는 서열번호 19 또는 20인 것인 중첩된 재조합 M2e 단백질.
4. 제3항에 있어서, 상기 중첩된 재조합 M2e 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 것인 중첩된 재조합 M2e 단백질.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 중첩된 재조합 M2e 단백질을 포함하는 바이러스 유사입자(VLP).
6. 제5항의 바이러스 유사입자(VLP)를 포함하는 인플루엔자 바이러스 단독 백신.
7. 제5항의 바이러스 유사입자(VLP); 및 불활성화 바이러스 백신, 약독화 바이러스 백신, 서브 유닛 백신 또는 이들의 혼합물을 포함하는 교차 방어 능력이 향상된 인플루엔자 바이러스 보강 백신.
8. (a) 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29의 종 특이적 M2e 단백질을 모두 포함하는 재조합 DNA 분자를 제조하는 단계;
   (b) 숙주세포를 하나 이상의 재조합 DNA 분자로 형질감염 또는 형질전환시키고, 단백질의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하는 단계;
   (c) 배양 상층액으로부터 바이러스 유사입자(VLP)를 정제하는 단계를 포함하는,
   중첩된 종 특이적 M2e 단백질을 포함하는 바이러스 유사입자(VLP)를 제조하는 방법.

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