CN102791734B - 源自人b细胞且具有抗甲型流感病毒的中和活性的人单克隆抗体 - Google Patents

源自人b细胞且具有抗甲型流感病毒的中和活性的人单克隆抗体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及人单克隆抗体，该人单克隆抗体来源于在已从感染甲型流感病毒中恢复的患者的血液中存在的人B细胞，其中所述单克隆抗体具有抗甲型流感病毒的中和活性。本发明的抗甲型流感病毒的单克隆抗体具有抗选自由甲型流感病毒H1、H2和H5亚型组成的组中至少一种甲型流感病毒的结合和中和活性，且因此所述抗甲型流感病毒的单克隆抗体对预防和治疗由甲型流感病毒引起的疾病是有用的，且对甲型流感病毒感染的诊断也是有用的。

Description

源自人B细胞且具有抗甲型流感病毒的中和活性的人单克隆抗体
技术领域
本发明涉及人单克隆抗体，该人单克隆抗体来源于已从感染甲型流感病毒中恢复的患者的血液中存在的人B细胞，其中该单克隆抗体具有抗甲型流感病毒的中和活性。
背景技术
流感是由呼吸道感染的流感病毒引起的疾病，常常在冬季发生。已知流感具有非常高的传染性，会影响所有年龄组的人、尤其是老年人(Treanor J，2004，N Engl J Med.350(3)：218-20)。流感病毒是负链且被包膜的RNA(核糖核酸)病毒，属于正黏液病毒(Orthomyxoviridae)科。流感病毒具有单链RNA的8个节段，且被分类为甲型(A)、乙型(B)和丙型(C)。甲型流感病毒根据它们主要的表面蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)进一步分成多种亚型。迄今为止，已鉴定出16种HA和9种NA(Cheung TK和Poon LL 2007，AnnNYAcad Sci.1102：1-25)。流感病毒根据它们的类型而具有广泛的感染范围(包括鸟、猪和人)，且流感病毒具有由分段的RNA组成的基因组。因为这一原因，流感病毒可持续地突变和重组，从而产生新的遗传变异体(Treanor J，2004.NEngl J Med.350(3)：218-20)。因为这一原因，难以获得抗流感病毒的长期免疫。当前使用的最有效的预防方法是抗每次预期要流行的特定流感病毒的疫苗。
通常使用蛋生产流感疫苗，但这是需要很长时间的低效率的方法。因此，该方法具有难以每年在有限的时间范围内生产足够量的疫苗的问题。为了解决这一问题，在多家制药公司(GSK、Baxter等)中正积极进行对通过细胞培养生产疫苗的方法的研究。此外，当出现大范围流行的传染时，很难迅速开发出抗该大范围流行的流感病毒的疫苗。另外由于与具有抗性的突变病毒的出现相关的问题，抗病毒药物并不是完全可靠的。
为了解决这一问题，最近已积极开发了抗流感病毒的抗体以用于治疗目的(Throsby等，2008，PloS One 3(e3942)；Sui等，2009，Nature structural&molecular biology.16(265-273)；Simmons等，2007，PloS Medicine 4(e 178))。
已使用来自恢复的患者的血液产物来治疗被各种病毒感染的患者，以及治疗流行性的流感传染。例如，当被西班牙流感病毒感染的患者具有肺炎症状时，使用从该流感病毒感染中恢复的患者收集血液产物以治疗该病毒(Luke等，2006.Annals of internal medicine.145：599)。同样地，从人的血浆中纯化超免疫球蛋白(IgIv)以用于治疗被各种病毒感染的患者，但由于血液中潜在的感染介质而使如上述方法获得的产物可能并不安全，且不足以进行大批量生产。
人B细胞用于特异性人单克隆抗体的筛选。但是，通过Epstein-Barr病毒(EBV)而使人B细胞无限增殖化在B细胞的无限增殖化中是低效且费时的。为了克服该低效，正在开发和使用新的技术。这些技术中的一项是使用RT-PCR方法以直接从B细胞获得抗体的遗传信息。例如，有一种方法包括：对表达抗特异性抗原的抗体的B细胞进行染色，使用流式细胞仪(FACS)分离B细胞，通过RT-PCR方法从单个B细胞获得抗体的遗传信息，将该遗传信息插入表达载体，然后将表达载体转染进入动物细胞，从而产生大量的抗体。为了以更容易且快速的方式进行所述生产，可使用下面的技术。新技术“芯片上的免疫斑阵列测试”(ISAAC)使得能够在几个星期内通过筛选单个B细胞获得抗体基因，该B细胞分泌特异的单克隆抗体(Jin等，2009Nat Med.15，1088-1092)。
非专利文件
1.Reed L.J.和Muench H(1938).A simple method of estimating fifty percentendpoints.The American Journal of Hygiene，27(493-497)。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种人单克隆抗体，所述人单克隆抗体源自人B细胞，且具有抗甲型流感病毒的中和活性。
本发明的另一个目的是提供一种编码所述单克隆抗体的分离的核酸分子。
本发明的又一个目的是提供一种包含所述核酸分子的表达载体，所述核酸分子插在所述表达载体中。
本发明的又一个目的是提供一种转染有所述表达载体的生成抗体的细胞系。
本发明的又一个目的是提供一种用于筛选人单克隆抗体的方法。
本发明的又一个目的是提供一种包括所述人单克隆抗体的组合物。
本发明的又一个目的是提供一种使用所述人单克隆抗体治疗由甲型流感病毒引起的疾病的方法。
本发明的又一个目的是提供一种使用所述人单克隆抗体预防由甲型流感病毒引起的疾病的方法。
本发明的又一个目的是提供一种用于使用所述人单克隆抗体诊断甲型流感病毒的方法。
本发明的再一个目的是提供一种用于甲型流感病毒诊断的试剂盒，所述试剂盒包括所述人单克隆抗体。
技术方案
为了达到上述目的，本发明提供了一种抗甲型流感病毒的单克隆抗体，所述单克隆抗体具有抗选自由甲型流感病毒H1、H2和H5亚型组成的组中的至少一种的中和活性。
本发明还提供了一种编码所述单克隆抗体的分离的核酸分子。
本发明还提供了一种包含所述分离的核酸分子的表达载体，所述核酸分子插在所述表达载体中。
本发明还提供了一种转染有所述表达载体的生成抗体的细胞系。
本发明还提供了一种用于筛选人单克隆抗体的方法。
本发明还提供了一种包括所述人单克隆抗体的组合物。
本发明还提供了一种用于预防和治疗由甲型流感病毒引起的疾病的组合物，所述组合物包括所述人单克隆抗体。
本发明还提供了一种用于甲型流感病毒诊断的组合物，所述组合物包括所述人单克隆抗体。
本发明还提供了一种使用所述人单克隆抗体治疗由甲型流感病毒引起的疾病的方法。
本发明还提供了一种使用所述人单克隆抗体预防由甲型流感病毒引起的疾病的方法。
本发明还提供了一种用于使用所述人单克隆抗体诊断甲型流感病毒感染的方法。
本发明还提供了一种用于甲型流感病毒诊断的试剂盒，所述试剂盒包括所述人单克隆抗体。
有益效果
本发明的抗甲型流感病毒的单克隆抗体具有抗选自由甲型流感病毒H1、H2和H5亚型组成的组中的至少一种甲型流感病毒的结合和中和活性，因此对预防和治疗由甲型流感病毒引起的疾病是有用的，且还对诊断甲型流感病毒的感染是有用的。
附图说明
图1为示出CT109、CT111-1和CT14-2抗体对单体的血凝素(在下文中被称为“HA”)和三聚体的HA的结合亲和力的一组曲线图。
图2为示出CT104、CT120和CT123抗体对单体的HA和三聚体的HA的结合亲和力的一组曲线图。
图3为示出CT137、CT151和CT165抗体对单体的HA和三聚体的HA的结合亲和力的一组曲线图。
图4示出了pCT145(A)和pCT147(B)的载体图谱：
A：pCT145载体；
B：pCT147载体；
pac：编码嘌呤霉素-N-乙酰基转移酶(PAC)的基因；及
DS：二重对称(dyad symmetry)(EBNA1连接至EBV的质粒复制起点(oriP)中的二重对称(DS)元素)。
图5为表达本发明抗甲型流感病毒的单克隆抗体的表达载体的图谱。
图6示出了使用本发明的抗甲型流感病毒单克隆抗体进行的动物(小鼠)存活实验的结果：
