KR20080093382A

KR20080093382A - 독감 예방용 백신 조성물

Info

Publication number: KR20080093382A
Application number: KR1020080034773A
Authority: KR
Inventors: 이창근; 박기석; 이지영; 최소영; 안소신; 심자연; 성영철
Original assignee: 주식회사 제넥신; 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2007-04-16
Filing date: 2008-04-15
Publication date: 2008-10-21

Abstract

본 발명은 i) 독감 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 단백질 및 M2 단백질의 세포외 영역(M2eX)을 포함하는 체액성 면역반응 유도 융합 폴리펩티드와 ii) 매트릭스 단백질 또는 뉴클레오캡시드 단백질(Nucleocapsid Protein)을 포함하는 세포성 면역반응 유도 폴리펩티드를 포함하는 독감 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의한 백신 조성물은 다양한 변이체에 의해 유발되는 독감 예방 또는 치료용 백신으로 활용될 수 있다.

독감 바이러스, 재조합 아데노바이러스, 백신

Description

독감 예방용 백신 조성물{A vaccine composition against influenza A viruses}

본 발명은 i) 헤마글루티닌(HA) 단백질과 M2 단백질의 세포외 영역(M2eX)을 포함하는 체액성 면역반응 유도 융합 폴리펩티드와 ii) 독감 바이러스의 매트릭스 또는 뉴클레오캡시드 단백질(Nucleocapsid Protein, NP)를 포함하는 세포성 면역반응 유도 폴리펩티드를 포함하는 독감 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.

독감 바이러스 (Influenza virus)에 의한 호흡기 감염은 가장 오래되고 흔한 질병중 하나이다. 오르소믹소바이러스(Orthomyxovirus)에 속하는 독감 바이러스에 의한 감염은 계절성을 띠며, 어린이나 노인등 면역력이 약한 사람들에게서는 상당한 수준의 치사율을 보이고 있다. 독감 바이러스의 높은 돌연변이율에 기인한 새로운 변종 바이러스의 출현은 독감 바이러스에 대한 백신 개발을 힘들기 하는 큰 요인으로 작용한다. 최근 사회적으로 큰 문제가 되고 있는 조류독감(Avian Influenza)은 조류에만 감염하던 종류의 독감 바이러스의 변종으로 조류에서 고병원성을 보이고, 나아가 인체에까지 감염하여 높은 치사율을 보이고 있다. 이렇게 높은 병원성을 보이는 고병원성 조류독감은 국제수역사무국(OIE)에서도 가장 위험한 등급인 리스트 A(List A) 질병으로 분류하고 있으며, 국내외 양계산업뿐만 아니라, 1997년 홍콩에서의 조류독감 바이러스(Avian influenza virus; 이하, AIV)에 의한 인체감염 사례가 처음 보고된 이례, 공중보건학적 측면에서도 매우 중요시되고 있는 질병이다.

독감 바이러스는 바이러스를 이루고 있는 뉴클레오캡시드(Nucleocapsid) 단백질 및 매트릭스(Matrix) 단백질의 항원성의 차이에 따라 A형, B형 및 C형으로 분류하며, 조류에서는 A형 독감 바이러스만이 분리 보고되고 있다. A형 독감 바이러스는 표면당단백질로 해마글루티닌(Haemagglutinin; 이하, HA)과 뉴라미니데이즈(Neuraminidase; 이하, NA)를 가지고 있는데, 현재까지 분리된 A형 인플루엔자 바이러스의 경우 HA는 16종류, NA는 9종류의 혈청형이 보고되어 있으며, 이들의 조합에 따라 아형(subtype)으로 구분되고, 따라서 다양한 혈청형의 독감 바이러스가 존재하는 것을 의미한다. AIV의 다양한 혈청형 중 현재까지 발생한 고병원성 조류독감은 모두 H5 또는 H7 혈청형에 의한 것으로 나타났다.

우리나라에서 과학적으로 확인된 첫 고병원성 조류독감(Highly Pathogenic Avian Influenza; HPAI)의 발생은 2003년 유행이 보고된 이후 베트남, 태국 및 인도네시아 등 동남아 국가들의 가금류에서 지속적으로 유행하고 있으며 중국, 중동지역 및 유럽을 거쳐서 아프리카 대륙까지 총 36개 국가로 확산을 거듭하고 있다. 인체감염 사례도 2003년 베트남 3명 및 중국 1명 등 총 4명에 불과하였으나 2006년 11월 29일 현재 터키, 이라크, 이집트 등을 포함한 10개 국에서 258명(154명 사망)까지 늘어났다. 실제로 조류독감은 지리적 확산뿐 아니라 다양한 생물종의 감염으로 종(種)간 확산도 계속 확인되고 있으며, 유전적 변이도 계속 진행되고 있기 때문에 세계보건기구를 포함한 각국에서 모두 예의 주시하고 있는 질환이다.

사실 생태·유전학적 특성상 인체에 잘 적응하는 신종 독감 바이러스는 확률적으로 출현할 수밖에 없다. 단지 그 시기를 알 수 없을 뿐이다. 세계보건기구가 각국에 신종 독감의 범유행에 대해 철저한 대비를 강조하고 있는 이유는 바로 이 때문이며, 선진국일수록 이에 대한 대비가 사회 전반에 걸쳐서 잘 되어 있다. 신종 독감의 범유행은 피해규모가 워낙 막대하기 때문에 광범위하고 장기적인 대비가 되어야 한다. 현재까지 개발된 조류독감 백신으로는 멕시코에서 사용 중인 H5N2 혈청에 대한 사독오일백신(inactivated oil vaccine; Intervet Mexico사, 멕시코)과 계두바이러스를 벡터로 한 H5 혈청형에 대한 유전자재조합 백신(H5 recombinant fowl pox-vectored AI vaccine; Merial Select사, 미국)이 있고(Avian Diseases, 2003. 47 : 1002-1005), 이탈리아에서 개발되어 사용 중인 이른바 디바(DIVA) 백신이 있다(Differentiating Infected from Vaccinated Animals; DIVA, Avian Pathology, 2003. 32(1) : 47-55). 이탈리아의 디바 백신은 H7N1 형의 HPAI를 방어하기 위하여 저병원성의 H7N3 형의 바이러스를 백신주로 사용하여 개발한 백신으로, N형이 다른 점을 이용하여 감염동물과 백신접종동물을 혈청학적으로도 감별할 수 있는 장점이 있다. 또한, 메리알 셀렉트사의 유전자재조합 백신은 고병원성 바 이러스 H5N2와 그외 여덟 가지 H5 아형에 유효한 것으로 보고되었다. 그러나, 조류독감은 전술한 바와 같이 다양한 혈청형이 존재하며, 혈청형이 다르면 방어도 되지 않기 때문에, 독감 바이러스의 다양한 변이에 민감하지 않으면서 동시에 조류독감 바이러스의 다양한 변이체와 특이적으로 반응할 수 있어야 한다.

