KR102255099B1 - 2 이상의 인플루엔자 ａ 바이러스 중화 결합 분자를 포함하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인플루엔자 Ａ 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 단백질의 줄기 영역(stem region) 내 에피토프에 결합하는 2 이상의 인플루엔자 Ａ 바이러스 중화 결합 분자를 포함하는 조성물로서, i) H1, H2, H5 및 H9으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스 서브타입을 중화시킬 수 있는 제 1 결합 분자; 및 ii) H1, H3, H5, H7 및 H9으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스 서브타입을 중화시킬 수 있는 제 2 결합 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 혼합 조성물은 계통발생 그룹 1 및 2의 다중 인플루엔자 서브타입 둘 다를 효과적으로 중화시키며, 화학적 화합물과도 병용하여 사용할 수 있으므로, 인플루엔자 바이러스로 인한 질환의 예방 및 치료에 매우 유용하다.

Description

2 이상의 인플루엔자 Ａ 바이러스 중화 결합 분자를 포함하는 조성물{Composition comprising two or more influenza A viruses neutralizing binding molecules}
본 발명은 2 이상의 인플루엔자 Ａ 바이러스 중화 결합 분자를 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 인플루엔자 A 바이러스에 감염된 후 회복된 환자의 혈액에서 선별된 인간 B 세포가 생산하는, 인플루엔자 A 바이러스에 대하여 중화 활성을 가지는 2 이상의 인간 단일클론 항체들의 혼합 조성물에 관한 것이다.
독감은 인플루엔자 바이러스(Influenza virus)가 호흡기에 감염되며 나타나는 질병으로 겨울철에 흔하게 나타나며, 감염성이 매우 높아 전 연령층을 대상으로 쉽게 전파되는데 특히 노약자층이 취약한 것으로 알려져 있다(Treanor J, 2004, N Engl J Med . 350(3):218-20). 오르쏘믹소바이러스(Orthomyxoviridae)에 속하는 외피 보유 바이러스(enveloped virus)로 8개의 분절로 된 음성-극성 및 단일 가닥(Negative-sense, single-strand)의 RNA(ribonucleic acid)를 유전체로 가지는 인플루엔자 바이러스는 A, B 및 C 그룹으로 분류되며 인플루엔자 A 바이러스(influenza A virus)의 경우 주요 표면 단백질인 HA(hemagglutinin)와 NA(neuraminidase)에 따라 다시 여러 서브타입(subtype)으로 나뉜다. 현재까지 17 종의 HA와 10 종의 NA가 알려져 있다(Cheung TK and Poon LL 2007, Ann N Y Acad Sci. 1102:1-25; Tong S, et al. 2012, Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109:4269-4274). 인플루엔자 바이러스는 종류에 따라 조류, 돼지 및 사람에 감염될 수 있다는 특성과 RNA 분절로 되어 있는 유전체로 인하여 다양한 유전자의 조합과 돌연변이로 계속해서 변종 바이러스가 발생한다(Treanor J, 2004. N Engl J Med. 350(3):218-20). 이런 지속적인 변이로 인하여 영구적인 면역력을 얻기가 힘들므로 현재 가장 효과적이라고 생각되는 예방법은 매년 유행할 것으로 예측되는 인플루엔자 바이러스에 대한 백신(vaccine)을 접종하여 특정 타입(type)에 맞는 면역력을 매년 형성시키는 것이다.
현재 매년 접종하고 있는 인플루엔자 바이러스 백신은 3가 백신으로 influenza A의 H1과 H3 subtype의 HA와 influenza B type의 HA를 섞어 사용하고 있다.
인플루엔자 바이러스에 대한 백신은 일반적으로 계란을 이용하여 생산되는데, 이는 많은 시간을 요하게 되는 비효율적 방법이다. 그러므로 거의 매년 짧은 시간에 충분한 양의 백신을 생산하는데 문제점이 발생한다. 이러한 문제를 해결하고자 세포 배양(cell culture)을 이용한 백신 생산 방법이 여러 제약회사(GSK, Baxter)에서 활발히 진행되고 있다. 또한 인플루엔자 바이러스의 유행성 감염(pandemic infection)이 유발될 경우 이에 대한 신속한 백신 개발은 시간상 극히 어려움을 초래하고 있는 실정이다. 항 바이러스제(antiviral drug) 또한 돌연변이로 저항성을 갖는 바이러스의 출현 문제로 인하여 100% 신뢰할 수 없다.