A：在使用H5N1亚型病毒(A/越南/1203/04)激发之前24小时注射抗体的组；
B：在使用H5N1亚型病毒(A/越南/1203/04)激发之后48小时注射抗体的组；
C：在使用大范围流行的H1N1亚型病毒(A/加利福尼亚/07/2009)激发之前24小时注射抗体的组；
D：在使用季节性H1N1亚型病毒(A/波多黎各/8/1934)激发之前24小时注射抗体的组。
图7示出了在使用H1N1亚型(A/加利福尼亚/04/09)激发之后24小时使用本发明的CT120进行的动物(雪貂)实验的洗鼻液(nasal wash)中病毒滴定度变化的结果。
图8示出了在使用H1N1亚型(A/加利福尼亚/04/09)激发后使用本发明的CT120进行的动物(雪貂)实验的肺组织中的病毒滴定度变化的结果。
具体实施方式
下文中，本文所使用的术语定义如下。
术语“甲型流感病毒”指负链且被包膜的RNA(核糖核酸)病毒，属于正黏液病毒(Orthomyxoviridae)科。正黏液病毒具有单链RNA的8个节段，且被分类为甲型(A)、乙型(B)和丙型(C)。甲型流感病毒根据它们的主要表面蛋白HA(血凝素)和NA(神经氨酸酶)被进一步分成多种亚型。迄今为止，已知有16种HA和9种NA。
本文所使用的术语“H1亚型”意于包括甲型流感病毒的H1N1、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5、H1N6、H1N7、H1N8和H1N9。
本文所使用的术语“H2亚型”意于包括甲型流感病毒的H2N1、H2N2、H2N3、H2N4、H2N5、H2N6、H2N7、H2N8和H2N9。
本文所使用的术语“H5亚型”意于包括甲型流感病毒的H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N5、H5N6、H5N7、H5N8和H5N9。
术语“血凝素”(下文被称为“HA”)指流感病毒的包膜糖蛋白。HA介导流感病毒进入宿主细胞的吸附和侵入。存在16种已知的HA亚型。
本文所使用的术语“恢复的或完全恢复的患者”指曾经由于甲型流感病毒的感染而甲型流感病毒呈阳性的患者在给定时间段后血液中的甲型流感病毒呈阴性，表明患者已从感染有甲型流感病毒中恢复。
下面，将对本发明进行详细地描述。
本发明人从已由感染有甲型流感病毒中恢复的患者收集的血液中分离外周血单核细胞(PBMC)。在分离出的PBMC中筛选产生单克隆抗体的B细胞。通过RT-PCR法，在筛选的B细胞中获得用于产生单克隆抗体的遗传信息，并将该遗传信息插入pcDNA载体中。将该载体转染进入CHO细胞系以证实初步的抗体产生及抗体的HA结合活性。筛选出总计有82种抗体。为了更准确地测量对HA的结合亲和性，插入pcDNA载体的所有抗体被转染进入人F2N细胞，且使用单体HA和三聚体HA作为抗原通过HA-ELISA对比分析由已转染的细胞生成的抗体，从而选择出35种抗体，选择出的这些抗体与三聚体HA的反应程度高于与单体HA的反应程度。将pcDNA载体中的选择出的这35种抗体基因插入MarEx表达载体，然后转染进入F2N细胞以产生更大量的抗体。这些抗体被用于进行微量中和试验(下文被称为“MN试验”)和红血球凝聚抑制试验(下文被称为“HI试验”)以确定抗多种流感病毒的中和活性。许多抗体展示出或高或低的抗多种流感病毒的中和活性，但所有的抗体在HI试验中示出阴性反应。通过MN试验，最终选择了示出抗多种病毒的中和活性的三种单克隆抗体(CT104、CT120和CT123抗体)。发现：在该筛选出的三种单克隆抗体中，CT104具有抗H1和H5亚型的中和活性，CT120具有抗H1、H2和H5亚型的中和活性，且C T123具有抗H1亚型的中和活性(见表1)。此外，在使用H1和H5亚型进行的动物(小鼠)存活实验中，C T104和CT120显示了抗H5N1感染的极好的预防和治疗效果，且这三种抗体均显示出抗大范围流行和季节性H1N1感染的极好的预防效果(见图6)。在使用H1亚型进行的另一种动物(雪貂)实验中，C T120显示出抗H1N1(A/加利福尼亚/04/09)感染的治疗效果(见图7和图8)。基于上述结果，本发明人已完成了中和保护免受甲型流感病毒感染的单克隆抗体的发明。
因此，本发明提供了具有抗甲型流感病毒H1、H2和H5亚型的中和活性的单克隆抗体。
在本发明中，单克隆抗体优选与甲型流感病毒表面上的HA结合。此外，单克隆抗体优选来源于已从甲型流感病毒H1N1亚型感染中恢复的患者的血液中存在的B细胞。
在本发明中，甲型流感病毒优选属于H1N1亚型，且甲型流感病毒H1N1亚型为选自由A/德克萨斯州/05/2009-RG15、A/纽约/18/2009-RG15、A/所罗门群岛/2006和A/俄亥俄州/83组成的组中的至少一种。而且，甲型流感病毒优选属于H2N2亚型，且甲型流感病毒H2N2亚型为A/安阿伯/6/60ca。此外，甲型流感病毒优选属于H5N1亚型，且甲型流感病毒H5N1亚型为选自A/越南/1203/04和A/安徽/1/05中的一种。
在本发明中，单克隆抗体不具有抗甲型流感病毒H3N2亚型的中和活性。
本发明还提供了包括以下轻链多肽序列和重链多肽序列的抗甲型流感病毒的单克隆抗体，及其片段和功能性变异体：
包括CDR1区域、CDR2区域和CDR3区域的轻链，该CDR1区域包括选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：12组成的组中的序列，该CDR2区域包括SEQ ID NO：2的序列，及该CDR3区域包括选自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：13组成的组中的序列；以及
包括CDR1区域、CDR2区域和CDR3区域的重链，该CDR1区域包括选自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：14组成的组中的序列，该CDR2区域包括选自由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：15组成的组中的序列，及该CDR3区域包括选自由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：11和SEQID NO：16组成的组中的序列。
本发明还提供了选自由以下单克隆抗体组成的组中的抗甲型流感病毒的单克隆抗体，及其片段和功能性变异体：
包括轻链和重链的单克隆抗体，其中该轻链包括：包括SEQ ID NO：1序列的CDR1区域、包括SEQ ID NO：2序列的CDR2区域和包括SEQ ID NO：3序列的CDR3区域，该重链包括：包括SEQ ID NO：4序列的CDR1区域、包括SEQ ID NO：5序列的CDR2区域和包括SEQ ID NO：6序列的CDR3区域；
包括轻链和重链的单克隆抗体，其中该轻链包括：包括SEQ ID NO：7序列的CDR1区域、包括SEQ ID NO：2序列的CDR2区域和包括SEQ ID NO：8序列的CDR3区域，该重链包括：包括SEQ ID NO：9序列的CDR1区域、包括SEQ ID NO：10序列的CDR2区域和包括SEQ ID NO：11序列的CDR3区域；以及
包括轻链和重链的单克隆抗体，其中该轻链包括：包括SEQ ID NO：12序列的CDR1区域、包括SEQ ID NO：2序列的CDR2区域和包括SEQ ID NO：13序列的CDR3区域，该重链包括：包括SEQ ID NO：14序列的CDR1区域、包括SEQ ID NO：15序列的CDR2区域和包括SEQ ID NO：16序列的CDR3区域。
在本发明中，上述单克隆抗体优选包括：包括SEQ ID NO：36多肽序列的轻链，及包括SEQ ID NO：37多肽序列的重链。该单克隆抗体优选具有抗甲型流感病毒H1和H5亚型的中和活性，且不具有抗甲型流感病毒H3亚型的中和活性。H1亚型包括H1N1、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5、H1N6、H1N7、H1N8和H1N9，且H5亚型包括H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N5、H5N6、H5N7、H5N8和H5N9。
