TW201617092A

TW201617092A - 包含類病毒顆粒之疫苗

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Publication number: TW201617092A
Application number: TW104123240A
Authority: TW
Inventors: Kazuhiko Kimachi; Motoharu Abe; Kazuyuki Ikeda; Hiroto Onuma; Yukari TSURUDOME; Daisuke Ikeno; Kiyoto Nishiyama; Tatsufumi Onchi; Yusuke OOYAMA; Issay ASANO; Ryoichi Kitano
Original assignee: Chemo Sero Therapeut Res Inst
Priority date: 2014-07-18
Filing date: 2015-07-17
Publication date: 2016-05-16
Also published as: AU2015290575A1; US10525122B2; JP6602762B2; WO2016010081A1; EP3170509A1; CA2955287A1; KR20170030635A; US20200093915A1; CN106535928A; TWI677349B; JPWO2016010081A1; EP3170509A4; US20170196965A1

Abstract

本發明提供一種疫苗，其是含有類病毒顆粒之疫苗，該類病毒顆粒源自具有套膜之病毒顆粒，其中，相對於上述病毒顆粒的脂質成分的含量，上述類病毒顆粒的脂質成分的含量是較少的。

Description

包含類病毒顆粒之疫苗

本發明有關一種包含類病毒顆粒的疫苗。本發明有關一種包含類病毒顆粒的疫苗，相對於全顆粒病毒，該類病毒顆粒的脂質成分的含量是較少的。

由於流行性感冒病毒及日本腦炎病毒等病毒所導致的傳染病，有時會隨著病毒的種類、所感染的對象而重症化。作為對於像這樣由於病毒所導致的傳染病的防禦方法，已知可接種疫苗等。

[先前技術文獻] (非專利文獻)

非專利文獻1：J. Infect. Dis. 2009 200(6)841-848

非專利文獻2：Vaccine 2009 27(5)786-791

對於流行性感冒病毒及日本腦炎病毒等病毒的疫苗，已製造、市售有去活化疫苗與活性疫苗兩種。其中，去活化疫苗大致分為：全病毒疫苗(whole virus vaccine)，其是以福馬林等去活化劑來處理精製後的病毒顆粒而進行調配；及，裂解疫苗(split vaccine)，其是以有機溶劑或界面活性劑來破壞精製後的病毒顆粒而進行調配。全病毒疫苗的免疫原性(immunogenicity)較高，因而在預防感染的效果方面較優異。然而，全病毒疫苗會有出現較強的局部反應和發熱等副反應的傾向。另一方面，裂解疫苗是一種疫苗，其是為了解決此副反應的問題，而包含以有機溶劑或界面活性劑來破壞(裂解化)病毒而成的物質。裂解疫苗，因為局部反應減少並且也幾乎無發熱反應，所以安全性優異。然而，弱是未建立基礎免疫的孩童或免疫反應衰弱的老年人，則會有裂解疫苗的免疫原性較低的傾向。因此，正在期待開發一種疫苗，其能夠顯示比裂解疫苗更優異的有效性(免疫原性)，進一步更佳是能夠顯示與全病毒疫苗匹敵的有效性，並且安全性較高。

本發明是有鑑於上述事由而完成，其目的在於提供一種疫苗，該疫苗的免疫原性較高，並且抑制副反應。

本發明人為了解決上述問題而專心研究，結果發現，令人驚訝的是，不破壞(裂解化)病毒的顆粒結構，而只減少病毒套膜的脂質成分，除此之外具有其餘與原本的病毒相同成分和結構之類病毒顆粒，在免疫原性試驗和發熱試驗的成績方面優異，以至完成本發明。

亦即，本發明提供以下[1]~[15]的發明。

[1]一種疫苗，其是含有類病毒顆粒之疫苗，該類病毒顆粒源自具有套膜之病毒顆粒，其中，上述類病毒顆粒的脂質成分的含量，相對於上述病毒顆粒的脂質成分的含量是較少的。

[2]如[1]所述的疫苗，其中，上述類病毒顆粒的脂質成分的含量，以上述病毒顆粒的脂質成分的含量作為基準，是小於50質量%。

[3]如[1]或[2]所述的疫苗，其中，上述類病毒顆粒的脂質成分的含量，以上述病毒顆粒的脂質成分的含量作為基準，是小於20質量%。

[4]如[1]~[3]中任一項所述的疫苗，其中，上述脂質成分是膽固醇。

[5]如[1]~[4]中任一項所述的疫苗，其中，上述類病毒顆粒包含：上述病毒顆粒的表面抗原、上述病毒顆粒的基質蛋白質或膜蛋白質、及上述病毒顆粒的核蛋白質。

[6]如[1]~[5]中任一項所述的疫苗，其中，上述類病毒顆粒包含源自上述病毒顆粒的基因組核酸。

[7]如[1]~[6]中任一項所述的疫苗，其中，上述病毒顆粒是正黏液病毒顆粒、黃病毒顆粒、或B型肝炎病毒顆粒。

[8]如[7]所述的疫苗，其中，上述病毒顆粒是流行性感冒病毒顆粒、日本腦炎病毒顆粒、或B型肝炎病毒表面抗原也就是HBs顆粒。

[9]如[8]所述的疫苗，其中，上述病毒顆粒是流行性感冒病毒顆粒。

[10]如[9]所述的疫苗，其中，上述流行性感冒病毒顆粒是A型流行性感冒病毒顆粒或B型流行性感冒病毒顆粒。

[11]如[9]或[10]所述的疫苗，其中，上述流行性感冒病毒顆粒是被分類為下述亞型株的流行性感冒病毒顆粒：H1N1亞型株、H2N2亞型株、H3N2亞型株、H3N8亞型株、H5N1亞型株、H5N2亞型株、H5N6亞型株、H6N1亞型株、H7N3亞型株、H7N7亞型株、H7N9亞型株、H9N2亞型株、或H10N8亞型株。

[12]如[8]~[11]中任一項所述的疫苗，其中，上述表面抗原包含血球凝集素也就是HA或神經胺酸酶也就是NA。

[13]如[8]~[12]中任一項所述的疫苗，其中，上述基質蛋白質或膜蛋白質包含M1蛋白質或M2蛋白質。

[14]如[1]~[13]中任一項所述的疫苗，其中，上述類病毒顆粒具有下述平均粒徑：上述病毒顆粒的粒徑的70~130%。

[15]如[1]~[14]中任一項所述的疫苗，其中，上述類病毒顆粒是下述類病毒顆粒：以蔗糖密度梯度離心法來進行測定時，在蔗糖濃度35%以上被偵測到峰值。

進一步，本發明提供以下[16]~[50]的發明。

[16]一種疫苗的製造方法，其是含有類病毒顆粒之疫苗的製造方法，該製造方法包含下述步驟：固定化步驟，其對於具有套膜之病毒顆粒，將顆粒結構固定化；及，實行脫脂處理的步驟，其對於被固定化後的上述病毒顆粒實行脫脂處理。

[17]如[16]所述的疫苗的製造方法，其中，上述固定化步驟包含下述步驟：在懸浮液A中添加固定劑的步驟，該懸浮液A包含上述病毒顆粒。

[18]如[17]所述的疫苗的製造方法，其中，上述固定劑包含醛類。

[19]如[17]所述的疫苗的製造方法，其中，上述固定劑包含1-乙基-3-[3-二甲胺丙基]碳二亞胺鹽酸鹽也就是EDC。

[20]如[18]所述的疫苗的製造方法，其中，上述醛類是選自由甲醛、聚甲醛、戊二醛、及這些醛類的組合所構成之群組。

[21]如[20]所述的疫苗的製造方法，其中，上述醛類包含甲醛。

[22]如[21]所述的疫苗的製造方法，其中，上述甲醛的濃度，以上述懸浮液A和上述固定劑的總量作為基準，是0.007~0.076w/v%。

[23]如[20]所述的疫苗的製造方法，其中，上述醛類包含戊二醛。

[24]如[23]所述的疫苗的製造方法，其中，上述戊二醛的濃度，以上述懸浮液A和上述固定劑的總量作為基準，是0.002~0.05w/v%。

[25]如[16]~[24]中任一項所述的疫苗的製造方法，其中，上述實行脫脂處理的步驟包含下述步驟：在懸浮液B中添加脫脂劑的步驟，該懸浮液B包含被固定化後的上述病毒顆粒。

[26]如[25]所述的疫苗的製造方法，其中，上述脫脂劑是選自由二乙醚、二異丙醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、及這些脫脂劑的組合所構成之群組。

[27]如[26]所述的疫苗的製造方法，其中，上述脫脂劑包含二乙醚。

[28]如[27]所述的疫苗的製造方法，其中，上述二乙醚的濃度，以上述懸浮液B和上述脫脂劑的總量作為基準，是10vol%以上。

[29]如[25]~[28]中任一項所述的疫苗的製造方法，其中，上述脫脂劑進一步包含界面活性劑。

[30]如[16]~[29]中任一項所述的疫苗的製造方法，其中，上述病毒顆粒是使培養細胞或雞蛋感染並回收而得的病毒顆粒。

[31]如[30]所述的疫苗的製造方法，其中，上述培養細胞是非洲綠猴腎(Vero)細胞或馬丁達比犬腎(MDCK)細胞。

[32]一種預防由於病毒所導致的傳染病的方法，其中，該方法包含投予步驟，該步驟是將含有類病毒顆粒之疫苗投予至對象，而該類病毒顆粒源自具有套膜之病毒顆粒；並且，相對於上述病毒顆粒的脂質成分的含量，上述類病毒顆粒的脂質成分的含量是較少的。

[33]如[32]所述的方法，其中，上述對象是哺乳動物。

[34]如[32]所述的方法，其中，上述對象是人。

[35]如[32]~[34]中任一項所述的方法，其中，上述類病毒顆粒的脂質成分的含量，以上述病毒顆粒的脂質成分的含量作為基準，是小於50質量%。

[36]如[32]~[35]中任一項所述的方法，其中，上述類病毒顆粒的脂質成分的含量，以上述病毒顆粒的脂質成分的含量作為基準，是小於20質量%。

[37]如[32]~[36]中任一項所述的方法，其中，上述脂質成分是膽固醇。

[38]如[32]~[37]中任一項所述的方法，其中，上述類病毒顆粒包含：上述病毒顆粒的表面抗原、上述病毒顆粒的基質蛋白質或膜蛋白質、及上述病毒顆粒的核蛋白質。

[39]如[32]~[38]中任一項所述的方法，其中，上述類病毒顆粒包含源自病毒顆粒的基因組核酸。

[40]如[32]~[39]中任一項所述的方法，其中，上述病毒顆粒是正黏液病毒顆粒、黃病毒顆粒、或B型肝炎病毒顆粒。

[41]如[40]所述的方法，其中，上述病毒顆粒是流行性感冒病毒顆粒、日本腦炎病毒顆粒、或B型肝炎病毒表面抗原也就是HBs顆粒。

[42]如[41]所述的方法，其中，上述病毒顆粒是流行性感冒病毒顆粒。

[43]如[42]所述的方法，其中，上述流行性感冒病毒顆粒是A型流行性感冒病毒顆粒或B型流行性感冒病毒顆粒。

[44]如[42]或[43]所述的方法，其中，上述流行性感冒病毒顆粒是被分類為下述亞型株的流行性感冒病毒顆粒：H1N1亞型株、H2N2亞型株、H3N2亞型株、H3N8亞型株、H5N1亞型株、H5N2亞型株、H5N6亞型株、H6N1亞型株、H7N3亞型株、H7N7亞型株、H7N9亞型株、H9N2亞型株、或H10N8亞型株。

[45]如[41]~[44]中任一項所述的方法，其中，上述表面抗原包含血球凝集素也就是HA或神經胺酸酶也就是NA。

[46]如[41]~[45]中任一項所述的方法，其中，上述基質蛋白質或膜蛋白質包含M1蛋白質或M2蛋白質。

[47]如[32]~[46]中任一項所述的方法，其中，上述類病毒顆粒具有下述平均粒徑：上述病毒顆粒的粒徑的70~130%。

[48]如[32]~[47]中任一項所述的方法，其中，上述類病毒顆粒是下述類病毒顆粒：以蔗糖密度梯度離心法來進行測定時，在蔗糖濃度35%以上被偵測到峰值。

[49]一種用途，其是在對於病毒製造疫苗時的類病毒顆粒的用途，該類病毒顆粒源自具有套膜之病毒顆粒，其中，相對於上述病毒顆粒的脂質成分的含量，上述類病毒顆粒的脂質成分的含量是較少的。

[50]一種類病毒顆粒，其是源自具有套膜之病毒顆粒之類病毒顆粒，該類病毒顆粒是用來預防由於病毒所導致的傳染病，其中，相對於上述病毒顆粒的脂質成分的含量，上述類病毒顆粒的脂質成分的含量是較少的。

