JP6602762B2 - ウイルス様粒子を含むワクチン - Google Patents
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Description
[1]エンベロープを有するウイルス粒子に由来するウイルス様粒子を含有するワクチンであって、
上記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量が、上記ウイルス粒子の脂質成分の含有量に対して低減している、ワクチン。
[2]上記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量が、上記ウイルス粒子の脂質成分の含有量を基準として、50質量%未満である、[1]に記載のワクチン。
[3]上記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量が、上記ウイルス粒子の脂質成分の含有量を基準として、20質量%未満である、[1]又は[2]に記載のワクチン。
[4]上記脂質成分がコレステロールである、[1]〜[3]のいずれかに記載のワクチン。
[5]上記ウイルス様粒子が、
上記ウイルス粒子の表面抗原、
上記ウイルス粒子のマトリックス蛋白質又は膜蛋白質、及び、
上記ウイルス粒子の核蛋白質、
を含む、[1]〜[4]のいずれかに記載のワクチン。
[6]上記ウイルス様粒子が、上記ウイルス粒子に由来するゲノム核酸を含む、[1]〜[5]のいずれかに記載のワクチン。
[7]上記ウイルス粒子が、オルソミクソウイルス粒子、フラビウイルス粒子、又はB型肝炎ウイルス粒子である、[1]〜[6]のいずれかに記載のワクチン。
[8]上記ウイルス粒子が、インフルエンザウイルス粒子、日本脳炎ウイルス粒子、又はB型肝炎ウイルス表面抗原(HBs)粒子である、[7]に記載のワクチン。
[9]上記ウイルス粒子が、インフルエンザウイルス粒子である、[8]に記載のワクチン。
[10]上記インフルエンザウイルス粒子が、A型インフルエンザウイルス粒子、又はB型インフルエンザウイルス粒子である、[9]に記載のワクチン。
[11]上記インフルエンザウイルス粒子が、H1N1亜型株、H2N2亜型株、H3N2亜型株、H3N8亜型株、H5N1亜型株、H5N2亜型株、H5N6亜型株、H6N1亜型株、H7N3亜型株、H7N7亜型株、H7N9亜型株、H9N2亜型株、又はH10N8亜型株に分類されるインフルエンザウイルス粒子である、[9]又は[10]に記載のワクチン。
[12]上記表面抗原が、ヘマグルチニン(HA)又はノイラミニダーゼ(NA)を含む、[8]〜[11]のいずれかに記載のワクチン。
[13]上記マトリックス蛋白質又は膜蛋白質が、M1蛋白質又はM2蛋白質を含む、[8]〜[12]のいずれかに記載のワクチン。
[14]上記ウイルス様粒子が、上記ウイルス粒子の粒子径の70〜130%の平均粒子径を有する、[1]〜[13]のいずれかに記載のワクチン。
[15]上記ウイルス様粒子が、ショ糖密度勾配遠心で測定した場合に、ショ糖濃度35%以上にピークが検出されるウイルス様粒子である、[1]〜[14]のいずれかに記載のワクチン。
[16]ウイルス様粒子を含有するワクチンの製造方法であって、
エンベロープを有するウイルス粒子に対して粒子構造を固定化する工程と、
固定化された上記ウイルス粒子に対して脱脂処理を行う工程と、
を含む、製造方法。
[17]上記固定化する工程が、上記ウイルス粒子を含む懸濁液Aに固定化剤を加える工程を含む、[16]に記載の製造方法。
[18]上記固定化剤がアルデヒド類を含む、[17]に記載の製造方法。
[19]上記固定化剤が1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドハイドロクロライド(EDC)を含む、[17]に記載の製造方法。
[20]上記アルデヒド類が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、及びそれらの組合せからなる群から選択される、[18]に記載の製造方法。
[21]上記アルデヒド類が、ホルムアルデヒドを含む、[20]に記載の製造方法。
[22]上記ホルムアルデヒドの濃度が、上記懸濁液A及び上記固定化剤の全量を基準として、0.007〜0.076w/v%である、[21]に記載の製造方法。
[23]上記アルデヒド類が、グルタルアルデヒドを含む、[20]に記載の製造方法。
[24]上記グルタルアルデヒドの濃度が、上記懸濁液A及び上記固定化剤の全量を基準として、0.002〜0.05w/v%である、[23]に記載の製造方法。
[25]上記脱脂処理を行う工程が、固定化された上記ウイルス粒子を含む懸濁液Bに脱脂剤を加える工程を含む、[16]〜[24]のいずれかに記載の製造方法。
[26]上記脱脂剤が、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、酢酸メチル、酢酸エチル、及びそれらの組合せからなる群から選択される、[25]に記載の製造方法。
[27]上記脱脂剤が、ジエチルエーテルを含む、[26]に記載の製造方法。
[28]上記ジエチルエーテルの濃度が、上記懸濁液B及び上記脱脂剤の全量を基準として、10vol%以上である、[27]に記載の製造方法。
[29]上記脱脂剤が界面活性剤を更に含む、[25]〜[28]のいずれかに記載の製造方法。
[30]上記ウイルス粒子が、培養細胞又は鶏卵に感染させて、回収されたウイルス粒子である、[16]〜[29]のいずれかに記載の製造方法。
[31]上記培養細胞が、Vero細胞、又はMDCK細胞である、[30]に記載の製造方法。
[32]ウイルスによる感染症を予防する方法であって、
エンベロープを有するウイルス粒子に由来するウイルス様粒子を含有するワクチンを対象に投与する工程を含み、
上記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量が、上記ウイルス粒子の脂質成分の含有量に対して低減している、方法。
[33]上記対象が哺乳動物である、[32]に記載の方法。
[34]上記対象がヒトである、[32]に記載の方法。
[35]上記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量が、上記ウイルス粒子の脂質成分の含有量を基準として、50質量%未満である、[32]〜[34]のいずれかに記載の方法。
[36]上記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量が、上記ウイルス粒子の脂質成分の含有量を基準として、20質量%未満である、[32]〜[35]のいずれかに記載の方法。
[37]上記脂質成分がコレステロールである、[32]〜[36]のいずれかに記載の方法。
[38]上記ウイルス様粒子が、
上記ウイルス粒子の表面抗原、
上記ウイルス粒子のマトリックス蛋白質又は膜蛋白質、及び、
上記ウイルス粒子の核蛋白質、
を含む、[32]〜[37]のいずれかに記載の方法。
[39]上記ウイルス様粒子が、上記ウイルス粒子に由来するゲノム核酸を含む、[32]〜[38]のいずれかに記載の方法。
[40]上記ウイルス粒子が、オルソミクソウイルス粒子、フラビウイルス粒子、又はB型肝炎ウイルス粒子である、[32]〜[39]のいずれかに記載の方法。
[41]上記ウイルス粒子が、インフルエンザウイルス粒子、日本脳炎ウイルス粒子、又はB型肝炎ウイルス表面抗原(HBs)粒子である、[40]に記載の方法。
[42]上記ウイルス粒子が、インフルエンザウイルス粒子である、[41]に記載の方法。
[43]上記インフルエンザウイルス粒子が、A型インフルエンザウイルス粒子、又はB型インフルエンザウイルス粒子である、[42]に記載の方法。
[44]上記インフルエンザウイルス粒子が、H1N1亜型株、H2N2亜型株、H3N2亜型株、H3N8亜型株、H5N1亜型株、H5N2亜型株、H5N6亜型株、H6N1亜型株、H7N3亜型株、H7N7亜型株、H7N9亜型株、H9N2亜型株、又はH10N8亜型株に分類されるインフルエンザウイルス粒子である、[42]又は[43]に記載の方法。
[45]上記表面抗原が、ヘマグルチニン(HA)又はノイラミニダーゼ(NA)を含む、[41]〜[44]のいずれかに記載の方法。