在本发明中，上述单克隆抗体优选包括：包括SEQ ID NO：40多肽序列的轻链，及包括SEQ ID NO：41多肽序列的重链。该单克隆抗体优选具有抗甲型流感病毒H1、H2和H5亚型的中和活性，且不具有抗甲型流感病毒H3亚型的中和活性。H1亚型包括H1N1、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5、H1N6、H1N7、H1N8和H1N9，且H2亚型包括H2N1、H2N2、H2N3、H2N4、H2N5、H2N6、H2N7、H2N8和H2N9。而且，H5亚型包括H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N5、H5N6、H5N7、H5N8和H5N9。
在本发明中，上述单克隆抗体优选包括：包括SEQ ID NO：44多肽序列的轻链，及包括SEQ ID NO：45多肽序列的重链。该单克隆抗体优选具有抗甲型流感病毒H1亚型的中和活性，且不具有抗甲型流感病毒H3亚型的中和活性。H1亚型包括H1N1、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5、H1N6、H1N7、H1N8。
本发明的甲型流感病毒的单克隆抗体的片段不是整个抗体，而是抗体的一部分。该片段具有结合至甲型流感病毒的HA的能力，且旨在包括与本发明的抗甲型流感病毒的单克隆抗体竞争结合至HA的所有片段。
此外，本发明包括本发明的单克隆抗体的功能性变异体。如果单克隆抗体的变异体可与本发明的单克隆抗体竞争以特异性结合甲型流感病毒H1、H2和H5亚型及其片段，则它们被认为是本发明的单克隆抗体的功能性变异体。具体地，如果功能性变异体可结合至甲型流感病毒H1、H2和H5亚型或其片段，且具有抗所述亚型或片段的中和活性，则该功能性变异体被认为是本发明的功能性变异体。功能性变异体包括但并不限于：在一级结构序列中基本类似、但包含本发明的亲本单克隆抗体中没有的例如体外或体内的化学和/或生物化学的改性的衍生物。这些改性包括例如乙酰化、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、交联、二硫键的形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解处理、磷酸化等。可选择地，功能性变异体可为如下的单克隆抗体：与亲本单克隆抗体的氨基酸序列相比，包括含有一个或多个氨基酸的取代、插入、缺失或其组合的氨基酸序列。进一步地，功能性变异体可在氨基末端或羧基末端的其中一端或两端包括氨基酸序列的截短。与亲本单克隆抗体相比，根据本发明的功能性变异体可能具有相同或不同、较高或较低的结合亲和力，但仍能够键合至甲型流感病毒H1、H2和H5亚型或其片段。例如，与亲本单克隆抗体相比，根据本发明的功能性变异体对甲型流感病毒H1、H2和H5亚型或其片段可具有升高或降低的结合亲和力。优选地，包括但并不限于构架区域、高可变区域、尤其是CDR3区域的可变区域的氨基酸序列被改性。通常，轻链或重链区域包括三个高可变区域(包括三个CDR)和更保守的区域(所谓的构架区域(FR))。高可变区域包括来自CDR的氨基酸残基和来自高可变环的氨基酸残基。意于落入本发明的范围内的功能性变异体与本文所定义的亲本单克隆抗体具有至少大约50～99％、优选至少大约60～99％、更优选至少大约80～99％、甚至更优选至少大约90～99％、尤其至少大约95～99％，且特别至少大约97～99％的氨基酸序列同源性。可将本领域技术人员已知的计算机算法诸如Gap或Bestfit用于最优化地比对要对比的氨基酸序列，且定义相似或相同的氨基酸残基。可通过本领域已知的通用的分子生物学方法(包括PCR、寡核苷酸定点诱变(oligonucleotide-directed mutagenesis)和定点诱变(site-directed mutagenesis))改变亲本单克隆抗体或其部分，或通过有机合成方法获得功能性变异体。
本发明还提供了包括以下轻链多核苷酸序列和重链多核苷酸序列的抗甲型流感病毒的单克隆抗体，及其片段和功能性变异体：
包括CDR1区域、CDR2区域和CDR3区域的轻链，该CDR1区域包括选自由SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：28组成的组中的序列，该CDR2区域包括SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：29的序列，及该CDR3区域包括选自由SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：30组成的组中的序列；以及
包括CDR1区域、CDR2区域和CDR3区域的重链，该CDR1区域包括选自由SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：31组成的组中的序列，该CDR2区域包括选自由SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：32组成的组中的序列，及该CDR3区域包括选自由SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：33组成的组中的序列。
本发明还提供了选自由以下单克隆抗体组成的组中的抗甲型流感病毒的单克隆抗体，及其片段和功能性变异体：
包括轻链和重链的单克隆抗体，该轻链包括：包括SEQ ID NO：17的序列的CDR1区域、包括SEQ ID NO：18的序列的CDR2区域和包括SEQ ID NO：19的序列的CDR3区域，且该重链包括：包括SEQ ID NO：20的序列的CDR1区域、包括SEQ ID NO：21的序列的CDR2序列和包括SEQ ID NO：22的序列的CDR3区域；
包括轻链和重链的单克隆抗体，该轻链包括：包括SEQ ID NO：23的序列的CDR1区域、包括SEQ ID NO：18的序列的CDR2区域和包括SEQ ID NO：24的序列的CDR3区域，且该重链包括：包括SEQ ID NO：25的序列的CDR1区域、包括SEQ ID NO：26的序列的CDR2区域和包括SEQ ID NO：27的序列的CDR3区域；以及
包括轻链和重链的单克隆抗体，该轻链包括：包括SEQ ID NO：28的序列的CDR1区域、包括SEQ ID NO：29的序列的CDR2区域和包括SEQ ID NO：30的序列的CDR3区域，且该重链包括：包括SEQ ID NO：31的序列的CDR1区域、包括SEQ ID NO：32的序列的CDR2区域和包括SEQ ID NO：33的序列的CDR3区域。
在本发明中，上述单克隆抗体优选包括：包括SEQ ID NO：34的多核苷酸序列的轻链，和包括SEQ ID NO：35的多核苷酸序列的重链。该单克隆抗体优选具有抗甲型流感病毒H1和H5亚型的中和活性，但不具有抗甲型流感病毒H3N2亚型的中和活性。H1亚型包含H1N1、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5、H1N6、H1N7、H1N8和H1N9，且H5亚型包含H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N5、H5N6、H5N7、H5N8和H5N9。
在本发明中，单克隆抗体优选包括：包括SEQ ID NO：38的多核苷酸序列的轻链，和包括SEQ ID NO：39的多核苷酸序列的重链。该单克隆抗体优选具有抗甲型流感病毒H1、H2和H5亚型的中和活性，但不具有抗甲型流感病毒H3N2亚型的中和活性。H1亚型包含H1N1、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5、H1N6、H1N7、H1N8和H1N9，且H2亚型包含H2N1、H2N2、H2N3、H2N4、H2N5、H2N6、H2N7、H2N8和H2N9。此外，H5亚型包含H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N5、H5N6、H5N7、H5N8和H5N9。