根據本發明，能夠提供一種疫苗，其免疫原性較高，並且抑制副反應。

第1圖是以電子顯微鏡拍攝流行性感冒病毒顆粒和源自該病毒顆粒的類病毒顆粒的照片(福馬林處理)。

第2圖是表示狹縫墨點(Slot-blot)法的結果的照片，該結果表示在源自流行性感冒病毒顆粒的類病毒顆粒中有無基質蛋白質(M1)和核蛋白質(NP)。

第3圖是表示西方墨點(Western-blot)法的結果的照片，該結果表示在源自流行性感冒病毒顆粒的類病毒顆粒中有無血球凝集素(HA)、基質蛋白質(M1)及核蛋白質(NP)。

第4圖是瓊脂膠體電泳(agarose gel electrophoresis)的照片，該瓊脂膠體電泳是確認在源自流行性感冒病毒顆粒的類病毒顆粒中有無基因組RNA。

第5圖是以電子顯微鏡拍攝流行性感冒病毒顆粒和源自該病毒顆粒的類病毒顆粒的照片(戊二醛處理)。

第6圖是以電子顯微鏡拍攝流行性感冒病毒顆粒和源自該病毒顆粒的類病毒顆粒的照片(EDC處理)。

第7圖是以電子顯微鏡拍攝日本腦炎病毒顆粒和源自該病毒顆粒的類病毒顆粒的照片(戊二醛處理)。

第8圖是以電子顯微鏡拍攝重組沉降B型肝炎類病毒顆粒和源自該類病毒顆粒的類病毒顆粒的照片(福馬林處理)。

以下，詳細說明本發明的適合的實施形態。但是本發明並未受限於以下實施形態。

(含有類病毒顆粒之疫苗)

本實施形態的疫苗是一種含有類病毒顆粒之疫苗，該類病毒顆粒源自具有套膜(envelope)之病毒顆粒(以下有時稱為「套膜病毒顆粒」)，其中，相對於上述病毒顆粒的脂質成分的含量，上述類病毒顆粒的脂質成分的含量是較少的。上述疫苗的免疫原性是在裂解疫苗的免疫原性以上，亦可以是與全病毒疫苗的免疫原性相同程度或以上。上述疫苗能夠以與裂解疫苗相同或以上的程度來抑制局部反應及發熱等副反應。

「源自具有套膜之病毒顆粒之類病毒顆粒」(以下有時僅稱為「類病毒顆粒」)意指一種結構體，其是藉由改變具有套膜之病毒顆粒而獲得，且具有與上述病毒顆粒類似的外部結構和內部結構。本實施形態的類病毒顆粒，其顆粒結構可被固定化，以維持與成為該類病毒顆粒的來源的原病毒顆粒相同程度的顆粒性。

作為套膜病毒顆粒所含的脂質成分，可列舉例如：膽固醇、磷脂醯膽鹼(phosphatidylcholine)、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、神經鞘磷脂(sphingomyelin)等。上述脂質成分可以是膽固醇。

上述脂質成分的含量，可藉由公知的方法來測定。可列舉例如：膽固醇氧化酶-DAOS(3,5-二甲氧基-N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-苯胺鈉鹽)法、螢光色素法、質譜分析法等。

例如以螢光色素法進行測定時，上述類病毒顆粒的脂質成分的含量，以上述病毒顆粒的脂質成分的含量作為基準，可以是80質量%以下，亦可以是75質量%以下，亦可以是70質量%以下，亦可以是60質量%以下，亦可以是50質量%以下，亦可以是小於50質量%，亦可以是40質量%以下，亦可以是30質量%以下，亦可以是20質量%以下，亦可以是小於20質量%。若上述類病毒顆粒的脂質成分的含量，以上述病毒顆粒的脂質成分的含量作為基準，是在上述範圍內，以類病毒顆粒作為疫苗進行接種時，會有更容易抑制發熱反應等副反應的傾向。上述類病毒顆粒的脂質成分的含量的下限並無特別限制，例如，以上述病毒顆粒的脂質成分的含量作為基準，可以是1質量%以上，亦可以是5質量%以上，亦可以是10質量%以上，亦可以是15質量%以上。

作為具有套膜之病毒顆粒，可列舉例如：痘病毒顆粒、疱疹病毒顆粒、正黏液病毒顆粒、副黏液病毒顆粒、棒狀病毒顆粒、冠狀病毒顆粒、沙狀病毒顆粒、披膜病毒顆粒、黃病毒顆粒、布尼亞病毒(bunyavirus)顆粒、反轉錄病毒顆粒、肝去氧核糖核酸病毒顆粒(hepadnavirus)、及B型肝炎病毒顆粒。上述病毒顆粒可以是下述病毒顆粒：使顆粒結構固定化，並且具有表面抗原和基質蛋白質或膜蛋白質。作為像這樣的病毒顆粒，可列舉例如：正黏液病毒顆粒、副黏液病毒顆粒、棒狀病毒顆粒、及黃病毒顆粒。上述正黏液病毒顆粒可以是流行性感冒病毒顆粒。上述黃病毒顆粒可以是日本腦炎病毒顆粒。上述B型肝炎病毒顆粒可以是B型肝炎病毒表面抗原(HBs)顆粒。

作為流行性感冒病毒顆粒，可列舉例如：A型流行性感冒病毒顆粒和B型流行性感冒病毒顆粒。若為A型流行性感冒病毒顆粒，可列舉被分類為下述亞型株的流行性感冒病毒顆粒：H1N1亞型株、H2N2亞型株、H3N2亞型株、H3N8亞型株、H5N1亞型株、H5N2亞型株、H5N6 亞型株、H6N1亞型株、H7N3亞型株、H7N7亞型株、H7N9亞型株、H9N2亞型株、或H10N8亞型株。

類病毒顆粒可包含：病毒顆粒的表面抗原、病毒顆粒的基質蛋白質或膜蛋白質、及病毒顆粒的核蛋白質。藉由採取像這樣的構成，會有免疫原性更加提升的傾向。

病毒顆粒是流行性感冒病毒顆粒時，作為上述表面抗原，可列舉例如：血球凝集素(HA)、神經胺酸酶(NA)。

病毒顆粒是流行性感冒病毒顆粒時，作為上述基質蛋白質，可列舉例如M1蛋白質。作為膜蛋白質，可列舉例如M2蛋白質。

類病毒顆粒可包含源自病毒顆粒的基因組核酸。上述類病毒顆粒的上述基因組核酸的含量，以上述病毒顆粒(或去活化全顆粒病毒)的上述基因組核酸的含量作為基準，可以是50質量%以上，亦可以是80質量%以上，亦可以是85質量%以上，亦可以是90質量%以上，亦可以是95質量%以上，亦可以是100質量%。上述類病毒顆粒的上述基因組核酸的含量的上限，並無特別限制，以上述病毒顆粒的上述基因組核酸的含量作為基準，可以是100質量%以下，亦可以是99質量%以下，亦可以是95質量%以下。

上述基因組核酸的含量，可藉由公知的方法來測定。可列舉例如：螢光法、吸光度法、聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)法等。

過去，已知一種類病毒顆粒(virus-like particle，VLP)的製作方法，其是將編碼表面抗原、基質蛋白質、或膜蛋白質的基因導入宿主內(例如，酵母細胞、昆蟲細胞等)，這些蛋白質能夠構成病毒顆粒，並使這些蛋白質在宿主內表現，之後形成病毒顆粒。以像這樣的基因重組技術所獲得的VLP，不含源自病毒的基因組核酸和核蛋白質。另一方面，本實施形態的類病毒顆粒，如後所述，是藉由下述方式製作：使病毒顆粒本身對宿主感染、增殖，之後對於所獲得的病毒顆粒施加後述的固定化處理和脫脂處理。因此，本實施形態的類病毒顆粒，與以基因重組技術所製作的VLP不同，而能夠包含源自病毒顆粒的基因組核酸和核蛋白質。

源自病毒顆粒的基因組核酸能夠作為佐劑(adjuvant)來作用。例如，在去活化脊髓灰質炎疫苗中有下述抗原：包含病毒基因組RNA的D抗原和不含病毒基因組RNA的C抗原。C抗原，其免疫原性較弱，而無法顯現作為疫苗抗原的功效。作為疫苗抗原而具有功效的分子種類只有D抗原。此暗示疫苗所內含的病毒基因組RNA對於該功效的表現是重要的。因此，本實施形態的類病毒顆粒，從使疫苗的免疫原性更加提升的觀點而言，可含有源自病毒顆粒的基因組核酸。核蛋白質能夠誘發對應於病毒的細胞毒性T細胞(cytotoxic T cell)等細胞性免疫，而對於排除病毒顯現功效，因此本實施形態的類病毒顆粒可包含核蛋白質。

本實施形態的類病毒顆粒，能夠誘發Th1型反應。與裂解流行性感冒疫苗會誘發Th2型反應是相對的。在小鼠中藉由Th1型反應所誘發的IgG2a亞型的抗體，比藉由Th2型反應所誘發的IgG1亞型的抗體，對於流行性感冒病毒的感染防禦性能更優異。因此，可期待藉由上述類病毒顆粒所導致的有效性更加提升。亦即，在小鼠中，比起誘發抗原特異性的IgG1，上述類病毒顆粒更可誘發抗原特異性的IgG2a。

類病毒顆粒，在藉由蔗糖密度梯度離心法、高速液相層析(high speed liquid chromatography)、及/或動態光散射法來進行測定時，可以是與成為來源的原病毒顆粒相同的參數(例如，分子量、平均粒徑、密度、血球凝集素(HA)含量等)。

例如，類病毒顆粒可以是具有下述平均粒徑的類病毒顆粒：成為來源的原病毒顆粒的粒徑的70~130%；亦可以是具有下述平均粒徑的類病毒顆粒：成為來源的原病毒顆粒的粒徑的80~120%。

類病毒顆粒是源自流行性感冒病毒顆粒時，類病毒顆粒的平均粒徑，在以動態光散射法進行測定時，可以是120nm前後，亦可以是110~130nm，亦可以是120~130nm。在其他方面，類病毒顆粒是源自流行性感冒病毒顆粒時，類病毒顆粒的平均粒徑，在以動態光散射法進行測定時，可以是95nm以上，亦可以是100nm以上，亦可以是110nm以上，亦可以是120nm以上，亦可以是130nm以上。上述平均粒徑，可以是145nm以下，亦可以是140nm以下，亦可以是130nm以下。類病毒顆粒是源自日本腦炎病毒顆粒時，類病毒顆粒的平均粒徑，在以動態光散射法進行測定時，可以是95nm前後，亦可以是80~120nm。類病毒顆粒是源自B型肝炎病毒表面抗原(HBs)顆粒時，類病毒顆粒的平均粒徑，在以動態光散射法進行測定時，可以是100nm前後，亦可以是90~160nm。

類病毒顆粒，在以蔗糖密度梯度離心法來進行測定時，可以是在蔗糖濃度35%以上被偵測到峰值之類病毒顆粒，亦可以是在蔗糖濃度45%以上且55%以下能夠偵測到峰值的類病毒顆粒，亦可以是在蔗糖濃度49%以上且52%以下能夠偵測到峰值的類病毒顆粒。上述蔗糖濃度可藉由公知的方法求得。例如，可藉由下述方式來求得上述蔗糖濃度：將包含類病毒顆粒的檢體疊加於15~60%的蔗糖密度梯度上，以4℃、18000rpm實行離心分離16小時。

疫苗所含的類病毒顆粒的量，可視病毒的種類或投予對象來適當選擇。例如，疫苗所含的類病毒顆粒的量(濃度)，以血球凝集素濃度計，可以是每病毒株1~40μg/ml。

疫苗可以是單價疫苗(monovalent vaccine)，其包含源自相同種類病毒或細菌的抗原。疫苗亦可以是混合疫苗，其包含源自複數種類病毒或細菌的抗原。疫苗亦可以是多價疫苗(multivalent vaccine)，其包含源自同屬病毒或細菌且複數種類型的抗原。例如，疫苗是流行性感冒病毒疫苗時，可包含A型流行性感冒病毒顆粒或B型流行性感冒病毒顆粒的任一者，亦可包含兩者。上述流行性感冒病毒疫苗或日本腦炎病毒疫苗可包含源自其他病毒或細菌的抗原。例如，可混合有白喉-百日咳-破傷風-去活化脊髓灰白質炎病毒混合疫苗(DPT-IPV疫苗)。

疫苗的劑型，可以是例如：液狀、粉末狀(冷凍乾燥粉末、乾燥粉末)、膠囊狀、錠劑、冷凍狀態。

疫苗可包含作為醫藥而能夠被容許的載體。作為上述載體，可無限制地使用在製造疫苗時一般所使用的載體。具體而言，上述載體，可列舉：食鹽水、緩衝食鹽水、葡萄糖、水、甘油、等張水性緩衝溶液、及這些載體的組合。疫苗可進一步適當摻合有乳化劑、防腐劑(例如硫柳汞(thimerosal))、等張化劑(isotonicifier)、pH調整劑、去活化劑(例如福馬林)等。