그러나 현재의 독감 백신들 대부분은 주로 하나의 표면 당단백질 헤마글루티닌에 대항하여 중화항체를 유도하는 것을 목표로 하고 있다. HA가 항원돌연변이(antigenic drift)나 항원유전자재조합(antigenic shift)등 유전적 재조합에 자유롭기 때문에(뉴클레오티드 당 1 년에 10.3개가 치환됨), 현재까지는 광범위 적용의 독감 백신이 개발되어 있지는 않다. 결과적으로, 세계보건기구에 의해 제안됨에 따라 매년 백신 종을 최신의 것으로 바꾸는 것이 필요하다. 전술한 문제점을 해결하기 위해서는 독감 바이러스의 다양한 변화된 아형을 교차-보호(cross-protection)할 수 있는 광범위 적용 백신의 개발이 필요하기 때문에, 최근의 연구들은 독감 바이러스 A의 표면 단백질인 M2 단백질의 세포외 영역(extracellular domain of influenza virus M2 protein; 이하 M2eX)에 관심을 두고 있다. M2eX는 독감 바이러스 아형간 아미노산 서열의 변이가 적은 지역으로, 상기 연구들은 쥐에서 M2eX-기반 백신이 여러 가지 유형의 단백질 구조물들(항원)에서 효율적으로 보호적 면역을 유발할 수 있는 것을 증명하였다. M2eX와 Ｂ형 간염 바이러스 코어 단백질(hepatitis B virus core protein; HBc)의 융합 단백질(fusion protein)인 M2HBc는 치사 독감 바이러스에 감염된 쥐를 90 내지 100% 보호할 수 있다고 보증하였고, 더욱 중대한 것은, M2eX 단백질에 의해 유발되는 보호적 면역이 또한 광범위 적용인 것을 알게 된 것이었다. M2HBc 백신은 H1N1 또는 H3N2 아형 독감 종에 의한 치사로부터 쥐를 보호하였고, 또한 유사한 결과가 최근의 다른 연구들에서 지속적으로 보고되고 있다. 즉, M2eX 단백질은 광범위 적용 면역을 유발할 수 있는 아형간 아미노산 서열이 매우 높게 보존된 것으로 생각되고, 상기 단백질은 다양한 변이체를 갖는 조류독감 바이러스 백신 개발을 위한 에피토프로서 훌륭한 후보 단백질이 될 수 있다.

조류독감 및 독감 바이러스의 감염 예방에 항체 생성에 의한 체액성 면역 반응뿐 아니라 T 세포에 의한 세포성 면역 반응 또한 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 바이러스는 세포밖에 존재하지 않고, 숙주세포와 연관되어 세포 안에 존재하여 증식하는 항원이기 때문에, 체액성 면역반응으로는 항체가 직접적으로 세포를 통과하여 들어갈 수 없어서 상기 항원을 효과적으로 제거하기 어렵고, 항원이 존재하는 세포 내부의 문제를 해결하여야 한다. 즉, 보다 효과적으로 세포 내부와 연관된 항원을 제거하기 위하여 세포성 면역 반응이 필요하게 된다.

본 발명은 체액성 면역반응과 세포성 면역반응을 유도할 수 있는 항원 단백질을 동시에 포함하도록 재조합된 아데노바이러스 기반 백신 조성물을 제조하여, 생쥐에서 상기 백신 조성물의 면역원성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 독감 바이러스의 다양한 아형에 대해 광범위하게 적용되며, 체액성 면역반응과 세포성 면역반응을 동시에 유도할 수 있는 항원 단백질을 포함하는 독감 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 일 양태로 i) 헤마글루티닌(Haemagglutinin; 이하, HA) 단백질과 M2 단백질의 세포외 영역(M2eX)을 포함하는 체액성 면역반응 유도 융합 폴리펩티드와 ii) 독감 바이러스의 매트릭스 또는 뉴클레오캡시드 단백질(Nucleocapsid Protein; 이하, NP)을 포함하는 세포성 면역반응 유도 폴리펩티드를 포함하는 독감 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다. 바람직하게, 상기 독감은 인체 독감 또는 조류 독감을 포함한다.

본 발명에 따른 상기 백신 조성물은 체액성 면역반응 유도 융합 폴리펩티드와 세포성 면역반응 유도 폴리펩티드가 하나의 융합 폴리펩티드 형태로 포함되거나 또는 각각 별개의 폴리펩티드로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 체액성 면역반응 유도 융합 폴리펩티드와 세포성 면역반응 유도 폴리펩티드가 각각 별개의 폴리펩티드로 포함되는 것을 특징으로 한다.

상기 백신 조성물의 체액성 면역반응 유도 융합 폴리펩티드에 포함되는 HA 단백질은, 바람직하게, 신호서열(signal sequence) 및 막통과부분(transmembrane)부터 C-터미널까지의 핵산을 제거하여 발현시킨 것일 수 있고, 다양한 형태의 독감 바이러스, 예를 들면, 인체 독감 또는 조류 독감 바이러스에서 유래할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 HA 펩티드의 단편을 포함한다.

또한, 체액성 면역반응 유도 융합 폴리펩티드에 포함되는 상기 M2eX는 독감 바이러스의 표면 단백질 매트릭스 2(서열번호 10)의 세포외 영역(Extracellular domain)으로써 아미노산 서열의 변이도가 낮으며, 바람직하게는 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 14 또는 서열번호 15의 아미노산 서열을 가지는 23 개의 아미노산으로 구성될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물 내 체액성 면역반응 유도 융합 폴리펩티드는 상기 M2eX 부분을 1개 포함할 수 있으나, 바람직하게는 1 내지 8개, 더욱 바람직하게는 3개, 4개 또는 8개의 M2eX가 링커에 의해 연결되어 발현되도록 포함할 수 있다. 이때, 하나 이상의 상기 연결되는 M2eX는 아미노산 서열이 동일한 것일 수도 있고, 서로 다른 아미노산 서열을 나타내는 것을 2 이상 조합하여 연결할 수도 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 M2eX 2개와 서열번호 9의 아미노산 서열을 가지는 M2eX 1개를 GS 링커에 의해 연속적으로 연결한 형태(M2eX3, 서열번호 4)로 상기 백신 조성물의 체액성 면역반응 유도 융합 폴리펩티드를 제조하였다.

바람직하게, 본 발명에 따른 상기 백신 조성물의 체액성 면역반응 유도 융합 폴리펩티드는 체액성 면역반응을 증가시키는 추가의 폴리펩티드를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 체액성 면역반응의 증가를 위해 인간 CD40L(CD40리간드)의 세포외 영역을 사용하였다(도 1 참조).

본 발명에 따른 상기 백신 조성물에서 세포성 면역반응 유도 폴리펩티드는 매트릭스(Matrix, M) 또는 뉴클레오캡시드 단백질(Nucleocapsid Protein; 이하, NP; 서열번호 11)로 이루어지며, 매트릭스는 매트릭스 1(M1; 서열번호 12), 매트릭스 2(M2; 서열번호 13), 또는 매트릭스 1과 매트릭스 2의 융합 폴리펩티드를 포함하며, 바람직하게는 M1과 M2를 링커에 의해 연결한 융합 폴리펩티드(서열번호 2)이다. 매트릭스 1, 매트릭스 2 및 뉴클레오캡시드 단백질(NP)은 사람에서 강한 세포성 면역 반응을 유도하는 에피토프를 포함하고 있을 뿐 아니라 아미노산 서열이 잘 보존되어 있기 때문에(Lamb RA & Lai CJ, Virology 1981;112:746-51), 본 발명에서 세포성 면역반응 유도 폴리펩티드의 주요 항원으로 고안되었다.