이러한 문제점을 보완하기 위하여 인플루엔자 바이러스에 대한 항체의 사용 및 개발이 수행되었으며, 근래에 활발하게 진행되고 있다(Throsby et al, 2008, PloS One 3 (e3942); Sui et al., 2009, Nature structural & molecular biology . 16 (265-273); Simmons et al, 2007, PloS Medicine 4 (e178); Wrammert et al., 2011, J Exp Med. 208 (181-193); Corti et al., 2011, Science 333 (850-856)).
회복된 환자의 혈액 생산물은 다양한 바이러스에 감염된 환자의 치료에 이용되어 왔으며 유행성 독감 감염(pandemic flu infection)의 치료에도 쓰여왔다. 예로서, 스페인 독감 바이러스(Spanish influenza virus)에 감염된 환자들이 폐렴 증상을 수반한 경우 상기 독감에 감염된 후 회복된 환자들로부터 채취한 혈액 생산물(blood product)을 치료에 사용하였다(Luke et al., 2006. Annals of internal medicine. 145:599). 이처럼 하이퍼 면역글로블린(Hyper immune globulin:IgIv)은 인간 혈장에서 정제되어 다양한 바이러스에 감염된 환자의 치료에 이용되나, 상기와 같이 제조된 생산물은 잠정적 감염원에 대하여 안전하지 않고, 대량 생산에 비효율적이다.
최근 본 출원인이 특허출원한 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항체는 다양한 인플루엔자의 subtype에 대하여 중화 효능을 보였으며, 특히 한국특허출원 제10-2011-0020061호에 개시된 항체는 주로 계통발생 그룹 1(H1, H2, H5, H9)에, 한국특허출원 제10-2012-0107512호에 개시된 항체는 주로 계통발생 그룹 2 (H3, H7)에 중화 효능을 나타내었다. 이에 두 종류 이상의 항체를 섞어 동시에 투여함으로써 유행할 가능성이 있는 그룹 1과 그룹 2에 속한 바이러스에 대하여 모두 예방과 치료 효과를 보일 수 있는 칵테일 제제를 개발하고자 하였다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 계통발생 그룹 1과 계통발생 그룹 2 모두에 중화 효능을 나타내는, 2 이상의 인플루엔자 Ａ 바이러스 중화 결합 분자를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 조성물을 투여하여 인플루엔자 A 바이러스 유래 질환의 진단, 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 조성물을 이용하여 인플루엔자 A 바이러스 감염 여부 진단 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 조성물을 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 진단용 키트를 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하고자, 본 발명은 인플루엔자 Ａ 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 단백질의 줄기 영역(stem region) 내 에피토프에 결합하는 2 이상의 인플루엔자 Ａ 바이러스 중화 결합 분자를 포함하는 조성물로서,
i) H1, H2, H5 및 H9으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스 서브타입을 중화시킬 수 있는 제 1 결합 분자; 및
ii) H1, H3, H5, H7 및 H9으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스 서브타입을 중화시킬 수 있는 제 2 결합 분자
를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 제 1 결합 분자의 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 18, 38, 40, 291, 292 및 318의 아미노산 잔기(residue)를 포함할 수 있다. 또한, 제 1 결합 분자의 에피토프는 HA2 폴리펩티드의 위치 18, 19, 20, 21, 41, 42, 45, 48, 49, 52 및 53의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 제 1 결합 분자의 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 18, 38, 40, 291, 292 및 318의 아미노산 잔기(residue)를 포함하고, HA2 폴리펩티드의 위치 18, 19, 20, 21, 41, 42, 45, 48, 49, 52 및 53의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 제 2 결합 분자의 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 278 및 318의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 또한, 제 2 결합 분자의 에피토프는 HA2 폴리펩티드의 위치 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52, 및 53 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 또한, 제 2 결합 분자의 에피토프는 HA 제1 단량체(monomer)의 