[46]上記マトリックス蛋白質又は膜蛋白質が、M1蛋白質又はM2蛋白質を含む、[41]〜[45]のいずれかに記載の方法。
[47]上記ウイルス様粒子が、上記ウイルス粒子の粒子径の70〜130%の平均粒子径を有する、[32]〜[46]のいずれかに記載の方法。
[48]上記ウイルス様粒子が、ショ糖密度勾配遠心で測定した場合に、ショ糖濃度35%以上にピークが検出されるウイルス様粒子である、[32]〜[47]のいずれかに記載の方法。
[49]ウイルスに対するワクチンの製造における、エンベロープを有するウイルス粒子に由来するウイルス様粒子の使用であって、
上記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量が、上記ウイルス粒子の脂質成分の含有量に対して低減している、使用。
[50]ウイルスによる感染症を予防するための、エンベロープを有するウイルス粒子に由来するウイルス様粒子であって、
上記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量が、上記ウイルス粒子の脂質成分の含有量に対して低減している、ウイルス様粒子。
本実施形態に係るワクチンは、エンベロープを有するウイルス粒子(以下、「エンベロープウイルス粒子」という場合がある。)に由来するウイルス様粒子を含有するワクチンであって、上記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量が、上記ウイルス粒子の脂質成分の含有量に対して低減している。上記ワクチンの免疫原性は、スプリットワクチンの免疫原性以上であり、全粒子ワクチンの免疫原性と同等以上であってもよい。上記ワクチンは、局所反応及び発熱等の副反応がスプリットワクチンと同等以上に抑えられる。
本実施形態に係るウイルス様粒子を含有するワクチンの製造方法は、エンベロープを有するウイルス粒子に対して粒子構造を固定化する工程と、固定化された上記ウイルス粒子に対して脱脂処理を行う工程を含む。
本実施形態において「固定化」とは、表面抗原同士、表面抗原とマトリックス蛋白質(若しくは膜蛋白質)、又はマトリックス蛋白質同士(若しくは膜蛋白質同士)を化学的に結合させ、ウイルス粒子の粒子構造を保持することを意味する。ウイルス様粒子は、ウイルス本来の粒子構造を保持することによって、ウイルス様粒子の免疫原性がスプリットワクチンの免疫原性以上であり、作製条件によっては不活化全粒子ウイルスの免疫原性と同等以上となると本発明者らは考えている。粒子構造の保持は、電子顕微鏡解析、ショ糖密度勾配遠心、又は動的光散乱法、HA、NP若しくはM1に対する抗体を用いた検出法(Slot blot、Western blot等)によって、確認することが可能である。
脱脂処理を行う工程は、固定化されたウイルス粒子を脱脂剤で処理する方法が例示され、例えば、固定化されたウイルス粒子を含む懸濁液Bに脱脂剤を加える工程が挙げられる。脱脂剤の種類は、ウイルスの種類に応じて適宜変更してもよい。例えば、上記脱脂剤はジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、酢酸メチル、酢酸エチル、及びそれらの組合せが挙げられる。脱脂剤で処理する際の濃度は、ウイルスの種類又は脱脂剤の種類に応じて適宜変更してもよい。脱脂剤の濃度は、懸濁液B及び脱脂剤の全量を基準として、10vol%以上400vol%以下であってもよい。上記脱脂剤の濃度が10vol%未満である場合、脱脂が不完全となる傾向がある。上記脱脂剤の濃度が400vol%を超える場合、ウイルス粒子の構造が保持されなくなる傾向がある。脱脂剤がジエチルエーテルを含む場合、ジエチルエーテルの濃度は、懸濁液B及び脱脂剤の全量を基準として、10vol%以上であってもよく、12.5vol%〜50vol%であってもよく、33vol%〜50vol%であってもよい。
インフルエンザウイルス様粒子の調製
1.ホルマリン処理(ウイルス粒子に対して粒子構造を固定化する工程)
B型インフルエンザウイルス(B/Wisconsin/1/2011株、以下、「B/WC株」と記載することがある。)を11日齢の発育鶏卵の漿尿膜腔内に接種し、34℃で2日間培養した。得られた漿尿液を清澄化した後、遠心分離によってインフルエンザウイルス粒子を沈殿させた。上記インフルエンザウイルス粒子をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で再浮遊させ、ショ糖密度勾配遠心で、ショ糖濃度が33%〜50%である画分を回収することによって精製した。精製したインフルエンザウイルス粒子の蛋白質の濃度が終濃度500μg/mLとなるように、得られた画分を希釈し、懸濁液Aを得た。その後、最終濃度が0.02〜0.2vol%(ホルムアルデヒド換算で、0.007〜0.076w/v%)となるようにホルマリン(35〜38w/v%ホルムアルデヒド水溶液、固定化剤)を懸濁液Aに添加し、4℃で4週間若しくは6週間、又は、25℃で1週間反応させた。反応終了後、PBSで反応液を透析し、ホルマリンを除くことで、固定化されたインフルエンザウイルス粒子を含む懸濁液Bを得た。
ホルマリン処理を行った上記インフルエンザウイルス粒子を含む懸濁液Bに、最終濃度が0.1vol%になるようにポリソルベート80を添加した。その後最終濃度が50vol%となるように、上記懸濁液Bと等容のジエチルエーテル(脱脂剤)を添加し、4℃で2時間撹拌した。その後、得られた混合液を4℃、3000rpmで5分間遠心分離を行って、水相を回収することによってエーテル相を除いた。以上の工程によって、検体であるインフルエンザウイルス様粒子を調製した。
予備実験として、得られたインフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量をコレステロールオキシダーゼ・3,5−ジメトキシ−N−エチル−N−(2−ハイドロキシ−3−スルホプロピル)−アニリンナトリウム(DAOS)法で測定した。その結果、得られたインフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量は、インフルエンザウイルス粒子の脂質成分の含有量に対して多くても80質量%以下であることが示唆された。以下、蛍光色素法によって、インフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量を詳細に検討した。
インフルエンザウイルスのエンベロープは、コレステロールを多く含むことが報告されていることから、コレステロールを脂質成分の代表として定量した。
A型インフルエンザウイルスにおいても、H1N1亜型株(A/California/07/2009(X−179A)株、以下、「A/CA株」と記載することがある。)及びH3N2亜型株(A/New York/39/2012(X−233A)株、以下、「A/NY株」と記載することがある。)について、上記に準じた方法でウイルス様粒子を作製した。他のB型インフルエンザウイルスについてもB/Brisbane/60/2008株(以下、「B/BR株」と記載することがある。)及びB/Massachusetts/2/2012(BX−51B)株(以下、「B/MA株」と記載することがある。)について、上記に準じた方法でウイルス様粒子を作製した。代表として、0.08%のホルマリン濃度で25℃、1週間反応後、エーテル処理したインフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量を、Amplex Red Cholesterol Assay Kit(Invitrogen社製、商品名)を用いて測定した。まず、インフルエンザウイルス様粒子を含む検体を超遠心分離(24000rpm、2hrs、4℃)にかけて上清とペレット成分とに分離した。得られたペレット成分をPBSで再懸濁した。再懸濁したペレット成分に蛍光物質レゾルフィンを加えて反応させた。反応後の蛍光物質レゾルフィンの蛍光強度を測定することによって、インフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量を定量した。その結果、インフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量は、インフルエンザウイルス全粒子(以下、「全粒子抗原」と記載することがある。)の脂質成分の含有量に対して、多くても40質量%以下であることが示唆された(表1)。
