ES2831802T3 - Composición que comprende al menos dos moléculas de unión neutralizantes del virus influenza A - Google Patents

Composición que comprende al menos dos moléculas de unión neutralizantes del virus influenza A Download PDF

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Sung Hwan Kim
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Jae Won Lee
So Jung Lee
Ji Young Shin
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Abstract

Una composición que comprende al menos dos moléculas de unión neutralizantes del virus influenza A que se unen a un epítopo en una región troncal de la proteína hemaglutinina (HA) del virus influenza A, comprendiendo la composición: i) una primera molécula de unión capaz de neutralizar al menos un subtipo del virus influenza A seleccionado entre el grupo que consiste en H1, H2, H5 y H9; y ii) una segunda molécula de unión capaz de neutralizar al menos un subtipo del virus influenza A seleccionado entre el grupo que consiste en H1, H3, H5, H7 y H9; en la que la primera molécula de unión comprende una región variable de cadena ligera que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 7, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 8 y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 9, y una región variable de cadena pesada que comprende, según el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 10, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 11 y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 12; y en la que la segunda molécula de unión comprende un polipéptido cualquiera seleccionado entre el grupo que consiste en i) un polipéptido que comprende una región variable de cadena ligera que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 19, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 20 y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 21, y una región variable de cadena pesada que comprende, según el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 22, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 23 y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 24; ii) un polipéptido que comprende una región variable de cadena ligera que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 25, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 26 y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 27, y una región variable de cadena pesada que comprende, según el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 28, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 29 y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 30; iii) un polipéptido que comprende una región variable de cadena ligera que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 31, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 32 y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 33, y una región variable de cadena pesada que comprende, según el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 34, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 35 y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 36; y iv) un polipéptido que comprende una región variable de cadena ligera que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 37, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 38 y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 39, y una región variable de cadena pesada que comprende, según el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 40, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 41 y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 42.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición que comprende al menos dos moléculas de unión neutralizantes del virus influenza A
rCampo técnico!
La presente invención se refiere a una composición que comprende al menos dos moléculas de unión neutralizantes del virus influenza A, y más en particular, a una composición que comprende al menos dos anticuerpos monoclonales humanos que tienen actividad neutralizante frente al virus influenza A, que son producidos por linfocitos B humanos derivados de sangre de pacientes que se han recuperado de la infección por el virus influenza A.
ITécnica antecedente!
La gripe, una enfermedad provocada por infección respiratoria de virus influenza, sucede habitualmente en invierno. Se sabe que tiene una infectividad muy alta y que afecta a todos los grupos de edad, en particular a gente de edad avanzada (Treanor J, 2004, N Engl J. Med. 350(3):218-20). Los virus influenza son virus con envoltura ARN (ácido ribonucleico) que pertenecen a la familia Orthomyxoviridae y que tienen un genoma compuesto de ocho segmentos de ARN (ácido ribonucleico) monocatenario de sentido negativo. Estos virus influenza se clasifican en los tipos A, B y C. Los virus influenza A se dividen además en subtipos basados en sus proteínas superficiales principales hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). Hasta la fecha, se han identificado 17 HA y 10 NA (Cheung TK y Poon LL 2007, Ann N Y Acad. Sci. 1102:1-25; Tong S, et al. 2012, Proc.Natl. Acad. Sci. E. U. A. 109:4269-4274). Los virus influenza pueden afectar a aves, cerdos y seres humanos dependiendo de sus tipos y tienen un genoma compuesto de segmentos de ARN y, por esta razón, sus genes pueden mutar continuamente y recombinarse, dando como resultado nuevas variaciones genéticas (Treanor J, 2004. N Engl J. Med. 350(3):218-20). Debido a esta mutación continua, es difícil obtener una inmunidad permanente frente a los virus influenza y, por tanto, un método preventivo que actualmente se piensa que es el más eficaz es un método de administración de una vacuna contra un tipo particular de virus influenza que se espera que prevalezca cada año para desarrollar inmunidad contra el virus influenza cada año.
Las vacunas contra el virus influenza que actualmente se administran cada año son vacunas trivalentes que contienen influenza A H1, H3 subtipo HA e influenza tipo B HA.
El documento WO 2010/010466 A2 desvela anticuerpos que se unen a hemaglutinina y neutralizan un subtipo del grupo 1 y un subtipo del grupo 2 del virus influenza A. Además, se describe un anticuerpo, que se une a un epítopo conservado en la región troncal de HA de los subtipos del virus influenza A del grupo 1 y del grupo 2.
El documento WO 2011/111966 A2 desvela anticuerpos CT102, CT120 y CT123 que muestran actividades de unión contra la HA trimérica y también contra la HA monomérica. Además, la composición preventiva y terapéutica descrita en ellos puede comprender anticuerpos monoclonales que se unen a los subtipos H1, H2 y H5 del virus influenza A o fragmentos de los mismos que muestren un efecto sinérgico sobre la actividad neutralizante.
El documento WO 2009/079259 A2 también desvela anticuerpos que neutralizan el virus influenza. Específicamente, uno monoclonal descrito en el mismo se une a un epítopo en la región troncal de HA, tal como el polipéptido HA1 o HA2. Además, se describe un método para prevenir una enfermedad o trastorno provocado por un virus influenza, en el que se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de dos o más anticuerpos específicos del virus influenza para el grupo I o para el grupo II. Adicionalmente, se desvela una composición que comprende uno o más de dichos anticuerpos.
El documento WO 2010/130636 A1 desvela anticuerpos que se unen al virus influenza que comprende HA del subtipo H3, en particular virus influenza H3N2. La composición farmacéutica descrita comprende al menos dos moléculas de unión neutralizantes del virus influenza, mediante las cuales al menos una molécula de unión es capaz de neutralizar los virus influenza que comprenden HA del subtipo H1 y/o H5 y al menos una molécula de unión es capaz de neutralizar los virus influenza que comprenden HA del subtipo H3, H7 y/o H10.
El documento WO 2011/117848 A1 desvela anticuerpos dirigidos contra el antígeno de hemaglutinina del virus influenza A y son capaces de unirse y de neutralizar una pluralidad de subtipos, por ejemplo los subtipos H1, H2, H3, H5 y H9, del virus influenza A.
El documento WO 2013/007770 A1 desvela moléculas de unión capaces de unirse específicamente a cepas del virus influenza A tanto del grupo filogenético 1 como el grupo 2 mediante unión a un epítopo en la región troncal de la proteína hemaglutinina que es compartida entre los subtipos del virus influenza A dentro del grupo filogenético 1 y el grupo 2.
El documento WO 2013/048153 A2 (EP 2762491 A2) desvela moléculas de unión que tienen actividad neutralizante del virus influenza A derivada de un linfocito B que se selecciona de la sangre de un paciente infectado con un virus influenza A. Esta molécula de unión es útil en el diagnóstico del virus influenza A.
Las vacunas contra los virus influenza se producen generalmente utilizando huevos, pero este método de producción es un método ineficaz y requiere mucho tiempo. En consecuencia, este método tiene el problema de que es difícil producir cantidades suficientes de vacunas cada año dentro de un marco de tiempo limitado. En un intento para resolver estos problemas, varias compañías farmacéuticas (GSK, Baxter, etc.) han realizado activamente estudios sobre métodos de producción de vacunas mediante cultivo celular. Además, si sucede una infección pandémica por virus influenza, es muy difícil desarrollar una vacuna contra la infección en poco tiempo. También, los fármacos antivíricos no son completamente fiables debido a un problema asociado a la aparición de virus mutantes resistentes a fármacos.
Para superar este problema, últimamente se han desarrollado activamente anticuerpos contra virus de influenza (Throsby et al, 2008, PloS One 3 (e3942); Sui et al., 2009, Nature structural & molecular biology. 16 (265-273); Simmons et al, 2007, PloS Medicine 4 (e178); Wrammert et al., 2011, J Exp Med. 208 (181-193); Corti et al., 2011, Science 333 (850-856)).
Se han utilizado productos sanguíneos de pacientes recuperados para tratar a pacientes infectados con diversos virus, así como para tratar infecciones pandémicas por influenza. Por ejemplo, cuando los pacientes infectados por el virus de la gripe española tuvieron síntomas de neumonía, los productos sanguíneos recogidos de pacientes que se habían recuperado de la infección con el virus influenza se utilizaron para tratar el virus influenza (Luke et al., 2006. Annals of internal medicine. 145:599). Como tal, se purifica globulina hiperinmune (Iglv) de plasma humano y se utiliza para tratar a pacientes infectados con diversos virus, pero el producto obtenido como se ha descrito anteriormente puede no ser seguro debido a potenciales agentes infecciosos en la sangre y es ineficaz para su producción en masa.
Los anticuerpos contra el virus influenza A mostraron actividad neutralizante contra diversos subtipos de influenza. En particular, un anticuerpo desvelado en la solicitud de patente coreana N.° 10-2011-0020061 (número de publicación KR20110102198) mostró actividad neutralizante, principalmente contra el grupo filogenético 1 (H1, H2, H5 y H9), y un anticuerpo desvelado en la solicitud de patente coreana 10-2012-0107512 (número de publicación KR20130035916) mostró actividad neutralizante, principalmente contra el grupo filogenético 2 (H3 y H7). En consecuencia, los inventores de la presente invención han realizado estudios para desarrollar una formulación de combinación que contenga al menos dos clases de anticuerpos, que pueda mostrar efectos preventivos y terapéuticos contra todos los virus que pertenecen a los grupos 1 y 2, que probablemente sean pandémicos.
D ivulgación!
P roblem a técnico!
Es un objeto de la presente invención proporcionar una composición que comprende al menos dos moléculas de unión neutralizantes del virus influenza A, mostrando la composición actividad neutralizante tanto contra el grupo filogenético 1 como el grupo filogenético 2. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición para su uso en el diagnóstico, prevención o tratamiento de una enfermedad provocada por el virus influenza A mediante la administración de la composición.
Otro objeto más de la presente invención es proporcionar un método de diagnóstico de infección por el virus influenza A usando la composición.
Otro objeto adicional de la presente invención es proporcionar un kit para el diagnóstico del virus influenza A, que comprende la composición.
rSolución técnica!
Para conseguir los objetivos anteriores, la presente invención proporciona una composición que comprende al menos dos moléculas de unión neutralizantes del virus influenza A que se unen a un epítopo en la región troncal de la proteína hemaglutinina (HA) del virus influenza A, comprendiendo la composición:
i) una primera molécula de unión capaz de neutralizar al menos un subtipo del virus influenza A seleccionado entre el grupo que consiste en H1, H2, h 5 y H9; y
ii) una segunda molécula de unión capaz de neutralizar al menos un subtipo del virus influenza A seleccionado entre el grupo que consiste en H1, H3, H5, H7 y H9.
El epítopo de la primera molécula de unión puede comprender restos de aminoácidos en las posiciones 18, 38, 40, 291,292 y 318 de un polipéptido HA1. Además, el epítopo de la primera molécula de unión puede comprender restos de aminoácidos en las posiciones 18, 19, 20, 21, 41,42, 45, 48, 49, 52 y 53 de un polipéptido HA2.
El epítopo de la primera molécula de unión puede comprender restos de aminoácidos en las posiciones 18, 38, 40, 291, 292 y 318 del polipéptido HA1, y puede comprender restos de aminoácidos en las posiciones 18, 19, 20, 21, 41, 42, 45, 48, 49, 52 y 53 del polipéptido HA2.
El epítopo de la segunda molécula de unión puede comprender restos de aminoácidos en las posiciones 278 y 318 del polipéptido HA1. Además, el epítopo de la segunda molécula de unión puede comprender restos de aminoácidos en las posiciones 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52 y 53 del polipéptido HA2. Adicionalmente, el epítopo de la segunda molécula de unión puede comprender restos de aminoácidos en las posiciones del polipéptido HA1 y/o polipéptido HA2 de un primer monómero de HA, y puede comprender además restos de aminoácidos en las posiciones 25, 32 y 33 del polipéptido HA1 de un segundo monómero adyacente al primer monómero.