상기 HA1 폴리펩티드 및/또는 HA2 폴리펩티드의 위치의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 제1 단량체에 인접한 제2 단량체의 HA1 폴리펩티드의 위치 25, 32 및 33 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 제 2 결합 분자의 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 278 및 318의 아미노산 잔기를 포함하고, HA2 폴리펩티드의 위치 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52, 및 53 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 제 2 결합 분자의 에피토프는 HA 제1 단량체(monomer)의 상기 HA1 폴리펩티드 및 HA2 폴리펩티드의 위치의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 제1 단량체에 인접한 제2 단량체의 HA1 폴리펩티드의 위치 25, 32 및 33 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 제 2 결합 분자의 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 278 및 318의 아미노산 잔기를 포함하고, HA2 폴리펩티드의 위치 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52, 53, 58 및 99의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 제 2 결합 분자의 에피토프는 HA 제1 단량체(monomer)의 상기 HA1 폴리펩티드 및 HA2 폴리펩티드의 위치의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 제1 단량체에 인접한 제2 단량체의 HA1 폴리펩티드의 위치 25, 27, 32 및 33 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 제 2 결합 분자의 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 54, 55, 278, 291 및 318의 아미노산 잔기를 포함하고, HA2 폴리펩티드의 위치 19, 20, 21, 38, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 52, 53, 56, 57 및 60의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 제 2 결합 분자의 에피토프는 HA 제1 단량체(monomer)의 상기 HA1 폴리펩티드 및 HA2 폴리펩티드의 위치의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 HA 제1 단량체에 인접한 HA 제2 단량체의 HA1 폴리펩티드의 위치 25, 32, 33, 310, 311, 및 312의 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
상기 에피토프의 아미노산 위치 넘버링(numbering)은 H3 HA 넘버링에 기초한다.
본 발명의 결합분자는 바이러스와 표적 세포의 막 융합을 억제할 수 있다. 또한, 본 발명의 결합분자는 항체의 Fc 기능, 즉 ADCC, CDC에 의해 바이러스를 억제할 수 있다.
본 발명에 따른 제 1 결합분자는 인플루엔자 바이러스 A 또는 그것의 단편에 바람직하게는 1.0×10-8M 미만, 더욱 바람직하게는 1.0×10-9M 미만, 더욱 바람직하게는 1.0×10-10M 미만, 더욱 바람직하게는 1.0×10-11M 미만, 가장 바람직하게는 1.0×10-12M 미만의 결합친화도(KD)로 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 제 2 결합분자는 인플루엔자 바이러스 A 또는 그것의 단편에 바람직하게는 1.0×10-6M 미만, 더욱 바람직하게는 1.0×10-7M 미만, 더욱 바람직하게는 1.0×10-8M 미만, 더욱 바람직하게는 1.0×10-9M 미만, 더욱 바람직하게는 1.0×10-10M 미만, 더욱 바람직하게는 1.0×10-11M 미만, 가장 바람직하게는 1.0×10-12M 미만의 결합친화도(KD)로 결합할 수 있다.
상기 결합친화도(KD)는 표면 플라즈몬 공명, 예를 들면 BIACORE 시스템을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 1 결합 분자는 H1 서브타입에 2.0 ug/ml 이하, H2 서브타입에 7.0 ug/ml 이하, H5 서브타입에 7.0 ug/ml 이하, 또는 H9 서브타입에 4.0 ug/ml 이하의 EC50값을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 2 결합 분자는 H3 서브타입에 40.0 ug/ml 이하, H5 서브타입에 212.0 ug/ml 이하, H7 서브타입에 8.0 ug/ml 이하, 또는 H9 서브타입에 8.0 ug/ml 이하의 EC50값을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 H1 서브타입에 3.0 ug/ml 이하, H2 서브타입에 13.0 ug/ml 이하, H3 서브타입에 70.0 ug/ml 이하, H5 서브타입에 9.0 ug/ml 이하, H7 서브타입에 14.0 ug/ml 이하, 또는 H9 서브타입에 6.0 ug/ml 이하의 EC50값을 가질 수 있다.