在本发明中，上述单克隆抗体优选包括：包括SEQ ID NO：42的多核苷酸序列的轻链，和包括SEQ ID NO：43的多核苷酸序列的重链。该单克隆抗体优选具有抗甲型流感病毒H1亚型的中和活性，但不具有抗甲型流感病毒H3亚型的中和活性。H1亚型包含H1N1、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5、H1N6、H1N7、H1N8和H1N9。
本发明还提供了编码所述抗甲型流感病毒的单克隆抗体的分离的核酸分子。
本发明的核酸分子包含通过本领域的技术人员已知的方法将本发明的抗体的氨基酸序列翻译成多核苷酸序列所获得的所有核酸分子。因此，可制备具有开放阅读框(ORF)的多种多核苷酸序列，且该制备的多核苷酸序列包含在本发明的核酸分子的范围内。
本发明还提供了包含所述核酸分子的表达载体，所述核酸分子插在所述表达载体中。该表达载体可优选源自选自由以下(但并不限于)载体组成的组中的一种：由Celltrion Inc.(韩国)生产的MarEx表达载体；市场上可广泛买到的pCDNA载体；F、R1、RP1、Col、pBR322、ToL、Ti载体；粘粒；噬菌体，诸如λ噬菌体、λ形噬菌体(lambdoid)、M13噬菌体、Mu噬菌体、P1噬菌体、P22噬菌体、Qμ噬菌体、T-偶数(T-even)噬菌体、T2噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体等；植物病毒。本发明中可使用本领域技术人员已知的各种表达载体的任意一种，且表达载体的选择依赖于所选择的宿主细胞的性质。宿主细胞中载体的导入可通过(但并不限于)磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔实现，且本领域的任何技术人员可选择和使用适用于所用的表达载体和宿主细胞的导入方法。优选地，上述载体包含一种或多种选择标记，但并不限于此，且还可使用不包含选择标记的载体。选择标记的选择可依赖于选择的宿主细胞(如本领域的技术人员公知的)，但这对于本发明并不是关键性的。
为了促进本发明的核酸分子的纯化，可将标签(tag)序列插入表达载体中。标签的实例包括(但不限于)六个组氨酸标签、血凝素标签、myc标签或FLAG标签。可在本发明中使用本领域的技术人员已知的促进纯化的任何标签。
本发明还提供了转化有所述表达载体的生产抗甲型流感病毒单克隆抗体的细胞系。
在本发明中，上述细胞包含(但并不限于)哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞或细菌来源的细胞。作为哺乳动物细胞，可优选使用选自(但并不限于)由CHO细胞、F2N细胞、CSO细胞、BHK细胞、Bowes黑色素瘤细胞、HeLa细胞、911细胞、AT1080细胞、A549细胞、HEK 293细胞和HEK293T细胞组成的组中的一种作为宿主细胞。在本领域中可使用本领域的技术人员已知的可用作哺乳动物宿主细胞的任何细胞。
本发明还提供了在从感染甲型流感病毒中恢复的患者中筛选具有抗甲型流感病毒的中和活性的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：1)检验感染甲型流感病毒的患者是否完全恢复，且从经检验的患者中筛选血液中甲型流感病毒呈阴性的患者；2)从在步骤1)中筛选出的完全恢复的患者收集血液；3)从在步骤2)中收集的患者血液中分离B细胞；4)从在步骤3)中分离的B细胞中筛选产生HA-结合抗体的B细胞；5)从在步骤4)中筛选出的B细胞中提取RNA；6)从在步骤5)提取的RNA中扩增抗体基因；7)将在步骤6)中扩增的基因克隆到表达载体中；8)将步骤7)的表达载体转染到宿主细胞中；9)检验步骤8)的转染的宿主细胞是否产生HA-结合抗体；10)培养步骤9)的筛选出的转染细胞；11)从步骤10)的被转染的细胞培养物中纯化与甲型流感病毒的HA结合的抗体；12)再次确定在步骤11)中纯化的抗体是否具有抗甲型流感病毒的中和活性；以及，13)再次筛选在步骤12)中确定具有抗甲型流感病毒的中和活性的抗体。
本发明还提供了包括所述抗甲型流感病毒的单克隆抗体的组合物。
除了抗甲型流感病毒的单克隆抗体之外，本发明的组合物可包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂是本领域的技术人员公知的。
本发明还提供了一种用于预防和治疗由甲型流感病毒引起的疾病的组合物，所述组合物包括所述抗甲型流感病毒的单克隆抗体。
除了抗甲型流感病毒的单克隆抗体之外，本发明的组合物可包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂是本领域的技术人员公知的。
此外，本发明的预防和治疗的组合物可包括用于甲型流感的至少五种其它的治疗剂。本发明的预防和治疗的组合物可包括多种结合至甲型流感病毒H1、H2和H5亚型的单克隆抗体或其片段，其中这些单克隆抗体可显示出对中和活性的协同作用。
此外，本发明的预防和治疗的组合物可额外包括一种或多种其它治疗剂或诊断剂。治疗剂包含但并不限于抗病毒药物。这样的药物可包含抗体、小分子、有机或无机化合物、酶、多核苷酸序列、抗病毒肽等。
本发明的预防和治疗的组合物在制造和储存条件下必须是无菌和稳定的。此外，本发明的预防和治疗的组合物可在递送之前或在递送时在适当的药学上可接受的赋形剂中以粉末形式重构。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备的优选方法是真空干燥和冷冻干燥，真空干燥和冷冻干燥从活性成分和其它期望成分的预先无菌过滤过的溶液产生活性成分和其它期望成分的粉末。可选择地，本发明的组合物可在溶液中，且在递送之前或递送时可加入和/或混合适当的药学上可接受的赋形剂以提供可注射的单位剂型。优选地，本发明中使用的药学上可接受的赋形剂适用于高药物浓度，可保持适当的流动性，且如果需要可延迟吸收。
预防和治疗组合物的最佳给药途径的选择会受到几个因素的影响，包含组合物中活性分子的物理化学性质、临床表现的紧迫性和活性分子的血浆浓度与期望的治疗效果之间的关系。例如，可与载剂一起制备本发明的单克隆抗体，其中载剂将保护它们以防止快速释放(诸如控释制剂)，该载剂包含植入物、透皮贴剂和微胶囊化的递送系统。可在本发明中使用生物可降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚正酯和聚乳酸。进一步地，单克隆抗体可包被有防止抗体失活的材料或化合物、或与这样的材料或化合物同时给药。例如，单克隆抗体可与适当的载剂(例如脂质体或稀释剂)一起给药。
本发明的预防和治疗组合物的给药途径可分成口服给药和胃肠外给药。优选的给药途径是静脉注射，但并不限于此。
口服剂型可被配制成片剂、锭剂(troche)、糖锭(lozenge)、水性或油性悬浮液、分散的粉末或颗粒、乳剂、硬胶囊、软胶胶囊、糖浆或酏剂、丸剂、糖衣丸(dragee)、液体、凝胶或膏剂(slurry)。这些制剂可包含药学赋形剂，其中药学赋形剂包括但并不限于：成粒剂和崩解剂，结合剂，润滑剂，防腐剂，着色剂、调味剂或甜味剂，植物油或矿物油，湿润剂，和增稠剂。
由于胃肠外给药的制剂可为水性或非水性的等渗无菌无毒的注射或灌注溶液或悬浮液的形式。所述溶液或悬浮液可包括所采用的剂量和浓度对接受者无毒的试剂，诸如1，3-丁二醇、林格氏溶液(Ringer’s solution)、汉克溶液(Hank’ssolution)、等渗的氯化钠溶液、油、脂肪酸、局部的麻醉剂、防腐剂、缓冲液、粘度或溶解性增高的试剂、水溶性的抗氧化剂、油溶性的抗氧化剂和金属螯合剂。
本发明提供了一种用于甲型流感病毒诊断的组合物，该组合物包括缀合物(conjugate)，所述缀合物包括缀合至所述抗甲型流感病毒单克隆抗体的标签。