El epítopo de la segunda molécula de unión puede comprender restos de aminoácidos en las posiciones 278 y 318 del polipéptido HA1, y puede comprender además restos de aminoácidos en las posiciones 38, 39, 41,42, 45, 48, 49, 52 y 53 del polipéptido HA2. El epítopo de la segunda molécula de unión puede comprender restos de aminoácidos en las posiciones del polipéptido HA1 y el polipéptido HA2 del primer monómero de HA, y puede comprender además restos de aminoácidos en las posiciones 25, 32 y 33 del polipéptido HA1 del segundo monómero adyacente al primer monómero.
El epítopo de la segunda molécula de unión puede comprender restos de aminoácidos en las posiciones 278 y 318 del polipéptido HA1, y puede comprender restos de aminoácidos en las posiciones 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52, 53, 58 y 99 del polipéptido HA2. El epítopo de la segunda molécula de unión puede comprender restos de aminoácidos en las posiciones del polipéptido HA1 y el polipéptido HA2 del primer monómero de hA, y puede comprender además restos de aminoácidos en las posiciones 25, 27, 32 y 33 del polipéptido HA1 del segundo monómero adyacente al primer monómero.
El epítopo de la segunda molécula de unión puede comprender restos de aminoácidos en las posiciones 54, 55, 278, 291 y 318 del polipéptido HA1, y puede comprender restos de aminoácidos en las posiciones 19, 20, 21, 38, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 52, 53, 56, 57 y 60 del polipéptido HA2. El epítopo de la segunda molécula de unión puede comprender restos de aminoácidos en las posiciones del polipéptido hA 1 y el polipéptido HA2 del primer monómero de HA, y puede comprender además restos de aminoácidos en las posiciones 25, 32, 33, 310, 311 y 312 del polipéptido HA1 del segundo monómero de HA adyacente al primer monómero de HA.
La numeración de las posiciones de aminoácidos del epítopo se basa en la numeración H3 HA.
Las moléculas de unión de la presente invención pueden inhibir la fusión del virus a la membrana de la célula diana. Además, las moléculas de unión de la presente invención pueden inhibir el virus mediante las funciones de Fc del anticuerpo, es decir, ADCC y CDC.
La primera molécula de unión de acuerdo con la presente invención es capaz de unirse al virus influenza A o un fragmento del mismo con una afinidad de unión (Kd) de menos de 1,0*10 -8 M, preferiblemente menos de 1,0*10 -9 M, más preferiblemente menos de 1,0*10-1° M, incluso más preferiblemente menos de 1,0*10-11 M, lo más preferiblemente menos de 1,0*10-12 M.
La segunda molécula de unión de acuerdo con la presente invención es capaz de unirse al virus influenza A o un fragmento del mismo con una afinidad de unión (Kd) de menos de 1,0*10 -6 M, preferiblemente menos de 1,0*10-7 M, más preferiblemente menos de 1,0*10- 8 M, incluso más preferiblemente 1,0*10- 9 M, incluso más preferiblemente menos de 1,0x10-10 M, aun más preferiblemente menos de 1,0x10-11 M, lo más preferiblemente menos de 1,0*10-12 M.
La afinidad de unión (Kd) puede medirse mediante resonancia de plasmón superficial usando, por ejemplo, un sistema BIACORE.
En una realización de la presente invención, la primera molécula de unión puede tener un valor de CE50 de 2,0 ug/ml o menos para el subtipo H1, 7,0 ug/ml o menos para el subtipo H2, 7,0 ug/ml o menos para el subtipo H5 o 4,0 ug/ml o menos para el subtipo H9.
En una realización de la presente invención, la segunda molécula de unión puede tener un valor de CE50 de 40,0 ug/ml o menos para el subtipo H3, 212,0 ug/ml o menos para el subtipo H5, 8,0 ug/ml o menos para el subtipo H7 u 8,0 ug/ml o menos para el subtipo H9.
En una realización de la presente invención, la composición puede tener un valor de CE50 para 3,0 ug/ml o menos para el subtipo H1, 13,0 ug/ml o menos para el subtipo H2, 70,0 ug/ml o menos para el subtipo H3, 9,0 ug/ml o menos para el subtipo H5, 14,0 ug/ml o menos para el subtipo H7 o 6,0 ug/ml o menos para el subtipo H9.
El valor de CE50 puede medirse mediante un ensayo de microneutralización.
De acuerdo con la presente invención, la primera molécula de unión comprende: una región variable de cadena ligera que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 7, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 8, y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 9; y una región variable de cadena pesada que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 10, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 11, y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 12.
De acuerdo con la presente invención, la segunda molécula de unión comprende un polipéptido cualquiera seleccionado entre el grupo que consiste en:
i) un polipéptido que comprende: una región variable de cadena ligera que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 19, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 20, y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 21; y una región variable de cadena pesada que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 22, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 23, y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 24;
ii) un polipéptido que comprende: una región variable de cadena ligera que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 25, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 26, y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 27; y una región variable de cadena pesada que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 28, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 29, y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 30;
iii) un polipéptido que comprende: una región variable de cadena ligera que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 31, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 32, y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 33; y una región variable de cadena pesada que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 34, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 35, y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 36; y
iv) un polipéptido que comprende: una región variable de cadena ligera que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 37, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 38, y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 39; y una región variable de cadena pesada que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 40, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 41, y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 42.
En una realización de la presente invención, la primera molécula de unión comprende: una región variable de cadena ligera que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 7, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 8, y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 9; y una región variable de cadena pesada que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 10, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 11, y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 12, y la segunda molécula de unión comprende: una región variable de cadena ligera que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 25, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 26, y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 27; y una región variable de cadena pesada que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 28, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 29, y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 30.
En la presente invención, las regiones determinantes de la complementariedad (CRD) de dominios variables se determinaron usando un método convencional de acuerdo con el sistema diseñado por Kabat et al. (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th), National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). La numeración de las CDR usadas en la presente invención se realizó de acuerdo con el método de Kabat, pero la presente invención también abarca moléculas de unión que comprenden CDR determinadas por otros métodos, incluyendo el método IMGT, el método de Chothia y el método AbM.
En una realización de la presente invención, la primera molécula de unión comprende una cadena ligera que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 45 y una cadena pesada que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 46.
En una realización de la presente invención, la segunda molécula de unión comprende un polipéptido cualquiera seleccionado entre el grupo que consiste en:
un polipéptido que comprende una cadena ligera que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 49, y una cadena pesada que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 50;
un polipéptido que comprende una cadena ligera que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 51, y una cadena pesada que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 52;
un polipéptido que comprende una cadena ligera que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 53, y una cadena pesada que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 54;
un polipéptido que comprende una cadena ligera que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 55, y una cadena pesada que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 56.
En una realización de la presente invención, la primera molécula de unión comprende un polipéptido que comprende una cadena ligera que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 45, y una cadena pesada que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 46, y la segunda molécula de unión comprende una cadena ligera que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 51, y una cadena pesada que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 52.
La molécula de unión es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. El anticuerpo puede tener un fármaco unido al mismo.
En una realización de la presente invención, la composición puede ser para su uso en la prevención o tratamiento una enfermedad provocada por el virus influenza A.
En una realización de la presente invención, la composición puede ser para el diagnóstico de una enfermedad provocada por el virus influenza A.
La composición puede comprender un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En una realización de la presente invención, la composición puede estar en forma de una solución inyectable estéril, una formulación liofilizada, una solución de jeringa precargada, una forma farmacéutica oral, una formulación para uso externo o un supositorio, pero no se limita a las mismas.
La presente invención también proporciona una composición para su uso en el tratamiento de una enfermedad provocada por el virus influenza A, en la que el uso de la composición comprende una etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición a un sujeto que tiene la enfermedad.
La presente invención también proporciona una composición para su uso en el diagnóstico, prevención o tratamiento de una enfermedad provocada por el virus influenza A, en la que el uso de la composición comprende: la etapa de i) administrar cantidades terapéuticamente eficaces de la primera molécula de unión y la segunda molécula de unión al mismo tiempo a un sujeto que tiene la enfermedad; o la etapa ii) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la primera molécula de unión a un sujeto que tiene la enfermedad y después administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la segunda molécula de unión al sujeto; o la etapa iii) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la segunda molécula de unión a un sujeto que tiene la enfermedad y después administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la primera molécula de unión al sujeto.
En una realización, la presente invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento de una enfermedad provocada por el virus influenza A, comprendiendo el método las etapas de: i) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la primera molécula de unión a un sujeto que tiene la enfermedad; y ii) posteriormente a la etapa i), administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la segunda molécula de unión al sujeto.
En otra realización, la presente invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento de una enfermedad provocada por el virus influenza A, comprendiendo el método las etapas de: i) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la segunda molécula de unión a un sujeto que tiene la enfermedad; y ii) posteriormente a la etapa i), administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la primera molécula de unión al sujeto.
En una realización de la presente invención, la composición para su uso en el diagnóstico, prevención o tratamiento de la enfermedad puede comprender además una etapa de administrar un fármaco antivírico, un inhibidor de la entrada del virus o un inhibidor de la adhesión del virus. El fármaco antivírico puede ser un inhibidor de neuraminidasa, un inhibidor de hemaglutinina (HA), un inhibidor de ácido siálico, un inhibidor del canal iónico M2 o un inhibidor de ARN polimerasa, pero no se limita a los mismos.
En una realización, el inhibidor de neuraminidasa puede ser Peramivir, Zanamivir, Oseltamivir o Laninamivir, pero no se limita a los mismos.
En otra realización, el inhibidor del canal iónico M2 puede ser amantadina o rimantadina, pero no se limita a los mismos y
el inhibidor de ARN polimerasa puede ser Favipiravir, pero no se limita al mismo.
La presente invención también proporciona una composición para su uso en la prevención de una enfermedad provocada por el virus influenza A, en la que el uso de la composición comprende una etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición a un sujeto que tiene la enfermedad.
En una realización, la presente invención proporciona una composición para su uso en la prevención de una enfermedad provocada por el virus influenza A, comprendiendo el método las etapas de: i) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la primera molécula de unión a un sujeto que tiene la enfermedad; y ii) una cantidad terapéuticamente eficaz de la segunda molécula de unión al sujeto.
En otra realización, la presente invención proporciona una composición para su uso en la prevención de una enfermedad provocada por el virus influenza A, comprendiendo el método las etapas de: i) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la segunda molécula de unión a un sujeto que tiene la enfermedad; y ii) una cantidad terapéuticamente eficaz de la primera molécula de unión al sujeto.
La presente invención también proporciona un método de diagnóstico de la infección por virus influenza A en un paciente, comprendiendo el método las etapas de: i) poner en contacto la composición con una muestra; y ii) detectar una reacción entre la composición y la muestra.
La presente invención también proporciona un kit para el diagnóstico del virus influenza A, comprendiendo el kit: i) la composición para el diagnóstico del virus influenza; y ii) un recipiente.
rEfectos ventajosos!
La composición de la presente invención, que comprende al menos dos moléculas de unión neutralizantes del virus influenza A, mantiene las actividades neutralizantes de las moléculas de unión contra los subtipos respectivos sin interferencia entre las moléculas de unión y, como resultado, muestra efectos aditivos. La composición de la presente invención muestra efectos sinérgicos incluso cuando se administra en combinación con un compuesto químico. La composición de la presente invención puede neutralizar eficazmente múltiples subtipos de influenza de ambos grupos filogenéticos 1 y 2 y puede usarse en combinación con un compuesto químico, y por tanto es muy útil para la prevención y tratamiento de una enfermedad provocada por el virus influenza.
[Descripción de los dibujos!
La FIG. 1 es un gráfico que muestra las afinidades de unión de los anticuerpos CT104, CT120 y CT123 por la hemaglutinina monomérica (denominada en lo sucesivo en el presente documento como "HA") y HA trimérica. La FIG. 2 es un gráfico que muestra las afinidades de unión de los anticuerpos CT147, CT149, CT164 y CT166 para una subunidad de HA monomérica (HA1) y una HA trimérica.
La FIG. 3 ilustra mapas de los vectores pCT145 (A) y pCT147 (B):
A: vector pCT145;
B: vector pCT147;
pac: gen que codifica una N-acetil-transferasa de puromicina (PAC); y
DS: secuencia de simetría de la diada (EBNA1 se une al elemento de simetría de la diada (DS) en oriP).