H1N1亜型株(A/CA株)由来のウイルス様粒子を代表として、エーテル容量比を変化させることによる脱脂処理に対する影響について検討した。まず、蛋白質濃度が終濃度2500μg/mLとなるように、PBSでウイルス様粒子を希釈し、0.08%のホルマリン濃度で25℃、1週間反応させた。反応終了後、PBSで反応液を透析し、ホルマリンを除くことで、固定化されたインフルエンザウイルス粒子を含む懸濁液Bを得た。その後、エーテルの容量を変えたこと以外は、上記「2.エーテル処理」と同様の方法によって、エーテル処理(脱脂処理)を行い、インフルエンザウイルス様粒子を得た。得られたインフルエンザウイルス様粒子を使用し、脂質成分の含有量をAmplex Red Cholesterol Assay Kit(Invitrogen社製、商品名)を用いて測定した。インフルエンザウイルス様粒子を含む検体を超遠心分離(24000rpm、2hrs、4℃)にかけて上清とペレット成分とに分離した。得られたペレット成分をPBSで再懸濁した。再懸濁したペレット成分に蛍光物質レゾルフィンを加えて反応させた。反応後の蛍光物質レゾルフィンの蛍光強度を測定することによって、インフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量を定量した。比較対照は、ホルマリン濃度0.02%で4℃、6週間反応させた不活化全粒子ウイルス(以下、「全粒子抗原」と記載することがある。)を用いた。その結果、エーテル:懸濁液B(vol比)を1:1としてエーテル処理を行った場合、インフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量は、インフルエンザウイルス全粒子の脂質成分の含有量に対して、約70質量%であった。エーテル:懸濁液B(vol比)を1:2又は1:6としてエーテル処理を行った場合、インフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量は、インフルエンザウイルス全粒子の脂質成分の含有量に対して、約30質量%であった。一方、エーテル:懸濁液B(vol比)を1:12としてエーテル処理を行った場合、インフルエンザウイルス様粒子の脂質成分の含有量は、全粒子抗原と同様に脂質成分はほとんど除去されず、約100%残存していることが示唆された(表2)。上記結果から、脱脂の効果は、エーテルの量だけではなく、ポリソルベート80の濃度にも依存していると本発明者らは考えている。すなわち、「エーテル:懸濁液B」が、1:1から1:6に変化するにつれて、相対的にポリソルベート80の濃度が高くなるため、脱脂が進むと本発明者らは考えている。しかし、「エーテル:懸濁液B」が1:12になると、相対的にポリソルベート80の濃度が高かったとしても、エーテルの濃度が低すぎることが影響し、脱脂の効果が減少すると本発明者らは考えている。
比較対照とするスプリットインフルエンザウイルス(以下、「スプリット抗原」と記載することがある。)は、インフルエンザHAワクチン(化学及血清療法研究所製、商品名「インフルエンザHAワクチン“化血研”」)を使用した。
物性評価
上記実施例1で得られたウイルス様粒子(検体)の物性を以下の方法で評価した。なお、以下の実験において、特にことわりがない限り、比較対照として用いた全粒子抗原はホルマリン濃度0.02%で4℃、6週間反応させたものである。
1.ショ糖密度勾配遠心法による分析
実施例1によって調製したウイルス様粒子をショ糖密度勾配遠心法によって分析した。検体を15〜60%のショ糖密度勾配に重層し、4℃、18000rpmで16時間、遠心分離を行った。遠心後、1フラクションあたり0.6mLずつ分画し、各フラクションのショ糖濃度、HA価及び蛋白質濃度を測定した。H1N1亜型株の結果を表3に示す。スプリット抗原では、蛋白質がショ糖濃度25〜50%に幅広く分布し、ウイルス粒子が分解していることが示された。これに対し、ウイルス様粒子では高いショ糖濃度(49〜51.4%)に単一ピークとして分画されていることから、不活化全粒子と同様の形状(粒子性)を有することが示された。HA活性についてはホルマリン処理時のホルマリン濃度が0.02%以上で2560倍であった。B型株(B/WC株)の結果を表4に示す。スプリット抗原では、蛋白質が同様にショ糖濃度25〜50%に幅広く分布し、ウイルス粒子が分解していることが示された。これに対し、ウイルス様粒子では高いショ糖濃度(50.6〜52.2%)に単一ピークとして分画されていることから、不活化全粒子と同様の形状(粒子性)を有することが示された。HA活性についてはホルマリン処理時のホルマリン濃度が高い程、HA価が高く、0.05%で2560倍、0.08%以上では5120倍であった。
ウイルス様粒子(B型株であるB/WC株由来)の形状をさらに詳細に調べるために、電子顕微鏡による観察を実施した。約500μg/mLの上記検体を、グルタルアルデヒドを用いて室温で20分間固定した。その後、観察用のイオンコートしたシートメッシュ(日新EM社製)に、固定した検体を載せて約60秒間静置し、2%リンタングステン酸水溶液でネガティブ染色した。染色した検体を、透過型電子顕微鏡(FEIカンパニー社製テクナイG2:加速電圧120kV)を用いて観察、撮影した。
ウイルス様粒子(B型株であるB/WC株由来)の平均粒子径をParticle Sizing System:NICOMP 380 ZLS−Sを用いて解析した。動的光散乱法による液体中の平均粒子径を表5に示す。スプリット抗原は二峰性であり、110nm付近と400nm付近とにピークが認められた。一方、それ以外の全ての検体は平均粒子径が120nm前後で単峰性であった。このことから、エーテル処理後の平均粒径は、ウイルス粒子と同等の粒子サイズであることがわかった。すなわち、エーテル処理によって脱脂されてもウイルス様粒子の平均粒子径は単一で変わらないことがわかった。動的光散乱実験から、ウイルス様粒子の粒子構造は保たれており、凝集体のような不純物は認められなかった。
代表として、H1N1亜型株(A/CA株)に由来するウイルス様粒子、全粒子抗原及びスプリット抗原の分子量分布を測定した。上記測定は、TSKgel G6000PWXL(TOSOH)を用いて行った。溶離液にPBSを用いた。溶出パターンを表6に示す。スプリット抗原は溶出時間19〜29分付近に三峰性のピークが認められた。一方、ウイルス様粒子及び全粒子抗原は溶出時間17分付近に単峰性のピークが認められた。このことから、エーテル処理を行っているウイルス様粒子の分子量分布は、エーテル処理を行っていないウイルス粒子(全粒子抗原)と同等の分子量分布であることが分かった。この結果から、エーテル処理によって脱脂されても分子量分布は単一で変わらないことが示唆された。
ウイルス様粒子(B型株であるB/WC株由来)の構成蛋白質について調べるために、Slot−blot法によって抗体染色を行った。スプリット抗原、ホルマリン処理のみ行った検体、又はホルマリン処理後にエーテル処理した検体について、それぞれの検体に対してSDS処理及び加熱処理を行っていない群(A群)、並びに、SDS処理及び加熱処理を行った群(B群)を用意した。検体の種類を表7に示す。
上記の群のそれぞれの検体をPVDF膜(ポリフッ化ビニリデン膜)へアプライし、乾燥させた。染色、脱色後、PVDF膜をブロッキングし、一次抗体(マウスモノクローナル抗体:抗NP抗体又は抗M1抗体)、二次抗体(抗マウスIgG−HRPコンジュゲート)と反応させ、LAS−3000(富士フイルム株式会社製、商品名)で撮影した。図2にM1、NPのSlot blotの結果を示す。SDS処理及び加熱処理を共に行っていない群(A群)では、粒子構造が壊れているスプリット抗原(第1レーン)、及びホルマリン固定が弱い検体(0.02%ホルマリン濃度反応後、エーテル処理した検体:第3、第4レーン)において、NP及びM1が検出された。これに対し、全粒子抗原(第2レーン)、及び0.02%より高いホルマリン濃度の検体(第5、第6、第7レーン)において、NP及びM1はほとんど検出されなかった。一方、SDS処理及び加熱処理を共に行った群(B群)では、ウイルス様粒子が破壊され、いずれの検体でもM1及びNPが検出された。このことから、M1及びNPはウイルス様粒子の内部に存在することが示された。