本发明的诊断组合物包括至少一种可检测的标签，诸如可检测的部分/试剂。标签可非共价地缀合至本发明的单克隆抗体。标签还可通过共价键直接缀合至单克隆抗体。可选择地，标签可利用一种或多种连接化合物缀合至上述单克隆抗体。用于将标签缀合至单克隆抗体的技术对本领域的技术人员是公知的。作为标签的可检测的部分/试剂优选为选自由(但并不限于)酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射材料和非放射性的顺磁金属离子组成的组中的一种。
本发明还提供了一种治疗由甲型流感病毒引起的疾病的方法，该方法包括向患有由甲型流感病毒引起的疾病的受试者给予本发明的甲型流感病毒的单克隆抗体。
在本发明的治疗方法中，甲型流感病毒优选为选自由H1、H2和H5亚型组成的组中的至少一种。H1亚型包括H1N1、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5、H1N6、H1N7、H1N8和H1N9，且H2亚型包括H2N1、H2N2、H2N3、H2N4、H2N5、H2N6、H2N7、H2N8和H2N9。此外，H5亚型包括H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N5、H5N6、H5N7、H5N8和H5N9。
在本发明的治疗方法中，本领域的技术人员已知的用于由甲型流感病毒引起的疾病的任何治疗剂均可与本发明的单克隆抗体一起给药。
在本发明的治疗方法中，由甲型流感病毒引起的疾病可为选自由(但并不限于)新型流感、流行性流感和季节性流感组成的组中一种。
在本发明的治疗方法中，甲型流感病毒的单克隆抗体的剂量可被调整为最佳的响应。所述剂量为：例如0.01～200mg/kg，优选为0.1～150mg/kg，且更优选地为1～100mg/kg，但并不限于此。可每天给予几次分开的剂量，或可按照个体状态的紧迫性按比例降低剂量。本发明的组合物可一次给药，或在一天中间隔几次给药。本发明中并不限定给药的模式，且可由主治医师决定给药的模式。
在本发明的治疗方法中，甲型流感病毒的单克隆抗体的给药途径可分成口服给药和胃肠外给药。优选的给药途径是静脉注射，但并不限于此。
本发明还提供了一种用于预防由甲型流感病毒引起的疾病的方法，该方法包括向受试者给予本发明的甲型流感病毒的单克隆抗体的步骤。
在本发明的预防方法中，甲型流感病毒的单克隆抗体可与本领域技术人员已知的用于由甲型流感病毒引起的疾病的任何预防试剂一起给药。
在本发明的预防方法中，甲型流感病毒单克隆抗体的剂量可被调整为最佳的响应。该剂量为：例如0.01～200mg/kg，优选为0.1～150mg/kg，且更优选为1～100mg/kg，但并不限于此。可每天给予几次分开的剂量，或可按照个体状态的紧迫性按比例降低剂量。本发明的组合物可一次给药，或在一天中间隔几次给药。本发明中并不限定给药的模式，且可由主治医师决定给药的模式。
本发明还提供一种用于诊断患者中甲型流感病毒的方法，该方法包括以下步骤：1)使样品与本发明的抗甲型流感病毒的单克隆抗体接触；以及，2)检测单克隆抗体和样品之间的反应。可选择地，上述诊断方法可包括以下步骤：1)使样品与本发明的诊断组合物接触；以及，2)检测诊断组合物和样品之间的反应。
在本发明的诊断方法中，甲型流感病毒具有选自由H1、H2和H5组成的组中的一种或多种亚型。H1亚型包括H1N1、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5、H1N6、H1N7、H1N8和H1N9，且H2亚型包括H2N1、H2N2、H2N3、H2N4、H2N5、H2N6、H2N7、H2N8和H2N9。此外，H5亚型包括H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N5、H5N6、H5N7、H5N8和H5N9。
在本发明的诊断方法中，根据本领域技术人员已知的任何方法本发明的单克隆抗体可(如果需要)缀合有用于诊断和检测的标签。
在本发明的诊断方法中，样品优选为选自由(但并不限于)痰、唾液、血液、肺细胞、肺组织粘液、呼吸组织和鼠尾草组成的组中的一种。可根据本领域技术人员已知的任何传统方法制备样品。
在本发明的诊断方法中，用于检测反应的方法可为选自由(但并不限于)同质和异质结合的免疫测试所组成的组中的一种，诸如放射-免疫测试(RIA)、ELISA、免疫荧光、免疫组化、FACS、BIACORE和Western印迹分析。本领域技术人员已知的任何检测方法均可用于本发明中。
本发明还提供了一种用于甲型流感病毒诊断的试剂盒，包括：1)本发明的抗甲型流感病毒的单克隆抗体；以及，2)容器。
此外，本发明还提供了用于甲型流感病毒感染诊断的试剂盒，包括：1)根据本发明的用于甲型流感病毒感染诊断的组合物；以及，2)容器。
在本发明的诊断试剂盒中，甲型流感病毒优选具有选自由H1、H2和H5组成的组中的一种或多种亚型。H1亚型包括H1N1、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5、H1N6、H1N7、H1N8和H1N9，且H2亚型包括H2N1、H2N2、H2N3、H2N4、H2N5、H2N6、H2N7、H2N8和H2N9。此外，H5亚型包括H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N5、H5N6、H5N7、H5N8和H5N9。
在本发明的诊断试剂盒中，固体支撑物被包括在容器2)中。本发明的单克隆抗体可结合至固体支撑物，且该固体支撑物可为多孔的或无孔的、平面的或非平面的。
实施例
实施例1：从流感恢复的患者的血液中分离PBMC
已恢复的患者组由被证实患新流感感染后的2～4周的患者志愿者组成。这些志愿者经证实在其血液内没有流感病毒(H1N1)，且具有抗该新流感病毒的抗体。本研究是在伦理审查委员会(IRB)的许可下进行的。该患者组具有以下特征：(1)患者没有接种抗季节型流感的疫苗；(2)患者对其它传染性病毒(即HBsAg)呈阴性，且对抗-HCV抗体和抗-HIV抗体呈阴性；(3)患者血浆中对流感病毒H1N1亚型的RT-PCR呈阴性；(4)在甲型流感病毒H1N1亚型的(单体)HA(H1N1)的ELISA测试中，患者血清中示出1∶160或更高的滴定度。从上述志愿者收集大约100ml全血，且使用lymphoprepTM(Axis-Shield，挪威，1114545)从收集的血液中分离外周血的单核细胞(PBMC)。分离的PBMC用磷酸盐缓冲液洗涤三次，以2×107个细胞/ml悬浮在KM banker II冷冻介质(Cosmobio，日本，KOJ-16092010)中，且保存在液氮罐中。
实施例2：单克隆抗体的初级筛选
使用Jin等(Jin A.等，2009.Nat Med.15，1088-1092)描述的方法筛选分泌抗原-特异性抗体的B细胞。简而言之，将PBMC以1个细胞/孔的密度加入准备的微阵列芯片的每个孔中。通过预包被的抗-人IgG的抗体确认从单个细胞分泌的抗体。通过酶-连接的免疫斑测试(ELISPOT；Sedgwick J.D.，2005，Methods MolBiol.Vol.302，pp.314)使用已标记的HA抗原检验筛选出的分泌抗体的细胞是否分泌HA-结合的抗体。通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)获得来自单个分泌抗体的细胞的抗体的重链和轻链基因的完整序列。将获得的重链和轻链DNA插入pcDNA3.1(+)表达载体(Invitrogen，美国，V790-20)中以制备分别产生抗体的重链和轻链的表达载体。制备的表达载体被共转染进入CHO细胞。之后，使用源自被转染的CHO细胞的抗体，通过下面实施例3描述的HA-ELISA初步选择出结合至HA的82种抗体。这里，在没有梯度稀释(serially dilute)抗体样品的情况下初步筛选出表现出与HA反应的所有抗体。
实施例3：单克隆抗体的第二步筛选及单克隆抗体的产生