疫苗的投予途徑可以是例如：經皮投予、舌下投予、點眼投予、皮內投予、肌內投予、經口投予、經腸投予、經鼻投予、靜脈內投予、皮下投予、腹腔內投予、自口至肺的吸入投予。

疫苗的投予方法可以是藉由例如下述手段來進行投予的方法：注射器、經皮貼劑、微針、可移植的緩釋性裝置、附有微針的注射器、無針裝置、或噴劑。

為了更加提高疫苗的免疫原性，疫苗除了包含類病毒顆粒以外，也可包含佐劑。作為佐劑，可列舉例如：鋁佐劑或包含角鯊烯(squalene)的水中油型乳化佐劑(AS03、MF59等)；CpG和3-O-去醯化4’-單磷醯基脂質A(3-O-deacylated monophosphoryl lipid A，MPL)等類鐸受體(toll-like receptor)的配體(ligand)；皂素系佐劑；γ-聚麩胺酸等聚合物系佐劑；幾丁聚醣(chitosan)和菊糖(inulin)等多醣類。

作為對象的哺乳動物，可列舉例如：小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、兔、貓、狗、綿羊、豬、牛、馬、山羊、猴、人等。本實施形態的疫苗，可對於人使用，亦可對於未滿5歲的孩童、65歲以上的老年人使用。

疫苗會隨著投予目的、投予方法、投予對象的狀況(性別、年齡、體重、病情等)而不同，在對於人投予時，可以每一次投予3.8μgHA~30μgHA的有效成分(類病毒顆粒)的方式來使用。

(疫苗的製造方法)

本實施形態的含有類病毒顆粒之疫苗的製造方法，其包含下述步驟：固定化步驟，其對於具有套膜之病毒顆粒，將顆粒結構固定化；及，實行脫脂處理的步驟，其對於被固定化後的上述病毒顆粒實行脫脂處理。

作為提高疫苗的安全性的技術，過去以來，已知一種方法，其使用界面活性劑或有機溶劑來破壞(裂解化)具有套膜之病毒顆粒。然而，這些方法會有伴隨顆粒崩壞而疫苗的有效性(免疫原性)下降的傾向。上述製造方法則是在實行脫脂處理前已將病毒顆粒固定化，因此，即使藉由脫脂處理也能夠維持病毒顆粒結構，就結果而言，變成能夠一邊維持疫苗的有效性一邊提高安全性。

上述製造方法可進一步包含下述步驟：培養宿主的步驟、使病毒對宿主感染的步驟、在宿主內使病毒增殖的步驟、或自宿主回收病毒顆粒的步驟。

病毒顆粒可以是下述病毒顆粒：使病毒顆粒對宿主感染、增殖，之後自宿主回收而得。宿主可視病毒顆粒的種類來適當選擇。病毒顆粒是流行性感冒病毒顆粒時，作為宿主，可列舉例如：培養細胞、雞蛋。作為培養細胞，可列舉例如：非洲綠猴腎細胞(Vero cell)及馬丁達比犬腎細胞(Madin-Darby canine kidney cell，MDCK cell)。

作為流行性感冒病毒的感染、增殖方法，使用雞蛋或Vero細胞作為宿主的方法(Vaccine.1998 May-Jun；16(9-10)：960-8.)、使用Vero細胞作為宿主的方法(Vaccine.2007 August 10；25(32)：6028-6036.)、使用MDCK細胞作為宿主的方法(J Virol.2012 Nov；86(22)：12341-50)，是對本發明所屬技術領域中具有通常知識者而言公知的方法。

<對於具有套膜之病毒顆粒將顆粒結構固定化的步驟>

在本實施形態中，「固定化」意指使表面抗原彼此、表面抗原與基質蛋白質(或膜蛋白質)、或基質蛋白質彼此(或膜蛋白質彼此)進行化學鍵結，而保持病毒顆粒的顆粒結構。本發明人認為，類病毒顆粒藉由保持病毒原本的顆粒結構，而使類病毒顆粒的免疫原性為裂解疫苗的免疫原性以上，並且隨著製作條件不同而能夠成為與去活化全顆粒病毒的免疫原性相同程度或以上。顆粒結構的保持可藉由下述方法來確認：電子顯微鏡解析、蔗糖密度梯度分離、或動態光散射法、使用對應於HA、NP或M1的抗體的偵測法(狹縫墨點法、西方墨點法等)。

上述固定化的步驟，可例示以固定劑對病毒顆粒進行處理的方法，可列舉例如：在懸浮液A中添加固定劑的步驟，該懸浮液A包含上述病毒顆粒。固定劑的種類，可視病毒的種類來適當變更。上述固定劑，可列舉例如：有機溶劑、醛類、二亞胺酸酯、富馬酸雙(3,5-二溴水楊酸)酯(DBBF)、1-乙基-3-[3-二甲胺丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、及這些固定劑的組合。作為有機溶劑，可列舉例如：甲醇、乙醇、丙酮、及這些有機溶劑的組合。作為醛類，可列舉例如：甲醛(例如福馬林)、聚甲醛、戊二醛、及這些醛類的組合。

固定劑的濃度，可視病毒的種類、固定劑的種類來適當變更。固定劑包含甲醛時，甲醛的濃度，以懸浮液A和固定劑的總量作為基準，可以是0.007~0.076w/v%。上述甲醛的濃度小於0.007 w/v%時，會使固定化變弱，而有不易保持顆粒結構的傾向。上述甲醛的濃度超過0076w/v%時，會使固定化較強，而有由於交聯所實行的化學修飾(chemical modification)會過度進行的傾向。從使HA活性更加提升的觀點而言，甲醛的濃度，以懸浮液A和固定劑的總量作為基準，可以是0.0175~0.076w/v%，亦可以是0.028~0.076w/v%。使用包含甲醛的固定劑的方法，在病毒顆粒是流行性感冒病毒顆粒時亦可使用。

固定劑是福馬林時(35~38%甲醛水溶液)，福馬林濃度，以懸浮液A和固定劑的總量作為基準，可以是0.02~0.2vol%，亦可以是0.05~0.2vol%，亦可以是0.08~0.2vol%。

固定劑包含戊二醛時，戊二醛的濃度，以懸浮液A和固定劑的總量作為基準，可以是0.002~0.05vol%，亦可以是0.005~0.01vol%。上述濃度小於0.002vol%時，在使用了日本腦炎病毒顆粒作為病毒顆粒時，會有顆粒凝集的傾向。上述濃度超過0.05vol%時，在使用了日本腦炎病毒顆粒作為病毒顆粒時，會有主要結構蛋白質也就是E蛋白質的抗原決定位(epitope)失去活性的傾向。使用戊二醇作為固定劑的方法，在病毒顆粒是流行性感冒病毒顆粒、日本腦炎病毒顆粒時亦可使用。

固定劑包含1-乙基-3-[3-二甲胺丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)時，EDC的濃度，以懸浮液A的總量作為基準，可以是0.005~0.5M，亦可以是0.005~0.05M。使用包含EDC的固定劑的方法，在病毒顆粒是流行性感冒病毒顆粒時亦可使用。

以固定劑進行處理時的溫度，可視病毒的種類、固定劑的種類、固定劑的濃度等來適當變更。上述溫度可以是4℃~37℃，亦可以是25℃~37℃。

以固定劑進行處理時的期間(處理時間)，可視病毒的種類、固定劑的種類、固定劑的濃度、固定化處理的溫度等來適當變更。上述期間可以是1天至6星期，亦可以是1星期至4星期。使用EDC作為固定劑時，上述期間可以是0.5小時~4小時，亦可以是1.5小時~2.5小時。

<對於被固定化後的病毒顆粒實行脫脂處理的步驟>

實行脫脂處理的步驟，可例示以脫脂劑對被固定化後的病毒顆粒進行處理的方法，可列舉例如：在包含被固定化後的病毒顆粒的懸浮液B中添加脫脂劑的步驟。脫脂劑的種類，可視病毒的種類來適當變更。上述脫脂劑，可列舉例如：二乙醚、二異丙醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、及這些脫脂劑的組合。以脫脂劑進行處理時的濃度，可視病毒的種類或脫脂劑的種類來適當變更。脫脂劑的濃度，以懸浮液B和脫脂劑的總量作為基準，可以是10vol%以上且400vol%以下。上述脫脂劑的濃度小於10vol%時，會有使脫脂不完全的傾向。上述脫脂劑的濃度超過400vol%時，會有變成無法保持病毒顆粒的結構的傾向。脫脂劑包含二乙醚時，二乙醚的濃度，以懸浮液B和脫脂劑的總量作為基準，可以是10vol%以上，亦可以是12.5vol%~50vol%，亦可以是33vol%~50vol%。

脫脂劑可包含界面活性劑。會抑制類病毒顆粒彼此凝集，而有產率提升的傾向。作為界面活性劑，可列舉例如：聚氧乙烯辛基苯基醚、聚山梨醇酯80、及這些界面活性劑的組合。脫脂劑所含的界面活性劑的濃度，可以是0.002vol%~0.3vol%，亦可以是0.005vol%~0.1vol%。

以脫脂劑進行處理時的溫度，可視病毒的種類、脫脂劑的種類、脫脂劑的濃度等來適當變更。上述溫度可以是4℃至常溫(25℃)。

以脫脂劑進行處理時的期間(處理時間)，可視病毒的種類、脫脂劑的種類、脫脂劑的濃度、脫脂劑的溫度等來適當變更。上述期間可以是1小時至2小時。

在上述製造方法中，可進一步包含在脫脂處理後去除脫脂劑的步驟。脫脂劑是二乙醚時，可列舉例如下述方法：以4℃、3000rpm將懸浮液B與脫脂劑的混合液進行離心5分鐘，之後回收水相。

可視需要進一步包含將所回收的類病毒顆粒進行精製的步驟。作為將類病毒顆粒進行精製的方法，可依公知的方法來適當實行，可列舉例如：使用超過濾膜(ultrafiltration membrane)進行過濾的方法。

疫苗接種較佳是能夠對於對象賦予與實際感染時相同的免疫的質和量，而由疫苗所誘發的免疫相對於由實際感染所引起的免疫的模仿性能夠決定其功效。疫苗中可以包含所有作為用來防禦感染的抗原的病毒蛋白質。考慮到用來提高病毒蛋白質的免疫原性的源自病毒的基因組核酸的存在、病毒顆粒的大小、形狀等，分別在免疫反應中發揮作用，本發明人認為，最佳的疫苗是指具有與實際的病毒更接近的成分和結構之疫苗。本實施形態的類病毒顆粒，僅減少病毒套膜的脂質成分，此外則具有與原本的病毒顆粒相同程度的成分和結構，因此可提供一種疫苗，其免疫原性較高，並且抑制副反應。

[實施例]

以下，藉由實施例詳細說明本發明，但是本發明完全不受限於這些實施例。

[實施例1]

<調配流行性感冒類病毒顆粒>

1.福馬林處理(對於病毒顆粒將顆粒結構固定化的步驟)

將B型流行性感冒病毒(B/Wisconsin/1/2011株，以下有時記載為「B/WC株」)接種至11日齡的受精雞蛋的絨毛尿囊腔內，並在34℃培養2天。將所獲得的尿囊液進行澄清化，之後藉由離心分離使流行性感冒病毒顆粒沉澱。藉由下述方式精製上述流行性感冒病毒：以磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)再度使其漂浮，並以蔗糖密度梯度離心法來回收蔗糖濃度為33%~50%的部分。以精製後的流行性感冒病毒顆粒的蛋白質的濃度成為最後濃度500μ g/mL的方式，來稀釋所獲得的部分，而獲得懸浮液A。之後，以最後濃度成為0.02~0.2vol%(以甲醛換算，為0.007~0.076w/v%)的方式，將福馬林(35~38w/v%甲醛水溶液，固定劑)添加至懸浮液A中，並且，在4℃使其反應4星期或6星期，或在25℃使其反應1星期。反應結束後，以PBS進行滲析來去除福馬林，藉此獲得懸浮液B，該懸浮液B包含被固定化後的流行性感冒病毒顆粒。

2.醚化處理(對於被固定化後的病毒顆粒實行脫脂處理的步驟)

在實行福馬林處理後的包含流行性感冒病毒顆粒的懸浮液B中，以最後濃度成為0.1vol%的方式來添加聚山梨醇酯80。之後，以最後濃度成為50vol%的方式，來添加與上述懸浮液B相同容量的二乙醚(脫脂劑)，並在4℃攪拌2小時。之後，以4℃、3000rpm對所獲得的混合液實行離心分離5分鐘，並回收水相，藉此去除醚相。藉由以上步驟，來調配檢體也就是流行性感冒類病毒顆粒。