상기한 바와 같이 체액성 면역반응 유도 융합 폴리펩티드와 세포성 면역반응 유도 폴리펩티드로 구성되는 본 발명의 백신 조성물은, 후술할 바와 같이, 항원에 특이적인 항체 반응과 CD8 세포성 면역반응을 잘 유도한 것을 확인할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 백신 조성물에 포함된 체액성 면역반응 유도 융합 폴리펩티드와 세포성 면역반응 유도 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에 따른 상기 재조합 뉴클레오티드는 체액성 면역반응 유도 융합 폴리펩티드와 세포성 면역반응 유도 폴리펩티드가 하나의 융합 폴리펩티드로 포함되거나 또는 각각 별개의 폴리펩티드로 발현되도록 재조합될 수 있다. 체액성 면역 반응 유도 융합 폴리펩티드와 세포성 면역반응 유도 폴리펩티드를 각각 별개의 폴리펩티드로 발현시키고자 할 경우, 상기 각각의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드는 각각 별개의 발현 벡터에 재조합되거나 또는 하나의 발현 벡터에 함께 포함되어 각각 별도로 발현되도록 재조합될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 상기 뉴클레오티드가 하나의 발현 벡터 내에 재조합된 후, 각각 별개의 폴리펩티드로 발현되도록 하기 위해 내부 리보솜 부착 부위(Internal Ribosome Entry Site; 이하, IRES)를 통하여 연결되었다. IRES는 두 개의 유전자에 대해 전사는 한번 일어나지만 단백질의 번역은 두 번 이상 일어날 수 있도록 하는 염기서열로, 두 유전자 사이에 삽입함으로써 하나의 프로모터에 의해 여러 유전자를 동시에 발현시키도록 한다(도 1 참조).

바람직하게, 본 발명에 따른 상기 백신 조성물의 체액성 면역반응 유도 융합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드는 신호서열을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 신호서열로서 Tissue Plasminogen Activator 유래 신호서열(이하, tpa)을 사용하였다(도 1 참조). 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 상기 tpa 신호서열을 포함한 상기 체액성 면역반응 유도 융합 폴리펩티드를 발현하는 재조합 폴리뉴클레오티드는, tpa 신호서열, M2eX, HA 단편 및 CD40L 세포외 영역을 코딩하는 뉴클레오티드를 N-말단으로부터 C-말단 쪽으로 순서대로 배치하여 구성하였다(도 1 참조). 이때, HA 단편을 코딩하는 뉴클레오티드는, 바람직하게, 신호서열(signal sequence) 및 막통과부분(transmembrane)부터 C-터미널까지의 핵산을 제거한 것일 수 있다.

본 발명에 따른 세포성 면역반응 유도 매트릭스 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 또한 신호서열을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 상기 신호서열로서 체액성 면역반응 유도 융합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드에서 사용한 것과 같은 tpa를 사용하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따라 체액성 면역반응 유도 융합 폴리펩티드와 세포성 면역반응 유도 폴리펩티드를 함께 발현하도록 IRES를 통해 연결된 재조합 폴리뉴클레오티드의 구성을 도 1에 나타내었다. 또한, 상기 재조합 뉴클레오티드의 염기서열을 서열번호 1 및 서열번호 2로 나타내었다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 재조합 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다.

본 발명에 따른 상기 재조합 아데노바이러스 벡터는 본 발명에 따른 상기 재조합 뉴클레오티드를 제한효소를 이용하여 아데노바이러스 벡터에 주입하여 제조될 수 있다. 바람직하게, 상기 아데노바이러스 벡터는 복제-결함 아데노바이러스 벡터(Replication-defective adenovirus vector)인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 복제-결함 아데노바이러스 벡터로서 Q-Biogene사(미국)의 pAdEasy 벡터를 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 양태로서, 상기 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터를 숙주세포에 감염시켜 증폭하는 과정을 포함하는 조류독감 예방 또는 치료용 백신의 제조방법을 제공한다. 상기 방법은 바람직하게, 상기 숙주세포로부터 제조된 재조 합 아데노바이러스를 CsCl를 이용한 Ultrafugation 법에 의해 분리 정제하는 것을 더 포함한다.

상기 숙주세포는 동물세포이고, 상기 동물세포는 바람직하게는 293 또는 Trex-293 세포인 것을 특징으로 한다.

상기 방법으로 수득한 조류독감 백신의 면역원성을 측정하기 위하여 상기 백신을 생쥐에 접종하여 보았다. 상기 백신이 독감 바이러스의 인체 감염에 대해 실제로 방어작용을 수행할 수 있는지 확인하기 위해, 사람의 조직적합성항원(human leukocyte antigen; 이하, HLA)을 발현하는 유전자 조작(Transgenic) 생쥐를 사용하였다. 백신의 접종 농도와 방법을 달리하여 1차 접종과 2차 접종을 일정한 간격을 두고 수행한 결과(표 1, 도 2 참조), HA에 대한 항체반응을 관찰할 수 있었고(도 3-A 참조), 1차 호흡기 접종 후 2차 근육 접종 시, 1차와 2차를 호흡기 접종한 것에 비해 10 배 정도 강한 HA 반응을 유도함을 알 수 있었다(도 3-B 참조). 또한, 혈청 내에서 M2eX에 특이적인 IgG와 IgA가 백신의 접종량에 비례하여 그 유도량이 변화하는 것을 알 수 있었고(도 4 참조), 호흡기 접종과 근육 접종을 병행한 경우에 조류독감 바이러스 감염을 방어하는데 중요한 역할을 하는 호흡기 점막에서 M2eX에 대한 IgG와 IgA가 유도되었음을 알 수 있었다(도 5 참조)[도4: 혈청내에서, 도5: 호흡기 점막에 측정한 M2eX에 대한 항체 반응]. 또한, 호흡기 점막에서 세포성 면역 반응이 유도됨을 비장 세포를 이용한 실험을 통해 확인할 수 있었고(도 6 참조), 호흡기 접종과 근육 접종을 수행한 생쥐의 폐점막에서 얻은 세포에서 항원 (매트릭스 1)에 특이적인 CD8 세포성 면역 반응이 유도되었음을 확인할 수 있었다(도 7 참조).

마지막으로, 상기 백신이 독감 바이러스의 감염에 대해 실제로 방어효능을 보이는지 확인하기 위해, Babl/c 생쥐에 5x10⁶pfu의 백신을 2주 간격으로 2회 접종 후 최종면역화 후 4주에 이종근원의 H5N2 조류인플루엔자 바이러스를 5LD₅₀로 감염후 몸무게 변화와 생존률을 관찰하였다(도 2 참조). 도 8에서와 같이 상기 백신을 면역화한 모든 생쥐는 바이러스 감염 후 몸무게 감소가 크지 않았고 모두 생존한 반면 대조군인 면역화하지 않은 생쥐(Naive)의 경우 감염 후 몸무게 감소가 컸으며 모두 생존하지 못하였다.