상기 EC50값은 마이크로중화시험법을 이용하여 측정될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 1 결합 분자는
카밧 방법(Kabat method)에 따라
i) 서열번호 1의 CDR1 영역, 서열번호 2의 CDR2 영역, 및 서열번호 3의 CDR3 영역;
ii) 서열번호 4의 CDR1 영역, 서열번호 5의 CDR2 영역, 및 서열번호 6의 CDR3 영역;
iii) 서열번호 7의 CDR1 영역, 서열번호 8의 CDR2 영역, 및 서열번호 9의 CDR3 영역;
iv) 서열번호 10의 CDR1 영역, 서열번호 11의 CDR2 영역, 및 서열번호 12의 CDR3 영역;
v) 서열번호 13의 CDR1 영역, 서열번호 14의 CDR2 영역, 및 서열번호 15의 CDR3 영역; 및
vi) 서열번호 16의 CDR1 영역, 서열번호 17의 CDR2 영역, 및 서열번호 18의 CDR3 영역
으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 1 결합 분자는
카밧 방법(Kabat method)에 따라
서열번호 1의 CDR1 영역, 서열번호 2의 CDR2 영역, 및 서열번호 3의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역; 및
서열번호 4의 CDR1 영역, 서열번호 5의 CDR2 영역, 및 서열번호 6의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 1 결합 분자는
카밧 방법(Kabat method)에 따라
서열번호 7의 CDR1 영역, 서열번호 8의 CDR2 영역, 및 서열번호 9의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역; 및
서열번호 10의 CDR1 영역, 서열번호 11의 CDR2 영역, 및 서열번호 12의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 1 결합 분자는
카밧 방법(Kabat method)에 따라
서열번호 13의 CDR1 영역, 서열번호 14의 CDR2 영역, 및 서열번호 15의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역; 및
서열번호 16의 CDR1 영역, 서열번호 17의 CDR2 영역, 및 서열번호 18의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 2 결합 분자는
카밧 방법(Kabat method)에 따라
i) 서열번호 19의 CDR1 영역, 서열번호 20의 CDR2 영역, 및 서열번호 21의 CDR3 영역;
ii) 서열번호 22의 CDR1 영역, 서열번호 23의 CDR2 영역, 및 서열번호 24의 CDR3 영역;
iii) 서열번호 25의 CDR1 영역, 서열번호 26의 CDR2 영역, 및 서열번호 27의 CDR3 영역;
iv) 서열번호 28의 CDR1 영역, 서열번호 29의 CDR2 영역, 및 서열번호 30의 CDR3 영역;
v) 서열번호 31의 CDR1 영역, 서열번호 32의 CDR2 영역, 및 서열번호 33의 CDR3 영역;
vi) 서열번호 34의 CDR1 영역, 서열번호 35의 CDR2 영역, 및 서열번호 36의 CDR3 영역;
vii) 서열번호 37의 CDR1 영역, 서열번호 38의 CDR2 영역, 및 서열번호 39의 CDR3 영역; 및
viii) 서열번호 40의 CDR1 영역, 서열번호 41의 CDR2 영역, 및 서열번호 42의 CDR3 영역
으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 2 결합 분자는
카밧 방법(Kabat method)에 따라
서열번호 19의 CDR1 영역, 서열번호 20의 CDR2 영역, 및 서열번호 21의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
서열번호 22의 CDR1 영역, 서열번호 23의 CDR2 영역, 및 서열번호 24의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 2 결합 분자는
카밧 방법(Kabat method)에 따라
서열번호 25의 CDR1 영역, 서열번호 26의 CDR2 영역, 및 서열번호 27의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
서열번호 28의 CDR1 영역, 서열번호 29의 CDR2 영역, 및 서열번호 30의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 2 결합 분자는
카밧 방법(Kabat method)에 따라
서열번호 31의 CDR1 영역, 서열번호 32의 CDR2 영역, 및 서열번호 33의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
서열번호 34의 CDR1 영역, 서열번호 35의 CDR2 영역, 및 서열번호 36의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 2 결합 분자는
카밧 방법(Kabat method)에 따라
서열번호 37의 CDR1 영역, 서열번호 38의 CDR2 영역, 및 서열번호 39의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
서열번호 40의 CDR1 영역, 서열번호 41의 CDR2 영역, 및 서열번호 42의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 1 결합 분자는
카밧 방법(Kabat method)에 따라
서열번호 7의 CDR1 영역, 서열번호 8의 CDR2 영역, 및 서열번호 9의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및;
서열번호 10의 CDR1 영역, 서열번호 11의 CDR2 영역, 및 서열번호 12의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하고,
상기 제 2 결합 분자는
카밧 방법(Kabat method)에 따라
서열번호 25의 CDR1 영역, 서열번호 26의 CDR2 영역, 및 서열번호 27의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역; 및
서열번호 28의 CDR1 영역, 서열번호 29의 CDR2 영역, 및 서열번호 30의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함한다.