La FIG. 4 es un mapa de un vector de expresión que expresa un anticuerpo monoclonal contra el virus influenza A de la presente invención.
Las FIG. 5a a 5d muestran los resultados de verificar las capacidades de los anticuerpos CT120 y CT149 para inhibir la fusión a membrana inducida por HA expuesta a un pH bajo, usando una línea celular que expresa el subtipo H1(H1N1), H2 (H2N2), H3(H3N2) o H5(H5N1) de HA.
La FIG. 6a muestra los resultados de un ensayo ADCC in vitro realizado utilizando los anticuerpos CT120 y CT149 de la presente invención y la FIG. 6b muestra los resultados de un ensayo CDC in vitro realizado utilizando los anticuerpos CT120 y CT149 de la presente invención.
La FIG. 7 muestra los resultados de un ensayo en animales realizado utilizando un anticuerpo CT149 que tiene un Fc de ratón.
La FIG. 8a representa una secuencia de aminoácidos y una vista esquemática, que muestra el sitio de unión a la HA del virus A/Vietnam/1203/04 (H5N1) de un anticuerpo CT120, y las FIG. 8b y 8c representan secuencias de aminoácidos y vistas esquemáticas, que muestran los sitios de unión a la proteína HA de A/Aichi/1968 (H3N2) y A/Anhui/1/2013(H7N9) HA de un anticuerpo CT149, respectivamente.
La FIG. 9 es un gráfico que muestra los resultados de verificar las afinidades de unión de los anticuerpos (CT120, CT149 y una mezcla de anticuerpos de a CT120 y CT149) por HA mediante un ensayo CELISA utilizando una línea celular que expresa el subtipo H1(H1N1), H3(H3N2) o H5(H5N1) de HA.
La FIG. 10 muestra los resultados de un ensayo en animales realizado administrando los anticuerpos CT120 y CT149 solos o en combinación a ratones para confirmar los efectos preventivos y terapéuticos de los anticuerpos contra H1N1.
La FIG. 11 muestra los resultados de un ensayo en animales realizado administrando los anticuerpos CT120 y CT149 solos o en combinación a ratones para confirmar los efectos preventivos y terapéuticos de los anticuerpos contra H3N2.
La FIG. 12 muestra los resultados de un ensayo en animales realizado administrando los anticuerpos CT120 y CT149 solos o en combinación a ratones para confirmar los efectos preventivos y terapéuticos de los anticuerpos contra H5N1.
La FIG. 13 muestra los resultados de un ensayo en animales realizando administrando un anticuerpo CT149 a ratones para confirmar los efectos preventivos y terapéuticos del anticuerpo contra H7N9.
La FIG. 14 muestra los resultados de observar el cambio la tasa de mortalidad de ratones después de haber administrado Peramivir y un anticuerpo contra el virus H1N1 o el virus H3N2 solos o en combinación a concentraciones no óptimas.
La FIG. 15 muestra los resultados de un ensayo de MN sobre un anticuerpo CT149 y una mezcla de anticuerpos de CT120 y CT149 contra H7N9 (A/Anhui/l/2013, A/Shanghai/2/2013).
La FIG. 16a muestra los resultados de un ensayo de MN en un anticuerpo CT149 y un anticuerpo mixto de CT120 y CT149 contra H7N9 (A/Shanghai/2/2013) de tipo silvestre, y la FIG. 16b muestra los resultados de un ensayo de MN en un anticuerpo CT149 y una mezcla de anticuerpos de CT120 y CT149 contra H7N9 resistente a NAI (A/Shanghai/2/2013) R292K.
La FIG. 17a muestra los resultados de un ensayo de MN en un anticuerpo CT120 y una mezcla de anticuerpos de CT120 y CT149 contra H1N1 (A/California/04/2009) de tipo silvestre, y la FIG. 17b muestra los resultados de un ensayo de MN en un anticuerpo CT120 y una mezcla de anticuerpos de CT120 y CT149 contra H1N1 resistente a NAI (A/California/04/2009) H275Y.
La FIG. 18a muestra los resultados de tinción immunofluorescente de anticuerpos CT120 y CT149 contra A/Wisconsin/67/05 (H3N2) de tipo silvestre y un HA D19N mutante, y la FIG. 18b muestra los resultados de tinción immunofluorescente de anticuerpos CT120 y CT149 contra A/Anhui/1/2013 (H7N9) de tipo silvestre y un HA D19N mutante.
rMeior Modo!
En lo sucesivo en el presente documento, los términos usados en la presente invención se definirán de la siguiente manera.
La expresión "virus influenza A" como se usa en el presente documento se refiere a virus con envoltura que pertenecen a la familia Orthomyxoviridae y que tienen un genoma compuesto de ocho segmentos de ARN monocatenario (ácido ribonucleico) de sentido negativo. Estos virus influenza se clasifican en los tipos A, B y C, y los virus influenza A se dividen además en subtipos basados en sus proteínas superficiales principales hA (hemaglutinina) y NA (neuraminidasa). Hasta la fecha, se han notificado 17 HA y 10 NA.
Los "subtipos H1" descritos en la presente invención incluyen H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8, H1N9 y H1N10.
Los "subtipos H2" descritos en la presente invención incluyen H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N6, H2N7, H2N8, H2N9 y H2N10.
Los "subtipos H5" descritos en la presente invención incluyen H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8, H5N9 y H5N10.
Los "subtipos H9" descritos en la presente invención incluyen H9N1, H9N2, H9N3, H9N4, H9N5, H9N6, H9N7, H9N8, H9N9 y H9N10.
Los "subtipos H3" descritos en la presente invención incluyen H3N1, H3N2, H3N3, H3N4, H3N5, H3N6, H3N7, H3N8, H3N9 y H3N10.
Los "subtipos H7" descritos en la presente invención incluyen H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N5, H7N6, H7N7, H7N8, H7N9 y H7N10.
Como se usa en el presente documento, el término "hemaglutinina" (denominado en lo sucesivo en el presente documento como "HA") indica la glicoproteína de envoltura del virus influenza. HA media en la absorción y penetración del virus influenza en una célula hospedadora. Hasta la fecha, se han notificado 17 subtipos de HA.
Como se usa en el presente documento, la expresión "molécula de unión" se refiere a una inmunoglobulina intacta que comprende anticuerpos monoclonales, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos, humanizados o humanos, o a un dominio variable, una enzima de unión a sustrato, un receptor o una proteína, que comprende un fragmento de inmunoglobulina que compite con la inmunoglobulina intacta por la unión específica al compañero de unión de la inmunoglobulina, por ejemplo, la HA monomérica o la HA trimérica del virus influenza A. Independientemente de la estructura, el fragmento de unión a antígeno se une con el mismo antígeno que es reconocido por la inmunoglobulina intacta. Un fragmento de unión a antígeno puede comprender un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en al menos 2, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200 o 250 restos de aminoácidos continuos de la secuencia de aminoácidos de la molécula de unión. Los "fragmentos de unión a antígeno" incluyen, entre otros, los fragmentos Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, región determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios bivalentes, anticuerpos de fagos monocatenarios, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, polipéptidos que contienen al menos un fragmento de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir una unión específica a antígeno al polipéptido, etc. Los fragmentos anteriores pueden producirse sintéticamente o mediante escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas o pueden modificarse por ingeniería genética por técnicas de ADN recombinante. Los métodos de producción son bien conocidos en la técnica.
Como se usa en el presente documento, la expresión "excipiente farmacéuticamente aceptable" significa cualquier sustancia inerte que se combina con una molécula activa, tal como un fármaco, agente o molécula de unión para preparar una forma farmacéutica agradable o conveniente. El excipiente farmacéuticamente aceptable es un excipiente que es no tóxico para los destinatarios en las dosis y concentraciones usadas y es compatible con otros ingredientes de la formulación que comprende el fármaco, agente o molécula de unión.
Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de la molécula de unión que es eficaz para prevenir o tratar una afección resultante de la infección con el virus influenza A.
La composición que comprende las moléculas de unión de acuerdo con la presente invención pueden formularse como formas farmacéuticas orales, incluyendo formulaciones en polvos, gránulos, comprimidos, cápsulas, suspensiones, emulsiones, jarabes y aerosoles, así como formulaciones para uso externo, supositorios, soluciones inyectables estériles, solución en jeringa precargada o formulaciones liofilizadas. Específicamente, la composición de la presente invención puede formularse con diluyentes o excipientes utilizados comúnmente, tales como cargas, diluyentes, aglutinantes, agentes humectantes, disgregantes, tensioactivos, etc. Las formulaciones sólidas para administración oral incluyen comprimidos, píldoras, polvos, gránulos, cápsulas y similares, y dichas formulaciones sólidas comprenden, además de la composición, al menos un excipiente, por ejemplo, almidón, carbonato cálcico, sacarosa, lactosa o gelatina. Además de excipientes simples, también pueden utilizarse lubricantes, tales como estearato de magnesio o talco. Las formulaciones líquidas para administración oral incluyen suspensiones, soluciones, emulsiones y jarabe, y pueden contener diversos excipientes, por ejemplo, agentes humectantes, agentes saborizantes, aromáticos y conservantes, además de agua y parafina líquida, que se utilizan habitualmente en diluyentes simples. Las formulaciones para administración parenteral incluyen soluciones acuosas esterilizadas, soluciones no acuosas, suspensiones, emulsiones, preparaciones criodesecadas y supositorios. Como disolventes no acuosos o agentes de suspensión, pueden usarse propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, ésteres inyectables, tales como oleato de etilo y similares. Como base de los supositorios, pueden usarse Witepsol, Macrogol, Tween 61, manteca de cacao, grasa laurina, glicerogelatina y similares.
Las moléculas de unión que se usan en la composición de diagnóstico de la presente invención se marcan preferiblemente de un modo detectable. Hay disponible una diversidad de técnicas para marcar biomoléculas, son bien conocidas para la persona experta en la técnica y se considera que están dentro del ámbito de la presente invención. Dichas técnicas se describen, por ejemplo, en Tijssen, 'Practice and theory of enzyme immuno assays', Burden, RH y von Knippenburg (Eds), Volumen 15 (1985), 'Basic methods in molecular biology'; Davis LG, Dibmer MD; Battey Elsevier (1990), Mayer et al., (Eds) 'Immunochemical methods in cell and molecular biology' Academic Press, London (1987), Methods in Enzymology', Academic Press, Inc.
Hay muchos marcadores diferentes y los métodos de marcado son conocidos para aquellos con una habilidad habitual en la técnica. Los marcadores utilizados comúnmente comprenden, entre otros, fluorocromos (como fluoresceína, rodamina, rojo Texas, etc.), enzimas (como peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, fosfatasa alcalina), isótopos radiactivos (como 32P o 125I), biotina, digoxigenina, metales coloides, compuestos quimio o bioluminiscentes (como dioxetanos, luminol o acridinios). En la técnica se conocen bien los procedimientos de marcado, tales como acoplamiento covalente de enzimas de grupos biotinilo, yodaciones, fosforilaciones, biotinilaciones, etc.
Los métodos de detección incluyen, pero sin limitación, autorradiografía, microscopio de fluorescencia, reacciones enzimáticas directas e indirectas, etc. Los ensayos de detección utilizados comúnmente incluyen métodos radioisotópicos o no radioisotópicos. Estos incluyen, entre otros, RIA (ensayo radioisotópico) e IRMA (ensayo inmunológico radioinmunométrico), EIA (inmunoensayo enzimático), ELISA (ensayo inmunológico ligado a enzimas), FIA (inmunoensayo de fluorescencia) y CLIA (inmunoensayo de quimioluminiscencia).
El anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede usarse en forma de conjugados de anticuerpo y fármaco. El uso de conjugados de anticuerpo y fármaco (ADC), es decir, immunoconjugados, para la liberación local de fármacos de fármacos, permite la liberación dirigida del resto de fármaco a las células infectadas, puesto que la administración de agentes farmacológicos no conjugados pueda dar como resultado niveles inaceptables de toxicidad para células normales. La eficacia máxima y toxicidad mínima de ADC pueden conseguirse aumentando la selectividad de anticuerpos policlonales y monoclonales (mAbs) así como propiedades de unión a fármaco y de liberación de fármaco.