따라서, 본 발명은 또 하나의 양태로서, 1차적으로 본 발명의 면역반응 유도 융합 폴리펩티드를 포함하는 백신 조성물을 호흡기내, 근육내, 피하, 정맥내 또는 동맥내, 바람직하게는 호흡기내에 인간을 포함한 개체에 투여하고, 2차적으로 본 발명의 면역반응 유도 융합 폴리펩티드를 포함하는 백신 조성물을 일정 시간 경과 후 호흡기내, 근육내, 피하, 정맥내 또는 동맥내, 바람직하게는 근육내에 투여함으로써(도 2 참조) 조류 독감바이러스를 효과적으로 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 당업자에게 잘 알려진 현탁액, 용액 또는 에멀젼 등으로 제형화하여 사용할 수 있다. 바람직한 약제학적으로 허용되는 담체로는 섭취, 흡입 또는 좌제에 의한 직장 또는 질로의 투여를 위해 적합한 멸균된 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼이 포함될 수 있다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성유(예, 올리브유) 및 특정 유기 에스테르(예, 에틸 올레에이트)를 들 수 있다. 수성 담체로는 물, 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액(염수 및 완충된 매질을 포함)이 포함된다. 또한, 보존제 및 기타 첨가제, 예를 들면 항균제, 항산화제, 킬레이트화제 및 불활성 가스 등이 존재할 수 있다.

바람직하게, 상기 백신 조성물은 당해 분야에 잘 알려진 면역보조제를 더 포함할 수 있다. 바람직한 면역 보조제로는, 이에 제한되는 것은 아니나, Poly(lactic-co-glycolic acid; PLGA), 싸이토카인 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 방법, 백신이 투여되는 조직(예, 근육, 호흡기), 목적하는 항체 역가, 면역화 대상자의 특정한 치료 요건 등에 의해 다양할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물의 유효용량은 10⁵ pfu(plaque forming unit) 내지 10¹² pfu/체중 kg이고, 바람직하게는 10⁸ 내지 10¹¹ pfu/체중 kg이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 재조합 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 백신을 제공한다.

바람직하게, 상기 DNA 백신은 본 발명의 재조합 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한다.

상기 DNA 백신은 면역 반응의 향상 및/또는 접종 후의 적절한 흡수 속도의 촉진을 위해 애주번트를 더 포함할 수 있다. 허용가능한 애주번트는 프로인트 완전애주번트, 프로인트 불완전애주번트, 사포닌, 미네랄 젤 예컨대 수산화 알루미늄, 계면활성제 예컨대 리소레시틴, 플루론 폴리올, 다중음이온, 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 에멀전, 키홀림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, 등을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 백신은 추가로 약리학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다. 백신에 적합한 담체는 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 설탕 등을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀젼일 수 있다. 비-수용액 담체의 예는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사 가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸올리에이트를 들 수 있다. 수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양 보충제 등을 포함한다. 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 예를 들면 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것이 추가로 존재할 수 있다. 바람직한 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B를 포함한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 인간 또는 동물에게 면역에 유효한 양의 본 발명의 백신을 접종하여 인간 또는 동물의 독감을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 목적을 위해 본 발명의 "면역에 유효한 양"의 백신은 체중 1 g 당 0.1 ㎍ 이상이며, 바람직하게는 체중 1 g 당 0.001 ㎍ 내지 1 ㎍의 범위이다.

본 발명의 독감 예방 또는 치료용 백신 조성물은 체액성 면역반응과 세포성 면역반응을 동시에 유도할 수 있어, 조류 독감 또는 인체 독감 바이러스의 다양한 아형에 대해 광범위한 적용이 가능한 장점이 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예로 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 재조합 아데노바이러스 기반의 조류독감 예방용 백신의 제조

<1-1> pShuttle tet 10 벡터의 제조

서열번호 3의 Tetracycline response element를 유전자 합성에 의해 제작하 고, 양끝의 NdeI와 BamHI를 이용하여 pShuttle CMV(Q-Biogene, USA)의 NdeI와 BglII에 삽입하여, pShuttle tet 10 벡터를 제조하였다.

<1-2> 재조합 아데노바이러스의 제조

체액성 면역반응과 세포성 면역반응을 유도할 수 있는 뉴클레오티드를 발현할 수 있는 벡터를 제조하고자 하였다.

구체적으로, IRES 유전자를 서열번호 6과 서열번호 7의 프라이머를 이용하여 증폭하고(PCR 조건: 95℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분; 28회), 얻어진 PCR 산물을 SalI과 BamHI 제한 효소를 이용하여 pSK+ 벡터(Stratagene, USA)에 삽입하였다(pSK+ IRES). 그 다음, tpa-M1-GS-M2에 해당하는 유전자를 합성(서열번호 2)한 뒤, NcoI과 XbaI 제한 효소를 이용하여 pSK+ IRES와 연결함으로써 pSK+ IRES-tpa-M1-GS-M2를 제작하였다. 또한, 서열번호 1의 tpa-M2eX-HA0(ΔTM)-hCD40L(ecd) 유전자를 합성하고 KpnI과 XbaI 제한효소를 이용하여 pSK+ 벡터(Stratagene, USA)에 삽입하여 pSK+ tpa-M2eX-HA0(ΔTM)-hCD40L(ecd)를 제작하였다. 이어서, pSK+ IRES-tpa-M1-GS-M2로부터 IRES-tpa-M1-GS-M2를 NheI과 NotI 제한효소를 이용하여 잘라내어, pSK+ tpa-M2eX-HA0(ΔTM)-hCD40L(ecd)에 삽입함으로써 pSK+ tpa-M2eX-HA0(ΔTM)-hCD40L(ecd)-IRES-tpa-M1-GS-M2를 제작하였다. 다시, EcoRV와 XbaI 제한효소를 이용하여 tpa-M2eX-HA0(ΔTM)-hCD40L(ecd)-IRES-tpa-M1-GS-M2를 실시예 1-1의 방법으로 제조한 pShuttle tet 10 벡터에 삽입하여 pShuttle tet 10-tpa-M2eX-HA0(ΔTM)-hCD40L(ecd)-IRES-tpa-M1-GS-M2을 완성하였다. 마지막으로, 상기의 방법으로 수득한 벡터를 pAdEasy 벡터(Q-Biogene, USA)와 Q-Biogene에서 제시한 매뉴얼에 따라 재조합하여, tpa-M2eX-HA0(ΔTM)-hCD40L(ecd)-IRES-tpa-M1-GS-M2의 유전자를 가진 아데노바이러스 벡터를 완성하였다.

<1-3> 본 발명 조류독감 예방용 백신의 제조

실시예 1-2에 의해 제작된 아데노바이러스 벡터를 이용하여, Q-Biogene에서 제시한 매뉴얼에 따라 293 세포(ATCC) 또는 Trex-293 세포(Invitrogen, USA)에서 아데노바이러스를 생산하고, CsCl를 이용한 Ultrafugation법에 의해 재조합 단백질을 분리정제 하였다.