H1N1亜型株(A/CA株)について上記に準じた方法でウイルス様粒子を作製した。異なるホルマリン濃度(0.02%〜0.14%)でウイルス粒子を固定化後、エーテル処理を行いウイルス様粒子を得た。得られたウイルス様粒子は、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS―PAGE)を行った後、PVDF膜へ転写した。上記PVDF膜を、一次抗体(マウスモノクローナル抗体:抗HA抗体、抗NP抗体又は抗M1抗体)、及び二次抗体(抗マウスIgG−HRPコンジュゲート)と反応させ、LAS−3000(富士フイルム株式会社製、商品名)で撮影した。このとき、発色基質としてRPN2209 ECL Western Blotting Detection Reagents(GE Healthcare社製、商品名)を用いた。HA(図3のA)、M1(図3のB)、NP(図3のC)のWestern blotの結果を示す。ホルマリン未処理に対し、ホルマリン処理された各ウイルス構成タンパク質は高分子化し、高分子側に泳動されていることが示された。すなわちホルマリン未処理に対し、ホルマリン処理された各ウイルス構成タンパク質は、0.05%以上の濃度で250kDa以上の高分子重合体を生じ、ゲルトップに詰まっていることが示された。0.05%未満の弱い架橋ではエーテル処理時に粒子を保つことが出来ず、図2に示すようにNP及びM1が検出されている。
ウイルス様粒子(B型株であるB/WC株由来)におけるウイルス粒子に由来するゲノム核酸(「ウイルス由来ゲノム核酸」という場合がある。)について検討した。ホルマリン処理のみを行った検体、又はホルマリン処理後にエーテル処理した検体について、それぞれの検体に対して超遠心した群又は超遠心していない群を用意した。上記の群の上清からQIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN社製、商品名)を用いて、RNAを抽出した。抽出後、One Step RNA PCR Kit(AMV)(タカラバイオ株式会社製、商品名)、PCR System(GeneAmpR9700)を用いて、RT−PCRを行い、HAをコードするDNA領域を増幅した。アガロースゲル電気泳動を行い、DNA産物のバンドパターンを確認した。
ウイルス様粒子における、ウイルス粒子に由来するゲノム核酸(「ウイルス由来ゲノム核酸」という場合がある。)の定量について検討した。ウイルス様粒子、全粒子抗原、スプリット抗原をPBSで希釈し、SDSとProteinase Kを加えて55℃、24時間で反応させた。その後、TRIzol LS ReagentとPureLink RNA Mini Kit、PureLink DNase (invitrogen社製、商品名)とを用いてRNAを抽出した。抽出したRNAの含有量は、Quant−iT RiboGreen RNA Reagent and Kit (invitrogen社製、商品名)で測定した。
A型インフルエンザウイルスにおいて、H3N2亜型株(A/Texas/50/2012(X−223)株、以下、「A/TX株」と記載することがある。)についても実施例1に準じた方法でウイルス様粒子を作製した。ウイルス様粒子における免疫原性を、マウスを用いて評価した。ddYマウス(雌性、8週齢)に、スプリット抗原、全粒子抗原、又はウイルス様粒子を、蛋白質量として0.8μgの接種量で筋肉内接種した(一群当たり16匹)。免疫3週後にマウスを安楽死させ、全採血した。遠心分離によって血清を得て、HI抗体価を測定した。代表として0.08%のホルマリンで25℃、1週間反応後、エーテル処理した検体の免疫原性(HI抗体価(GMT))の結果を表10に示す。H1N1亜型株、H3N2亜型株の場合、ウイルス様粒子はスプリット抗原と比較して有意に高い免疫原性(H1N1亜型株:P<0.05、H3N3亜型株:P<0.01)であり、全粒子抗原と同等の免疫原性であった。B型株(B/MA株)の場合、ウイルス様粒子はスプリット抗原と比較して高い免疫原性であり、全粒子抗原と同等の免疫原性であった。
H1N1亜型株(A/New Caledonia/20/99、以下、「A/NC株」と記載することがある。)、H3N2亜型株(A/Wyoming/3/2003、以下、「A/WY株」と記載することがある。)及びB株(B/Shanghai/361/2002、以下、「B/SG株」と記載することがある。)について実施例1に準じた方法でウイルス様粒子を作製した。得られたインフルエンザウイルス様粒子における免疫原性を、マウスを用いて評価した。ddYマウス(雌性、8週齢)を用いて、スプリット抗原、又はウイルス様粒子を1群当たり8匹に1μgHAの接種量で、3週間の間隔で2回皮下接種した。1次免疫を行って3週後に部分採血、2次免疫を行って2週後に全採血した。遠心分離によって血清を得て、HI抗体価を測定した。代表として0.2%のホルマリンで5℃、3日間反応後、エーテル処理した検体の免疫原性(HI抗体価(GMT))の結果を表11(1次免疫後)、表12(2次免疫後)に示す。1次免疫後のA/NC株、A/WY株の場合、ウイルス様粒子はスプリット抗原と比較して有意に免疫原性が高かった。
スプリット抗原、全粒子抗原、及びウイルス様粒子の免疫原性を、カニクイザル(雌性、21〜29箇月齢)を用いて評価した。スプリット抗原、全粒子抗原、又はウイルス様粒子を1群当たり5匹に7.5μgHA相当(スプリット抗原のHA量に相当するタンパク質量)の接種量で、28日間の間隔で2回皮下接種した。2次免疫前、及び2次免疫後28日後に部分採血した。遠心分離によって血清を得て、HI抗体価及び中和抗体価を測定した。代表として0.08%のホルマリンで25℃、7日間反応後、エーテル処理した検体(ウイルス様粒子)の免疫原性の結果を、表13(2次免疫後のHI抗体価(GMT))、表14(2次免疫後の中和抗体価(GMT))に示す。HI抗体価では、ウイルス様粒子はスプリット抗原と比較して高い免疫原性を有することが分かった。特に、H1N1亜型株では有意に免疫原性が高かった。中和抗体価においても、ウイルス様粒子はスプリット抗原と比較して高い免疫原性を有することが分かった。特に、H1N1亜型株及びB型株では有意に免疫原性が高かった。
抗体サブクラス解析として、上記「8.免疫原性1」で得られたマウスの血清中に含まれる、ウイルス抗原に特異的なIgG1及びIgG2a抗体価を測定した。比較対照として、0.02%のホルマリンで25℃、1週間反応後、エーテル処理した検体を同様にマウスに免疫した。得られたマウスの血清中に含まれる、ウイルス抗原特異的なIgG1及びIgG2aの抗体価を測定した。その結果、スプリット抗原とは対照的に、ウイルス様粒子(ホルマリン濃度:0.08%)は、全粒子抗原と同様に抗原特異的IgG1よりも抗原特異的IgG2aを誘導することが示された。一方、同じウイルス様粒子であっても、0.02%のホルマリンで固定化を行った検体は、スプリット抗原と同様に抗原特異的IgG2aよりも抗原特異的IgG1を誘導することが示された([表15]〜[表17])。Th1型応答によって誘導されるIgG2aサブクラスの抗体は、Th2型応答によって誘導されるIgG1サブクラスの抗体よりもインフルエンザウイルスに対する感染防御能が優れていることから、ウイルス様粒子(ホルマリン濃度:0.08%)による有効性のさらなる向上が期待できる。