Los medios convencionales de acoplamiento, es decir, unir a través de enlaces covalentes un resto de fármaco a un anticuerpo, conducen generalmente a una mezcla heterogénea de moléculas donde los restos de fármaco se acoplan en una diversidad de sitios en el anticuerpo. Por ejemplo, los fármacos citotóxicos se han conjugado típicamente con anticuerpos a través de los a menudo numerosos residuos de lisina de un anticuerpo, generando de este modo una mezcla de conjugado de anticuerpo y fármaco. Dependiendo de las condiciones de reacción, la mezcla heterogénea contiene típicamente una distribución de anticuerpos con de 0 a aproximadamente 8 o más, unidos a restos de fármaco. Además, cada subgrupo de conjugados con una proporción de número entero particular de restos de fármaco con respecto a anticuerpo es una mezcla potencialmente heterogénea donde el resto de fármaco está acoplado a diversos sitios en el anticuerpo. Los anticuerpos son biomoléculas grandes, complejas y estructuralmente diversas, a menudo con muchos grupos funcionales reactivos. Sus reactividades con reactivos enlazadores e intermedios de fármaco y enlazador dependen de factores, tales como el pH, la concentración, la concentración de sal y los codisolventes.
En la presente invención, las reactividades de una composición de mezcla, obtenida mezclando los anticuerpos solicitados para la protección de patente (solicitud de patente coreana n.° 10-2011-0020061 (número de publicación KR20110102198) y la solicitud de patente coreana n.° 10-2012-0107512) (número de publicación KR20130035916), con los subtipos de virus del grupo filogenético 1 o 2, se midieron mediante un ensayo de microneutralización (denominado en lo sucesivo en el presente documento como "ensayo de MN"). Entre ellos, CT120 que tiene una actividad neutralizante específica contra el grupo 1 se mezcló con CT149 que muestra actividad neutralizante contra algunos virus del grupo 1 y los virus del grupo 2, y se analizaron las afinidades de unión y actividades de neutralización de CT120 y CT149 antes y después del mezclado.
Las afinidades de unión de anticuerpos se midieron por un método basado en resonancia de plasmón superficial y un ensayo CELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas celulares) empleando una línea celular que expresa H1, H3 o H5. Como resultado, CT120 y CT149 se unieron a las líneas celulares que expresan hA de H1 y H5, respectivamente, y una mezcla de CT120 y CT149 mostraron una afinidad de unión similar a la de cada uno de CT120 y CT149. CT149 mostró afinidad de unión en un ensayo CELISA realizado utilizando una línea celular que expresa HA de H3, pero CT120 no mostró afinidad de unión. Cuando se analizó una mezcla de CT120 y CT149 mediante un ensayo CELISA, se descubrió que CT120 no interfirió con la unión de CT149.
Se midieron las actividades neutralizantes de CT120 y CT149 antes y después del mezclado mediante el ensayo de microneutralización. Como resultado, se descubrió que CT120 y CT149 mostraron las actividades neutralizantes originales respectivas sin interferencia entre los mismos, indicando que CT120 y CT149 mostraron actividades neutralizantes contra todos los virus influenza A del grupo 1 y el grupo 2.
Para examinar la actividad neutralizante in vivo, se administraron CT120 y CT149 o una mezcla de CT120 y CT149 a ratones antes y después de haber infectado a los ratones con el virus influenza A. Como resultado, se observó que la administración de la mezcla de anticuerpo (denominada en el presente documento como CT-P27) reflejaba el efecto de cada uno de los anticuerpos o mostró los efectos combinados de los anticuerpos, y los anticuerpos no interfirieron entre sí.
CT120 y CT149 mostraron un efecto neutralizante mejorado cuando se administraron en una mezcla o se administraron en combinación con un compuesto químico. El Peramivir es un inhibidor de neuraminidasa que se usa contra la infección de influenza A. Cuando se infectaron ratones con el virus influenza A y se administró una cantidad de CT120 o CT149 con dificultad para mostrar un efecto neutralizante en combinación con una baja concentración de Peramivir a los ratones, apareció un efecto aumento en comparación con el de la administración de solo CT120 o CT149.
En consecuencia, en la presente invención, los anticuerpos (CT104, CT120 y CT123) eficaces contra los virus influenza A del grupo 1, que se representan por CT120, y los anticuerpos (CT147, CT149, CT164 y CT166) eficaces contra los virus influenza A del grupo 2, que se representan por CT149, se mezclaron entre sí y se administraron. Como resultado, se descubrió que las mezclas de anticuerpos mostraron efectos neutralizantes contra todos los virus influenza A de los grupos 1 y 2. Además, se descubrió que, cuando cada uno de los anticuerpos se administró en combinación con un agente terapéutico químico, este mostró un efecto neutralizante aumentado.
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá en detalle con referencia a ejemplos. Debe entenderse, sin embargo, que estos ejemplos son para propósitos ilustrativos y no están destinados a limitar el ámbito de la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: A islam iento de PBMC a partir de sangre de pacientes que se recuperaron del virus influenza
Un grupo de pacientes recuperados consistió en pacientes voluntarios que habían pasado 2-4 semanas después de la confirmación de nuevas infecciones de gripe. Se confirmó que los voluntarios no tenían virus influenza (H1N1) en su sangre y que tenían anticuerpos contra el nuevo virus influenza. Este estudio se realizó con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB). Este grupo de pacientes tenía las siguientes características: (1) los pacientes no se habían vacunado contra la gripe estacional; (2) los pacientes fueron negativos para otros virus infecciosos, es decir, HBsAg, y fueron negativos para anticuerpos anti-VHC y anticuerpos anti-VIH; (3) el plasma de los pacientes tuvo una PCR TI negativa para el subtipo H1N1 del virus influenza; (4) el suero de los pacientes mostró un título de 1:160 o superior en ensayos ELISA para la HA(H1N1) del subtipo H1N1 del virus influenza A. Se recogieron aproximadamente 100 ml de sangre completa de los voluntarios y se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de la sangre recogida usando Lymphoprep™ (Axis-Shield, Noruega, 1114545). Las PBMC aisladas se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato, se suspendieron en medio de congelación KM banker II (Cosmobio, Japón, KOJ-16092010) a una concentración de 2*107 células/ml, y se almacenaron en un tanque de nitrógeno líquido.
Ejemplo 2: Identificación primaria de anticuerpos monoclonales
Se identificaron linfocitos B que secretan anticuerpos específicos para el antígeno usando el método descrito por Jin et al. (Jin A. et al., 2009. Nat. Med. 15, 1088-1092). Brevemente, las PBMC aisladas en el Ejemplo 1 se añadieron a cada pocillo de un chip de micromatriz preparado a una densidad de una célula/pocillo. Los anticuerpos secretados de las células individuales se confirmaron por el anticuerpo anti-IgG humana prerrecubierto. Se analizó si las células secretoras de anticuerpos identificadas secretaban anticuerpos de unión a HA mediante ELISPOT (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima de puntos: Sedgwick J.D., 2005, Methods Mol Biol. Vol.302, pp.314) usando el antígeno de HA marcado. Las secuencias completas de los genes de cadena pesada y de cadena ligera de los anticuerpos de las células secretoras de anticuerpos individuales se obtuvieron mediante una reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (PCR TI). Los ADN de cadena pesada y de cadena ligera obtenidos se insertaron en vectores de expresión ADNpc 3.1(+) (Invitrogen, EUA, V790-20) para preparar vectores de expresión que producen cada una de las cadenas pesadas y las cadenas ligeras de los anticuerpos. Los vectores de expresión preparados se transfectaron en células en células CHO. Después, utilizando los anticuerpos producidos en las células CHO transfectadas, se seleccionaron principalmente los anticuerpos que se unen a HA por el método HA-ELISA descrito más adelante en el Ejemplo 3. En este documento, todos los anticuerpos que mostraban una reacción con HA se identificaron principalmente sin diluir en serie las muestras de anticuerpo.
Ejemplo 3: Identificación secundaria de anticuerpos monoclonales y producción de anticuerpos
Para identificar de forma secundaria anticuerpos monoclonales, que tienen una gran capacidad de unirse a la HA del virus influenza H1N1, a partir de los anticuerpos identificados primariamente, se realizó un HA-ELISA utilizando HA monomérica y HA trimérica. Se adquirió una HA1 monomérica recombinante del virus influenza A de Sino Biological Inc. (China). La HA monomérica (11055-V08H) del A/CA/04/09 (H1N1) adquirido consistió en un dominio extracelular (met1 - gln529) de HA que comprende 10 restos de polihistidina en el extremo C y la subunidad de HA1 recombinante (11056-V08H1) de A/Brisbane/10/07(H3N2) consistió en el fragmento N-terminal (Met1-Arg345) de la HA que comprende restos de polihistidina en el extremo C y se produjo en células humanas transfectadas. Las HA triméricas recombinantes (FR-180 y FR-61) de A/CA/04/09 (H1n 1) y A/Brisbane/10/07 (H3N2) fueron proporcionadas por IRR (Influenza Reagent Resource, EUA). Cada una de las HA triméricas comprendía un sitio de escisión de trombina en el extremo C, un dominio de trimerización (foldon) y seis restos de histidina y se produjo usando un sistema de baculovirus.
La reactividad del anticuerpo con el antígeno de HA se midió mediante ELISA utilizando la HA y el anticuerpo. Específicamente, en primer lugar se adsorbieron 50 pl de cada antígeno de HA monomérica y antígeno de HA trimérica (25o ng/ml) en cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos (Nunc, Dinamarca, 449824). La placa se bloqueó con solución salina tamponada con fosfato (Teknova, EUA, D5120) que contenía seroalbúmina bovina al 1 % (BSA) y después se añadió una muestra de anticuerpo diluida 3 veces en serie (concentración de partida: 1 pg/ml) a cada pocillo de la placa. A continuación, la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora y después se trató con anticuerpo anti gamma humana de cabra marcado con peroxidasa (Zymed, EUA, 62.8420). Después de incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, la placa se incubó con tetrametilbencidina (TMB; Sigma-Aldrich, EUA, T0440) y la incubación se detuvo añadiendo HCl 1 N. Se midió la absorbancia a 450/570 nm utilizando un lector de placas (Spectramax plus 384, Molecular Device) y la reactividad antígeno-anticuerpo se expresó gráficamente usando el programa Graphpad Prism (GraphPad Software Inc. EUA).
Como se muestra en la FIG. 1, los anticuerpos CT104, CT120 y CT123 mostraron alta reactividad con la HA trimérica de A/CA/04/09(H1N1), pero mostraron poca o ninguna reactividad con la HA monomérica.
Como se muestra en la FIG. 2, los anticuerpos CT147, CT149, CT164 y CT166 se unieron fácilmente a la HA trimérica de A/Brisbane/10/07 (H3N2), pero no se unieron a la subunidad HA1. Esto sugiere que los anticuerpos identificados no se unen al epítopo HA1 previamente conocido, pero tienen la capacidad de unirse únicamente al límite entre los segmentos HA1 y HA2, o a HA2 o a HA con una conformación normal.
En base a los resultados mostrados en las FIG. 1 y 2, a partir de los anticuerpos identificados primariamente, se seleccionaron secundariamente anticuerpos que muestran altas afinidades de unión por la HA trimérica. Para aumentar los niveles de expresión de los anticuerpos identificados secundariamente, estos genes de anticuerpo se reclonaron a partir de vectores de ADNpc en vectores de expresión MarEx (construidos y patentados por Celltrion, Inc.) de la siguiente manera. Después de reclonar, los vectores de expresión MarEx que contiene los genes de anticuerpo se usaron para producir los anticuerpos requeridos para un ensayo de microneutralización (ensayo de MN) y un ensayo de inhibición de hemaglutinación (ensayo HI).