作為預備實驗，以膽固醇氧化酶-3,5-二甲氧基-N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-苯胺鈉鹽(DAOS)法來測定所獲得的流行性感冒類病毒顆粒的脂質成分的含量。其結果暗示，相對於流行性感冒病毒顆粒的脂質成分的含量，所獲得的流行性感冒類病毒顆粒的脂質成分的含量至多是80質量%以下。以下，藉由螢光色素法來詳細研究流行性感冒類病毒顆粒的脂質成分的含量。

已有報告指出流行性感冒病毒的套膜包含多量的膽固醇，因此將膽固醇作為脂質成分的代表來進行定量。

3.脂質成分的含量

在A型流行性感冒病毒中，H1N1亞型株(A/California/07/2009(X-179A)株，以下有時記載為「A/CA株」)和H3N2亞型株(A/New York/39/2012(X-233A)株，以下有時記載為「A/NY株」)，是以依照上述的方法來製作類病毒顆粒。在其他的B型流行性感冒病毒中，B/Brisbane/60/2008株(以下有時記載為「B/BR株」)和B/Massachusetts/2/2012(BX-51B)株(以下有時記載為「B/MA株」)，是以依照上述的方法來製作類病毒顆粒。使用Amplex Red Cholesterol Assay Kit(Invitrogen Corporation製造的商品名)來測定作為代表的流行性感冒類病毒顆粒的脂質成分的含量，該類病毒顆粒是以0.08%的福馬林濃度在25℃進行反應1星期，之後進行醚處理而成。首先，對包含流行性感冒類病毒顆粒的檢體，進行超高速離心分離(24000rpm，2hr，4℃)而分離成上清液與沉澱成分。以PBS將所獲得的沉澱成分進行再懸浮。在再懸浮後的沉澱成分中添加螢光物質試鹵靈(resorufin)，而使其反應。反應後測定螢光物質試鹵靈的螢光強度，藉此對流行性感冒類病毒顆粒的脂質成分的含量進行定量。其結果暗示，相對於流行性感冒病毒全顆粒(以下有時記載為「全顆粒抗原」)的脂質成分的含量，流行性感冒類病毒顆粒的脂質成分的含量至多是40質量%以下(表1)。

4.脂質成分的含量(研究醚容量比)

以源自H1N1亞型株(A/CA株)的類病毒顆粒作為代表，研究藉由改變醚容量比所導致的對於脫脂處理的影響。首先，以蛋白質濃度成為最後濃度2500μg/mL的方式，以PBS稀釋類病毒顆粒，並以0.08%的福馬林濃度在25℃使其反應1星期。反應結束後，以PBS進行滲析來去除福馬林，藉此獲得懸浮液B，該懸浮液B包含被固定化後的流行性感冒病毒顆粒。之後，除了改變醚的容量以外，其餘則藉由與上述「2.醚處理」相同的方法來實行醚處理(脫脂處理)，而獲得流行性感冒類病毒顆粒。使用所獲得的流行性感冒類病毒顆粒，並使用Amplex Red Cholesterol Assay Kit(Invitrogen Corporation 製造的商品名)來測定脂質成分的含量。對包含流行性感冒類病毒顆粒的檢體，進行超高速離心分離(24000rpm，2hr，4℃)而分離成上清液與沉澱成分。以PBS將所獲得的沉澱成分進行再懸浮。在再懸浮後的沉澱成分中添加螢光物質試鹵靈，而使其反應。反應後測定螢光物質試鹵靈的螢光強度，藉此對流行性感冒類病毒顆粒的脂質成分的含量進行定量。比較對照是使用去活化全顆粒病毒(以下有時記載為「全顆粒抗原」)，該全顆粒病毒是以福馬林濃度0.02%在4℃使其反應6星期而成。其結果暗示，在將醚：懸浮液B(vol比)設為1：1來實行醚處理時，流行性感冒類病毒顆粒的脂質成分的含量，相對於流行性感冒病毒全顆粒的脂質成分的含量，是約70質量%。在將醚：懸浮液B(vol比)設為1：2或1：6來實行醚處理時，流行性感冒類病毒顆粒的脂質成分的含量，相對於流行性感冒病毒全顆粒的脂質成分的含量，是約30質量%。另一方面，在將醚：懸浮液B(vol比)設為1：12來實行醚處理時，流行性感冒類病毒顆粒的脂質成分的含量，與全顆粒抗原同樣，其脂質成分幾乎未被去除，而殘留有約100%(表2)。由上述結果，本發明人認為，脫脂的功效，不僅取決於醚的量，也取決於聚山梨醇酯80的濃度。亦即，隨著「醚：懸浮液B」由1：1改變成1：6，相對地聚山梨醇酯80的濃度會變高，因此脫脂能夠進行。然而，本發明人認為，當「醚：懸浮液B」變成1：12，即使相對地聚山梨醇酯80的濃度較高，醚的濃度過低仍會造成影響，而使脫脂的功效減少。

[表2]

<源自流行性感冒病毒顆粒的裂解抗原>

作為比較對照的裂解流行性感冒病毒(以下有時記載為「裂解抗原」)，是使用流行性感冒HA疫苗(化學及血清療法研究所製造，商品名稱「流行性感冒HA疫苗”化血研”」)。

[實施例2]

<物性評估>

利用以下方法來評估上述實施例1所獲得的類病毒顆粒(檢體)的物性。再者，在以下實驗中，除非另有說明，作為比較對照使用的全顆粒抗原是以福馬林濃度0.02%在4℃使其反應6星期而成。

1.藉由蔗糖密度梯度離心法來實行分析

藉由蔗糖密度梯度離心法來對實施例1所調配的類病毒顆粒進行分析。將檢體疊加在15~60%的蔗糖密度梯度上，並以4℃、18000rpm實行離心分離16小時。離心後，每一部分(fraction)各提取0.6ml，並測定各部分的蔗糖濃度、HA價及蛋白質濃度。H1N1亞型株的結果表示於表3。在裂解抗原中，其蛋白質廣泛分佈於蔗糖濃度25~50%，而顯示病毒顆粒已分解。相對於此，在類病毒顆粒中，是作為單一峰值而被區分在高蔗糖濃度(49~51.4%)，因此顯示具有與去活化全顆粒相同的形狀(顆粒性)。關於HA的活性，福馬林處理時的福馬林濃度是0.02以上時，是2560倍。B型株(B/WC株)的結果表示於表4。在裂解抗原中，其蛋白質同樣地廣泛分佈於蔗糖濃度25~50%，而顯示病毒顆粒已分解。相對於此，在類病毒顆粒中，是作為單一峰值而被區分在高蔗糖濃度(50.6~52.2%)，因此顯示具有與去活化全顆粒相同的形狀(顆粒性)。關於HA活性，福馬林處理時的福馬林濃度愈高，HA價就愈高，0.05%時是2560倍，0.08%以上時則是5120倍。

[表4]

2.藉由電子顯微鏡實行解析

為了進一步詳細調查類病毒顆粒(源自B型株也就是B/WC株)的形狀，實施藉由電子顯微鏡所實行的觀察。使用戊二醇在室溫將約500μg/mL的上述檢體進行固定20分鐘。之後，在觀察用的經離子鍍膜的網片(日新EM公司製造)上，放置固定後的檢體並靜置約60秒，然後以2%磷鎢酸水溶液進行負染色。使用穿透式電子顯微鏡(FEI Company製造的Tecnai G2：加速電壓120kV)來對染色後的檢體進行觀察、攝影。

第1圖的(B)表示作為代表的類病毒顆粒的觀察結果，該類病毒顆粒是以0.05%的福馬林濃度在25℃進行反應1星期，之後進行醚處理而成。第1圖的(A)表示作為比較對照的全顆粒抗原的觀察結果，該全顆粒抗原是以0.02%的福馬林濃度在4℃使其反應6星期而成。進一步，H1N1亞型株(A/CA株)和H3N2亞型株(A/NY株)，是以依照上述的方法來製作類病毒顆粒。其他的B型流行性感冒病毒也就是B/BR株和B/MA株，是以依照上述的方法來製作類病毒顆粒。第1圖的(C)~(F)表示作為代表的類病毒顆粒的觀察結果，該類病毒顆粒是以0.08%的福馬林濃度在25℃進行反應1星期，之後進行醚處理而成。類病毒顆粒，與全顆粒抗原同樣地保持了顆粒結構。在藉由醚處理對套膜進行脫脂的觀察圖像中，並未確認到類病毒顆粒彼此相互結合而成的凝集體。

3.動態光散射

使用Particle Sizing System：NICOMP 380 ZLS-S來對類病毒顆粒(源自B型株也就是B/WC株)的平均粒徑進行解析。藉由動態光散射法所測得的液體中的平均粒徑表示於表5。裂解抗原是雙峰性，而在110nm附近與400nm附近確認到峰值。另一方面，該裂解抗原以外的所有檢體，其平均粒徑是120nm前後且為單峰性。由此可知，醚處理後的平均粒徑是與病毒顆粒相同的顆粒大小。亦即，可知即使藉由醚處理進行脫脂，類病毒顆粒的平均粒徑仍是單一且不變的。由動態光散射實驗可知，類病毒顆粒保持了顆粒結構，且未確認到像凝集體這樣的雜質。

4.高速液相層析(尺寸排阻層析(size exclusion chromatography，SEC))

測定作為代表的源自H1N1亞型株(A/CA株)的類病毒顆粒、全顆粒抗原及裂解抗原的分子量分佈。上述測定是使用TSKgel G6000PWXL(東曹股份有限公司製造)來實行。使用PBS作為溶析液。溶析型態表示於表6。裂解抗原在溶析時間19~29分鐘附近確認到三峰性的峰值。另一方面，類病毒顆粒和全顆粒抗原則在溶析時間17分鐘附近確認到單峰性的峰值。由此可知，實行了醚處理的類病毒顆粒的分子量分佈，是與未實行醚處理的病毒顆粒(全顆粒抗原)相同程度的分子量分佈。由此結果暗示，即使藉由醚處理進行脫脂，分子量分佈仍是單一且不變的。

5.分析病毒蛋白質

為了調查類病毒顆粒(源自B型株也就是B/WC株)的構成蛋白質，藉由狹縫墨點法來實行抗體染色。裂解抗原、僅實行福馬林處理而成的檢體、或在福馬林處理後進行醚處理而成的檢體，對於各檢體準備下述群組：未實行SDS(十二烷基硫酸鈉)處理和加熱處理的群組(A群組)、及實行了SDS處理和加熱處理的群組(B群組)。檢體的種類表示於表7。

(狹縫墨點法)

將上述群組的各檢體塗敷至PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)上，並使其乾燥。在染色、脫色後，對PVDF膜進行阻斷(blocking)，並使其與一級抗體(小鼠單株抗體：抗NP抗體或抗M1抗體)、二級抗體(anti-Mouse IgG-HRP Conjugate)進行反應，並以LAS-3000(富士軟片股份有限公司製造的商品名)進行拍攝。第2圖中表示M1、NP的狹縫墨點結果。SDS處理和加熱處理皆未實行的群組(A群組)，在顆粒結構已被破壞的裂解抗原(第1 Lane)和福馬林固定較弱的檢體(在0.02%福馬林濃度反應後進行醚處理而成的檢體：第3、第4 Lane)中，偵測到NP和M1。相對於此，在全顆粒抗原(第2 Lane)和比0.02%高的福馬林濃度的檢體(第5、第6、第7 Lane)中，幾乎未偵測到NP和M1。另一方面，在SDS處理和加熱處理皆實行後的群組(B群組)中，類病毒顆粒受到破壞，且任一檢體皆偵測到M1和NP。由此顯示，類病毒顆粒的內部存在M1和NP。

(西方墨點法)

H1N1亞型株(A/CA株)，是以依照上述的方法來製作類病毒顆粒。以不同的福馬林濃度(0.02%~0.14%)來將病毒顆粒固定化，之後實行醚處理而獲得類病毒顆粒。所獲得的類病毒顆粒，實行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，之後轉印至PVDF膜上。使上述PVDF膜與一級抗體(小鼠單株抗體：抗HA抗體、抗NP抗體或抗M1抗體)和二級抗體(anti-Mouse IgG-HRP Conjugate)進行反應，並以LAS-3000(富士軟片股份有限公司製造的商品名)進行拍攝。此時，使用RPN2209 ECL Western Blotting Detection Reagents(奇異醫療公司製造的商品名)作為顯色受質(chromogenic substrate)。第3圖的A、第3圖的B、第3圖的C表示HA、M1、NP的西方墨點結果。相對於未進行福馬林處理，顯示福馬林處理後的各病毒構成蛋白質會高分子化，而泳動至高分子側。亦即，相對於未進行福馬林處理，顯示福馬林處理後的各病毒構成蛋白質，在0.05%以上的濃度時會產生250kDa以上的高分子聚合物，而阻塞在凝膠上端。若為小於0.05%的弱交聯，在醚處理時則無法保持顆粒，而如第2圖所示，偵測到NP和M1。