ウイルス様粒子抗原の免疫原性機序を解析するために、Toll like receptor 7 knock−out(TLR7KO)マウス(Backborne:BALB/c)を用いて解析を行った。使用したマウスはオリエンタルバイオサービス社から購入した。雌性、5週齢のマウスを用いて、全粒子抗原、ウイルス様粒子抗原、スプリット抗原を1群当たり5〜6匹に蛋白質量2μg/各株の接種量で、3週間の間隔で2回筋肉内接種した。1次免疫を行って3週後に部分採血、2次免疫を行って2週後に全採血した。遠心分離によって血清を得て、HI抗体価を測定した。ワクチン株は、H1N1亜型株(A/CA株)、H3N2亜型株(A/NY株)、B型株(B/BR株及びB/MA株)を使用した。全粒子抗原、ウイルス様粒子抗原、及びスプリット抗原の調製方法に関しては、実施例1に準じた。1次免疫を行って3週間後の血清中のHI抗体価の幾何平均値(GMT)を表18に示す。野生型マウス(+/+)では、ウイルス様粒子はスプリット抗原と比較して高いHI抗体価を示した。一方、ノックアウトマウス(−/−)では、スプリット抗原と同等まで、ウイルス様粒子に対するHI抗体価が低下していた。この結果は、ウイルス様粒子に内包されているウイルス一本鎖RNAがウイルス様粒子の免疫原性に大きく寄与していることを示唆している。
抗体サブクラス解析として、上記「12.免疫原性4」で得られたマウスの血清中に含まれる、ウイルス抗原に特異的なIgG1及びIgG2a抗体価を測定した。その結果を[表19]〜[表21]に示す。Th2優位な免疫応答が誘導されやすいBALB/c野生型マウス(+/+)においても、スプリット抗原とは対照的に、ウイルス様粒子は、抗原特異的IgG1よりも抗原特異的IgG2aを誘導することが示された。それに対してノックアウトマウス(−/−)では、IgG2aの抗体価が顕著に低下していた。この結果は、ウイルス一本鎖RNAがTh1優位な免疫誘導に必須であることを示唆している。
上記「12.免疫原性4」で得られたマウスの脾臓中に含まれる、抗原特異的なIFN−γ産生細胞数を計測するためにELISPOTアッセイを行った。解析にはMouse IFN gamma ELISPOT Ready−SET−Go!(eBioscience社製、商品名)を用い、添付概要書に記載されている方法に準じて行った。その結果を[表22]〜[表25]に示す。樹状細胞、Th1細胞、及びNK細胞等の細胞性免疫に関わる細胞から産生されるIFN−γは、スプリット抗原よりも全粒子抗原又はウイルス様粒子を接種されたマウスにおいて強く誘導されることが確認された。ノックアウトマウス(−/−)では、ウイルス様粒子抗原によって誘導されたIFN−γ産生細胞数が顕著に低下していた。このことから、ウイルス一本鎖RNAによってIFN−γ産生細胞が誘導され、Th1優位な免疫応答が惹起されることが示唆された。
上記「12.免疫原性4」で得られたマウスの脾臓中に含まれる、抗原特異的なメモリーB細胞数を計測するためにELISPOTアッセイを行った。ELISPOTを行う前に、メモリーB細胞から抗体産生細胞に分化させるために、マイトジェン(Phytolacca americana由来のレクチン、S.aureus由来のProtein A soluble、CpG ODN、及びEscherichia coli由来のLPS)による刺激を行った。その結果を[表26]〜[表29]に示す。脾臓細胞中のメモリーB細胞は、スプリット抗原よりも全粒子抗原又はウイルス様粒子抗原を接種されたマウスにおいて強く誘導されることが確認された。ウイルス様粒子抗原を接種されたノックアウトマウス(−/−)では、脾臓中のメモリーB細胞数が低下していた。このことから、ウイルス様粒子抗原のメモリーB細胞誘導能にウイルス一本鎖RNAが大きく関与していることが示唆された。
スプリット抗原、全粒子抗原又はウイルス様粒子をPBSで希釈し、1mL中の蛋白質含量を240μgとしたものを試料とした。ウイルス様粒子は代表として0.08%のホルマリンで25℃、1週間反応後、エーテル処理した検体を用いた。上記試料を、体重1kg当たりにつき1mLをウサギに接種して、発熱の上昇を観察した。ウサギ3羽の発熱反応の和(℃)を表30に示す。
H1N1亜型株(A/CA株)のウイルス粒子を、蛋白質濃度が終濃度2500μg/mLとなるように希釈し、0.08%のホルマリン濃度で25℃、1週間反応させた。反応終了後、PBSで反応液を透析し、ホルマリンを除くことで、固定化されたインフルエンザウイルス粒子を含む懸濁液Bを得た。その後、エーテル容量及びポリソルベート80濃度を0.05vol%に変えたこと以外は、上記「2.エーテル処理」と同様の方法によって、エーテル処理を行い、コレステロールの含有量がそれぞれ異なるインフルエンザウイルス様粒子を得た。得られたインフルエンザウイルス様粒子をPBSで希釈し、1mL中の蛋白質含量を240μgとしたものを試料とした。体重1kg当たりにつき1mLの上記試料を、ウサギに接種して、発熱の上昇を観察した。ウサギ3羽の発熱反応の和(℃)を表31に示す。
発熱試験の代替法として、ヒトPBMCを用いた炎症性サイトカイン測定系によって、サイトカインの量を評価した。炎症性サイトカインとして代表的な、IL−1β、IL−6に関して測定を行った。ヒト末梢血単核球(PBMC)をFCS MEMに懸濁し、4x106cells/mLに希釈した。100μLずつ96穴プレートに添加し、スプリット抗原、全粒子抗原又はウイルス様粒子を同量添加した(終濃度50μg/mL)。その後、37℃で24時間CO2雰囲気下で培養し、上清中のIL−1βとIL−6とをELISA法で定量した。代表として0.08%のホルマリンで25℃、1週間反応後、エーテル処理した検体のサイトカイン定量(IL−1β)の結果を表32に示し、サイトカイン定量(IL−6)の結果を表33に示す。ウイルス様粒子を用いた場合、全粒子抗原を用いた場合よりも、炎症性サイトカインの量が少ないことがわかった。このことから、ウイルス様粒子は、全粒子抗原に比べて、副反応を抑制しやすいことが示唆された。
インフルエンザウイルス様粒子の調製
1.グルタルアルデヒド(GA)処理(ホルマリンのようにメチレン架橋を形成せず、ウイルス粒子に対して不可逆的な架橋反応によって固定化する工程)
A型インフルエンザウイルス(H3N2亜型株(A/NY株))及びB型インフルエンザウイルス(B/BR株)を実施例1と同様に精製した。精製したインフルエンザウイルス粒子をβ−プロピオラクトン(BPL)不活化後、蛋白質濃度が終濃度1000μg/mLとなるように希釈し、懸濁液A1(A/NY株)及び懸濁液A2(B/BR株)を得た。次に、1w/v%GA溶液を用いて、GA濃度が0.016w/v%又は0.008w/v%となるように希釈した。
懸濁液A1又は懸濁液A2と、希釈したGA溶液(0.016w/v%又は0.008w/v%)とを等量混合し、4℃で3日間反応させた。反応終了後、PBSで反応液を透析し、GAを除くことで、固定化されたインフルエンザウイルス粒子を含む懸濁液B1(A/NY株)及び懸濁液B2(B/BR株)を得た(全粒子抗原(GA固定))。
GA処理を行った上記インフルエンザウイルス粒子を含む懸濁液B1及び懸濁液B2に、最終濃度が0.05vol%になるようにポリソルベート80を添加した。その後上記懸濁液B1又は懸濁液B2に、最終濃度が33vol%となるようにジエチルエーテル(脱脂剤)を添加し、25℃で1時間撹拌した。その後、得られた混合液を4℃、3000rpmで5分間遠心分離を行って、水相を回収することによってエーテル相を除いた。以上の工程によって、検体であるインフルエンザウイルス様粒子を調製した。
物性評価
上記実施例3で得られたウイルス様粒子(検体)の物性を以下の方法で評価した。
1.電子顕微鏡による解析
ウイルス様粒子(A/NY株由来)の形状をさらに詳細に調べるために、電子顕微鏡による観察を実施した。約500μg/mLの上記検体を、グルタルアルデヒドを用いて室温で20分間固定した。その後、観察用のイオンコートしたシートメッシュ(日新EM社製)に、固定した検体を載せて約60秒間静置し、2%リンタングステン酸水溶液でネガティブ染色した。染色した検体を、透過型電子顕微鏡(FEIカンパニー社製テクナイG2:加速電圧120kV)を用いて観察、撮影した。
ウイルス様粒子の平均粒子径をウイルス様粒子の平均粒子径をZetasizer Nano ZS(Malvern社製)を用いて解析した。動的光散乱法による液体中の平均粒子径を表35に示す。ウイルス様粒子は平均粒子径が130nm前後で単峰性であった。このことから、エーテル処理後の平均粒径は、ウイルス粒子と同等の粒子サイズであることがわかった。すなわち、エーテル処理により脱脂されてもウイルス様粒子の平均粒子径は単一で変わらないことがわかった。動的光散乱実験から、ウイルス様粒子の粒子構造は保たれており、凝集体のような不純物は認められなかった。