Los vectores de ADNpc originales que contenían cada uno de los genes de cadena pesada y los genes de cadena ligera de los anticuerpos seleccionados secundariamente se trataron con las enzimas de restricción NheI y PmeI para obtener genes de cadena pesada y genes de cadena ligera. Los genes de cadena pesada y genes de cadena ligera obtenidos se insertaron respectivamente en los vectores pCT145 y los vectores pCT147, que se habían tratado con las mismas enzimas de restricción. Los vectores pCT145 y pCT147 se construyeron por Celltrion, Inc., para clonar la cadena pesada y la cadena ligera de cada uno de los anticuerpos, respectivamente (FIG. 3). A continuación, para construir vectores de expresión que contiene una unidad de transcripción de cadena pesada (poli A de gen de cadena pesada de promotor) junto con una unidad de transcripción de cadena ligera (poli A de gen de cadena ligera de promotor), los vectores pCT145 que contienen los genes de cadena pesada se trataron con las enzimas de restricción PacI y ^scI para obtener unidades de transcripción de cadena pesada, y después los vectores pCT147 que contienen los genes de cadena ligera se trataron con las mismas enzimas de restricción y las unidades de transcripción de cadena pesada se insertaron en ellos. Después, se identificaron vectores que contenían tanto la unidad de transcripción de cadena pesada como la unidad de transcripción de cadena ligera usando enzimas de restricción (FIG.
4). Los vectores identificados se extrajeron usando un maxi kit de plásmido Endofree (QIAGEN, Alemania, 12362) y se analizaron las secuencias de nucleótidos de porciones de las muestras de ADN extraídas, determinando de este modo las secuencias de nucleótidos de los anticuerpos.
A continuación, el ADN de los anticuerpos extraídos se transfectó en un cultivo de suspensión de una línea celular F2N (hágase referencia a la patente coreana n.° 10-1005967) (preparada por Celltrion, Inc., Corea), preparando de este modo una línea celular transitoria que produce anticuerpos monoclonales. La transfección se realizó de la siguiente manera. La transfección transitoria de las células se realizó utilizando el polímero catiónico FreeStyle™ Max (Invitrogen, EUA, 16447-100) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El día antes de la transfección, las células F2N cultivadas en medio exento de suero EX-CELL 293 (SAFC, LIK, 14571C; denominado en lo sucesivo en el presente documento como "medio EX-CELL 293") se centrifugaron y se suspendieron a una concentración celular de 1*106 células/ml en medio EX-CELL 293 modificado (SAFC, LIK, 65237; hecho a la medida) y se sembraron 80 ml de la suspensión celular en un matraz Erlenmeyer de 250 ml, o 200 ml de la suspensión celular se sembraron en un matraz Erlenmeyer de 1 litro. En el día de la transfección, en el caso en el que se sembraron 80 ml de la suspensión celular, se diluyeron 100 |jg de un ADN codificante de anticuerpo monoclonal y 100 j l de reactivo FreeStyle™ Max a un volumen de 1,6 ml utilizando el medio OptiPRO SFM II (Invitrogen, EUA, 12309), seguido de agitación cuidadosa. En el caso en el que se sembraron 200 ml de la suspensión celular, se diluyeron 250 jg de ADN y 250 jg de reactivo FreeStyle™ Max a un volumen de 4 ml utilizando el medio OptiPRO SFM II, seguido de agitación cuidadosa. Inmediatamente después del proceso de agitación, la solución que contenía el reactivo FreeStyle™ Max diluido en la misma se mezcló con la solución que contenía el ADN diluido en la misma, y la solución mixta se incubó a temperatura ambiente durante 19 minutos. Durante la incubación a temperatura ambiente durante 19 minutos, las células F2N sembradas se diluyeron a una concentración celular de 0,8*10® células utilizando medio EX-CELL 293 recién modificado. Después de incubación durante 19 minutos, las células F2N se trataron y se transfectaron con la solución mixta que contenía ADN y reactivo FreeStyle™ Max. En el día después de la transfección, se añadió la misma cantidad de medio EX-CELL 293 a las células transfectadas, que después se incubaron durante 7-8 días, produciendo de este modo anticuerpos monoclonales.
Ejemplo 4: Examen de actividad neutralizante in vitro contra virus
Los anticuerpos identificados por los inventores de la presente invención se sometieron a un ensayo de microneutralización (MN) para examinar su actividad neutralizante contra diversos virus influenza.
Ejemplo 4-1: Cultivo de línea celular MDCK y determinación de la concentración de virus
Como línea celular de riñón canino Madin-Darby (MDCK), se utilizó la línea Londres (MDCK-L). La línea celular MDCK se cultivó en una incubadora humedecida de CO2 al 5 % a 37 °C usando un medio DMEM (Gibco, EUA, 11965) que contiene FBS al 10 % (Atlas Biologicals, EUA, F0500A), 1* penicilina/estreptomicina (Gibco, EUA, 15140), HEPES 25 mM (Gibco, EUA, 15630) y L-glutamina 2 mM (Gibco, EUA, 25030).
La concentración de virus se cuantificó por un método ELISA basado en células para determinar la dosis infectiva en cultivo tisular media (TCID50). La determinación de la concentración de virus se realizó de la siguiente manera. En primer lugar, una reserva de virus se diluyó en serie 10 veces con un diluyente de virus [DMEM (Gibco, EUA), BSA al 3 % (Gibco, EUA, 15260), 1* penicilina/estreptomicina (Gibco, EUA) y HEPES 25 mM (Gibco, e Ua )] y 100 j l del virus diluido se añadió a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Como control negativo, se utilizó un diluyente de virus que no contenía virus. Después, la línea celular MDCK que se había estado cultivando se separó de la incubadora de cultivo mediante tratamiento con tripsina y después se trató con medio de cultivo MDCK para neutralizar la tripsina. A continuación, los microgránulos celulares se lavaron dos veces con una solución salina tamponada con fosfato y después se diluyeron con un diluyente de virus a una concentración celular de 5*105 células/ml. Se añadieron 3-4 (jg/m l de TPCK-tripsina (Sigma, EUA) a la placa de 96 pocillos que contenía el virus e inmediatamente después se añadieron 100 j l de la línea celular MDCK a cada pocillo de la placa y se incubaron en una incubadora humedecida de CO2 al 5 % a 37 °C durante 20 horas. La placa incubada se lavó una vez con solución salina tamponada con fosfato y después se añadieron 200 j l de una solución mixta de acetona fría:solución salina tamponada con fosfato (PBS) (80:20) a cada pocillo de la placa. A continuación, las células se fijaron durante 8 minutos y la placa se secó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Cada pocillo de la placa se lavó dos veces con 200 j l de solución salina tamponada con fosfato. Se diluyó anticuerpo monoclonal de proteína antinuclear (NP) biotinilada (Milipore, EUA, MAB8257B) 2.000 veces con solución salina tamponada con fosfato que contenía BSA al 1 % (Tween 20 al 0,1 %) y se añadieron 100 j l de la dilución a cada pocillo de la placa y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa se lavó tres veces con 200 (jl/pocillo solución salina tamponada con fosfato y después se añadieron 100 j l de una disolución 20.000 veces de anticuerpo conjugado con estreptavidina-HRP en solución salina tamponada con fosfato que contenía BSA al 1 % a cada pocillo de la placa y se incubaron a presión ambiental durante 1 hora. Después de lavar la placa cuatro veces con solución salina tamponada con fosfato, se añadieron 100 j l de solución de t Mb a cada pocillo de la placa y la placa se desarrolló a temperatura ambiente durante 10 minutos y se trató con ácido sulfúrico para detener el desarrollo del color, después de lo cual se midió la OD450 de cada pocillo. Basado en la OD450 medida, se calculó la TCID50 usando el método de Reed & Muench (The American 1938).
Ejemplo 4-2: Ensayo de MN
Cada anticuerpo se diluyó con un diluyente de virus a una concentración de 10 jg/ml. A partir de esta concentración inicial, la dilución de anticuerpo se diluyó en serie 2 veces con un diluyente de virus y se añadieron 50 j l de cada una de las diluciones a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. También, se añadieron 50 j l de virus a cada pocillo de la placa a una concentración correspondiente a 100 TCID50 y se incubaron en una incubadora humedecida de CO2 al 5 % a 37 °C durante 1 hora. A continuación, se añadieron 3-4 (jg/m l de TPCK-tripsina (Sigma, EUA, T1426) a cada pocillo y se añadieron 100 j l de las células de MDCK tratadas a cada pocillo, seguido de incubación en una incubadora humedecida de CO25 % a 37 °C durante 20 horas. Después de incubación durante 20 horas, se realizó un ensayo de MN de acuerdo con el mismo método que el método de cuantificación de virus descrito en el Ejemplo 4-1, determinando de este modo el valor de OD450 de cada pocillo. Se determinó que los pocillos que mostraron valores de OD450 mayores al pocillo introducido únicamente con las células estaban infectados con virus. Entre los valores de OD450 para cada anticuerpo en el que no se detectó ningún antígeno, la concentración más baja (jg/m l) del anticuerpo se muestra más adelante en la Tabla 1, y la concentración más baja del anticuerpo significa la mayor actividad neutralizante contra el virus.
Las capacidades neutralizantes de anticuerpos específicos contra el subtipo H1 de virus influenza A se muestran más adelante en la Tabla 1 y las capacidades neutralizantes de anticuerpos específicos contra el subtipo H3 de virus influenza A se muestran más adelante en la Tabla 2. Entre estos anticuerpos, CT120 y CT149 que tienen mejores efectos se sometieron a un ensayo de microneutralización usando los virus influenza A de diversos grupos. Como resultado, CT120 mostró un efecto neutralizante contra los virus influenza A del grupo 1, t CT149 mostró un efecto neutralizante contra algunos virus del grupo 1 y los virus influenza A del grupo 2 (Tabla 3).
Tabla 1: Resultados del ensayo de microneutralización realizado utilizando anticuerpos y el subtipo H1 del virus influenza A
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Tabla 2: Resultados del ensayo de microneutralización realizado utilizando anticuerpos y el subtipo H3 del virus influenza A
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Tabla 3: Resultados del ensayo de microneutralización realizado usando los virus influenza A del grupo 1 y el grupo
2
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continuación
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Ejemplo 5: Examen de la capacidad del anticuerpo de inhibir la reacción de hemaglutinación causada por virus
Debido a que los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos neutralizantes que se dirigen a la HA de virus, se examinó el mecanismo mediante el cual los anticuerpos de la presente invención muestran actividad neutralizante contra las funciones de la HA. Una de las funciones de la HA es unirse al receptor sobre la superficie celular para permitir que el virus se adhiera a la célula. Puesto que esta función puede observarse por una reacción de hemaglutinación, se examinó el efecto inhibitorio del anticuerpo contra una reacción de hemaglutinación inducida por HA. Para esto, el anticuerpo se diluyó en serie 2 veces en una placa de 96 pocillos con fondo en V y se añadieron virus que tienen 4 veces unidades de HA y se mezclaron con el anticuerpo. A continuación, la placa se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos, y después se añadió un 1 % de glóbulos rojos aviares a cada pocillo de la placa. Se determinó el punto final de la inhibición de hemaglutinación como la concentración más baja de anticuerpo a la cual no se observó reacción de hemaglutinación.
Como resultado, todos los anticuerpos contra el subtipo H1 de virus influenza A (Tabla 4) o los anticuerpos contra el subtipo H3 de virus influenza A (Tabla 5) no inhibieron la hemaglutinación para A/Texas/05/2009 y A/Nueva York/18/2009, A/Brisbane/10/07, contra los cuales los anticuerpos mostraron efectos neutralizantes en el ensayo de MN, incluso a altas concentraciones (>20 jg/ml).