본 발명에 있어서, 가변영역의 CDR은 Kabat 등에 의해 고안된 시스템에 따라 통상적인 방법으로 결정되었다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th), National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 본 발명에 사용된 CDR 넘버링은 Kabat 방법을 사용했지만, 이외에 IMGT 방법, Chothia 방법, AbM 방법 등 다른 방법에 따라 결정된 CDR을 포함하는 결합분자도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 1 결합 분자는 서열번호 43 내지 48로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 1 결합 분자는 서열번호 43의 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 44의 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 1 결합 분자는 서열번호 45의 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 46의 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 1 결합 분자는 서열번호 47의 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 48의 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 2 결합 분자는 서열번호 49 내지 56으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 2 결합 분자는 서열번호 49의 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 50의 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 2 결합 분자는 서열번호 51의 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 52의 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 2 결합 분자는 서열번호 53의 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 54의 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 2 결합 분자는 서열번호 55의 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 56의 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제 1 결합 분자는
서열번호 45의 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 46의 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고,
상기 제 2 결합 분자는
서열번호 51의 폴리펩티드 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 52의 폴리펩티드를 포함하는 중쇄를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합 분자는 항체 또는 그것의 항원 결합 단편이다. 또한, 상기 항체에 약물이 추가로 부착될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 인플루엔자 바이러스 유래 질환의 예방 또는 치료용일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 인플루엔자 바이러스 유래 질환의 진단용일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 멸균 주사용액, 동결건조(lyophilized) 제형, 사전 충전식 주사(pre-filled syringe) 용액제, 경구형 제형, 외용제 또는 좌제일 수 있으나, 이것에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 인플루엔자 바이러스로 인하여 발생하는 질환을 가진 대상에 상기 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스 유래한 질환 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
i) 인플루엔자 바이러스로 인하여 발생하는 질환을 가진 대상에 상기 제 1 결합 분자 및 제2 결합 분자를 치료학적으로 유효한 양으로 동시에 투여하는 단계;
ii) 인플루엔자 바이러스로 인하여 발생하는 질환을 가진 대상에 상기 제 1 결합 분자를 치료학적으로 유효한 양으로 투여한 다음 후속적으로 상기 대상에 제1항의 제 2 결합 분자를 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계; 또는
iii) 인플루엔자 바이러스로 인하여 발생하는 질환을 가진 대상에 상기 제 2 결합 분자를 치료학적으로 유효한 양으로 투여한 다음 후속적으로 상기 대상에 제1항의 제 1 결합 분자를 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계
를 포함하는 인플루엔자 바이러스 유래한 질환의 진단, 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명은
i) 인플루엔자 A 바이러스로 인하여 발생하는 질환을 가진 대상에 상기 제 1 결합 분자를 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계; 및
ii) 후속적으로 상기 대상에 상기 제 2 결합 분자를 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계
를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 유래한 질환 치료 방법을 제공한다.
또 다른 일 구체예에서, 본 발명은
i) 인플루엔자 A 바이러스로 인하여 발생하는 질환을 가진 대상에 상기 제 2 결합 분자를 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계; 및
ii) 후속적으로 상기 대상에 상기 제 1 결합 분자를 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계
를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 유래한 질환 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 진단, 예방, 또는 치료 방법은 항-바이러스 약물, 바이러스 진입 억제제 또는 바이러스 부착 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 항-바이러스 약물은 뉴라미니다제 억제제, 헤마글루티닌(HA) 억제제, 시알산 억제제, M2 이온 채널 억제제 또는 RNA 폴리머라제 억제제일 수 있으나, 이것에 한정되는 것은 아니다.