ウイルス様粒子におけるウイルス粒子に由来するゲノム核酸(「ウイルス由来ゲノム核酸」という場合がある。)の定量について検討した。ウイルス様粒子、全粒子抗原をPBSで希釈し、SDSとProteinase Kを加えて55℃、18〜57時間で反応させた。その後、TRIzol LS ReagentとPureLink RNA Mini Kit、PureLink DNase (invitrogen社製、商品名)を用いてRNAを抽出した。抽出したRNAの含有量は、Quant−iT RiboGreen RNA Reagent and Kit (invitrogen社製、商品名)で測定した。
ウイルス様粒子における免疫原性を、マウスを用いて評価した。ddYマウス(雌性、8週齢)に、スプリット抗原(ホルマリン不活化)、又はウイルス様粒子を蛋白質量として0.8μgの接種量で筋肉内接種した(一群当たり16匹)。免疫3週後にマウスを安楽死させ、全採血した。遠心分離によって血清を得て、中和抗体価を測定した。代表として0.004w/v%のGAで4℃、3日間反応後、エーテル処理した検体の免疫原性(中和抗体価(GMT))の結果を表37に示す。B型株の場合、ウイルス様粒子はスプリット抗原と比較して高い免疫原性であった。
B型株であるB/WC株について実施例1に準じた方法でウイルス様粒子を作製した。得られたインフルエンザウイルス様粒子における免疫原性を、マウスを用いて評価した。ddYマウス(雌性、8週齢)に、スプリット抗原(ホルマリン不活化)、ウイルス様粒子を蛋白質量として0.8μgの接種量で筋肉内接種した(一群当たり16匹)。免疫3週後にマウスを安楽死させ、全採血した。遠心分離によって血清を得て、HI抗体価を測定した。代表として0.010w/v%のGAで4℃、3日間反応後、エーテル処理したウイルス様粒子の免疫原性(HI抗体価(GMT))の結果を表38に示す。ウイルス様粒子はスプリット抗原と比較して高い免疫原性であった。
ウイルス様粒子をPBSで希釈し、1mL中の蛋白質含量を240μgとしたものを試料とした。上記試料を、体重1kg当たりにつき1mLをウサギに接種して、発熱の上昇を観察した。ウサギ3羽の発熱反応の和(℃)を表39に示す。
実施例2の「18.サイトカイン定量1」に準じて、サイトカインを定量した。ウイルス様粒子A/NY株のサイトカイン定量(IL−1β及びIFN−α)の結果を表40に、B/BR株のサイトカイン定量の結果を表41に示す。ウイルス様粒子を用いた場合、全粒子抗原(ホルマリン固定)を用いた場合よりも、炎症性サイトカインの量が少ないことがわかった。このことから、ウイルス様粒子は、全粒子抗原に比べて、副反応を抑制しやすいことが示唆された。
インフルエンザウイルス様粒子の調製
1. 1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドハイドロクロライド(EDC)処理(ウイルス粒子のカルボキシル基にアミノ基を反応させてアミド結合を生成させ固定化する工程)
EDCを、濃度が4〜0.1MとなるようにPBSで希釈した。A型インフルエンザウイルス(H3N2亜型株(A/NY株))及びB型インフルエンザウイルス(B/BR株)を実施例1と同様に精製した。精製したインフルエンザウイルス粒子をBPL不活化後、EDC濃度が0.5〜0.005Mとなるように希釈したEDC溶液を添加し、4℃で2時間反応させた。このとき、反応液中の蛋白質濃度が2500μg/mLとなるようにした。反応終了後、PBSで反応液を透析し、EDCを除くことで、固定化されたインフルエンザウイルス粒子を含む懸濁液B1(A/NY株)及び懸濁液B2(B/BR株)を得た。
EDC処理を行った上記インフルエンザウイルス粒子を含む懸濁液B1及び懸濁液B2に、最終濃度が0.05vol%になるようにポリソルベート80を添加した。その後上記懸濁液B1又は懸濁液B2に、最終濃度が33vol%となるようにジエチルエーテル(脱脂剤)を添加し、25℃で1時間撹拌した。その後、得られた混合液を4℃、3000rpmで5分間遠心分離を行って、水相を回収することによってエーテル相を除いた。以上の工程によって、検体であるインフルエンザウイルス様粒子を調製した。
物性評価
上記実施例5で得られたウイルス様粒子(検体)の物性を以下の方法で評価した。
1.ショ糖密度勾配遠心法による分析
H3N2亜型株(A/NY株)由来のウイルス様粒子について、ショ糖密度勾配遠心法によって分析した。代表として、0.05MのEDC濃度でEDC処理を行った検体(全粒子抗原及びウイルス様粒子)を15〜60%のショ糖密度勾配に重層し、4℃、18000rpmで16時間、遠心分離を行った。遠心後、1フラクションあたり0.6mLずつ分画し、各フラクションのショ糖濃度、HA価及び蛋白質濃度を測定した。結果を表43に示す。ウイルス様粒子では高いショ糖濃度(約50%)に単一ピークとして分画されていることから、不活化全粒子と同様の形状(粒子性)を有することが示された。HA活性については1280倍であった。
ウイルス様粒子(A/NY株由来)の形状をさらに詳細に調べるために、電子顕微鏡による観察を実施した。約500μg/mLの上記検体を、グルタルアルデヒドを用いて室温で20分間固定した。その後、観察用のイオンコートしたシートメッシュ(日新EM社製)に、固定した検体を載せて約60秒間静置し、2%リンタングステン酸水溶液でネガティブ染色した。染色した検体を、透過型電子顕微鏡(FEIカンパニー社製テクナイG2:加速電圧120kV)を用いて観察、撮影した。
ウイルス様粒子におけるウイルス粒子に由来するゲノム核酸(「ウイルス由来ゲノム核酸」という場合がある。)の定量について検討した。ウイルス様粒子、又は全粒子抗原をPBSで希釈し、SDSとProteinase Kを加えて55℃、6時間で反応させた。その後、TRIzol LS ReagentとPureLink RNA Mini Kit、PureLink DNase (invitrogen社製、商品名)を用いてRNAを抽出した。抽出したRNAの含有量は、Quant−iT RiboGreen RNA Reagent and Kit (invitrogen社製、商品名)で測定した。
ウイルス様粒子における免疫原性を、マウスを用いて評価した。ddYマウス(雌性、8週齢)に、スプリット抗原(ホルマリン不活化)、又はウイルス様粒子を蛋白質量として0.8μgの接種量で筋肉内接種した(一群当たり16匹)。免疫3週後にマウスを安楽死させ、全採血した。遠心分離によって血清を得て、中和抗体価を測定した。代表として0.05MのEDCで4℃、2時間反応後、エーテル処理したウイルス様粒子の免疫原性(中和抗体価(GMT))の結果を表45に示す。H3N2亜型株の場合、ウイルス様粒子はスプリット抗原と比較して高い免疫原性であった。B型株の場合、ウイルス様粒子はスプリット抗原と比較して有意に高い免疫原性(P<0.05)であった。
ウイルス様粒子をPBSで希釈し、1mL中の蛋白質含量を240μgとしたものを試料とした。上記試料を、体重1kg当たりにつき1mLをウサギに接種して、発熱の上昇を観察した。ウサギ3羽の発熱反応の和(℃)を表46に示す。
実施例2の「18.サイトカイン定量1」に準じて、サイトカインを定量した。ウイルス様粒子A/NY株のサイトカイン定量(IL−1β及びIFN−α)の結果を表47に、B/BR株のサイトカイン定量の結果を表48に示す。ウイルス様粒子を用いた場合、全粒子抗原(ホルマリン固定)を用いた場合よりも、炎症性サイトカインの量が少ないことがわかった。このことから、ウイルス様粒子は、全粒子抗原に比べて、副反応を抑制しやすいことが示唆された。
日本脳炎ウイルス様粒子の調製
1.グルタルアルデヒド処理(ウイルス粒子に対して粒子構造を固定化する工程)
Vero細胞培養日本脳炎ワクチン原薬(化学及血清療法研究所製、商品名「エンセバック」(0.08%ホルマリンで不活化済)、懸濁液A)に対して、最終濃度が0.002〜0.05vol%となるようにグルタルアルデヒドを添加し、4℃で3日間反応させた。反応終了後、賦活剤である乳糖(終濃度5w/v%)を添加したPBSで、得られた反応液を透析した。透析によって、グルタルアルデヒドを除くことで、固定化された日本脳炎ウイルス粒子を含む懸濁液Bを得た。