Tabla 4: Resultados del ensayo de inhibición de hemaglutinación realizado usando anticuerpos y subtipo H1 de virus influenza A
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Tabla 5: Resultados del ensayo de inhibición de hemaglutinación realizado usando anticuerpos y subtipo H3 de virus influenza A
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Ejemplo 6: Examen de la capacidad del anticuerpo para inh ibir la fusión a la membrana
Para examinar el mecanismo de acción del anticuerpo neutralizante, se examinó el efecto inhibitorio del anticuerpo contra otra función (capacidad de fusión a membrana) de HA. Cuando se expone HA a un entorno de bajo pH después de que el virus entre en las células por endocitosis, funciona para inducir la fusión de membrana entre el endosoma y la envoltura del virus de modo que el genoma del virus penetra en las células. Para reproducir esta función in vitro, las líneas celulares de CHO que expresan la HA de A/CA/04/09 (H1N1), A/Japón/305/-41957 (H2N2), A/Brisbane/10/07 (H3N2) o A/Vietnam/1203/04 (H5N1) se desarrollaron y usaron en un ensayo. Cuando cada una de las líneas celulares se expone a un pH bajo, las membranas celulares se fusionan para formar sincitios. Específicamente, cada una de las líneas celulares se sembró en una placa de 6 pocillos a una densidad de 1*105 células por pocillo y se añadió medio DMEM/F12 que contenía FBS al l0 % a cada pocillo, seguido de incubación en una incubadora humedecida de CO2 al 5 % a 37 °C durante 2 días. A continuación, las células se lavaron con PBS y se incubaron en un medio DMEM/F12 exento de FBS durante 30 minutos, después de lo cual las células se trataron con 4 pg/ml de TPCK-tripsina durante 5 minutos para activar la HA. A continuación, el medio se reemplazó por medio DMEM/F12 que contenía FBS al 10 %, seguido de incubación durante 20 minutos. Las células se trataron con 20 pg/ml de cada uno de los anticuerpos neutralizantes y después se incubaron en una incubadora humedecida con CO2 al 5 % a 37 °C durante 1 hora. Las células incubadas se lavaron con PBS y después se trataron con tampón de bajo pH (NaCl 150 mM, Hepes 10 mM, pH 5,0) durante 6 minutos. A continuación, el medio se reemplazó por medio DMEM/F12 que contenía FBS al 10 %, seguido de incubación durante 1 hora. A continuación, las células se lavaron con PBS, se fijaron con metanol y después se tiñeron con azul de tripano y se observó el grado de fusión a membrana de las células con un microscopio. Como resultado, se demostró que CT120 inhibió la fusión a membrana de la línea celular CHO que expresa la HA de A/CA/04/09 (H1N1), A/Japón/305/1957 (H2N2) o A/Vietnam/1203/04 (H5N1) y CT149 inhibió la fusión a membrana de la línea celular que expresa la HA de A/CA/04/09 (H1N1), A/Brisbane/10/07 (H3N2) o A/Vietnam/1203/04 (H5N1) (FIG.
5a a 5d).
Por tanto, los resultados de los Ejemplos 5 y 6 indicaron que los anticuerpos de la presente invención muestran efectos neutralizantes contra virus de acuerdo con el mecanismo mediante el cual se unen a HA para inhibir la fusión a membrana.
Ejemplo 7: Examen del efecto antivírico de mediado por la función de Fc de anticuerpos
Ejemplo 7-1: Ensayo ADCC in vitro
Para medir la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) del anticuerpo, se utilizó un ensayo de liberación de calceína AM.
Se añadió calceína AM a una línea celular CHO K1 que expresa la HA de influenza H1N1 (A/California/04/2009) para utilizar la línea celular como células diana. Las células diana que tenían calceína AM añadida a las mismas se trataron con concentraciones variables de cada uno de CT120, CT149 y el control negativo CT-P6 (anticuerpo anti-Her2) y después se trató con células efectoras. Después de incubar la placa a 37 °C durante 4 horas, la placa se centrifugó y el sobrenadante se transfirió a una placa opaca, seguido de medición de fluorescencia. Se calculó el porcentaje (%) de citotoxicidad a cada concentración de anticuerpo usando la liberación máxima (MR) y la liberación espontánea (SR).
Como se muestra en la FIG. 6a, el control negativo no mostró citotoxicidad a concentraciones variables de anticuerpo, pero CT120 y CT149 mostraron citotoxicidades mayores (es decir, ADCC mayor) a concentraciones mayores y CT120 mostró una citotoxicidad mayor que CT149.
Ejemplo 7-2: Ensayo CDC in vitro
Se midió la citotoxicidad celular dependiente del complemento (CDC) usando un kit-8 de recuento celular (CCK-8) en el que la absorbancia aumenta en proporción al número de células viables.
Específicamente, una línea celular CHO K1 que expresa la HA de influenza H1N1 (A/California/04/2009) se acopló a una placa y se usó como células diana. Las células diana se trataron con concentraciones variables de cada uno de CT120, CT149 y el control negativo CT-P6, y después se trataron con suero humano como fuente de complemento. La placa se incubó a 37 °C durante 2 horas y después se trató con CCK-8 y se incubó durante una noche, después de lo cual se midió la absorbancia de la placa. Se calculó el porcentaje (%) de citotoxicidad a cada concentración de anticuerpo usando la absorbancia máxima y la absorbancia mínima del sistema de ensayo.
Como se muestra en la FIG. 6b, el control negativo no mostró citotoxicidad a concentraciones variables de anticuerpo, pero CT120 y CT149 mostraron citotoxicidades mayores (es decir, ADCC mayor) a concentraciones mayores.
Ejemplo 7-3: Producción de anticuerpo CT149 que tiene Fc de ratón
Para prepara un anticuerpo CT149 anticuerpo que tiene Fc de ratón, se compararon entre sí cinco secuencias de IgG1 de ratón (GenBank n.° de acceso L27437.1, L35037.1, AB097849.1, Q724328.1 y M745099.1) en la base de datos NCBI, y se seleccionó la secuencia de región constante de AB097849.1 que tiene la identidad más alta con otras secuencias como la región constante de IgG1 de ratón. Como la región constante de IgG2a de ratón, opcionalmente se seleccionó la secuencia de región constante de X70423,1, puesto que dos secuencias de IgG2a de ratón (GenBank n.° de acceso X70423.1 y AB097847.1) en la base de datos NCBI tenían la misma secuencia de aminoácidos, incluso aunque había una diferencia de 1 bp entre las dos secuencias. Además, se compararon entre sí cuatro secuencias kappa de ratón (GenBank n.° de acceso U65535.1, BC028540.1, BC094013.1 y BC002112.1) en la base de datos NCBI y, como resultado, se descubrió que las secuencias kappa son idénticas entre sí.
Se sintetizaron las regiones constantes de IgG1 e IgG2a de ratón seleccionadas, se obtuvo una cadena pesada de IgG1 quimérica que tiene una región variable humana y una región constante de ratón mediante PCR de solapamiento con la región variable humana de CT149. Para obtener una cadena ligera de ratón, se obtuvo una región constante kappa de ARN de hibridoma mediante PCR TI, y después se obtuvo una cadena ligera quimérica (kappa) que tiene una región variable humana y una región constante de ratón mediante PCR de solapamiento. Se descubrió que las secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera obtenidas eran idénticas a las secuencias en la base de datos NCBI.
Los genes de anticuerpo quimérico preparados se clonaron en vectores de expresión (construidos por Celltrion Inc.) que después se introdujeron en células CHOK1. Las células se incubaron en medio SFM4CHO (Hyclone, Cat. N.°: SH30549,02) que contenía 8 ug/ml de puromicina y se seleccionaron líneas celulares estables de las células. Las líneas celulares seleccionadas se cultivaron por lotes para producir anticuerpos de la forma IgG1 y la forma IgG2a que tienen Fc de ratón.
Ejemplo 7-4: Ensayo en animales usando CT149 que tiene Fc de ratón
Cada grupo de ratones consistente en cinco ratones se infectó por vía intranasal con 5 LD50 de virus A/California/04/09. A las 24 horas después de la infección vírica, se administraron 3 mg/kg de cada anticuerpo a cada ratón mediante inyección intraperitoneal y se midió la tasa de supervivencia de los ratones. Los anticuerpos usados en el experimento tenían el sitio de unión a antígeno de CT149 y el Fc humano o la Fc de IgG1 o IgG2a de ratón. En el caso de anticuerpos de ratón, IgG2a tiene una afinidad mayor por FcgR que IgG1 (Bruhns P, 2012, Blood, 119(24):5640-5649).
Como resultado, como se muestra en la FIG. 7, CT149 que tiene la Fc de IgG2a de ratón mostró una tasa de supervivencia mayor en comparación con otros anticuerpos. Por tanto, puede verse que el anticuerpo de la presente invención mostró su efecto por la Fc incluso in vivo.
Ejemplo 8: Determinación de sitios donde los anticuerpos CT120 y CT149 se unen a HA de los subtipos de H5 y H3
Para determinar el sitio de unión de HA del anticuerpo de la presente invención, la secuencia de aminoácidos de un fragmento de anticuerpo que se une a la proteína HA se analizó por cristalografía de rayos X (FIG. 8a y 8b). Como resultado, el elemento principal del epítopo CT120 se localizó al lado de la hélice de la subunidad HA2 de A/Vietnam/1203/04 (H5N1) (f Ig .8a). CT149 se localizó en el lado de la hélice de la subunidad HA2 de A/Aichi/1968 (H3N2) mientras que se unió a otros monómeros adyacentes a la subunidad HA2, indicando que se unía a tres subunidades en un solo trímero de HA (FIG. 8b).
Ejemplo 8-1: Expresión de proteína HA recombinante
Para producir de una proteína HA recombinante para su uso en un análisis de difracción de rayos X, el ectodominio del gen de HA de cada uno de los virus A/Vietnam/1203/04 (H5N1) y A/Aichi/1968 (H3N2) se clonó en el vector de baculovirus pAcGP67-A (BD Pharmingen). Una línea celular de Tricoplusia ni (High 5) (Invitrogen) se infectó con baculovirus (construido usando el vector) a una MOI (multiplicidad de infección) de 5-10 a 28 °C durante 72 horas. La proteína HA expresada y secretada se purificó del medio recogido mediante cromatografía por afinidad a metal y cromatografía de filtración en gel por exclusión de tamaño (columna Superdex 200 16/60; GE Healthcare). Para la cristalización, la HA purificada se incubó con 3 unidades de trombina a 4 °C durante 18 horas para retirar la etiqueta de foldon/histidina del extremo C.
Ejemplo 8-2: Purificación de fragmento de anticuerpo
Cada uno de los anticuerpos CT120 y CT149 se mezcló con papaína (Roche REF N.°:10108014001) a una proporción de 100:1, y después se trató con papaína a 37 °C durante 1 horas, después de lo cual se le añadió IAA 20 mM (Sigma:A3221), seguido de incubación a 37 °C durante 45 minutos. El medio se reemplazó por un tampón que contenía fosfato sódico 20 mM y NaCl 25 mM (pH7,0) usando una columna de desalación HiPrep 26/10 (GE Healthcare N.° de cat. 17-5087-01), y después el material incubado se cargó en una columna Mabselect Sure (GE Healthcare N.° de cat. 17-5438-03) para retirar la región de Fc, y el fragmento de Fab se concentró a una concentración de 10 mg/ml usando una unidad de filtro ultra centrífuga Amicon (Millipore, REF N.°: UFC901096). El fragmento Fab concentrado se purificó adicionalmente mediante cromatografía de filtración en gel con exclusión de tamaño (Superdex200 10/300 GL GE Healthcare, N.° cat.: 17-5175-01) con tampón de PBS.
Ejemplo 8-3: Cocristalización de fragmento de anticuerpo y proteína HA
El fragmento Fab de CT120 estaba en forma de un trímero y se mezcló a una proporción de 5:1 con la proteína HA de A/Vietnam/1203/04 (H5N1) purificada de acuerdo con el método del Ejemplo 7-1, seguido de cristalización, y el fragmento Fab de CT149 se mezcló con la proteína HA de A.Aichi/2/68 (H3N2) a una proporción de 5:1, seguido de cristalización. Los cristales producidos se separaron por cromatografía de filtración en gel con exclusión de tamaño (columna Superdex 200 10/30; GE Healthcare) usando un tampón que contiene Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) y NaCl 150 mM, y después se concentraron a 15 mg/ml y 12 mg/ml, respectivamente.