상기 뉴라미니다제 억제제는 페라미비르(Peramivir), 자나미비르(Zanamivir) 또는 오셀타미비르(Oseltamivir), 라니나미비르(Laninamivir)일 수 있으나, 이것에 한정되는 것은 아니다.
상기 M2 이온 채널 억제제는 아만타딘(Amantadine) 또는 리만타딘(Rimantadine)일 수 있으나, 이것에 한정되는 것은 아니다.
상기 RNA 폴리머라제 억제제는 파비피라비르(Favipiravir)일 수 있으나, 이것에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 인플루엔자 바이러스로 인하여 발생하는 질환을 가진 대상에 상기 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스 유래한 질환 예방 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명은
i) 인플루엔자 A 바이러스로 인하여 발생하는 질환을 가진 대상에 상기 제 1 결합 분자를 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계; 및
ii) 상기 대상에 상기 제 2 결합 분자를 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계
를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 유래한 질환 예방 방법을 제공한다.
또 다른 일 구체예에서, 본 발명은
i) 인플루엔자 A 바이러스로 인하여 발생하는 질환을 가진 대상에 상기 제 2 결합 분자를 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계; 및
ii) 상기 대상에 상기 제 1 결합 분자를 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계
를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 유래한 질환 예방 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
i) 샘플과 상기 조성물을 접촉시키는 단계; 및
ii) 상기 조성물과 샘플의 반응을 검출하는 단계
를 포함하는 환자의 인플루엔자 바이러스 감염 여부 진단 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 i) 상기 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물; 및 ii) 용기를 포함하는 인플루엔자 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 2 이상의 인플루엔자 Ａ 바이러스 중화 결합 분자를 포함하는 조성물은 결합 분자 간에 상호 간섭하지 않고 각각의 서브타입에 대한 결합 분자의 중화 효능을 유지하여, 결과적으로 부가적인(additive) 효과를 나타내었다. 본 발명의 조성물은 화학적 화합물과의 병용 투여 시에도 항진된(synergistic) 효과를 나타내었다. 본 발명의 혼합 조성물은 계통발생 그룹 1 및 2의 다중 인플루엔자 서브타입 둘 다를 효과적으로 중화시키며, 화학적 화합물과도 병용하여 사용할 수 있으므로, 인플루엔자 바이러스로 인한 질환의 예방 및 치료에 매우 유용하다.
도 1은 CT104, CT120 및 CT123 항체를 대상으로 한 단량체 헤마글루티닌(Hemagglutinin; 이하 "HA"라 칭함) 및 삼량체 HA에 대한 항체 결합력을 나타내는 그래프이다.
도 2는 CT147, CT149, CT164, 및 CT166 항체를 대상으로 한 단량체 HA의 서브유닛(HA1) 및 삼량체 HA에 대한 항체 결합력을 나타내는 그래프이다.
도 3은 pCT145(A)와 pCT147(B)의 벡터 지도이다:
A: pCT145 벡터;
B; pCT147 벡터;
pac: Puromycin N-acetyl-tranferase (PAC)를 코딩하는 유전자; 및
DS: dyad symmetry 서열 (EBNA1이 oriP에 있는 dyad symmetry (DS) element에 결합함).
도 4는 본 발명의 항-인플루엔자 A 바이러스 단일클론 항체를 발현하는 발현 벡터 지도이다.
도 5a 내지 5d는 H1(H1N1), H2 (H2N2), H3(H3N2) 또는 H5(H5N1) 서브타입의 HA를 발현하는 세포주를 이용하여 낮은 pH에 노출되었을 때 HA에 의해서 유도되는 막융합에 대한 CT120과 CT149 항체의 억제 능력을 검증한 것이다.
도 6a는 본 발명의 CT120, CT149 항체를 이용한 in vitro ADCC assay 결과이고, 도 6b는 본 발명의 CT120, CT149 항체를 이용한 in vitro CDC assay 결과이다.
도 7은 마우스 Fc를 가지는 CT149 항체를 이용한 동물실험 결과이다.