< 실험예 1> 본 발명 조류독감 예방용 백신의 면역원성 측정

<1-1> 본 발명 조류독감 예방용 백신의 접종 및 조류 인플루엔자 바이러스 감염

실시예 1의 방법으로 수득한 조류독감 바이러스 백신을 생쥐에 접종함으로써 면역원성을 확인하고자 하였다. 상기 백신이 독감 바이러스의 인체 감염에 대해 실제로 방어작용을 수행할 수 있는지 확인하기 위해, 사람의 조직적합성항원(human leukocyte antigen; 이하, HLA)-A2를 포함하도록 감염된 생쥐(Institut Pasteur)를 사용하였고 상기 백신의 방어효능을 확인하기 위해 Balb/c 생쥐를 사용하였다. 백신의 접종 농도와 방법을 달리하여, 1차 접종과 2차 접종을 일정한 간격을 두고 수행하였다(표 1, 도 2). 실험군 1 내지 4는 1차 접종과 2차 접종을 모두 근육 접종으로 수행(IM-IM)하였고, 실험군 5 내지 8은 1차 접종은 호흡기 접종으로, 2차 접종은 근육 접종으로 수행(IN-IM)하였다(표 1). 1차 접종 후 2주 후에 2차 접종을 수행하였고, IM-IM 실험군의 검사를 위해서는 초기 접종 후 3주, IN-IM 실험군의 검사를 위해서는 초기 접종 후 3.5주 만에 시료용 혈액을 채취하였다. 최종 면역화 후 4주에 이종근원의 H5N2 조류인플루엔자 바이러스를 마취 후 호흡기를 통해 5LD₅₀로 감염한 후 몸무게 변화와 생존률을 관찰하였다.

실험군 별 항원의 접종 방법

실험군	항원	접종 방법
1	rAd-EGFP (5×10⁶pfu) - rAd-EGFP (5×10⁶ pfu)	IM-IM
2	rAd-AI (5×10⁴pfu) - rAd-AI (5×10⁶ pfu)	IM-IM
3	rAd-AI (5×10⁵pfu) - rAd-AI (5×10⁶ pfu)	IM-IM
4	rAd-AI (5×10⁶pfu) - rAd-AI (5×10⁶ pfu)	IM-IM
5	rAd-EGFP (5×10⁶pfu) - rAd-EGFP (5×10⁶ pfu)	IN-IM
6	rAd-AI (5×10⁴pfu) - rAd-AI (5×10⁶ pfu)	IN-IM
7	rAd-AI (5×10⁵pfu) - rAd-AI (5×10⁶ pfu)	IN-IM
8	rAd-AI (5×10⁶pfu) - rAd-AI (5×10⁶ pfu)	IN-IM

<1-2> HA 에 대한 항체 반응 검사

실험예 <1-1>에서 서술한 방법으로 수득한 시료들의 HA에 대한 항체 반응을 알아보기 위하여, FACS(fluorescence activated cell sorter; BD, USA)를 수행하였다. FACS를 이용한 방법에서는 백신에 사용한 것과 같은 HA를 세포표면에 발현하는 Cos7 세포(한국세포주은행)를 이용하여 항체 반응을 측정하였다. H5N1 아형의 조류독감 바이러스의 경우, 감염의 위험성 때문에 실제 바이러스를 이용한 중화 항체 실험을 하는 것이 제한적인데, Cos7 세포 표면에 발현된 HA는 조류독감 바이러스의 표면에 있는 HA와 유사한 구조로 되어 있으므로 박테리아 등에서 정제된 HA 단백질을 이용하는 것보다 실제 방어 능력을 정확하게 측정할 수 있다는 장점이 있다.

그 결과, HA에 대한 항체반응을 관찰할 수 있었고(도 3-A 참조), 실험군 4(IM-IM, 5×10⁶ pfu)의 경우 약 5x10³ titer 정도, 실험군 8(IN-IM, 5×10⁶ pfu)은 약 4.5×10⁵ titer 정도의 HA에 대한 항체 반응을 유도하였다. 즉, IN-IM 방법에 IM-IM 방법보다 10배 정도 강한 HA 항체 반응을 유도함을 알 수 있다(도 3-B).

<1-3> M2eX 에 대한 항체 반응 검사

독감 및 조류독감 바이러스에서 비교적 서열 변이가 적어 다른 아형에도 작용할 수 있는 M2eX 부분에 대한 항체 반응 유도를 확인하고자, M2eX에 해당하는 펩티드를 합성하여 항체반응을 측정하였다.

M2eX peptide를 PBS에 2 ㎍/㎖의 농도로 녹이고, 50 ㎕씩 96 웰 ELISA 플레이트에 분주하고 4℃에서 밤새도록 반응을 시킨다. 용액을 제거한 후, 200 ㎕의 5% 탈지유(Tween을 PBS에 0.05%되게 녹인 후, 탈지유를 5%로 녹임)를 분주하고 상온에서 1시간 동안 반응시킨다. 용액을 제거한 후, 200 ㎕의 PBST로 두 번 세척한다. 실험 동물에서 얻은 혈청이나 폐를 세척한 용액을 5% 탈지유에 희석(혈청의 경우 1:100, 폐 세척액의 경우 1:2)하고, 이를 50 ㎕씩 각 웰에 분주하고, 37℃에서 2시간 반응시킨 뒤 용액을 제거하고 PBST로 5번 세척한다. 항-마우스 IgG 또는 IgA-HRP를 5% 탈지유에 1:3000으로 희석하고, 이를 50 ㎕씩 각 웰에 분주하였다. 상온에서 90분간 반응한 후, 용액을 제거하고 PBST로 7번 세척하였다. Peroxidase substrate를 50 ㎕씩 분주하고 발색한 후, 50 ㎕의 2N H₂SO₄를 첨가하여 반응을 정지하였다. 450 nm에서 흡광도를 측정하여 결과를 얻었다.

그 결과, 혈청 내에서 M2eX에 특이적인 IgG와 IgA가 백신의 접종량에 비례하여 그 유도량이 증가하는 것을 확인하였다(도 4). 또한, 호흡기 접종과 근육 접종을 병행한 경우(IN-IM)에 M2eX에 대한 IgG와 IgA가 호흡기 점막에서도 유도되었음을 호흡기 점막을 세척한 용액을 이용하여 확인하였다(도 5).

<1-4> 세포성 면역반응에 대한 검사

다른 아형의 독감 및 조류독감 바이러스에 항체보다 보다 효과적으로 작용할 수 있는 세포성 면역 반응을 조사하였다.

그 결과, M1의 항원 결정기에 대한 CD8 T 세포성 면역반응이 잘 유도됨을, 비장 세포를 이용한 실험을 통해, IFN-감마 ELISPOT과 IFN-감마 세포내 염색(Immune Network 5:1-10, 2005에서 기재한 방법으로 수행하고, 자극제는 아미노산 서열이 GILGFVFTL인 M1에 대한 항원 결정기를 사용하였다)에서 유사한 결과를 얻음으로써, 확인할 수 있었다(도 6).