为了从82种初步筛选出的抗体中二次筛选与重组HA具有高结合亲和力的单克隆抗体，使用单体HA和三聚体HA进行HA-ELISA。来自甲型流感病毒(A/加利福尼亚/04/2009)的重组单体HA(11055-V08H)购买自北京义翘神州生物技术有限公司(中国)。购买的单体HA由包括位于C末端的10个多组氨酸残基的HA的细胞外结构域组成，且来源于被转染的人细胞。由IRR(流感试剂源，美国)提供重组的三聚体HA(FR-180)。来自H1N1(A/加利福尼亚/04/2009)的三聚体HA包括位于C末端的凝血酶剪切位点、三聚化结构域(折叠子(foldon))和六个组氨酸残基，且该三聚体HA使用杆状病毒系统制得。
使用HA和抗体通过ELISA测量抗体与HA抗原的反应性。具体地，首先将50μl各单体HA或三聚体HA(250ng/ml)包被在96孔微量滴定板(Nunc，丹麦，449824)的每个孔上。使用包含1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(Teknova，美国，D5120)封闭该板，然后，将3倍梯度稀释的抗体样品(起始浓度：1μg/ml)加入该板的每个孔中。接着，该板在室温下孵育1小时，然后用过氧化物酶标记的山羊抗人的γ抗体(Zymed，美国，62.8420)处理。在室温下孵育1小时后，该板与四甲基联苯胺(TMB；Sigma-Aldrich，美国，T0440)孵育，且通过加入1N的HCl终止孵育。使用酶标仪(plate reader)(Spectramaxplus 384，Molecular Device)测量在450/570nm处的吸光度，且使用Graphpad棱镜程序(GraphPad Software Inc.，美国)图解表示抗原-抗体的反应性。
如图1所示，CT109、CT111-1和CT154-2抗体示出针对三聚体HA的非常高的结合活性，且也示出针对单体HA的高结合活性，但低于针对三聚体HA的结合活性。
此外，CT104、CT102和CT123抗体示出针对三聚体HA的高结合活性，但示出针对单体HA的小的结合活性或没有结合活性(图2)。其它抗体(CT137、CT151和CT165抗体)示出针对这两种抗原的小的结合活性或没有结合活性(图3)。
基于图1～3所示的结果，从82种初步筛选的抗体中二次选择出针对三聚体HA示出高结合活性的35种抗体。为了定量单克隆抗体的结合活性且从而在MN试验中缩小单克隆抗体的数量，需要提高二次选择出的抗体的表达水平。因此，以下面的方式将这些抗体基因从cDNA载体再次克隆进入由Celltrion，Inc.构建且获得专利的MarEx表达载体中。再次克隆后，包含抗体基因的MarEx表达载体用于制备MN试验和HI试验所需的抗体。
使用限制性内切酶Nhe I和Pme I处理包含35种二次选择出的抗体的各重链基因和轻链基因的原pcDNA载体以分离重链基因和轻链基因。获得的重链基因和轻链基因被分别插入已用相同的限制性内切酶处理过的pCT145载体和pCT147载体中。为了构建重链和轻链表达载体，Celltrion，Inc.分别构建了pCT145载体和pCT147载体(图4)。接下来，为了构建同时包含重链转录单元(启动子-重链基因-多聚腺苷酸(pol A))和轻链转录单元(启动子-轻链基因-多聚腺苷酸)的表达载体，使用限制性内切酶Pac I和AscI处理包含重链基因的pCT145载体以分离重链转录单元，然后包含轻链基因的pCT147载体用相同的限制性内切酶处理，且将分离的重链转录单元插入其中。然后，使用限制性内切酶筛选同时包含重链转录单元和轻链转录单元的载体(图5)。使用Endofree质粒大提试剂盒(QIAGEN，德国，12362)提取筛选出的载体，且使用提取的DNA样品的一部分分析核苷酸序列，从而确定抗体的核苷酸序列。
接下来，将提取的抗体的DNA转染进入F2N细胞系(由Celltrion，Inc.构建，韩国)的悬浮细胞中，以瞬时产生的方式产生单克隆抗体。这里，以下面的方法进行转染。根据制造商的说明书，使用阳离子聚合物FreeStyleTM Max(Invitrogen，美国，16447-100)进行质粒DNA的细胞转染。在转染之前的一天，将培养在EX-CELL 293无血清培养基(SAFC，LIK，14571C；后面将被称为“EX-CELL 293培养基”)的F2N细胞离心，且以1×106个细胞/ml的细胞浓度悬浮在改性的EX-CELL 293培养基(SAFC，LIK，65237；定制的)中，且将80ml的细胞悬浮液接种在250ml的Erlenmeyer培养瓶中，或者将200ml的细胞悬浮液以200ml的量接种在1 1 Erlenmeyer培养瓶中。在转染的当天，在接种了80ml细胞悬浮液的情况下，使用OptiPRO SFM II培养基(Invitrogen，美国，12309)将编码单克隆抗体的每种DNA和100μl FreeStyleTM Max试剂稀释至1.6ml的体积，且温和摇动。在接种了200ml的细胞悬浮液的情况下，使用OptiPRO SFM II培养基将250μg的每种DNA和250μg FreeStyleTM Max试剂稀释至4ml的体积，且温和摇动。摇动步骤后立即将包含稀释在其中的FreeStyleTM Max试剂的溶液和与包含稀释在其中的DNA的溶液混合，且混合溶液在室温下孵育19分钟。在室温下孵育19分钟的过程中，使用新鲜的改性EX-CELL 293培养基将接种的F2N细胞稀释至0.8×106个细胞/ml的浓度。孵育19分钟后，将DNA和FreeStyleTM Max试剂的混合溶液加入为转染准备的F2N细胞培养物中。转染后的一天，将相同量的EX-CELL 293培养基加至被转染的细胞，然后将被转染的细胞培养7～8天，从而产生单克隆抗体。
实施例4：抗病毒的中和活性的体外检验
从35种单克隆抗体的筛选中，选择在HA-ELISA中示出对三聚体HA具有高结合亲和力的11种抗体，并对其进行MN试验，以检验他们针对各流感病毒的中和活性。
实施例4-1：MDCK细胞系的培养和病毒浓度的确定
作为Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞系，使用了London系(MDCK-L)。使用DMEM培养基(Gibco，美国，11965)将MDCK细胞系培养在37℃的5％CO2湿润的培养箱中，其中DMEM培养基包含10％的FBS(Atlas Biologicals，美国，F0500A)、1×青霉素(pecinillin)/链霉素(Gibco，美国，15140)、25mMHEPES(Gibco，美国，15630)和2mM L-谷氨酰胺(Gibco，美国，25030)。
通过ELISA定量病毒浓度以确定半数组织培养感染(TCID50)。通过以下方法进行病毒浓度的确定。首先，使用病毒稀释剂[DMEM(Gibco，美国)，3％BSA(Gibco，美国，15260)，1×青霉素/链霉素(Gibco，美国)，和25mM HEPES(Gibco，美国)]将病毒存储液梯度稀释10倍，且将100μl稀释的病毒加入96孔板的各孔中。使用不包含病毒的病毒稀释液作为阴性对照。然后，使用胰蛋白酶处理培养的MDCK细胞系，使MDCK细胞系从培养孵育器上分离，且然后使用MDCK培养基处理以中和胰蛋白酶。接下来，细胞团使用磷酸盐缓冲液洗涤两次，且然后使用病毒稀释剂将细胞团稀释至5×105个细胞/ml的细胞浓度。将3～4μg/ml的TPCK-胰蛋白酶(Sigma，美国)加入包含病毒的96孔板中，且然后立即将100μl的MDCK细胞系加入上述板的各孔，且在37℃的5％CO2湿润的培养箱中孵育20小时。孵育的板使用磷酸盐缓冲液洗涤一次，然后将200μl冷的丙酮∶磷酸盐缓冲液(PBS)(80∶20)加入上述板的各孔中。接下来，细胞被固定8分钟，且然后该96孔板在室温下干燥20分钟。将200μl磷酸盐缓冲液加入上述板的各孔中以将各孔洗涤两次。将使用包含1％BSA的磷酸盐缓冲液稀释2,000倍的100μl生物素化的抗-核蛋白(NP)的单克隆抗体加入板的各孔中，且在室温孵育1小时。将该板使用200μl/孔的磷酸盐缓冲液洗涤三次，且使用含1％BSA的磷酸盐缓冲液将链霉亲和素-HRP-缀合的抗体稀释20,000倍。然后，将100μl的抗体稀释液加入上述板的各孔中，且在常压下孵育1小时。在使用磷酸盐缓冲液将板洗涤四次后，将100μl OPD溶液(Sigma，美国，P8287)加入各孔中，且将板在室温下显影10分钟。使用50μl/孔的3MHCl处理该板以终止显色，且然后测量各孔的OD490。基于测得的OD490，使用Reed&Muench(The American 1938)的方法计算TCID50。