La identificación inicial de cristalización de matriz dispersa se realizó usando un sistema cristalizador de difusión de cristalización libre Topaz™ (FID) (Fluidigm Corporation, San Francisco, CA). Las condiciones de cristalización preliminares para el complejo CT120 Fab-H5 se obtuvieron en 24 horas en varias condiciones que contenían el precipitante, polietilenglicol (PEG) 6.000. A través de la optimización, se establecieron las condiciones capaces de preparar cristales que pueden analizarse mediante análisis de difracción. Finalmente, los cristales se desarrollaron a 23 °C usando la cristalización por difusión de vapor de gota colgante mezclando 1,0 pl del complejo CT120/H5 con el mismo volumen de PEG 6.000 al 10 %, cacodilato sódico 100 mM (pH 6,5) y formiato sódico 400 mM. Se recogió un conjunto de datos de difracción para el complejo CT120 Fab-H5 a una resolución de 4,0 A en la línea de haz SER CAT 22-ID de Advanced Photon Source (APS). CT120 Fab-H5 se cristalizó en el grupo espacial triclínico primitivo p1.
Las condiciones de cristalización preliminares para el complejo CT149 Fab-H3 se obtuvieron en 24 horas en varias condiciones que contenían el precipitante, polietilenglicol (PEG) 3.000. A través de la optimización, se establecieron las condiciones capaces de preparar cristales que pueden analizarse mediante análisis de difracción. Finalmente, los cristales se desarrollaron a 23 °C usando la cristalización por difusión de vapor de gota colgante mezclando 1,0 pl del complejo CT149 Fab-H3 con el mismo volumen de PEG 3.000 al 20 % y citrato sódico 100 mM (pH 5,5). Se recogió un conjunto de datos de difracción para el complejo CT149 Fab-H3 a una resolución de 3,5 A en la línea de haz SER CAT 22-ID de Advanced Photon Source (APS). CT149 Fab-H3 se cristalizó en el grupo espacial trigonal primitivo p3-i.
Ejemplo 8-4: Análisis de difracción de rayos X
La recogida de datos y las estadísticas de refinado se presentan más adelante en la Tabla 6. Los datos se procesaron y se escalaron usando HKL2000 y el programa Denzo. Las estructuras del complejo CT120 Fab-HA3 y el complejo CT149 Fab-HA3 se resolvieron por reemplazo molecular usando el programa Phaser. La solución obtenida por reemplazo molecular se sometió a un cuerpo rígido y refinado restringido usando el programa REFMAC5 y la construcción del modelo se realizó usando Coot. La densidad electrónica 2Fo-Fc se definió bien a través del modelo y el refinado restringido de la estructura se completó en REFMAC5.
Tabla 6: Recogida de datos y estadísticas de refinado
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Ejemplo 8-5: Validación y análisis de datos estructurales
Los residuos se numeraron en la región de HA de los dos complejos de acuerdo con las subunidades HA1 y HA2 completas. La validación estructural se realizó usando Procheck y el servidor de validación RCSB PDB. La conectividad y nomenclatura de restos de carbohidratos se validó usando el sitio PDBCARE (Glycosciences.de). Se realizaron manipulaciones del modelo, cálculos de RMSD y mediciones de distancia usando Coot y Pymol. Los cálculos de superficie accesible a disolvente se realizaron usando PISA y Protorp.
Ejemplo 9: Determinación del sitio en el que el anticuerpo CT149 se une a Ha de subtipo H7
Para determinar el sitio de unión del anticuerpo CT149 de la presente invención, en la HA del subtipo H7 (H7N9, A/Anhui/1/2013), se analizó la secuencia de aminoácidos de la proteína HA donde se une un fragmento de anticuerpo mediante cristalografía de rayos X (FIG. 8c).
Tabla 7: Recogida de datos y estadísticas de refinado
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Ejemplo 10: Determinación de afinidad de antígeno-anticuerpo mediante tecnología de resonancia de plasmón superficial
El ensayo de resonancia de plasmón superficial (Biacore, Inc.) determina la afinidad de unión de anticuerpos con mediciones cinéticas de constantes velocidad de asociación y velocidad de disociación.
La unión de los anticuerpos CT120 y CT149 a proteína HA de influenza recombinante purificada se determinó mediante mediciones basadas en resonancia de plasmón superficial con un Biacore T200 (GE Healthcare) usando un tampón de operación HBS-EPB (HEPES 10 mM [pH 7,4], NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, BSA 0,1 mg/ml y tensioactivo P20 al 0,005 %) a 25 °C. Se inmovilizaron aproximadamente 5000 RU de anticuerpo con etiqueta anti-6x his en acetato sódico 10 mM (pH 5,0) a través de un chip biosensor de calidad de investigación CM5 usando un kit de acoplamiento de amina convencional de acuerdo con las instrucciones del fabricante y tiene lugar a 1 pg/ml. Los restos sin reaccionar de la superficie del biosensor se bloquearon con etanolamina. Para el análisis cinético, se usaron el software de control Biacore T200 y el software de evaluación Biacore T200. Los anticuerpos CT120 y CT149 se diluyeron en tampón HBS EP. Se inyectó una proteína Ha de influenza recombinante para su captura como un ligado sobre matrices de reacción a un caudal de 10 (pl/min. Durante el ensayo, todas las mediciones se refirieron a la superficie de captura que no tenía HA de influenza recombinante capturada. Las constantes de velocidad de asociación y disociación, Ka(M-1s-1) y Kd(s-1) se determinaron a un caudal de 30 (pl/min. Las constantes de velocidad se obtuvieron realizando mediciones me unión cinética a diferentes concentraciones de antígeno que varían de 1,23-100 nM, como una serie de dilución de 3 veces, e incluyeron una inyección únicamente de tampón para usarse como referencia doble. La constante de disociación de equilibrio KD (M) de la interacción entre anticuerpos y el antígeno diana se calculó después a partir de las constantes de velocidad cinética mediante la siguiente fórmula: Ko=Kd/Ka. La unión se registra en función del tiempo y se calculan las constantes de velocidad cinética.
Se determinaron las afinidades de unión de CT120 y CT149 por la HA recombinante purificada de diversos virus influenza (Tablas 8 a 18). CT120 mostró una afinidad mayor por H1 que CT149, pero no tiene afinidad por H3. CT149 mostró generalmente altas afinidades por H3 dependiendo de la cepa del virus. Tanto CT120 como CT149 mostraron altas afinidades por H5. Para H7, CT120 no mostró afinidad, pero CT149 mostró alta afinidad.
Tabla 8: Medición de afinidad de unión para proteína HA de H1N1 (A/California/04/09)
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Tabla 9: Medición de afinidad de unión para proteína HA de H1N1 (A/Texas/05/09)
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Tabla 10: Medición de afinidad de unión para proteína HA de H1N1 (A/Islas Salomón/03/06)
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Tabla 11: Medición de afinidad de unión para proteína HA de H1N1 (A/Ohio/07/09)
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Tabla 12: Medición de afinidad de unión para proteína HA de H3N2 (A/Filipinas/2/82)
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Tabla 13: Medición de afinidad de unión para proteína HA de H3N2 (A/Wisconsin/67/05)
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Tabla 14: Medición de afinidad de unión para proteína HA de H3N2 (A/Brisbane/10/07)
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Tabla 15: Medición de afinidad de unión para proteína HA de H5N1 (A/Vietnam/1203/04)
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Tabla 16: Medición de afinidad de unión para proteína HA de H7N7 (A/Inalaterra/268/96)
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Tabla 17: Medición de afinidad de unión para proteína HA de H7N9 (A/Shanahai/1/2013)
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Tabla 18: Medición de afinidad de unión para proteína HA de H7N9 (A/Anhui/1/2013)
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Ejemplo 11: Ensayo ELISA celular (CELISA)
La afinidad de unión de anticuerpos para HA se analizó mediante un ensayo CELISA usando una línea celular que expresa la HA de H1, H3 o H5. Para obtener la línea celular que expresa H1, se sintetizó un gen usando la información genética de la HA del virus A/CA/04/09, y después se subclonó en un vector de expresión que después se transfectó en una línea celular de CHO-K1, después de lo cual se seleccionó la línea celular que expresa H1. La línea celular que expresa H3 se obtuvo usando la información genética de la HA del virus A/Brisbane/10/07. La línea celular que expresa H5 se obtuvo usando la información genética de la HA del virus A/Vietnam/1203/04. Cada una de las líneas celulares que expresan HA se cultivó en una incubadora humedecida con CO2 al 5 % a 37 °C usando un medio DMEM que contenía FBS al 10 %. La línea celular cultivada se separó del frasco del cultivo mediante tratamiento con tripsina y se centrifugó después de añadir medio de cultivo para neutralizar la tripsina y después se diluyó en el medio de cultivo a una concentración de 2*105 células/ml. Se añadieron 100 j l de las células diluidas a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se cultivaron en una incubadora humedecida con CO2 al 5 % a 37 °C durante 18 horas de modo que se una a la placa de 96 pocillos. Después del cultivo, cada pocillo se lavó dos veces con 200 j l de PBS frío, y después se añadieron 150 j l de solución de formaldehído al 3,7% a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos para fijar las células. Cada pocillo se lavó tres veces con 200 j l de PBS que contenía Tween 20 al 0,05%, y después se bloqueó con 200 j l de tampón de disolución (TEKn Ov A, Cat. N.° D5120) a temperatura ambiente durante 60 minutos. La concentración (ug/ml) de cada muestra de anticuerpo (CT120 o CT149) se diluyó en serie 4 veces con tampón de disolución, y después se añadieron 100 j l de la muestra de anticuerpo a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 60 minutos. Cada pocillo se lavó tres veces con 200 j l de tampón PBS que contenía Tween 20 al 0,05 %, y después se añadieron 100 j l de una dilución 1:1000 de una cadena anti-kappa humana conjugada con HRP a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 40 minutos. Cada pocillo se lavó tres veces con 200 j l de tampón PBS que contenía Tween 20 al 0,05 %, y después se añadieron 100 j l de tampón TMB (Sigma, Cat. N.° T0440) a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 6 minutos. A continuación, se añadieron 100 j l de ácido sulfúrico 1 N a cada pocillo para detener la incubación y se midió la absorbancia a 450 nm.
Como resultado, CT120 y CT149 se unieron a las líneas celulares que expresan las HA de H1 y H5, respectivamente, y CT-P27 obtenido mezclando CT120 y CT149 a una proporción 1:1 mostró una afinidad de unión similar a la de cada uno de CT120 y CT149 (FIG. 9A y 9C). CT149 mostró una afinidad de unión en CELISA realizado usando la línea celular que expresa la HA de H3, pero CT120 no se unión a la HA de H3. CT-P27 mostró una afinidad de unión similar a la de CT149, sugiriendo que CT120 no interfirió con la unión de CT149 (FIG. 9B).
Ejemplo 12: Actividades neutralizantes de anticuerpos antes y después del mezclado contra el virus influenza A
CT120 y CT149 se mezclaron entre sí a una proporción de 1:1 y la mezcla se nombró "CT-P27". Se midieron los valores de CE50 del anticuerpo para diversos subtipos del virus influenza usando una modificación del ensayo de microneutralización descrito en el Ejemplo 4. Para medir los valores de CE50, los anticuerpos se ajustaron a una concentración inicial de 800-6400 |ig/ml, y después se diluyeron en serie cuatro veces para preparar virus infecciosos. Se midió la absorbancia a OD450 de cada pocillo y se restringió el valor base obtenido para el pocillo introducido únicamente con medio, después de lo cual se trazó un gráfico de 4 parámetros en función de la concentración usando el programa representación Sigma, y se calculó la concentración correspondiente al 50 % de la absorbancia máxima a OD450, determinado de este modo los valores de CE50.
CE50 es la concentración de anticuerpo que muestra el 50 % de la actividad neutralizante máxima del anticuerpo contra el virus, y un valor de CE50 menor indica la mayor actividad neutralizante del anticuerpo.
Como resultado, cada uno de CT120 y CT149 mostró capacidades neutralizantes similares contra virus contra los cuales estos mostraron originalmente actividades neutralizantes, y una mezcla de los dos anticuerpos mostró una capacidad neutralizante eficaz sin interferencia con los dos anticuerpos. Por tanto, el uso de las mezclas de CT120 y CT149 mostró efectos neutralizantes contra todos los virus influenza A del grupo 1 y del grupo 2 (Tabla 19).