또한, 호흡기 접종과 근육 접종을 수행한 생쥐의 폐점막에서 얻은 세포에서 항원(매트릭스 1)에 특이적인 CD8 세포성 면역 반응이 유도되었음을 확인함으로써(도 7), 조류독감 등의 독감 바이러스에 대한 방어에 보다 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려진 호흡기 점막에서 세포성 면역 반응이 유도됨을 알 수 있었다.

<1-5> 방어 효능 관측

상기 백신을 접종한 생쥐에 이종근원의 다른 아형 (H5N2) 조류독감 바이러스를 감염 한 후 몸무게 변화와 생존률을 관찰함으로써 방어효능을 관측하였다. 그 결과, 상기 백신을 접종한 모든 생쥐는 면역화하지 않은 대조군 (Naive) 생쥐에 비해 바이러스 감염 후 몸무게 감소가 크지 않았고 모두 생존하였다 (도 8).

본 발명에 의해 제조된 백신은 체액성 면역반응과 세포성 면역반응을 동시에 유도할 수 있어 독감 바이러스의 다양한 아형에 적용이 가능하여, 다양한 변이체에 의해 유발되는 독감 예방용 백신으로 효율적으로 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 백신인 재조합된 항원 단백질의 구성을 나타낸 도이다.

도 2는 면역화 및 감염 수행을 위한 시간 계획을 나타낸 도이다.

도 3은 본 발명 백신의 헤마글루티닌(Haemagglutinin; 이하, HA)에 대한 항체 반응을 나타낸 도이고;

도 3-A는 본 발명에 따른 백신을 5x10⁶ pfu를 사용하여, 1차와 2차 접종을 근육 접종으로 수행(IM-IM)한 결과이고,

도 3-B는 본 발명에 따른 백신을 5x10⁶ pfu를 사용하여, 1차는 호흡기, 2차는 근육 접종으로 수행(IN-IM)한 결과이다.

도 4는 본 발명 백신의 독감 바이러스 A의 표면 단백질인 매트릭스 2 단백질의 세포외 영역(extracellular domain of influenza virus M2 protein; 이하 M2eX)에 대한 혈청에서 유도된 항체 반응을 나타낸 도이다.

도 5는 본 발명 백신의 호흡기 점막에 유도된 M2eX에 대한 항체 반응을 나타낸 도이다.

도 6은 본 발명 백신의 매트릭스 1에 대한 CD8 세포성 면역 반응을 나타낸 도이다.

도 7은 본 발명에 따른 백신을 5x10⁶ pfu를 사용하여 1차는 호흡기, 2차는 근육 접종으로 수행(IN-IM)한 결과, 호흡기 점막에 유도된 매트릭스 1에 대한 CD8 세포성 면역 반응을 나타낸 도이다.

도 8은 본 발명에 따른 백신 2회 면역화 후 이종 유래의 H5N2 조류인플루엔자 바이러스를 5LD₅₀로 감염하여 방어 효능을 나타낸 도이다.