6.分析源自病毒顆粒的基因組核酸(定性分析)

研究類病毒顆粒(源自B型株也就是B/WC株)中源自病毒顆粒的基因組核酸(有時稱為「源自病毒的基因組核酸」)。僅實行福馬林處理而成的檢體、或在福馬林處理後進行醚處理而成的檢體，對於各檢體準備進行超高速離心後的群組或未進行超高速離心的群組。使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN N.V.製造的商品名)，自上述群組的上清液抽取RNA。抽取RNA後，使用One Step RNA PCR Kit(AMV)(寶生物股份有限公司製造的商品名)、PCR System(商品型號：GeneAmpR9700)，來實行反轉錄酶-聚合酶連鎖反應(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)，而將編碼HA的DNA區域擴增。實行瓊脂凝膠電泳，並確認DNA產物的條帶圖形(band pattern)。

第4圖中表示RT-PCR後的DNA產物的條帶圖形的結果。第4圖的結果整理於表8。未進行超高速離心時，在所有條件下藉由RT-PCR都偵測到源自病毒的RNA。另一方面，進行了超高速離心時，在裂解抗原和藉由福馬林所實行的固定化為最弱的檢體(以0.02%的福馬林濃度在4℃進行反應4星期，之後進行醚處理的檢體)中，亦自其超高速離心後的上清液偵測到RNA。該條件以外的檢體則未偵測到RNA。由此顯示，以0.02%以上的福馬林濃度在25℃進行福馬林處理1星期並進行醚處理後的抗原，其顆粒內包含有RNA。

7.分析源自病毒顆粒的基因組核酸(定量分析)

研究類病毒顆粒中源自病毒顆粒的基因組核酸(有時稱為「源自病毒的基因組核酸」)的定量。以PBS稀釋類病毒顆粒、全顆粒抗原、裂解抗原，並添加SDS和Proteinase K，然後以55℃、24小時使其反應。之後，使用TRIzol LS Reagent和PureLink RNA Mini Kit、PureLink DNase(Invitrogen Corporation製造的商品名)來抽取RNA。所抽取的RNA的含量是以Quant-iT RiboGreen RNA Reagent and Kit來進行測定(Invitrogen Corporation製造的商品名)。

表9中表示類病毒顆粒和裂解抗原相對於全顆粒抗原的RNA含量的比例。相對於全顆粒抗原，類病毒顆粒的RNA殘留約90%，而裂解抗原是10~40%。由此結果暗示，在類病毒顆粒中RNA幾乎都殘留。

8.免疫原性1

在A型流行性感冒病毒中，H3N2亞型株(A/Texas/50/2012(X-223)株，以下有時記載為「A/TX株」)，亦以依照實施例1的方法來製作類病毒顆粒。使用小鼠來評估類病毒顆粒的免疫原性。以蛋白質量0.8μg的接種量來對ddY小鼠(雌性，8週齡)在肌內接種裂解抗原、全顆粒抗原、或類病毒顆粒(每一群組16隻)。免疫3星期後使小鼠安樂死，然後進行全血採集(whole blood collection)。藉由離心分離來獲得血清，並測定HI抗體力價。作為代表的檢體的免疫原性(HI抗體力價(GMT))的結果表示於表10，該檢體是以0.08%的福馬林在25℃進行反應1星期，之後進行醚處理而成。若為H1N1亞型株、H3N2亞型株的情況，相較於裂解抗原，類病毒顆粒為明顯較高的免疫原性(H1N1亞型株：P<0.05；H3N3亞型株：P<0.01)，且為與全顆粒抗原相同程度的免疫原性。若為B型株的情況，相較於裂解抗原，類病毒顆粒為較高的免疫原性，且為與全顆粒抗原相同程度的免疫原性。

9.免疫原性2

H1N1亞型株(A/New Caledonia/20/99，以下有時記載為「A/NC株」)、H3N2亞型株(A/Wyoming/3/2003，以下有時記載為「A/WY株」)、及B型株(B/Shanghai/361/2002，以下有時記載為「B/SG株」)，是以依照實施例1的方法來製作類病毒顆粒。使用小鼠來評估所獲得的流行性感冒顆粒的免疫原性。使用ddY小鼠(雌性，8週齡)，以1μgHA的接種量，且以3星期的間隔來對每一群組8隻小鼠在皮下接種裂解抗原或類病毒顆粒2次。實行初級免疫，且在3星期後進行部分血液採集，並實行次級免疫，在2星期後進行全血採集。藉由離心分離來獲得血清，並測定HI抗體力價。作為代表的檢體的免疫原性(HI抗體力價(GMT))的結果表示於表11(初級免疫後)、表12(次級免疫後)，該檢體是以0.2%的福馬林在5℃進行反應3天，之後進行醚處理而成。若為初級免疫後的A/NC株、A/WY株的情況，相較於裂解抗原，類病毒顆粒為明顯較高的免疫原性。

10.免疫原性3

使用食蟹獼猴(雌性，21~29個月齡)來評估裂解抗原、全顆粒抗原、及類病毒顆粒的免疫抗原性。以相當於7.5μgHA(相當於裂解抗原的HA量的蛋白質量)的接種量，且以28天的間隔來對每一群組5隻食蟹獼猴在皮下接種裂解抗原、全顆粒抗原或類病毒顆粒2次。在次級免疫前和次級免疫後的28天後進行部分血液採集。藉由離心分離來獲得血清，並測定HI抗體力價和中和抗體力價。作為代表的檢體(類病毒顆粒)的免疫原性的結果表示於表13(次級免疫後的HI抗體力價(GMT))、表14(次級免疫後的中和抗體力價(GMT))，該檢體是以0.08%的福馬林在25℃進行反應7天，之後進行醚處理而成。由HI抗體力價可知，相較於裂解抗原，類病毒顆粒具有較高的免疫原性。尤其，H1N1亞型株的免疫原性明顯較高。由中和抗體亦可知，相較於裂解抗原，類病毒顆粒具有較高的免疫原性。尤其，H1N1亞型株和B型株的免疫原性明顯較高。

11.抗體亞型解析1

作為抗體亞型解析，是測定上述「8.免疫原性1」所獲得的小鼠的血清中所含的病毒抗原特異性的IgG1和IgG2a抗體力價。作為比較對照，是同樣地將下述檢體對小鼠進行免疫反應：以0.02%的福馬林在25℃進行反應1星期，之後進行醚處理而成。測定所獲得的小鼠的血清中所含的病毒抗原特異性的IgG1和IgG2a的抗體力價。其結果顯示，相對於裂解抗原，類病毒顆粒(福馬林濃度：0.08%)與全顆粒抗原同樣地，比起誘發抗原特異性的IgG1，更能夠誘發抗原特異性的IgG2a。另一方面顯示，即使是相同的類病毒顆粒，以0.02%的福馬林實行固定化後的檢體，與裂解抗原同樣地，比起誘發抗原特異性的IgG2a，仍更能夠誘發抗原特異性的IgG1([表15]~[表17])。由Th1型反應所誘發的IgG2a亞型的抗體，比由Th2型反應所誘發的IgG1亞型的抗體，對於流行性感冒病毒的感染防禦性能更優異，因此可期待藉由類病毒顆粒(福馬林濃度：0.08%)所導致的有效性更加提升。

[表15]A/CA株(H1N1亞型株)：亞型解析的結果(EU/mL)

將以裂解疫苗進行免疫後的小鼠血清，分別稀釋25600倍時的值設為1EU/mL。

將以裂解疫苗進行免疫反應後的小鼠血清，分別稀釋25600倍(IgG1)、51200倍(IgG2a)時的值設為1EU/mL。

將以裂解疫苗進行免疫反應後的小鼠血清，分別稀釋25600倍時的值設為1EU/mL。

12.免疫原性4

為了解析類病毒顆粒抗原的免疫原性機制，使用Toll like receptor 7 knock-out(TLR7KO)小鼠(Backborne：BALB/c)來實行解析。所使用的小鼠是購買自OrientalBioService,Inc.。使用雌性、5週齡的小鼠，以蛋白質量2μg/各株的接種量，且以3星期的間隔來對每一群組5~6隻小鼠在肌內接種全顆粒抗原、類病毒顆粒抗原、裂解抗原2次。實行初級免疫，且在3星期後進行部分血液採集，並實行次級免疫，在2星期後進行全血採集。藉由離心分離來獲得血清，並測定HI抗體力價。疫苗株是使用H1N1亞型株(A/CA株)、H3N2亞型株(A/NY株)、B型株(B/BR株和B/MA株)。關於全顆粒抗原、類病毒顆粒抗原、及裂解抗原的調配方法，是依照實施例1。實行初級免疫3星期後的血清中的HI抗體力價的幾何平均值(GMT)表示於表18。在野生型小鼠(+/+)中，相較於裂解抗原，類病毒顆粒顯示較高的HI抗體力價。另一方面，在基因剔除小鼠(-/-)中，對應於類病毒顆粒的HI抗體力價則降低至與裂解抗原相同程度為止。此結果暗示，類病毒顆粒所內含的病毒單股RNA非常有助於類病毒顆粒的免疫原性。

13.抗體亞型解析2

作為抗體亞型解析，是測定上述「12.免疫原性4」所獲得的小鼠的血清中所含的病毒抗原特異性的IgG1和IgG2a抗體力價。其結果表示於[表19]~[表21]。顯示即使在容易誘發Th2優勢免疫反應的BALB/c野生型小鼠(+/+)中，相對於裂解抗原，比起誘發抗原特異性的IgG1，類病毒顆粒仍更能夠誘發抗原特異性的IgG2a。相對於此，在基因剔除小鼠(-/-)中，IgG2a的抗體力價顯著下降。此結果暗示，病毒單股RNA對於Th1優勢免疫的誘發是必要的。

將以裂解疫苗進行免疫反應的小鼠血清，分別稀釋25600倍時的值設為1EU/mL。

14.產生INF-γ的細胞數解析

為了計量上述「12.免疫原性4」所獲得的小鼠的脾臟中所含的抗原特異性的產生INF-γ的細胞數，實行酶聯免疫斑點法(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT assay)。解析是使用Mouse IFN gamma ELISPOT Ready-SET-Go！(eBioscience,Inc.製造的商品名)，並依照附加的概要說明書所記載的方法來實行。其結果表示於[表22]~[表25]。確認到在接種有全顆粒抗原或類病毒顆粒的小鼠中，比在接種有裂解抗原的小鼠中，能夠更強烈地誘發由樹突細胞、Th1細胞、及NK細胞等與細胞性免疫相關的細胞所產生的IFN-γ。在基因剔除小鼠(-/-)中，類病毒顆粒所誘發的產生IFN-γ的細胞數顯著下降。由此暗示，藉由病毒單股RNA能夠誘發產生IFN-γ的細胞，而引起Th1優勢免疫反應。

[表23]

15.記憶B細胞數解析

為了計量上述「12.免疫原性4」所獲得的小鼠的脾臟中所含的抗原特異性的記憶B細胞，實行酶聯免疫斑點法。在實行酶聯免疫斑點法前，為了使記憶B細胞分化成產生抗體的細胞，實行藉由促分裂原(mitogen)(源自Phytolacca americana的凝集素；源自S.aureus的Protein A soluble、CpG ODN；及，源自Escherichia coli的LPS)所進行的刺激。其結果表示於[表26]~[表29]。確認到在接種有全顆粒抗原或類病毒顆粒的小鼠中，比在接種有裂解抗原的小鼠中，能夠更強烈地誘發脾臟細胞中的記憶B細胞。在接種有類病毒顆粒抗原的基因剔除小鼠(-/-)中，脾臟中的記憶B細胞數下降。由此暗示，病毒單股RNA與類病毒顆粒抗原的誘發記憶B細胞的性能有很大的關聯。

16.熱原試驗(pyrogen test)1

將以下所述者作為試樣：以PBS稀釋裂解抗原、全顆粒抗原、或類病毒顆粒，而使其1mL中的蛋白質含量成為240μg。類病毒顆粒是使用下述檢體作為代表：以0.08%的福馬林在25℃進行反應1星期，之後進行醚處理而成。將上述試樣，以每1kg體重1ml對兔進行接種，並觀察發熱的上升情形。3隻兔的熱原反應總和(℃)表示於表30。

只有未實行醚處理的全顆粒抗原確認到1.3℃以上的熱原反應總和。實行醚處理後的裂解抗原、類病毒顆粒皆未確認到1.3℃以上的熱原反應總和。

17.熱原試驗2

以蛋白質濃度成為最後濃度250μg/mL的方式，來稀釋H1N1亞型株(A/CA株)的病毒顆粒，並以0.08%的福馬林濃度在25℃進行反應使其反應1星期。反應結束後，以PBS進行滲析來去除福馬林，藉此獲得懸浮液B，該懸浮液B包含被固定化後的流行性感冒病毒顆粒。之後，除了改變醚容量及改變聚山梨醇酯80濃度為0.05vol%以外，其餘則藉由與上述「2.醚處理」相同的方法實行醚處理，而獲得膽固醇的含量各自不同的流行性感冒類病毒顆粒。將以下所述者作為試樣：以PBS稀釋所獲得的流行性感冒類病毒顆粒，而使其1mL中的蛋白質含量成為240μg。將每1kg體重1mL的上述試樣，對兔進行接種，並觀察發熱的上升情形。3隻兔的熱原反應總和(℃)表示於表31。