Tabla 19: Resultados de medición de CE^n para diversos virus influenza A
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Ejemplo 13: Examen de los efectos preventivos y terapéuticos de la mezcla de anticuerpos contra el virus influenza A mediante ensayo en animales
Para examinar si la administración de anticuerpos CT120 y CT149 solos o en una mezcla muestra efectos preventivos y terapéuticos contra el virus influenza A en ratones, se examinó la tasa de supervivencia de ratones. Cada grupo que consistía en 5-10 ratones se infectó por vía intranasal con 5-10 LD50 de virus influenza. El anticuerpo se administró a los ratones mediante inyección intraperitoneal en una cantidad de 7,5, 1530 mg/kg a 24 horas antes de la infección vírica o a 24 horas después de la infección vírica. CT-P27 era una mezcla 1:1 de CT120 y CT149 y se indica la cantidad total del mismo, y por tanto la cantidad de cada uno de CT120 y CT149 en la mezcla de anticuerpos es igual a la mitad de la cantidad indicada.
Como resultado, CT-P27 mantuvo el efecto de cada uno de los anticuerpos CT120 y CT149 y no mostró la interferencia entre los anticuerpos.
13-1: Efectos preventivos y terapéuticos de mezcla de anticuerpos contra H1N1
Cada grupo que consistía en 5-10 ratones de infectó por vía intranasal con 5-10 LD50 de A/California/04/09. El anticuerpo se administró a los ratones mediante inyección intraperitoneal a las 24 horas antes de la infección vírica o a 24 horas después de la infección vírica y se midió la tasa de supervivencia de los ratones.
Como resultado, como se muestra en la FIG. 10, cuando se administró el anticuerpo CT120, CT149 o CT-P27 a las 24 horas antes de la infección vírica, todos los ratones sobrevivieron durante el periodo del experimento de una manera independiente de la concentración del anticuerpo. Cuando el anticuerpo se administró a las 24 horas después de la infección vírica, la tasa de supervivencia de los ratones a los que se les administró el anticuerpo CT120, CT149 o CT-P27 aumento según aumentaba la concentración del anticuerpo. La tasa de supervivencia de los ratones a los que se les administró CT120 fue ligeramente mayor que la de los ratones a los que se les administró CT149. CT-P27 mostró una tasa de supervivencia similar a la suma de las tasas de supervivencia mostradas por CT120 y CT149 (efecto aditivo), indicando que la disminución en los efectos mediante la mezcla de los anticuerpos no sucedió.
13-2: Efectos preventivos y terapéuticos de mezcla de anticuerpos contra H3N2
Cada grupo que consistía en 5-10 ratones se infectó por vía intranasal con 10 LD50 de A/Brisbane/10/07 o 5 LD50 de A/Filipinas/2/82. El anticuerpo se administró a los ratones mediante inyección intraperitoneal a las 24 horas antes de la infección vírica o a 24 horas después de la infección vírica y se midió la tasa de supervivencia de los ratones.
Como resultado, como se muestra en la FIG. 11, cuando se administró cada uno de los anticuerpos a las 24 horas antes de la infección vírica, CT120 no contribuyó al aumento de la tasa de supervivencia de los ratones, mientras que todos los ratones a los que se les administró CT149 o CT-P27 sobrevivieron durante el periodo del experimento en cualquier concentración del anticuerpo ensayado. Cuando se administró cada uno de los anticuerpos a las 24 horas después de la infección con el virus A/Filipinas/2/82, el anticuerpo CT120 no contribuyó al aumento en la tasa de supervivencia de los ratones, mientras que CT149 y CT-P27 mostraron el aumento en la tasa de supervivencia como un aumento en la concentración de los mismos. CT-P27 mostró una tasa de supervivencia correspondiente a la concentración del anticuerpo CT149 del mismo, indicando que no había interferencia entre CT120 y CT149 en la mezcla de anticuerpos.
13-3: Efecto terapéutico de la mezcla de anticuerpos contra H5N1
Cada grupo que consistía en 5-10 ratones se infectó por vía intranasal con 10 LD50 del virus A/Vietnam/1203/04. El anticuerpo se administró a los ratones mediante inyección intraperitoneal a las 24 horas después de la infección vírica, y se midió la tasa de supervivencia de los ratones.
Como resultado, como se muestra en la FIG. 12, cuando se administró a los ratones el anticuerpo a las 24 horas después de la infección con el virus A/Vietnam/1203/04, todos los ratones sobrevivieron durante el periodo del experimento en cualquier concentración del anticuerpo ensayado.
13-4: Efecto terapéutico del anticuerpo CT149 contra H7N9
Cada grupo que consistía en 10 ratones se infectó por vía intranasal con 106 PFU del virus A/Anhui/1/2013. El anticuerpo se administró a los ratones mediante inyección intraperitoneal a las 24 horas después de la infección vírica, y se midió la tasa de supervivencia de los ratones.
Como resultado, como se muestra en la FIG. 13, cuando se administró el anticuerpo de control negativo, los ratones comenzaron a morir a los 3 días después de la administración y casi todos murieron después de 7 días. Sin embargo, la tasa de supervivencia de los ratones a los que se les administró el anticuerpo CT149 a las 24 horas después de la infección vírica aumentó según aumentaba la concentración del anticuerpo.
Ejemplo 14: Efecto de la administración de mezcla de anticuerpos en combinación con un compuesto químico
Cada grupo que consistía en 5 ratones se infectó por vía intranasal con 5 LD50 del virus A/CA/04/09 adaptado a ratón 5 LD50 del virus A/Filipinas/2/82. A las 24 horas después de la infección vírica, el Peramivir inhibidor de neuraminidasa se administró una vez (x1) a lo largo de cinco días consecutivos (x5) a los ratones mediante inyección intraperitoneal. Como alternativa, se administraron concentraciones variables de los anticuerpos solos o en combinación con Peramivir y se midió la tasa de supervivencia.
Como resultado, como se muestra en la FIG. 14A, cuando se administraron solos 15 mg de Peramivir o 1 mg de CT120 a los ratones a las 24 horas después de la infección con el virus A/CA/04/09, las tasas de supervivencia de los ratones fueron del 40 % y del 20 %, respectivamente, pero cuando se administraron en combinación 15 mg de Peramivir y 1 mg de CT120, la tasa de supervivencia de los ratones llegó al 80 %. De un modo similar, como se muestra en la FIG. 14B, cuando se administraron solos 15 mg de Peramivir a las 24 horas después de la infección con el virus A/Filipinas/2/82, apareció una tasa de supervivencia del 40 %, y cuando se administró solo 1 mg de CT149, todos los ratones murieron en el día 8. Sin embargo, la administración de CT149 en combinación con Peramivir mostró una tasa de supervivencia de hasta el 80 %. La administración del anticuerpo o Peramivir solos mostró una alta tasa de muertes, debido a que la concentración del anticuerpo o Peramivir no es una concentración optimizada, mientras que la administración del anticuerpo en combinación con Peramivir mostró un efecto sinérgico.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende al menos dos moléculas de unión neutralizantes del virus influenza A que se unen a un epítopo en una región troncal de la proteína hemaglutinina (HA) del virus influenza A, comprendiendo la composición:
i) una primera molécula de unión capaz de neutralizar al menos un subtipo del virus influenza A seleccionado entre el grupo que consiste en H1, H2, h 5 y H9; y
ii) una segunda molécula de unión capaz de neutralizar al menos un subtipo del virus influenza A seleccionado entre el grupo que consiste en H1, H3, H5, H7 y H9;
en la que la primera molécula de unión comprende una región variable de cadena ligera que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 7, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 8 y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 9, y una región variable de cadena pesada que comprende, según el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ iD NO: 10, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 11 y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 12; y
en la que la segunda molécula de unión comprende un polipéptido cualquiera seleccionado entre el grupo que consiste en
i) un polipéptido que comprende una región variable de cadena ligera que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 19, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 20 y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 21, y una región variable de cadena pesada que comprende, según el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 22, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 23 y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 24;
ii) un polipéptido que comprende una región variable de cadena ligera que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 25, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 26 y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 27, y una región variable de cadena pesada que comprende, según el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 28, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 29 y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 30;
iii) un polipéptido que comprende una región variable de cadena ligera que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 31, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 32 y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 33, y una región variable de cadena pesada que comprende, según el método de Kabat, una región CDR1 con la Se Q ID NO: 34, una región CDR2 con la Se Q ID NO: 35 y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 36; y
iv) un polipéptido que comprende una región variable de cadena ligera que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 37, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 38 y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 39, y una región variable de cadena pesada que comprende, según el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 40, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 41 y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 42.
2. La composición de la reivindicación 1, en la que la primera molécula de unión comprende
un polipéptido que comprende una cadena ligera que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 45 y una cadena pesada que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 46.
3. La composición de la reivindicación 1, en la que la segunda molécula de unión comprende un polipéptido cualquiera seleccionado entre el grupo que consiste en:
un polipéptido que comprende una cadena ligera que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 49 y una cadena pesada que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 50;
un polipéptido que comprende una cadena ligera que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 51 y una cadena pesada que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 52;
un polipéptido que comprende una cadena ligera que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 53 y una cadena pesada que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 54; y
un polipéptido que comprende una cadena ligera que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 55 y una cadena pesada que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 56.
4. La composición de la reivindicación 1, en la que
la primera molécula de unión comprende: una región variable de cadena ligera que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 7, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 8 y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 9; y una región variable de cadena pesada que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 10, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 11 y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 12; y
la segunda molécula de unión comprende: una región variable de cadena ligera que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 25, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 26 y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 27; y una región variable de cadena pesada que comprende, según se determinó de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 con la SEQ ID NO: 28, una región CDR2 con la SEQ ID NO: 29 y una región CDR3 con la SEQ ID NO: 30.
5. La composición de la reivindicación 1, en la que
la primera molécula de unión comprende una cadena ligera que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 45 y una cadena pesada que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 46, y
la segunda molécula de unión comprende una cadena ligera que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 51 y una cadena pesada que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 52.
6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la molécula de unión es un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno del mismo o un fármaco antivírico unido al anticuerpo.
7. La composición de la reivindicación 1 para su uso en el diagnóstico in vivo, prevención o tratamiento de una enfermedad provocada por el virus influenza A.
8. La composición de la reivindicación 1, en la que la composición está en forma de una solución inyectable estéril, una formulación liofilizada, una solución de jeringa precargada, una forma farmacéutica oral, una formulación para uso externo o un supositorio.
9. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en el diagnóstico in vivo, prevención o tratamiento de una enfermedad provocada por el virus influenza A, en la que el uso de la composición comprende:
i) administrar cantidades terapéuticamente eficaces de la primera molécula de unión y la segunda molécula de unión de la reivindicación 1 al mismo tiempo a un sujeto que tiene la enfermedad;
ii) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la primera molécula de unión de la reivindicación 1 a un sujeto que tiene la enfermedad, y después administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la segunda molécula de unión de la reivindicación 1 al sujeto; o
iii) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la segunda molécula de unión de la reivindicación 1 a un sujeto que tiene la enfermedad, y después administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la primera molécula de unión de la reivindicación 1 al sujeto.
10. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 9, en la que el uso de la composición comprende además administrar un fármaco antivírico, un inhibidor de la entrada del virus o un inhibidor de la adhesión del virus.
11. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el fármaco antivírico es un inhibidor de neuraminidasa, un inhibidor de hemaglutinina (HA), un inhibidor de ácido siálico, un inhibidor del canal iónico M2 o un inhibidor de ARN polimerasa.
12. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el fármaco antivírico se selecciona entre el grupo que consiste en Peramivir, Zanamivir, Oseltamivir, amantadina, rimantadina y Favipiravir.
13. Un método para diagnosticar la infección por el virus influenza A, comprendiendo el método las etapas de: i) poner en contacto la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 con una muestra; y ii) detectar una reacción entre la composición y la muestra.
14. Un kit para diagnosticar el virus influenza A, comprendiendo el kit:
i) una composición para diagnosticar el virus influenza de acuerdo con la reivindicación 1; y
ii) un recipiente.
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