<110> Genexine Co., Ltd <120> A vaccine composition against influenza A viruses <130> PA080150 <150> KR10-2007-0037115 <151> 2007-04-16 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2509 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> humoral immume response-inducing region <220> <221> sig_peptide <222> (13)..(78) <223> Tissue Plasminogen Activator signal sequence; tpa <220> <221> gene <222> (79)..(312) <223> M2eX3 <220> <221> gene <222> (322)..(1845) <223> Haemagglutinin <220> <221> gene <222> (1855)..(2502) <223> hCD40Lecd <400> 1 ggtaccgata tcatggacgc catgaagagg ggcctgtgct gcgtgctgct gctgtgcggc 60 gccgtgttcg tgagcccctc gcttctaacc gaggttgaga ccccaactag aaatgaatgg 120 gagtcccgct cttcagatag ctctgacggg tctgggtcct tgttaactga ggtcgaaacg 180 cctacccgaa acgaatggga atcccggagc agtgattcca gtgacggttc aggatctctc 240 ctgaccgaag tggaaacacc cacacgtaac gagtgggagt gcaggtgtag cgatagtagc 300 gacggcagcg gcagcgctag ccacgccaac aactggaccg agcaggtgga caccatcatg 360 gagaagaacg tgaccgtgac ccacgcccag gacatcctgg agaagaccca caacggcaag 420 ctgtgcgacc tggacggcgt gaagcccctg atcctgcgcg actgcagcgt ggccggctgg 480 ctgctgggca accccatgtg cgacgagttc atcaacgtgc ccgagtggag ctacatcgtg 540 gagaaggcca accccgccaa cgacctgtgc taccccggcg acttcaacga ctacgaggag 600 ctgaagcacc tgctgagccg catcaaccac ttcgagaaga tccagatcat ccccaagaac 660 agctggagca gccacgaggc cagcctgggc gtgagcagcg cctgccccta ccagggcaag 720 agcagcttct tccgcaacgt ggtgtggctg atcaagaaga acaacgccta ccccaccatc 780 aagcgcagct acaacaacac caaccaggag gacctgctgg tgctgtgggg catccaccac 840 cccaacgacg ccgccgagca gacccgcctg taccagaacc ccaccaccta catcagcgtg 900 ggcaccagca ccctgaacca gcgcctggtg cccaagatcg ccacccgcag caaggtgaac 960 ggccagaacg gccgcatgga gttcttctgg accatcctga agcccaacga cgccatcaac 1020 ttcgagagca acggcaactt catcgccccc gagtacgcct acaagatcgt gaagaagggc 1080 gacagcgcca tcatgaagag cgagctggag tacggcaact gcaacaccaa gtgccagacc 1140 cccatgggcg ccatcaacag cagcatgccc ttccacaaca tccaccccct gaccatcggc 1200 gagtgcccca agtacgtgaa gagcaaccgc ctggtgctgg ccaccggcct gcgcaacagc 1260 ccccagcgcg agcgccgccg caagaagcgc ggcctgttcg gcgccatcgc cggcttcatc 1320 gagggcggct ggcagggcat ggtggacggc tggtacggct accaccacag caacgagcag 1380 ggcagcggct acgccgccga caaggagagc acccagaagg ccatcgacgg cgtgaccaac 1440 aaggtgaaca gcatcatcga caagatgaac acccagttcg aggccgtggg ccgcgagttc 1500 aacaacctgg agcgccgcat cgagaacctg aacaagaaga tggaggacgg cttcctggac 1560 gtgtggacct acaacgccga gctgctggtg ctgatggaga acgagcgcac cctggacttc 1620 cacgacagca acgtgaagaa cctgtacgac aaggtgcgcc tgcagctgcg cgacaacgcc 1680 aaggagctgg gcaacggctg cttcgagttc taccacaagt gcgacaacga gtgcatggag 1740 agcgtgcgca acggcaccta cgactacccc cagtacagcg aggaggcccg cctgaagcgc 1800 gaggagatca gcggcgtgaa gctggagagc atcggcacct accaggggcg cgccgcgcaa 1860 gcgccgaaat ccaaaatcga ggacgagcgc aacctgcacg aggacttcgt gtttatgaag 1920 accatccaac gctgtaatac cggcgagcgc agcctgagcc tgctcaattg cgaagaaatc 1980 aagtcccaat tcgaggggtt cgtcaaagac atcatgctga ataaggaaga aaccaagaag 2040 gagaactcct tcgagatgca gaagggcgac caaaaccccc agatcgccgc ccacgtgatc 2100 agcgaagcgt ccagcaagac caccagcgtc ctgcaatggg ccgagaaggg ctattatacg 2160 atgtccaata atctggtgac gctcgagaac ggcaagcaac tcacggtgaa gcgccagggc 2220 ctgtactaca tttacgcgca ggtgacgttt tgcagcaacc gcgaggccag cagccaggcc 2280 cccttcatcg cgtccctgtg tctgaaaagc ccgggccgct ttgaacgcat tctgctgcgc 2340 gccgccaaca cgcatagcag cgcgaagccc tgcggccagc agagcatcca tctgggcggc 2400 gtgttcgagc tgcagcccgg cgccagcgtc ttcgtcaacg tgaccgaccc ctcccaggtc 2460 tcccacggga ccgggtttac cagcttcggg ctgctgaagc tgatctaga 2509 <210> 2 <211> 1154 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cellular immune response-inducing region <220> <221> sig_peptide <222> (13)..(68) <223> Tissue Plasminogen Activator signal sequence; tpa <220> <221> gene <222> (69)..(824) <223> Matrix 1 <220> <221> repeat_unit <222> (825)..(854) <223> GS linker <220> <221> gene <222> (855)..(1148) <223> Matrix 2 <400> 2 ccatggacgc catgaagagg ggcctgtgct gcgtgctgct gctgtgcggc gccgtgttcg 60 tgagccccat gagtctcttg acggaagtag agacctatgt gctatccatc atcccgtctg 120 gcccccttaa ggcagagatc gcgcaaaagc ttgaggacgt gttcgccgga aaaaatacag 180 atttggaagc attaatggag tggctaaaga caaggccaat attgtcgccg ctgaccaaag 240 gtattctagg gttcgtcttt acgctcaccg tgccctccga aagagggctt cagagacgga 300 ggttcgtgca gaatgctctc aacggtaatg gggacccaaa taacatggat cgagcagtga 360 aactctacaa gaagttgaag cgagagataa cctttcatgg cgccaaagaa gtggcccttt 420 cttattctac cggagctctc gccagctgta tgggcttaat ttacaaccgt atggggactg 480 tgacgaccga ggtggctttc ggtcttgtgt gcgccacttg tgaacagatc gcggattccc 540 agcacagatc tcacaggcag atggctacaa tcactaatcc cctgattcgg catgagaaca 600 ggatggtcct ggcgagcaca acagccaaag ctatggaaca gatggccgga agtagcgagc 660 aggctgctga agcgatggaa atcgccaacc aggctaggca gatggttcag gcaatgcgta 720 ctatcgggac tcaccccaac agctcagccg gactccgcga caacttgctg gagaatctgc 780 aggcctacca aaagagaatg ggcgtccaga tgcaacgctt caagggaagc ggctcgggct 840 caggctcagg atctatgagt ctgctgaccg aagtagagac acctacccgc aacgagtggg 900 aatgccggtg cagcgactcc agtgatccta tagtcgttgc agccaatatc attggtattc 960 tgcacctgat cctgtggatt ctcgatcgac tgttctttaa atgtatttac cggcgcctga 1020 aatatgggct gaagagaggc ccagccactg caggcgtccc tgagtcaatg cgcgaggaat 1080 atcggcaaga gcaacagtcc gcagttgacg ttgacgatgg acattttgtg aacatcgagc 1140 tggagtaatc taga 1154 <210> 3 <211> 486 <212> DNA <213> Avian influenza virus <400> 3 catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat 60 gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc 120 gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac 180 tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggaaccaa 240 aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt 300 aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctctcc ctatcagtga tagagatctc 360 cctatcagtg atagagatcg tcgacgagct cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga 420 cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccggg accgatccag cctccggact 480 ctagcg 486 <210> 4 <211> 78 <212> PRT <213> Avian influenza virus <220> <221> REPEAT <222> (24)..(26) <223> GS linker <220> <221> REPEAT <222> (50)..(52) <223> GS linker <220> <221> REPEAT <222> (76)..(78) <223> GS linker <400> 4 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu Ser 1 5 10 15 Arg Ser Ser Asp Ser Ser Asp Gly Ser Gly Ser Leu Leu Thr Glu Val 20 25 30 Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu Ser Arg Ser Ser Asp Ser Ser 35 40 45 Asp Gly Ser Gly Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn 50 55 60 Glu Trp Glu Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp Gly Ser Gly 65 70 75 <210> 5 <211> 508 <212> PRT <213> Avian influenza virus <400> 5 His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn 1 5 10 15 Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly 20 25 30 Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys 35 40 45 Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile 50 55 60 Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn 65 70 75 80 Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His 85 90 95 Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys 100 105 110 Asn Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys 115 120 125 Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile 130 135 140 Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr 145 150 155 160 Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp 165 170 175 Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser 180 185 190 Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr 195 200 205 Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Asn Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr 210 215 220 Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe 225 230 235 240 Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala 245 250 255 Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln 260 265 270 Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser Met Pro Phe His Asn Ile His 275 280 285 Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu 290 295 300 Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg 305 310 315 320 Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly 325 330 335 Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu 340 345 350 Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile 355 360 365 Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr 370 375 380 Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile 385 390 395 400 Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr 405 410 415 Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp 420 425 430 Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln 435 440 445 Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr 450 455 460 His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr 465 470 475 480 Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile 485 490 495 Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr Tyr Gln 500 505 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRES forward primer <400> 6 gacgtcgacg ctagcgaatt ccccctctcc ctccc 35 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRES reverse primer <400> 7 gcgggatccc ccgccatggc catattatca tcgtgtt 37 <210> 8 <211> 23 <212> PRT <213> Avian influenza virus <400> 8 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu Ser 1 5 10 15 Arg Ser Ser Asp Ser Ser Asp 20 <210> 9 <211> 23 <212> PRT <213> Avian influenza virus <400> 9 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu Cys 1 5 10 15 Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp 20 <210> 10 <211> 97 <212> PRT <213> Avian influenza virus <400> 10 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu 1 5 10 15 Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp Pro Ile Val Val Ala Ala Asn Ile 20 25 30 Ile Gly Ile Leu His Leu Ile Leu Trp Ile Leu Asp Arg Leu Phe Phe 35 40 45 Lys Cys Ile Tyr Arg Arg Leu Lys Tyr Gly Leu Lys Arg Gly Pro Ala 50 55 60 Thr Ala Gly Val Pro Glu Ser Met Arg Glu Glu Tyr Arg Gln Glu Gln 65 70 75 80 Gln Ser Ala Val Asp Val Asp Asp Gly His Phe Val Asn Ile Glu Leu 85 90 95 Glu <210> 11 <211> 498 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 11 Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Gly 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Arg Met 20 25 30 Val Ser Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys 35 40 45 Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu 50 55 60 Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Arg Tyr Leu Glu 65 70 75 80 Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile 85 90 95 Tyr Arg Arg Arg Asp Gly Lys Trp Val Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp 100 105 110 Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Glu Asp 115 120 125 Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Leu Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn 130 135 140 Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp 145 150 155 160 Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser 165 170 175 Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu 180 185 190 Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg 195 200 205 Gly Glu Asn Gly Arg Arg Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn 210 215 220 Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Ala Met Met Asp 225 230 235 240 Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu 245 250 255 Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His 260 265 270 Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Leu Ala Val Ala Ser Gly 275 280 285 Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe 290 295 300 Arg Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Phe Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu 305 310 315 320 Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala 325 330 335 Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser Ser Phe Ile Arg Gly Thr Arg Val 340 345 350 Val Pro Arg Gly Gln Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn 355 360 365 Glu Asn Met Glu Ala Met Asp Ser Asn Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg 370 375 380 Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg 385 390 395 400 Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg 405 410 415 Asn Leu Pro Phe Glu Arg Ala Thr Ile Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn 420 425 430 Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Ile Ile Arg Met Met 435 440 445 Glu Ser Ala Arg Pro Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe 450 455 460 Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Asn Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp 465 470 475 480 Met Asn Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr 485 490 495 Asp Asn <210> 12 <211> 252 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 12 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Ile Pro 1 5 10 15 Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Lys Leu Glu Asp Val Phe 20 25 30 Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Ala Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr 35 40 45 Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe 50 55 60 Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Val 65 70 75 80 Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Arg Ala 85 90 95 Val Lys Leu Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala 100 105 110 Lys Glu Val Ala Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met 115 120 125 Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Thr Val Thr Thr Glu Val Ala Phe 130 135 140 Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg 145 150 155 160 Ser His Arg Gln Met Ala Thr Ile Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu 165 170 175 Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met 180 185 190 Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Ile Ala Asn Gln 195 200 205 Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Asn 210 215 220 Ser Ser Ala Gly Leu Arg Asp Asn Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr 225 230 235 240 Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys 245 250 <210> 13 <211> 97 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 13 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu 1 5 10 15 Cys Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp Pro Ile Val Val Ala Ala Asn Ile 20 25 30 Ile Gly Ile Leu His Leu Ile Leu Trp Ile Leu Asp Arg Leu Phe Phe 35 40 45 Lys Cys Ile Tyr Arg Arg Leu Lys Tyr Gly Leu Lys Arg Gly Pro Ala 50 55 60 Thr Ala Gly Val Pro Glu Ser Met Arg Glu Glu Tyr Arg Gln Glu Gln 65 70 75 80 Gln Ser Ala Val Asp Val Asp Asp Gly His Phe Val Asn Ile Glu Leu 85 90 95 Glu <210> 14 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 14 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys 1 5 10 15 Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 15 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 15 Phe Gln Ile Leu Ser Ile Cys Ser Phe Ile Leu Ser Ala Leu His Phe 1 5 10 15 Met Ala Trp Thr Ile Gly His 20