包括相對於全顆粒抗原殘留有約70%膽固醇的含量的類病毒顆粒(醚：懸浮液B(vol比)為1：1的檢體)，在所有的檢體中，並未確認到1.3℃以上的熱原反應總和。

18.細胞激素(cytokine)定量1

作為熱原試驗的替代方法，是藉由發炎性細胞激素(inflammatory cytokine)測定系統來評估細胞激素的量，該測定系統是使用人類周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。作為發炎性細胞激素，是實行關於代表性的IL-1 β、IL-6的測定。使人類周邊血液單核細胞(PBMC)懸浮於胎牛血清-最低必需培養液(feltal calf serum-minimum essential medium，FCS-MEM)中，並稀釋成4×10⁶ cells/mL。各添加100μL至96孔培養盤中，並添加等量的裂解抗原、全顆粒抗原、或類病毒顆粒(最後濃度50μg/mL)。之後，以37℃在CO₂氣氛下進行培養24小時，並以酵素連結免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)來對上清液中的IL-1 β和IL-6進行定量。作為代表的檢體的細胞激素定量(IL-1 β)的結果表示於表32，細胞激素定量(IL-6)的結果表示於表33，該檢體是以0.08%的福馬林在25℃進行反應1星期，之後進行醚處理而成。可知相較於在使用全顆粒抗原時，在使用類病毒顆粒時發炎性細胞激素的量較少。由此暗示，相較於全顆粒抗原，類病毒顆粒較容易抑制副反應。

[表33] 細胞激素定量(IL-6)的結果(pg/mL)

[實施例3]

<調配流行性感冒類病毒顆粒>

1.戊二醇(GA)處理(不像福馬林這樣形成亞甲基交聯，而藉由不可逆的交聯反應來對於病毒顆粒進行固定化的步驟)

以與實施例1相同的方式，將A型流行性感冒病毒(H3N2亞型株(A/NY株))和B型流行性感冒病毒(B/BR株)進行精製。將精製後的流行性感冒病毒顆粒進行β-丙內酯(BPL)去活化，之後以蛋白質濃度成為最終濃度1000μg/mL的方式進行稀釋，而獲得懸浮液A1(A/NY株)和懸浮液A2(B/BR株)。繼而，使用1w/v%GA溶液，以GA濃度成為0.016 w/v%或0.008w/v%的方式進行稀釋。將懸浮液A1或懸浮液A2，與稀釋後的GA溶液(0.016 w/v%或0.008w/v%)等量混合，並在4℃使其反應3天。反應結束後，以PBS進行滲析來去除GA，藉此獲得懸浮液B1(A/NY株)和懸浮液B2(B/BR株)(全顆粒抗原(GA固定))，這些懸浮液包含被固定化後的流行性感冒病毒顆粒。

2.醚化處理(對於被固定化後的病毒顆粒實行脫脂處理的步驟)

在實行GA處理後的上述包含流行性感冒病毒顆粒的懸浮液B1和懸浮液B2中，以最後濃度成為0.05vol%的方式來添加聚山梨醇酯80。之後，在上述懸浮液B1或懸浮液B2中，以最後濃度成為33vol%的方式來添加二乙醚(脫脂劑)，並在25℃攪拌1小時。之後，以4℃、3000rpm對所獲得的混合液實行離心分離5分鐘，並回收水相，藉此去除醚相。藉由上述步驟來調配檢體也就是流行性感冒類病毒顆粒。

使用Amplex Red Cholesterol Assay Kit(Invitrogen Corporation製造的商品名)來測定所獲得的流行性感冒類病毒的脂質成分的含量。對包含流行性感冒類病毒顆粒的檢體，進行超高速離心分離(24000rpm，2hr，4℃)而分離成上清液與沉澱成分。以PBS將所獲得的沉澱成分進行再懸浮。在再懸浮後的沉澱成分中添加螢光物質試鹵靈，而使其反應。反應後測定螢光物質試鹵靈的螢光強度，藉此對流行性感冒類病毒顆粒相對於全顆粒抗原(GA固定)的脂質成分的含量進行定量。其結果暗示，相對於流行性感冒病毒顆粒的脂質成分的含量，流行性感冒類病毒顆粒的脂質成分的含量至多是50質量%以下(表34)。

[表34]

[實施例4]

<物性評估>

利用以下方法評估上述實施例3所獲得的類病毒顆粒(檢體)。

1.藉由電子顯微鏡實行解析

為了進一步詳細調查類病毒顆粒(源自A/NY株)的形狀，實施藉由電子顯微鏡所實行的觀察。使用戊二醇在室溫將約500μg/mL的上述檢體進行固定20分鐘。之後，在觀察用的經離子鍍膜的網片(日新EM公司製造)上，放置固定後的檢體並靜置約60秒，然後以2%磷鎢酸水溶液進行負染色。使用穿透式電子顯微鏡(FEI Company製造的Tecnai G2：加速電壓120kV)來對染色後的檢體進行觀察、攝影。

第5圖的(B)表示作為代表的類病毒顆粒的觀察結果，該類病毒顆粒是以0.008w/v%的GA濃度在4℃進行反應3天，之後進行醚處理而成。第5圖的(A)表示作為比較對照的全顆粒抗原的觀察結果，該全顆粒抗原是以0.008w/v%的GA濃度在4℃進行反應3天而成。類病毒顆粒，與全顆粒抗原同樣地保持了顆粒結構。在觀察圖像中並未確認到類病毒顆粒彼此結合而成的凝集體，該觀察圖像是藉由醚處理來破壞套膜，而使染色液滲入而成。

2.動態光散射

使用Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd製造)來對類病毒顆粒的平均粒徑進行解析。藉由動態光散射法所測得的液體中的平均粒徑表示於表35。類病毒顆粒的平均粒徑是130nm前後且為單峰性。由此可知，醚處理後的平均粒徑是與病毒顆粒相同程度的顆粒大小。亦即，可知即使藉由醚處理進行脫脂，類病毒顆粒的平均粒徑仍是單一且不變的。由動態光散射實驗可知，類病毒顆粒保持了顆粒結構，且未確認到像凝集體這樣的雜質。

全顆粒抗原(福馬林固定)是以福馬林濃度0.02在4℃使其反應6星期而成。

3.分析源自病毒顆粒的基因組核酸(定量分析)

研究類病毒顆粒中源自病毒顆粒的基因組核酸(有時稱為「源自病毒的基因組核酸」)的定量。以PBS稀釋類病毒顆粒、全顆粒抗原，並添加SDS和Proteinase K，然後以55℃、18~57小時來使其反應。之後，使用TRIzol LS Reagent和PureLink RNA Mini Kit、PureLink DNase(Invitrogen Corporation製造的商品名)來抽取RNA。所抽取的RNA的含量是以Quant-iT RiboGreen RNA Reagent and Kit來進行測定(Invitrogen Corporation製造的商品名)。

表36中表示類病毒顆粒相對於全顆粒抗原的RNA含量的比例。相對於全顆粒抗原，類病毒顆粒殘留有約80%RNA。顯示即使在GA處理的情況，也與福馬林處理的情況同樣地，在類病毒顆粒中RNA幾乎都殘留。

4.免疫原性1

使用小鼠來評估類病毒顆粒的免疫原性。以蛋白質量0.8μg的接種量來對ddY小鼠(雌性，8週齡)在肌內接種裂解抗原(福馬林去活化)或類病毒顆粒(每一群組16隻)。免疫3星期後使小鼠安樂死，然後進行全血採集。藉由離心分離來獲得血清，並測定中和抗體力價。作為代表的檢體的免疫原性(中和抗體力價(GMT))的結果表示於表37，該檢體是以004w/v%的GA在4℃進行反應3天，之後進行醚處理而成。若為B型株的情況，相較於裂解抗原，類病毒顆粒為較高的免疫原性。

5.免疫原性2

B型株也就是B/WC株，是以依照實施例1的方法來製作類病毒顆粒。使用小鼠來評估所獲得的流行性感冒顆粒的免疫原性。以蛋白質量0.8μg的接種量來對ddY小鼠(雌性，8週齡)在肌內接種裂解抗原(福馬林去活化)、類病毒顆粒(每一群組16隻)。免疫3星期後使小鼠安樂死，然後進行全血採集。藉由離心分離來獲得血清，並測定HI抗體力價。作為代表的檢體的免疫原性(HI抗體力價(GMT))的結果表示於表38，該檢體是以0.010w/v%的GA在4℃進行反應3天，之後進行醚處理而成。相較於裂解抗原，類病毒顆粒為較高的免疫原性。

6.熱原試驗

將以下所述者作為試樣：以PBS稀釋類病毒顆粒，而使其1mL中的蛋白質含量成為240μg。將上述試樣，以每1kg體重1ml對兔進行接種，並觀察發熱的上升情形。3隻兔的熱原反應總和(℃)表示於表39。

實行醚處理後的類病毒顆粒皆未確認到1.3℃以上的熱原反應總和。

7.細胞激素定量

依照實施例2的「18.細胞激素定量1」來對細胞激素進行定量。類病毒顆粒A/NY株的細胞激素定量(IL-1 β和IFN-α)的結果表示於表40，B/BR株的細胞激素定量的結果表示於表41。可知比起在使用全顆粒抗原(福馬林固定)時，在使用類病毒顆粒時發炎性細胞激素的量較少。由此暗示，相較於全顆粒抗原，類病毒顆粒較容易抑制副反應。

[表40] A/NY株(H3N2亞型株)：細胞激素定量的結果(pg/mL)

[實施例9]

<調配流行性感冒類病毒顆粒>

1. 1-乙基-3-[3-二甲胺丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)處理(使胺基與病毒顆粒的羧基反應而使醯胺鍵生成來進行固定化的步驟)

以濃度成為4~0.1M的方式，來以PBS稀釋EDC。以與實施例1相同的方式，將A型流行性感冒病毒(H3N2亞型株(A/NY株))和B型流行性感冒病毒(B/BR株)進行精製。將精製後的流行性感冒病毒顆粒進行BPL去活化，之後添加EDC溶液，並在4℃使其反應2小時，該EDC溶液是以EDC濃度成為0.5~0.005M的方式所稀釋而成。此時，使反應液中的蛋白質濃度成為2500μg/mL。反應結束後，以PBS滲析反應液，來去除EDC，藉此獲得懸浮液 B1(A/NY株)和懸浮液B2(B/BR株)，這些懸浮液包含被固定化後的流行性感冒病毒顆粒。

2.醚處理(對於被固定化後的病毒顆粒實行脫脂處理的步驟)

在實行EDC處理後的上述包含流行性感冒病毒顆粒的懸浮液B1和懸浮液B2中，以最後濃度成為0.05vol%來添加聚山梨醇酯80。之後，在上述懸浮液B1和懸浮液B2中，以最後濃度成為33vol%的方式，來添加二乙醚(脫脂劑)，並在25℃攪拌1小時。之後，以4℃、3000rpm對所獲得的混合液進行離心分離5分鐘，並回收水相，藉此去除醚相。藉由以上步驟，來調配檢體也就是流行性感冒類病毒顆粒。

使用Amplex Red Cholesterol Assay Kit(Invitrogen Corporation製造的商品名)來測定所獲得的流行性感冒類病毒的脂質成分的含量。對包含流行性感冒類病毒顆粒的檢體，進行超高速離心分離(24000rpm，2hr，4℃)而分離成上清液與沉澱成分。以PBS將所獲得的沉澱成分進行再懸浮。在再懸浮後的沉澱成分中添加螢光物質試鹵靈，而使其反應。反應後測定螢光物質試鹵靈的螢光強度，藉此對流行性感冒類病毒顆粒的脂質成分的含量進行定量。其結果暗示，相對於流行性感冒病毒顆粒的脂質成分的含量，流行性感冒類病毒顆粒的脂質成分的含量至多是50質量%以下(表42)。

[表42]

[實施例6]

<物性評估>

利用以下方法來評估上述實施例5所獲得的類病毒顆粒(檢體)的物性。

1.藉由蔗糖密度梯度離心法來實行分析

藉由蔗糖密度梯度離心法來對源自H3N2亞型株(A/NY株)的類病毒顆粒進行分析。將作為代表的檢體(全顆粒抗原和類病毒顆粒)疊加在15~60%的蔗糖密度梯度上，並以4℃、18000rpm實行離心分離16小時，該檢體是以0.05M的EDC濃度來實行EDC處理而成。離心後，每一部分各提取0.6ml，並測定各部分的蔗糖濃度、HA價及蛋白質濃度。結果表示於表43。類病毒顆粒，是作為單一峰值而被區分在高蔗糖濃度(約50%)，因此顯示該類病毒具有與去活化全顆粒相同的形狀(顆粒性)。HA的活性，是1280倍。