上記懸濁液Bに対して、等容のジエチルエーテル及び最終濃度が0.01vol%になるようにポリソルベート80を添加し、常温で1時間撹拌した。4℃、3000rpmで5分間遠心した後、水相を回収し、エーテル相を除いた。以上の工程によって、検体である日本脳炎ウイルス様粒子を調製した。
物性評価
上記実施例7で得られたウイルス様粒子(検体)の物性を以下の方法で評価した。
1.電子顕微鏡による解析
ウイルス様粒子の形状を詳細に調べるために、電子顕微鏡による観察を実施した。観察用のイオンコートしたシートメッシュ(日新EM社製)に、約70μg/mLの上記検体を載せて約60秒間静置し、2%リンタングステン酸水溶液でネガティブ染色した。染色した検体を、透過型電子顕微鏡(FEIカンパニー社製テクナイG2:加速電圧120kV)を用いて観察、撮影した。
ウイルス様粒子の平均粒子径をParticle Sizing System:NICOMP 380 ZLS−Sを用いて解析した。動的光散乱法による液体中の平均粒子径を表49に示す。ウイルス様粒子は平均粒子径が約90nmでほぼ単峰性であった。一方、Vero細胞培養日本脳炎ワクチン原薬は約80nmでほぼ単峰性であった。このことから、エーテル処理後の平均粒径は、エーテル処理を行っていないウイルス粒子よりわずかに大きく、エーテル処理によって脱脂されても平均粒子径はほぼ変わらないことがわかった。動的光散乱実験から、ウイルス様粒子の粒子構造は保たれており、凝集体のような不純物は認められなかった。
抗日本脳炎ウイルス抗体を用いたサンドイッチELISA法によって、抗原の含有量(抗原含量)を測定した。検体中に含まれるE抗原は、抗日本脳炎ウイルスウサギIgG(一次抗体;ポリクローナル抗体)が結合したマイクロプレートに捕捉される。その後、西洋わさび由来ペルオキシダーゼ(HRP)を結合した抗日本脳炎ウイルスB蛋白質モノクローナル抗体(二次抗体;モノクローナル抗体)を反応させることで、プレートに結合した抗E抗原抗体/E抗原/二次抗体の複合体が形成される。反応せず残った試薬及び検体を洗浄によって除去し、酵素基質液(o−フェニレンジアミン溶液:OPD溶液)と反応させるとE抗原複合体上のHRPが反応し、発色が起きる。OPDの発色の強度は、複合体の量(E抗原量を反映)に比例することを利用し、E抗原含量を測定した。
ウイルス様粒子におけるウイルス粒子に由来するゲノム核酸(「ウイルス由来ゲノム核酸」という場合がある。)の定量について検討した。ウイルス様粒子、又は全粒子抗原をPBSで希釈し、SDSとProteinase Kを加えて55℃、54時間で反応させた。その後、TRIzol LS ReagentとPureLink RNA Mini Kit、PureLink DNase (invitrogen社製、商品名)を用いてRNAを抽出した。抽出したRNAの含有量は、Quant−iT RiboGreen RNA Reagent and Kit (invitrogen社製、商品名)で測定した。
発熱試験の代替法として、ヒトPBMCを用いた炎症性サイトカイン測定系によって、サイトカインの量を評価した。炎症性サイトカインとして代表的な、IL−1β、IL−6に関して測定を行った。ヒト末梢血単核球(PBMC)をFCS MEMに懸濁し、4x106cells/mLに希釈した。100μLずつ96穴プレートに添加し、ウイルス様粒子又はVero細胞培養日本脳炎ワクチン原薬を同量添加した(終濃度25μg/mL)。その後、37℃で24時間CO2雰囲気下で培養し、上清中のIL−1βとIL−6とをELISA法で定量した。代表として0.01w/v%のグルタルアルデヒド濃度で4℃、3日間反応後、エーテル処理した検体のサイトカイン定量(IL−1β及びIL−6)の結果を表53に示す。IL−1β、IL−6共にウイルス様粒子はVero細胞培養日本脳炎ワクチン原薬よりも低かった。このことから、ウイルス様粒子は、Vero細胞培養日本脳炎ワクチン原薬に比べて、副反応を抑制しやすいことが示唆された。
ddYマウス(雌性、4週齢)に、代表として0.01w/v%のグルタルアルデヒド濃度で4℃、3日間反応後、エーテル処理したウイルス様粒子(ポリソルベート80を0.005%添加してエーテル処理したもの)又はVero細胞培養日本脳炎ワクチン原薬を4μg又は1μgの接種量で腹腔内接種した(一群当たり10匹)。免疫1週間後に再度免疫し、その1週間後にマウスを安楽死させ、全採血した。遠心分離によって血清を得て、群毎に等量ずつプールし、中和抗体価を測定した。50%プラック減少率から算出した結果を表54に示す。エーテル処理したウイルス様粒子はVero細胞培養日本脳炎ワクチン原薬と比較して同等又はそれ以上の中和抗体価であった。
カニクイザル(雌性、約8歳齢)に、代表として0.01w/v%のグルタルアルデヒド濃度で4℃、3日間反応後、エーテル処理したウイルス様粒子(ポリソルベート80を0.01%添加してエーテル処理したもの)又はVero細胞培養日本脳炎ワクチン原薬を4μgの接種量で腹腔内接種した(一群当たり3匹)。免疫3週間後に再度免疫し、その4週間後に部分採血した。遠心分離によって血清を得て、群毎に等量ずつプールし、中和抗体価を測定した。50%プラック減少率から算出した結果を表55に示す。エーテル処理したウイルス様粒子はVero細胞培養日本脳炎ワクチン原薬と比較し、同様に十分な中和抗体を誘導した。
HBsウイルス様粒子の調製
1.ホルムアルデヒド処理(ウイルス粒子に対して粒子構造を固定化する工程)
HBs抗原液(懸濁液A)を撹拌しながら、最終濃度が0.018〜0.162w/v%となるようにホルムアルデヒドを添加し、反応させた。反応終了後、PBSで反応液を透析し、ホルムアルデヒドを除くことで、固定化されたHBs粒子を含む懸濁液Bを得た。
上記懸濁液Bに対して、最終濃度が0.05vol%になるようにポリソルベート80を添加した。その後最終濃度が50vol%となるように、上記懸濁液Bと等容のジエチルエーテル(脱脂剤)を添加し、25℃で1時間撹拌した。その後、得られた混合液を4℃、3000rpmで5分間遠心分離を行って、水相(懸濁液C)を回収することによってエーテル相を除いた。
上記懸濁液Cにアルミニウム塩を混合した。以上の工程によって、検体であるHBsウイルス様粒子を調製した。
物性評価
上記実施例9で得られたウイルス様粒子(検体)の物性を以下の方法で評価した。
1.電子顕微鏡による解析
ウイルス様粒子の形状を詳細に調べるために、電子顕微鏡による観察を実施した。観察用のイオンコートしたシートメッシュ(日新EM社製)に、約25μg/mLの上記検体を載せて約60秒間静置し、2%リンタングステン酸水溶液でネガティブ染色した。染色した検体を、透過型電子顕微鏡(FEIカンパニー社製テクナイG2:加速電圧120kV)を用いて観察、撮影した。
高親和性抗HBsマウスモノクローナル抗体を用いた1ステップサンドイッチEIA法によって、抗原の含有量(抗原含量)を測定した。上記測定は、全自動エンザイムイムノアッセイ装置AIA(東ソー株式会社製、商品名)を用いて行った。測定に用いる試薬カップには、磁性ビーズに固定化された抗体とアルカリ性ホスファターゼ標識抗体とが、凍結乾燥体として封入されている。上記試薬カップに検体を添加することで抗原抗体反応を、一定時間、一定温度で行った。反応後、洗浄水で上記磁性ビーズを洗浄することによって遊離の酵素標識抗体及び検体成分を除去した。その後、磁性ビーズに結合したアルカリ性ホスファターゼ標識抗体の酵素活性を測定するため、酵素基質として4−メチルウンベリフェリルリン酸を添加した。酵素反応の結果として得られる蛍光物質(4−メチルウンベリフェロン)の生成速度を測定することによって、検体中のHBs抗原濃度を測定した。
ウイルス様粒子の平均粒子径をZetasizer Nano ZS(Malvern社製)を用いて解析した。代表として、0.05w/v%のホルムアルデヒド濃度で37℃、96時間反応後、エーテル処理したウイルス様粒子、及び、比較対照として組換え沈降B型肝炎ワクチンを測定した結果を表57に示す。どちらの検体も平均粒子径が100nm前後で単峰性であった。このことから、エーテル処理後のウイルス様粒子の平均粒径は、ウイルス粒子と同等の粒子サイズであり、単一で変わらないことがわかった。動的光散乱実験から、ウイルス様粒子の粒子構造は保たれており、凝集体のような不純物は認められなかった。