实施例4-2：MN测试
使用病毒稀释剂将各抗体稀释至10μg/ml的浓度。从该初始浓度开始，使用病毒稀释剂将抗体稀释液梯度稀释2倍，且将50μl稀释液加入96孔板的各孔中。此外，将50μl病毒以对应于100TCID50的浓度加入该板的各孔中，且在37℃的5％CO2湿润的培养箱中孵育1小时。接下来，将3～4μg/ml的TPCK-胰蛋白酶(Sigma，美国，T1426)加入各孔，且将100μl处理过的MDCK细胞加入各孔，且然后在37℃的5％CO2湿润的培养箱中孵育20小时。然后，根据与实施例4-1中描述的病毒定量方法相同的方法进行MN测试，从而确定各孔的OD490值。示出的OD490值高于仅引入细胞的孔的OD490值的孔被确定为感染病毒。在没有检测到病毒抗原的各抗体的OD490值中，将抗体的最低浓度(μg/ml)示于表1中，且抗体的较低浓度意味着较高的抗病毒的中和活性。
表1
[表1]
使用筛选出的抗体和各类型的病毒进行微量中和测试(MN测试)的结果
*单位：μg/ml
从抗H1、H2、H3和H5亚型流感病毒的11种候选抗体的MN测试的结果可看出，CT104在低浓度(0.313～0.625μg/ml)示出抗两种流行性H1N1亚型病毒(A/德克萨斯州/05/2009和A/纽约/18/2009)和两种季节性H1N1亚型病毒(A/所罗门群岛/3/2006和A/俄亥俄州/83)的中和活性，且CT104还分别在1.25μg/ml和0.625μg/ml的浓度下中和两种H5N1亚型病毒(A/越南/1203/04和A/安徽/1/05)。但是CT104抗体未示出抗H2N2亚型病毒(A/安阿伯市/6/60ca)和H3N2亚型病毒(A/威斯康星州/67/2005)的中和活性。CT123仅示出抗四种试验的H1N1亚型病毒的中和活性。特别地，CT120抗体示出抗四种H1N1亚型流感病毒、一种H2N2流感亚型(A/安阿伯市/6/60ca)和两种H5N1亚型流感病毒的高中和活性。但是，上述抗体未示出抗属于H3进化枝的H3N2亚型的中和活性。
测量具有抗病毒中和活性的三种筛选出的抗体的IC50值以用于比较，且测量结果示于下面的表2中。这里，IC50值为抗体示出抗病毒的最高中和活性的50％时的抗体浓度，且较低的IC50值意味着抗体较高的中和活性。
表2
[表2]
抗两种流行性H1N1病毒的C T104、CT120和CT123的中和活性的IC50值
注意：抗体浓度*是在表1中示出的中和抗体浓度。
如在上面的表2中可见，这三种抗体具有非常低的IC50值，从而具有抗表2中示出的两种病毒的高中和活性。
实施例5：检验抗体抑制由病毒引起的血球凝集反应的能力
将抗体在V型底的96孔板中梯度稀释2倍，且向抗体加入4倍HA单元的病毒，且与其混合。接下来，将该板在室温下孵育30分钟，然后将1％的鸟类红血球加入板的各孔中。确定血球凝集抑制的终点为没有观察到血球凝集反应的最低抗体浓度。
结果，所有试验的抗体即使在高浓度下(＞20μg/ml)也没有抑制两种流行性的H1N1亚型病毒(A/德克萨斯州/05/2009-RG15和A/纽约/18/2009-RG18)的血球凝集(表3)。
表3
[表3]
用于抗两种流行性的H1N1病毒的筛选出的抗体血球凝集抑制试验的结果
  抗体   A/德克萨斯州/05/2009-RG15   A/纽约/18/2009-RG18
  CT104   ＞20μg/ml   ＞20μg/ml
  CT105   ＞20μg/ml   ＞20μg/ml
  CT109   ＞20μg/ml   ＞20μg/ml
  CT111-1   ＞20μg/ml   ＞20μg/ml
  CT112-1   ＞20μg/ml   ＞20μg/ml
  CT113   ＞20μg/ml   ＞20μg/ml
  CT119   ＞20μg/ml   ＞20μg/ml
  CT120   ＞20μg/ml   ＞20μg/ml
  CT122-1   ＞20μg/ml   ＞20μg/ml
  CT123   ＞20μg/ml   ＞20μg/ml
实施例6：通过动物实验检验抗体对流感病毒感染的预防和治疗效果
实施例6-1：小鼠存活实验
为了检验在上述实施例中筛选出的CT104、CT120和CT123抗体具有抗小鼠中H1N1和H5N1亚型病毒的预防和治疗效果，进行以下实验。
由5只小鼠组成的各组通过鼻腔感染10×LD50的病毒。在病毒感染前24小时和病毒感染后48小时，通过腹腔内注射以小鼠的10mg/kg的量给予小鼠三种筛选出的抗体(C T104、CT120和CT123)和阴性对照抗体(CT-P6)的每一种。
实验结果示于图6中。如图6所示，当在感染10×LD50的H5N1亚型病毒(A/越南/1203/2004)前24小时将CT-104或CT-120注射入小鼠体内，所有的小鼠均存活；但当使用CT-123处理小鼠时，20％的小鼠在12天后死亡。在阴性对照抗体(CT-P6)的情况下，注射对照抗体的小鼠在7天后全部死亡(图6A)。当在病毒感染后2天注射抗体以检验抗体的治疗效果时，注射CT-104和CT-120的小鼠均存活达第14天(观察阶段的最后一天)，但注射阴性对照抗体(CT-P6)或CT-123的小鼠全部死亡(图6B)。
为了检验抗体的预防效果，在感染H1N1亚型病毒(A/加利福尼亚/07/2009)之前24小时注射抗体，注射CT-120和CT123的小鼠全部存活至第14天(观察阶段的最后一天)，且80％的注射CT-104的小鼠存活，但注射阴性对照抗体(CT-P6)的小鼠全部死亡(图6C)。
此外，在感染季节性H1N1亚型病毒(A/波多黎各/8/1934)之前24小时给予CT-104或CT-123的小鼠全部存活过观察阶段，且给予C T120的小鼠显示出80％的存活率，但注射阴性对照抗体(CT-P6抗体)的小鼠全部死亡(图6D)。
实施例6-2：雪貂实验
为了研究疗效，在雪貂动物模型上试验选择的CT-120，雪貂动物模型显示出与人抗流感病毒的相似的敏感性和症状。
除包括额外的4只雪貂以测量病毒感染的初始浓度的阴性对照组之外，每一试验组由9只雪貂组成。在适应环境后，雪貂经鼻腔内或气管内接种1ml(1×107EID50/ml)流感病毒(A/加利福尼亚/04/09(H1N1))。病毒接种后24小时时鼻腔内注射一次CT120：试验组1注射有15mg/kg的C T120；试验组2注射有30mg/kg的C T120。对于试验组3，每24小时注射30mg/kg的C T120，注射三天。对于阴性对照组，病毒接种后24小时时鼻腔内注射一次30mg/kg的CT-P6抗体。
病毒接种后的第1、3、5和8天从每一试验组的雪貂中收集各洗鼻液，且使用受精卵测量收集样品中的病毒浓度。病毒接种后的第1、3、5和8天牺牲每一试验组中的三只雪貂，且使用受精卵测量取出的肺组织中的病毒浓度。
在包含抗生素的PBS(每1g肺组织使用1ml)中使用匀浆器磨碎各肺组织，且然后在离心后移出上清液。
使用包含抗生素的1ml的PBS收集各洗鼻液，且然后离心后移出上清液以测量病毒浓度。肺组织匀浆液或洗鼻液的上清液经包含抗生素的PBS 10倍梯度稀释，且然后使用稀释的上清液接种10～13天龄的受精卵。来自48小时孵育的受精卵的尿囊液和相同体积的0.5％红血球(火鸡)的混合液孵育30分钟，且然后通过血液凝集反应滴定病毒。
虽然对照组中接种后直到第5天洗鼻液中的病毒滴定量一直保持高水平(＞log10 4EID0/ml)且然后降低，但在注射CT120的组中病毒滴定量显著下降，且在接种后第8天没有检测到病毒(图7)。因此，在C T120处理的组中观察到比对照组更快的病毒清除。特别是在第3试验组中，当初始3天每天注射抗体时更加显著地抑制了病毒。
对照组中激发免疫后直到第5天肺组织中的病毒滴定量一直保持高水平(＞log 4.5EID50/ml)且然后降低，但在注射CT120的组中病毒滴定量明显下降。在激发免疫后第8天没有检测到病毒(图8)。特别是雪貂实验示出在试验组2和3中更加显著地抑制了病毒。这些结果表明30mg/kg的CT120比15mg/kg的剂量更加有效地抑制了病毒增殖。