[表43]

2.藉由電子顯微鏡實行解析

第6圖的(B)表示作為代表的類病毒顆粒的觀察結果，該類病毒顆粒是以0.5M的EDC濃度在4℃進行反應2小時，之後進行醚處理而成。第6圖的(A)表示作為比較對照的全顆粒抗原的觀察結果，該全顆粒抗原是以0.5M的EDC濃度在4℃進行反應2小時而成。類病毒顆粒，與全顆粒抗原同樣地保持了顆粒結構。在觀察圖像中並未確認到類病毒顆粒彼此結合而成的凝集體，該觀察圖像是藉由醚處理來破壞套膜，而使染色液滲入而成。

3.分析源自病毒顆粒的基因組核酸(定量分析)

研究類病毒顆粒中源自病毒顆粒的基因組核酸(有時稱為「源自病毒的基因組核酸」)的定量。以PBS稀釋類病毒顆粒或全顆粒抗原，並添加SDS和Proteinase K，然後以55℃、6小時使其反應。之後，使用TRIzol LS Reagent和PureLink RNA Mini Kit、PureLink DNase(Invitrogen Corporation製造的商品名)來抽取RNA。所抽取的RNA的含量是以Quant-iT RiboGreen RNA Reagent and Kit來進行測定(Invitrogen Corporation製造的商品名)。

表44中表示類病毒顆粒相對於全顆粒抗原的RNA含量的比例。相對於全顆粒抗原，類病毒顆粒的RNA殘留約90%，暗示即使在EDC處理的情況，也與福馬林處理的情況同樣地，在類病毒顆粒中RNA幾乎都殘留。

4.免疫原性1

使用小鼠來評估類病毒顆粒的免疫原性。以蛋白質量0.8μg的接種量來對ddY小鼠(雌性，8週齡)在肌內接種裂解抗原(福馬林去活化)或類病毒顆粒(每一群組16隻)。免疫3星期後使小鼠安樂死，然後進行全血採集。藉由離心分離來獲得血清，並測定中和抗體力價。作為代表的類病毒顆粒的免疫原性(中和抗體力價(GMT))的結果表示於表45，該檢體是以0.05M的EDC在4℃進行反應2小時，之後進行醚處理而成。若為H3N2亞型株的情況，相較於裂解抗原，類病毒顆粒為較高的免疫原性。若為B型株的情況，相較於裂解抗原，類病毒顆粒為明顯較高的免疫原性(P<0.05)。

5.熱原試驗

將以下所述者作為試樣：以PBS稀釋類病毒顆粒，而使其1mL中的蛋白質含量成為240μg。將上述試樣，以每1kg體重1ml對兔進行接種，並觀察發熱的上升情形。3隻兔的熱原反應總和(℃)表示於表46。

實行醚處理後的類病毒顆粒皆未確認到1.3℃以上的發熱總和。

[表46] 類病毒顆粒的3隻兔的熱原反應的總和(℃)

6.細胞激素定量

依照實施例2的「18.細胞激素定量1」來對細胞激素進行定量。類病毒顆粒A/NY株的細胞激素定量(IL-1 β和IFN-α)的結果表示於表47，B/BR株的細胞激素定量的結果表示於表48。可知比起在使用全顆粒抗原(福馬林固定)時，在使用類病毒顆粒時發炎性細胞激素的量較少。由此暗示，相較於全顆粒抗原，類病毒顆粒較容易抑制副反應。

[實施例7]

<調配日本腦炎類病毒顆粒>

1.戊二醛處理(對於病毒顆粒將顆粒結構固定化的步驟)

對於Vero細胞培養日本腦炎疫苗原料藥(化學及血清療法研究所製造，商品名「ENCEVAC」(已以0.08%福馬林進行去活化)，懸浮液A)，以最後濃度成為0.002~0.05vol%的方式來添加戊二醛，並在4℃使其反應3天。反應結束後，以添加有活化劑也就是乳糖(最後濃度5w/v%)的PBS來滲析所獲得的反應液。藉由滲析來去除戊二醛，藉此獲得懸浮液B，該懸浮液B包含被固定化後的日本腦炎病毒顆粒。

2.醚處理(對於被固定化後的病毒顆粒實行脫脂處理的步驟)

對於上述懸浮液B，添加相同容量的二乙醚，以及以最後濃度成為0.01vol%的方式來添加聚山梨醇酯80，並在常溫下攪拌1小時。以4℃、3000rpm進行離心5分鐘，之後回收水相，而去除醚相。藉由以上步驟來調配檢體也就是日本腦炎類病毒顆粒。

[實施例8]

<物性評估>

利用以下方法來評估上述實施例7所獲得的類病毒顆粒(檢體)的物性。

1.藉由電子顯微鏡實行解析

為了進一步詳細調查類病毒顆粒的形狀，實施藉由電子顯微鏡所實行的觀察。在觀察用的經離子鍍膜的網片(日新EM公司製造)上，放置約70μg/mL的上述檢體並靜置約60秒，然後以2%磷鎢酸水溶液進行負染色。使用穿透式電子顯微鏡(FEI Company製造的Tecnai G2：加速電壓120kV)來對染色後的檢體進行觀察、攝影。

第7圖的(C)表示作為代表的類病毒顆粒的觀察結果，該類病毒顆粒是以0.01w/v%的戊二醛濃度在4℃進行反應3天，之後進行醚處理而成。第7圖的(B)、第7圖的(A)分別表示作為比較對照的類病毒顆粒、Vero細胞培養日本腦炎疫苗原料藥的觀察結果，該類病毒顆粒是未以戊二醛進行固定，之後進行醚處理而成。類病毒顆粒藉由以戊二醛進行固定，而與Vero細胞培養日本腦炎疫苗原料藥同樣地保持了顆粒結構。另一方面，未以戊二醛進行固定的類病毒顆粒則觀察到有凝集的情形。

2.動態光散射

使用Particle Sizing System：NICOMP 380 ZLS-S來對類病毒顆粒的平均粒徑進行解析。藉由動態光散射法所測得的液體中的平均粒徑表示於表49。類病毒顆粒的平均粒徑是約90nm且幾乎為單峰性。另一方面，Vero細胞培養日本腦炎疫苗原料藥則是約80nm且幾乎為單峰性。由此可知，醚處理後的平均粒徑是比未實行醚處理的病毒顆粒稍微較大，因而即使藉由醚處理進行脫脂，該平均粒徑仍幾乎不變。由動態光散射實驗可知，類病毒顆粒保持了顆粒結構，且未確認到像凝集體這樣的雜質。

3.抗原的含量

藉由三明治酵素連結免疫吸附分析法(Sandwich ELISA)來測定抗原的含量(抗原含量)，該分析法是使用抗日本腦炎病毒抗體。檢體中所含的E抗原被捕集於鍵結有抗日本腦炎病毒之兔IgG(一級抗體：多株抗體)的微量盤中。之後，使抗日本腦炎病毒B蛋白質單株抗體(二級抗體：單株抗體)與其進行反應，藉此形成鍵結於微量盤中的抗E抗原抗體/E抗原/二級抗體的複合物，該抗日本腦炎病毒B蛋白質單株抗體鍵結有源自辣根(horseradish)的過氧化酶(HRP)。藉由清洗來將未反應而殘留的試藥和檢體去除，並使其與酵素受質液(鄰苯二胺溶液：OPD溶液)進行反應時，E抗原複合物上的HPR會進行反應，而發生顯色。OPD的顯色強度會與複合物的量(反映E抗原量)成比例，而利用這樣的特性來測定E抗原含量。

作為代表的下述各檢體的抗原含量表示於表50：以0.01w/v%的戊二醛濃度在4℃進行反應3天，之後進行醚處理而成的類病毒顆粒(添加0.005%聚山梨醇酯80而進行醚處理而成的類病毒顆粒、及不添加聚山梨醇酯80而進行醚處理而成的類病毒顆粒)；未以戊二醛進行固定，之後進行醚處理而成的類病毒顆粒；及，Vero細胞培養日本腦炎疫苗原料藥。在未添加聚山梨醇酯80的檢體和未以戊二醛進行固定的檢體中，其抗原含量小於6.25μg/mL，相對於此，添加有0.005%聚山梨醇酯80的類病毒顆粒，則包含與Vero細胞培養日本腦炎疫苗原料藥相同程度的抗原。

顯示作為構成日本腦炎病毒的膜的脂質，膽固醇是最多的。因此，類病毒顆粒的脂質成分的含量是以膽固醇作為代表來進行定量。使用Amplex Red Cholesterol Assay Kit(Invitrogen Corporation製造的商品名)來測定所獲得的日本腦炎類病毒顆粒的脂質成分的含量。對包含日本腦炎類病毒顆粒的檢體，進行超高速離心分離(24000rpm，6hr，4℃)而分離成上清液與沉澱成分。以PBS將所獲得的沉澱成分進行再懸浮。在再懸浮後的沉澱成分中添加螢光物質試鹵靈，而使其反應。反應後測定螢光物質試鹵靈的螢光強度，藉此對日本腦炎類病毒顆粒的脂質成分的含量進行定量。其結果暗示，相對於日本腦炎病毒顆粒的脂質成分的含量，日本腦炎類病毒顆粒的脂質成分的含量至多是20質量%以下(表51)。

4.分析源自病毒顆粒的基因組核酸(定量分析)

研究類病毒顆粒中源自病毒顆粒的基因組核酸(有時稱為「源自病毒的基因組核酸」)的定量。以PBS稀釋類病毒顆粒或全顆粒抗原，並添加SDS和Proteinase K，然後以55℃、54小時來使其反應。之後，使用TRIzol LS Reagent和PureLink RNA Mini Kit、PureLink DNase(Invitrogen Corporation製造的商品名)來抽取RNA。所抽取的RNA的含量是以Quant-iT RiboGreen RNA Reagent and Kit來進行測定(Invitrogen Corporation製造的商品名)。

表52中表示類病毒顆粒相對於全顆粒抗原的RNA含量的比例。暗示相對於全顆粒抗原，類病毒顆粒殘留有約70%RNA(表52)。

5.細胞激素含量

作為熱原試驗的替代方法，是藉由發炎性細胞激素測定系統來評估細胞激素的量，該測定系統是使用人類周邊血液單核細胞。作為發炎性細胞激素，是實行關於代表性的IL-1 β、IL-6的測定。使人類周邊血液單核細胞(PBMC)懸浮於胎牛血清-最低必需培養液(FCS-MEM)中，並稀釋成4×10⁶ cells/mL。各添加100μL至96孔培養盤中，並添加等量的類病毒顆粒或Vero細胞培養日本腦炎疫苗原料藥(最後濃度25μg/mL)。之後，以37℃在CO₂氣氛下進行培養24小時，並以酵素連結免疫吸附分析法來對上清液中的IL-1 β和IL-6進行定量。作為代表的檢體的細胞激素定量(IL-1 β和IL-6)的結果表示於表53，該檢體是以0.01w/v%的戊二醛濃度在4℃進行反應3天，之後進行醚處理而成。類病毒顆粒的IL-1 β、IL-6皆比Vero細胞培養日本腦炎疫苗原料藥更少。由此暗示，相較於Vero細胞培養日本腦炎疫苗原料藥，類病毒顆粒較容易抑制副反應。

6.免疫原性(小鼠)

以4μg或1μg的接種量對ddY小鼠(雌性，4週齡)在腹腔內接種作為代表的類病毒顆粒(添加0.005%聚山梨醇酯80並進行醚處理而成的類病毒顆粒)或Vero細胞培養日本腦炎疫苗原料藥(每一群組10隻)，該類病毒顆粒是以0.01w/v%的戊二醛濃度在4℃進行反應3天，之後進行醚處理而成。在進行免疫1星期後再次進行免疫，且在1星期後使小鼠安樂死，然後進行全血採集。藉由離心分離來獲得血清，並且每一群組分別以等量來儲存，然後測定測定中和抗體力價。由50%溶斑(plaque)減少率計算出的結果表示於表54。相較於Vero細胞培養日本腦炎疫苗原料藥，進行醚處理而成的類病毒顆粒為相同程度或以上的中和抗體力價。

7.免疫原性(食蟹獼猴)