Claims

i) 독감 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 단백질 및 M2 단백질의 세포외 영역(M2eX)을 포함하는 체액성 면역반응 유도 융합 폴리펩티드와 ii) 매트릭스 단백질 또는 뉴클레오캡시드 단백질(Nucleocapsid Protein)을 포함하는 세포성 면역반응 유도 폴리펩티드를 포함하는 독감 예방 또는 치료용 백신 조성물.
제 1항에 있어서, 체액성 면역반응 유도 융합 폴리펩티드와 세포성 면역반응 유도 폴리펩티드가 하나의 융합 폴리펩티드 형태로 포함된 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 1항에 있어서, 체액성 면역반응 유도 융합 폴리펩티드와 세포성 면역반응 유도 폴리펩티드가 각각 별개의 폴리펩티드 형태로 포함된 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 1항에 있어서, 독감 바이러스의 매트릭스 단백질이 매트릭스 1(M1), 매트릭스 2(M2), 또는 매트릭스 1과 매트릭스 2의 융합 폴리펩티드인 것을 특징으로 하 는 백신 조성물.
제 4항에 있어서, 독감 바이러스의 매트릭스 단백질이 매트릭스 1 및 매트릭스 2의 융합 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 5항에 있어서, 독감 바이러스의 매트릭스 단백질은 매트릭스 1 과 매트릭스 2가 GS 링커(Glycine Serine linker)로 연결된 융합 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 1항에 있어서, M2eX 폴리펩티드는 인체독감 또는 조류독감 바이러스의 매트릭스 2의 세포외 영역(extracellular domain)인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 1항에 있어서, M2eX 폴리펩티드가 1개 포함되거나 또는 2 내지 8개가 연결된 형태로 포함된 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 8항에 있어서, M2eX 폴리펩티드는 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 14 또는 서열번호 15의 아미노산 서열을 가지며, 2 내지 8개의 연결된 형태로 포함되는 경우, M2eX 폴리펩티드의 각 아미노산 서열은 서로 동일하거나 또는 서로 상이한 것의 조합인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 9항에 있어서, M2eX가 3개(M2eX3), 4개(M2eX4) 또는 8개(M2eX8)가 연결된 형태인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 10항에 있어서, M2eX3가 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 1항에 있어서, HA는 인체 독감 또는 조류 독감 바이러스에서 유래한 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 12항에 있어서, HA는 신호서열(signal sequence) 및 막통과부 분(transmembrane)에서 C-터미널까지가 제거된 것임을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 13항에 있어서, HA는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 1항에 있어서, 체액성 면역반응 융합 폴리펩티드가 체액성 면역반응을 증가시키는 폴리펩티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 15항에 있어서, 체액성 면역반응을 증가시키는 폴리펩티드는 인간 CD40L(CD40리간드)의 세포외 영역인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 1항의 백신 조성물에 포함된 체액성 면역반응 유도 융합 폴리펩티드와 세포성 면역반응 유도 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드.
제 17항에 있어서, 세포성 면역반응 유도 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티 드가 신호서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 뉴클레오티드.
제 18항에 있어서, 신호서열은 tpa(tissue plasminogen activator) 유래 신호서열인 것을 특징으로 하는 재조합 뉴클레오티드.
제 17항에 있어서, 체액성 면역반응 유도 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드가 신호서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 뉴클레오티드.
제 20항에 있어서, 신호서열은 tpa(tissue plasminogen activator) 유래 신호서열인 것을 특징으로 하는 재조합 뉴클레오티드.
제 1항에 있어서, 체액성 면역반응 유도 융합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드와 세포성 역반응 유도 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드가 내부 리보솜 부착 부위(Internal Ribosome Entry Site; 이하, IRES)를 통하여 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 뉴클레오티드.
제 17항 내지 제 22항 중 어느 한 항의 재조합 뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제 23항에 있어서, 도 1의 개열지도를 포함하는 벡터.
제 23항에 있어서, 상기 벡터는 재조합 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
제 25항에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터는 복제-결함 아데노바이러스 벡터(Replication-defective adenovirus vector)인 것을 특징으로 하는 벡터.
제 17항 내지 제 22항 중 어느 한 항의 재조합 뉴클레오티드를 포함하는 독감 예방 또는 치료용 DNA 백신.