HBs抗原に含まれる脂質成分のうち、80%以上はホスファチジルコリンである。そこで、HBs抗原の脂質成分の含有量はホスファチジルコリンの含有量を代表として定量することとした。Phosphatidylcholine Assay Kit(CELL BIOLABS社製、商品名)を用いて測定した。西洋わさび由来ペルオキシダーゼ(HRP)の触媒下で、反応過程で生じる過酸化水素を高感度蛍光プローブで検出し、その蛍光強度を測定することによってホスファチジルコリンの含有量を測定した。代表として、0.05w/v%のホルムアルデヒド濃度で37℃、96時間反応後、エーテル処理したウイルス様粒子、及び、比較対照として組換え沈降B型肝炎ワクチンを測定した結果を表58に示す。ウイルス様粒子のホスファチジルコリンの含有量は、比較対照に対して、多くても59質量%以下であることが示唆された。
BALB/cマウス及びC57BL/6マウス(雌性、5週齢)に、0.05w/v%のホルムアルデヒド濃度で37℃、96時間反応後、エーテル処理したウイルス様粒子(ポリソルベート80を0.005%添加してエーテル処理したもの)又は組換え沈降B型肝炎ワクチンを、2μg又は0.5μgの接種量で筋肉内接種した(一群当たり8匹)。免疫4週間後に再度免疫し、その4週間後にマウスを安楽死させ、全採血した。遠心分離によって血清を得て、全自動エンザイムイムノアッセイ装置AIA(東ソー株式会社製、商品名)を用いて、血清中の抗体価を測定した。固層及び酵素標識抗原にHBs抗原を用いた1ステップサンドイッチEIA法によって測定した。測定に用いる試薬カップには、磁性ビーズに固定化された抗原とアルカリ性ホスファターゼ標識抗原とが、凍結乾燥体として封入されている。上記試薬カップに検体を添加することで抗原抗体反応を一定時間、一定温度で行った。反応後、洗浄水で上記磁性ビーズを洗浄することによって未反応の酵素標識抗原を除去した。その後、磁性ビーズに結合したアルカリ性ホスファターゼ標識抗原の酵素活性を測定するため、酵素基質として4−メチルウンベリフェリルリン酸を添加した。酵素反応の結果として得られる蛍光物質(4−メチルウンベリフェロン)の生成速度を測定することによって、検体中の抗HBs抗体濃度を測定した。結果を表59に示す。エーテル処理したウイルス様粒子は組換え沈降B型肝炎ワクチンと比較して同等又はそれ以上の免疫原性であった。
Claims (31)
- エンベロープを有するウイルス粒子に由来するウイルス様粒子を含有するワクチンであって、
前記ウイルス様粒子は、粒子構造が固定化されており、
前記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量が、前記ウイルス粒子の脂質成分の含有量に対して低減している、ワクチン。 - 前記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量が、前記ウイルス粒子の脂質成分の含有量を基準として、50質量%未満である、請求項1に記載のワクチン。
- 前記ウイルス様粒子の脂質成分の含有量が、前記ウイルス粒子の脂質成分の含有量を基準として、20質量%未満である、請求項1又は2に記載のワクチン。
- 前記脂質成分がコレステロールである、請求項1〜3のいずれか一項に記載のワクチン。
- 前記ウイルス様粒子が、
前記ウイルス粒子の表面抗原、
前記ウイルス粒子のマトリックス蛋白質又は膜蛋白質、及び、
前記ウイルス粒子の核蛋白質、
を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のワクチン。 - 前記ウイルス様粒子が、前記ウイルス粒子に由来するゲノム核酸を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のワクチン。
- 前記ウイルス粒子が、オルソミクソウイルス粒子、フラビウイルス粒子、又はB型肝炎ウイルス粒子である、請求項1〜6のいずれか一項に記載のワクチン。
- 前記ウイルス粒子が、インフルエンザウイルス粒子、日本脳炎ウイルス粒子、又はB型肝炎ウイルス表面抗原(HBs)粒子である、請求項7に記載のワクチン。
- 前記ウイルス粒子が、インフルエンザウイルス粒子である、請求項8に記載のワクチン。
- 前記インフルエンザウイルス粒子が、A型インフルエンザウイルス粒子、又はB型インフルエンザウイルス粒子である、請求項9に記載のワクチン。
- 前記インフルエンザウイルス粒子が、H1N1亜型株、H2N2亜型株、H3N2亜型株、H3N8亜型株、H5N1亜型株、H5N2亜型株、H5N6亜型株、H6N1亜型株、H7N3亜型株、H7N7亜型株、H7N9亜型株、H9N2亜型株、又はH10N8亜型株に分類されるインフルエンザウイルス粒子である、請求項9又は10に記載のワクチン。
- 前記表面抗原が、ヘマグルチニン(HA)又はノイラミニダーゼ(NA)を含む、請求項8〜11のいずれか一項に記載のワクチン。
- 前記マトリックス蛋白質又は膜蛋白質が、M1蛋白質又はM2蛋白質を含む、請求項8〜12のいずれか一項に記載のワクチン。
- 前記ウイルス様粒子が、前記ウイルス粒子の粒子径の70〜130%の平均粒子径を有する、請求項1〜13のいずれか一項に記載のワクチン。
- 前記ウイルス様粒子が、ショ糖密度勾配遠心で測定した場合に、ショ糖濃度35%以上にピークが検出されるウイルス様粒子である、請求項1〜14のいずれか一項に記載のワクチン。
- ウイルス様粒子を含有するワクチンの製造方法であって、
エンベロープを有するウイルス粒子に対して粒子構造を固定化する工程と、
固定化された前記ウイルス粒子に対して脱脂処理を行う工程と、
を含む、製造方法。 - 前記固定化する工程が、前記ウイルス粒子を含む懸濁液Aに固定化剤を加える工程を含む、請求項16に記載の製造方法。
- 前記固定化剤がアルデヒド類を含む、請求項17に記載の製造方法。
- 前記固定化剤が1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドハイドロクロライド(EDC)を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記アルデヒド類が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項18に記載の製造方法。
- 前記アルデヒド類が、ホルムアルデヒドを含む、請求項20に記載の製造方法。
- 前記ホルムアルデヒドの濃度が、前記懸濁液A及び前記固定化剤の全量を基準として、0.007〜0.076w/v%である、請求項21に記載の製造方法。
- 前記アルデヒド類が、グルタルアルデヒドを含む、請求項20に記載の製造方法。
- 前記グルタルアルデヒドの濃度が、前記懸濁液A及び前記固定化剤の全量を基準として、0.002〜0.05w/v%である、請求項23に記載の製造方法。
- 前記脱脂処理を行う工程が、固定化された前記ウイルス粒子を含む懸濁液Bに脱脂剤を加える工程を含む、請求項16〜24のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記脱脂剤が、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、酢酸メチル、酢酸エチル、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項25に記載の製造方法。
- 前記脱脂剤が、ジエチルエーテルを含む、請求項26に記載の製造方法。
- 前記ジエチルエーテルの濃度が、前記懸濁液B及び前記脱脂剤の全量を基準として、10vol%以上である、請求項27に記載の製造方法。
- 前記脱脂剤が界面活性剤を更に含む、請求項25〜28のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記ウイルス粒子が、培養細胞又は鶏卵に感染させて、回収されたウイルス粒子である、請求項16〜29のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記培養細胞が、Vero細胞、又はMDCK細胞である、請求項30に記載の製造方法。
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