以4μg的接種量對食蟹獼猴(雌性，約8歲齡)在腹腔內接種作為代表的類病毒顆粒(添加0.01%聚山梨醇酯80並進行醚處理而成的類病毒顆粒)或Vero細胞培養日本腦炎疫苗原料藥(每一群組3隻)，該類病毒顆粒是以0.01w/v%的戊二醛濃度在4℃進行反應3天，之後進行醚處理而成。在進行免疫3星期後再次進行免疫，且在4星期後進行部分血液採集。藉由離心分離來獲得血清，並且每一群組分別以等量來儲存，然後測定測定中和抗體力價。由50%溶斑減少率計算出的結果表示於表55。相較於Vero細胞培養日本腦炎疫苗原料藥，進行醚處理而成的類病毒顆粒同樣地誘發充分的中和抗體。

[實施例9]

<調配HBs類病毒顆粒>

1.甲醛處理(對於病毒顆粒將顆粒結構固定化的步驟)

一面攪拌HBs抗原液(懸浮液A)一面以最後濃度成為0.018~0.162w/v%的方式來添加甲醛，並使其反應。反應結束後，以PBS滲析反應液，來去除甲醛，藉此獲得懸浮液B，該懸浮液B包含被固定化後的HBs顆粒。

2.醚處理(對於被固定化後的病毒顆粒實行脫脂處理的步驟)

對於上述懸浮液B，以最後濃度成為0.05vol%的方式來添加聚山梨醇酯80。之後，以最後濃度成為50vol%的方式，來添加與上述懸浮液B相同容量的二乙醚(脫脂劑)，並在25℃攪拌1小時。之後，以4℃、3000rpm對所獲得的混合液實行離心分離5分鐘，並回收水相(懸浮液C)，藉此去除醚相。

3.添加鋁鹽

在上述懸浮液C中混合鋁鹽。藉由上述步驟來調配檢體也就是HBs類病毒顆粒。

[實施例10]

<物性評估>

利用以下方法來評估上述實施例9所獲得的類病毒顆粒(檢體)。

1.藉由電子顯微鏡實行解析

為了進一步詳細調查類病毒顆粒的形狀，實施藉由電子顯微鏡所實行的觀察。在觀察用的經離子鍍膜的網片(日新EM公司製造)上，放置約25μg/mL的上述檢體並靜置約60秒，然後以2%磷鎢酸水溶液進行負染色。使用穿透式電子顯微鏡(FEI Company製造的Tecnai G2：加速電壓120kV)來對染色後的檢體進行觀察、攝影。

第8圖的(B)表示作為代表的類病毒顆粒的觀察結果，該類病毒顆粒是以0.05w/v%的甲醛濃度在37℃ 進行反應96小時，之後進行醚處理而成。第8圖的(A)表示作為比較對照的全病毒顆粒的觀察結果，該類病毒顆粒在福馬林固定後未進行醚處理。類病毒顆粒藉由以甲醛進行固定，而與HBs全顆粒同樣地保持了顆粒結構。

2.抗原的含量

藉由單一步驟三明治酵素免疫分析法(one-step sandwich enzyme immunoassay)來測定抗原的含量(抗原含量)，該分析法是使用高親和性抗HBs之小鼠單株抗體。上述測定是使用全自動酵素免疫分析裝置AIA(Automated Enzyme Immunoassay analyzer AIA，東曹股份有限公司製造的商品名)來實行。在測定所使用的試藥杯中，裝有作為冷凍乾燥物的被固定化於磁性小珠上的抗體與鹼性磷酸酶標記抗體。在上述試藥杯中添加檢體，藉此以固定時間、固定溫度來實行抗原抗體反應。反應後，以清洗水清洗上述磁性小珠，藉此去除游離的酵素標記抗體和檢體成分。之後，為了測定鍵結於磁性小珠上的鹼性磷酸酶標記抗體的酵素活性，添加磷酸4-甲基繖形基酯(4-methylumbelliferyl phosphate)作為酵素受質。作為酵素反應的結果，是測定所獲得的螢光物質(4-甲基繖形酮(4-methylumbelliferone))的生成速度，藉此測定檢體中的HBs抗原濃度。

使用類病毒顆粒作為代表，以及使用重組重組沉降B型肝炎疫苗作為比較對照(化學及血清療法研究所製造，商品名「Bimmugen」)，該類病毒顆粒是以0.05w/v% 的甲醛濃度在37℃進行反應96小時，之後進行醚處理而成。各抗原含量(ng/mL)除以蛋白濃度(ng/mL)而得的比活性值表示於表56。添加有0.005%聚山梨醇酯80的類病毒顆粒包含與重組沉降B型肝炎疫苗相同程度的抗原。

3.動態光散射

使用Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd製造)來對類病毒顆粒的平均粒徑進行解析。對作為代表的類病毒顆粒和作為比較對照的重組沉降B型肝炎疫苗進行測定的結果表示於表57，該類病毒顆粒是以0.05w/v%的甲醛濃度在37℃進行反應96小時，之後進行醚處理而成。任一檢體的平均粒徑皆是100nm前後且為單峰性。由此可知，醚處理後的類病毒顆粒的平均粒徑是與病毒顆粒相同程度的顆粒大小，並且為單一且不變的。由動態光散射實驗可知，類病毒顆粒保持了顆粒結構，且未確認到像凝集體這樣的雜質。

4.磷脂醯膽鹼的含量試驗

在HBs抗原所含的脂質成分中，80%以上是磷脂醯膽鹼。因此，HBs抗原的脂質成分的含量是以磷脂醯膽鹼的含量作為代表來進行定量。使用Phosphatidylcholine Assay Kit(Cell Biolabs,Inc.製造的商品名)來進行測定。在源自辣根(horseradish)的過氧化酶(HRP)的催化作用下，利用高靈敏度螢光探針來偵測到在反應過程中產生的過氧化氫，並測定其螢光強度，藉此測定磷脂醯膽鹼的含量。對作為代表的類病毒顆粒和作為比較對照的重組沉降B型肝炎疫苗進行測定的結果表示於表58，該類病毒顆粒是以0.05w/v%的甲醛濃度在37℃進行反應96小時，之後進行醚處理而成。暗示相對於比較對照，類病毒顆粒的磷脂醯膽鹼的含量至多是59質量%以下。

5.免疫原性(小鼠)

以2μg或0.5μg的接種量對BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠(雌性，5週齡)在腹腔內接種類病毒顆粒(添加0.005%聚山梨醇酯80並進行醚處理而成的類病毒顆粒)或重組沉降B型肝炎疫苗(每一群組8隻)，該類病毒顆粒是以0.05w/v%的甲醛濃度在37℃進行反應96小時，之後進行醚處理而成。在進行免疫4星期後再次進行免疫，且在4星期後使小鼠安樂死，然後進行全血採集。藉由離心分離來獲得血清，並使用全自動酵素免疫分析裝置AIA(東曹股份有限公司製造的商品名)來測定血清中的抗體力價。藉由單一步驟三明治酵素免疫分析法來進行測定，該分析法使用HBs抗原作為固相層和酵素標記抗原。在測定所使用的試藥杯中，裝有作為冷凍乾燥物的被固定化於磁性小珠上的抗原和鹼性磷酸酶標記抗原。在上述試藥杯中添加檢體，藉此以固定時間、固定溫度來實行抗原抗體反應。反應後，以清洗水清洗上述磁性小珠，藉此去除未反應的酵素標記抗原。之後，為了測定鍵結於磁性小珠上的鹼性磷酸酶標記抗體的酵素活性，添加磷酸4-甲基繖形基酯作為酵素受質。作為酵素反應的結果，是測定所獲得的螢光物質(4-甲基繖形酮)的生成速度，藉此測定檢體中的抗HBs抗體濃度。結果表示於表59。相較於重組沉降B型肝炎疫苗，醚處理後的類病毒顆粒為相同程度或以上的免疫原性。

[產業上的可利用性]

本發明在醫藥品的領域，尤其是在疫苗的領域中是有用的。

Claims

一種疫苗，其是含有類病毒顆粒之疫苗，該類病毒顆粒源自具有套膜之病毒顆粒，其中，相對於前述病毒顆粒的脂質成分的含量，前述類病毒顆粒的脂質成分的含量是較少的。
如請求項1所述的疫苗，其中，前述類病毒顆粒的脂質成分的含量，以前述病毒顆粒的脂質成分的含量作為基準，是小於50質量%。
如請求項1或2所述的疫苗，其中，前述類病毒顆粒的脂質成分的含量，以前述病毒顆粒的脂質成分的含量作為基準，是小於20質量%。
如請求項1~3中任一項所述的疫苗，其中，前述脂質成分是膽固醇。
如請求項1~4中任一項所述的疫苗，其中，前述類病毒顆粒包含：前述病毒顆粒的表面抗原、前述病毒顆粒的基質蛋白質或膜蛋白質、及前述病毒顆粒的核蛋白質。
如請求項1~5中任一項所述的疫苗，其中，前述類病毒顆粒包含源自前述病毒顆粒的基因組核酸。
如請求項1~6中任一項所述的疫苗，其中，前述病毒顆粒是正黏液病毒顆粒、黃病毒顆粒、或B型肝炎病毒顆粒。
如請求項7所述的疫苗，其中，前述病毒顆粒是流行性感冒病毒顆粒、日本腦炎病毒顆粒、或B型肝炎病毒表面抗原也就是HBs顆粒。
如請求項8所述的疫苗，其中，前述病毒顆粒是流行性感冒病毒顆粒。
如請求項9所述的疫苗，其中，前述流行性感冒病毒顆粒是A型流行性感冒病毒顆粒或B型流行性感冒病毒顆粒。
如請求項9或10所述的疫苗，其中，前述流行性感冒病毒顆粒是被分類為下述亞型株的流行性感冒病毒顆粒：H1N1亞型株、H2N2亞型株、H3N2亞型株、H3N8亞型株、H5N1亞型株、H5N2亞型株、H5N6亞型株、H6N1亞型株、H7N3亞型株、H7N7亞型株、H7N9亞型株、H9N2亞型株、或H10N8亞型株。
如請求項8~11中任一項所述的疫苗，其中，前述表面抗原包含血球凝集素也就是HA或神經胺酸酶也就是NA。
如請求項8~12中任一項所述的疫苗，其中，前述基質蛋白質或膜蛋白質包含M1蛋白質或M2蛋白質。
如請求項1~13中任一項所述的疫苗，其中，前述類病毒顆粒具有下述平均粒徑：前述病毒顆粒的粒徑的70~130%。
如請求項1~14中任一項所述的疫苗，其中，前述類病毒顆粒是下述類病毒顆粒：以蔗糖密度梯度離心法來進行測定時，在蔗糖濃度35%以上被偵測到峰值。
一種疫苗的製造方法，其是製造含有類病毒顆粒之疫苗的方法，該疫苗的製造方法包含下述步驟：固定化步驟，其對於具有套膜之病毒顆粒，將顆粒結構固定化；及，實行脫脂處理的步驟，其對於被固定化後的前述病毒顆粒實行脫脂處理。
如請求項16所述的疫苗的製造方法，其中，前述固定化步驟包含下述步驟：在懸浮液A中添加固定劑的步驟，該懸浮液A包含前述病毒顆粒。
如請求項17所述的疫苗的製造方法，其中，前述固定劑包含醛類。
如請求項17所述的疫苗的製造方法，其中，前述固定劑包含1-乙基-3-[3-二甲胺丙基]碳二亞胺鹽酸鹽也就是EDC。
如請求項18所述的疫苗的製造方法，其中，前述醛類是選自由甲醛、聚甲醛、戊二醛、及這些醛類的組合所構成之群組。
如請求項20所述的疫苗的製造方法，其中，前述醛類包含甲醛。
如請求項21所述的疫苗的製造方法，其中，前述甲醛的濃度，以前述懸浮液A和前述固定劑的總量作為基準，是0.007~0.076w/v%。
如請求項20所述的疫苗的製造方法，其中，前述醛類包含戊二醛。
如請求項23所述的疫苗的製造方法，其中，前述戊二醛的濃度，以前述懸浮液A和前述固定劑的總量作為基準，是0.002~0.05w/v%。
如請求項16~24中任一項所述的疫苗的製造方法，其中，前述實行脫脂處理的步驟包含下述步驟：在懸浮液B中添加脫脂劑的步驟，該懸浮液B包含被固定化後的前述病毒顆粒。
如請求項25所述的疫苗的製造方法，其中，前述脫脂劑是選自由二乙醚、二異丙醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、及這些脫脂劑的組合所構成之群組。
如請求項26所述的疫苗的製造方法，其中，前述脫脂劑包含二乙醚。
如請求項27所述的疫苗的製造方法，其中，前述二乙醚的濃度，以前述懸浮液B和前述脫脂劑的總量作為基準，是10vol%以上。
如請求項25~28中任一項所述的疫苗的製造方法，其中，前述脫脂劑進一步包含界面活性劑。
如請求項16~29中任一項所述的疫苗的製造方法，其中，前述病毒顆粒是使培養細胞或雞蛋感染並回收而得的病毒顆粒。
如請求項30所述的疫苗的製造方法，其中，前述培養細胞是非洲綠猴腎細胞或馬丁達比犬腎細胞。