Claims (29)

1.一种抗甲型流感病毒的单克隆抗体，所述抗甲型流感病毒的单克隆抗体选自由以下单克隆抗体组成的组：
包括轻链和重链的单克隆抗体，该轻链包括：由SEQ ID NO:1的序列组成的CDR1区域、由SEQ ID NO:2的序列组成的CDR2区域和由SEQ ID NO:3的序列组成的CDR3区域，且该重链包括：由SEQ ID NO:4的序列组成的CDR1区域、由SEQ ID NO:5的序列组成的CDR2区域和由SEQ ID NO:6的序列组成的CDR3区域；
包括轻链和重链的单克隆抗体，该轻链包括：由SEQ ID NO:7的序列组成的CDR1区域、由SEQ ID NO:2的序列组成的CDR2区域和由SEQ ID NO:8的序列组成的CDR3区域，且该重链包括：由SEQ ID NO:9的序列组成的CDR1区域、由SEQ ID NO:10的序列组成的CDR2区域和由SEQ ID NO:11的序列组成的CDR3区域；以及
包括轻链和重链的单克隆抗体，该轻链包括：由SEQ ID NO:12的序列组成的CDR1区域、由SEQ ID NO:2的序列组成的CDR2区域和由SEQ ID NO:13的序列组成的CDR3区域，且该重链包括：由SEQ ID NO:14的序列组成的CDR1区域、由SEQ ID NO:15的序列组成的CDR2区域和由SEQ ID NO:16的序列组成的CDR3区域。
2.根据权利要求1所述的抗甲型流感病毒的单克隆抗体，其中所述抗甲型流感病毒的单克隆抗体包括：由SEQ ID NO:36的多肽序列组成的轻链，和由SEQ ID NO:37的多肽序列组成的重链。
3.根据权利要求2所述的抗甲型流感病毒的单克隆抗体，其中所述抗甲型流感病毒的单克隆抗体具有抗甲型流感病毒H1N1和H5N1亚型的中和活性。
4.根据权利要求1所述的抗甲型流感病毒的单克隆抗体，其中所述抗甲型流感病毒的单克隆抗体包括：由SEQ ID NO:40的序列组成的轻链，和由SEQ IDNO:41的序列组成的重链。
5.根据权利要求4所述的抗甲型流感病毒的单克隆抗体，其中所述抗甲型流感病毒的单克隆抗体具有抗甲型流感病毒H1N1、H2N2和H5N1亚型的中和活性。
6.根据权利要求1所述的抗甲型流感病毒的单克隆抗体，其中所述抗甲型流感病毒的单克隆抗体包括：由SEQ ID NO:44的多肽序列组成的轻链，和由SEQ ID NO:45的多肽序列组成的重链。
7.根据权利要求6所述的抗甲型流感病毒的单克隆抗体，其中所述抗甲型流感病毒的单克隆抗体具有抗甲型流感病毒H1N1亚型的中和活性。
8.一种抗甲型流感病毒的单克隆抗体，所述抗甲型流感病毒的单克隆抗体选自由以下单克隆抗体组成的组：
包括轻链和重链的单克隆抗体，该轻链包括：由SEQ ID NO:17的序列编码的多肽组成的CDR1区域、由SEQ ID NO:18的序列编码的多肽组成的CDR2区域和由SEQ ID NO:19的序列编码的多肽组成的CDR3区域，且该重链包括：由SEQ ID NO:20的序列编码的多肽组成的CDR1区域、由SEQ ID NO:21的序列编码的多肽组成的CDR2区域和由SEQ ID NO:22的序列编码的多肽组成的CDR3区域；
包括轻链和重链的单克隆抗体，该轻链包括：由SEQ ID NO:23的序列编码的多肽组成的CDR1区域、由SEQ ID NO:18的序列编码的多肽组成的CDR2区域和由SEQ ID NO:24的序列编码的多肽组成的CDR3区域，且该重链包括：由SEQ ID NO:25的序列编码的多肽组成的CDR1区域、由SEQ ID NO:26的序列编码的多肽组成的CDR2区域和由SEQ ID NO:27的序列编码的多肽组成的CDR3区域；以及
包括轻链和重链的单克隆抗体，该轻链包括：由SEQ ID NO:28的序列编码的多肽组成的CDR1区域、由SEQ ID NO:29的序列编码的多肽组成的CDR2区域和由SEQ ID NO:30的序列编码的多肽组成的CDR3区域，且该重链包括：由SEQ ID NO:31的序列编码的多肽组成的CDR1区域、由SEQ ID NO:32的序列编码的多肽组成的CDR2区域和由SEQ ID NO:33的序列编码的多肽组成的CDR3区域。
9.根据权利要求8所述的抗甲型流感病毒的单克隆抗体，其中所述抗甲型流感病毒的单克隆抗体包括：由SEQ ID NO:34的序列编码的多肽组成的轻链，和由SEQ ID NO:35的序列编码的多肽组成的重链。
10.根据权利要求9所述的抗甲型流感病毒的单克隆抗体，其中所述抗甲型流感病毒的单克隆抗体具有抗甲型流感病毒H1N1和H5N1亚型的中和活性。
11.根据权利要求8所述的抗甲型流感病毒的单克隆抗体，其中所述抗甲型流感病毒的单克隆抗体包括：由SEQ ID NO:38的序列编码的多肽组成的轻链，和由SEQ ID NO:39的序列编码的多肽组成的重链。
12.根据权利要求11所述的抗甲型流感病毒的单克隆抗体，其中所述抗甲型流感病毒的单克隆抗体具有抗甲型流感病毒H1N1、H2N2和H5N1亚型的中和活性。
13.根据权利要求8所述的抗甲型流感病毒的单克隆抗体，其中所述抗甲型流感病毒的单克隆抗体包括：由SEQ ID NO:42的序列编码的多肽组成的轻链，和由SEQ ID NO:43的序列编码的多肽组成的重链。
14.根据权利要求13所述的抗甲型流感病毒的单克隆抗体，其中所述抗甲型流感病毒的单克隆抗体具有抗甲型流感病毒H1N1亚型的中和活性。
15.一种编码根据权利要求1所述的抗甲型流感病毒的单克隆抗体的分离的核酸分子。
16.一种表达载体，在所述表达载体中插入有根据权利要求15所述的分离的核酸分子。
17.一种产生抗甲型流感病毒的单克隆抗体的细胞系，包含被转染到宿主细胞中的根据权利要求16所述的表达载体。
18.根据权利要求17所述的产生抗甲型流感病毒的单克隆抗体的细胞系，其中所述宿主细胞是选自由CHO细胞、F2N细胞和HEK293细胞组成的组中的一种。
19.一种组合物，包括根据权利要求1或8所述的抗甲型流感病毒的单克隆抗体。
20.一种用于预防和治疗由甲型流感病毒引起的疾病的组合物，所述组合物包括根据权利要求1或8所述的抗甲型流感病毒的单克隆抗体。
21.一种用于甲型流感病毒诊断的组合物，所述组合物包括缀合物，所述缀合物包含缀合至根据权利要求1或8所述的抗甲型流感病毒的单克隆抗体的标签。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述标签是选自由酶和放射性同位素组成的组中的一种。
23.根据权利要求1或8所述的抗甲型流感病毒的单克隆抗体在制备组合物中的应用，该组合物用于治疗由甲型流感病毒引起的疾病，其中所述甲型流感病毒具有选自由H1N1、H2N2和H5N1组成的组中的一种或多种亚型。
24.根据权利要求1或8所述的抗甲型流感病毒的单克隆抗体在制备组合物中的应用，该组合物用于预防由甲型流感病毒引起的疾病，其中所述甲型流感病毒具有选自由H1N1、H2N2和H5N1组成的组中的一种或多种亚型。
25.根据权利要求1或8所述的抗甲型流感病毒的单克隆抗体在制备试剂盒中的应用，该试剂盒用于诊断患者中甲型流感病毒感染，其中所述甲型流感病毒具有选自由H1N1、H2N2和H5N1组成的组中的一种或多种亚型。
26.根据权利要求21所述的用于甲型流感病毒诊断的组合物在制备试剂盒中的应用，该试剂盒用于诊断患者中甲型流感病毒感染，其中所述甲型流感病毒具有选自由H1N1、H2N2和H5N1组成的组中的一种或多种亚型。
27.一种用于甲型流感病毒诊断的试剂盒，包括：
1)根据权利要求1或8所述的抗甲型流感病毒的单克隆抗体；以及
2)容器。
28.一种用于甲型流感病毒诊断的试剂盒，包括：
1)根据权利要求21所述的用于甲型流感病毒诊断的组合物；以及
2)容器。
29.根据权利要求27或28所述的试剂盒，其中所述甲型流感病毒具有选自由H1N1、H2N2和H5N1组成的组中的一种或多种亚型。
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