도 8a는 CT120 항체의 A/Vietnam/1203/04 (H5N1) 바이러스의 HA 단백질에 결합하는 부위를 나타낸 아미노산 서열과 모식도이고, 도 8b, 8c는 각각 CT149 항체의 A/Aichi/1968 (H3N2), A/Anhui/1/2013(H7N9) 바이러스의 HA 단백질에 결합하는 부위를 나타낸 아미노산 서열과 모식도이다.
도 9는 H1(H1N1), H3(H3N2) 또는 H5(H5N1) 서브타입의 HA를 발현하는 세포주를 이용하여 HA에 대한 항체들(CT120, CT149, CT120와 CT149의 혼합항체)의 결합력을 CELISA 방법으로 검증한 그래프이다.
도 10은 마우스에 CT120과 CT149 항체를 단독 또는 혼합 투여하여 H1N1에 대한 예방 및 치료 효과를 확인한 동물실험 결과이다.
도 11은 마우스에 CT120과 CT149 항체를 단독 또는 혼합 투여하여 H3N2에 대한 예방 및 치료 효과를 확인한 동물실험 결과이다.
도 12는 마우스에 CT120과 CT149 항체를 단독 또는 혼합 투여하여 H5N1에 대한 치료 효과를 확인한 동물실험 결과이다.
도 13은 마우스에 CT149 항체를 투여하여 H7N9에 대한 치료 효과를 확인한 동물실험 결과이다.
도 14는 H1N1 바이러스 또는 H3N2 바이러스에 대하여 최적화되지 않은 농도의 Peramivir와 항체를 단독 또는 병용 투여하였을 경우 마우스의 사망률 변화를 확인한 결과이다.
도 15는 CT149 항체와 CT120/CT149 혼합항체의 H7N9(A/Anhui/1/2013, A/Shanghai/2/2013)에 대한 MN assay 결과이다.
도 16a는 CT149 항체와 CT120/CT149 혼합항체의 H7N9(A/Shanghai/2/2013) 야생형에 대한 MN assay 결과이고, 도 16b는 CT149 항체와 CT120/CT149 혼합항체의 NAI 내성 H7N9(A/Shanghai/2/2013) R292K에 대한 MN assay 결과이다.
도 17a는 CT120 항체와 CT120/CT149 혼합항체의 H1N1(A/California/04/2009) 야생형에 대한 MN assay 결과이고, 도 17b는 CT120 항체와 CT120/CT149 혼합항체의 NAI 내성 H1N1(A/California/04/2009) H275Y에 대한 MN assay 결과이다.
도 18a는 CT120 항체와 CT149 항체의 A/Wisconsin/67/05 (H3N2) 야생형과 HA D19N 돌연변이체에 대한 면역형광염색 결과이고, 도 16b는 CT120 항체와 CT149 항체의 A/Anhui/1/2013 (H7N9) 야생형과 HA D19N 돌연변이체에 대한 면역형광염색 결과이다.
이하 본 발명의 단어를 다음과 같이 정의한다.
"인플루엔자 A 바이러스(influenza A virus)"는 오르쏘믹소바이러스 (Orthomyxoviridae)에 속하는 외피 보유 바이러스(enveloped virus)로 8개의 분절로 된 음성-극성 및 단일 가닥(Negative-sense, single-strand)의 RNA(ribonucleic acid)를 유전체로 가지고, A, B 및 C 그룹으로 분류되며, 주요 표면 단백질인 HA(hemaggutinin)와 NA(neuraminidase)에 따라 다시 여러 서브타입(subtype)으로 나뉜다. 현재까지 17종의 HA와 10종의 NA가 알려져 있다.
본 발명에 기재된 "H1 서브타입"에는 H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8, H1N9 및 H1N10이 포함된다.
본 발명에 기재된 "H2 서브타입"에는 H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N6, H2N7, H2N8, H2N9 및 H2N10 이 포함된다.
본 발명에 기재된 "H5 서브타입"에는 H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8, H5N9 및 H5N10 이 포함된다.
본 발명에 기재된 "H9 서브타입"에는 H9N1, H9N2, H9N3, H9N4, H9N5, H9N6, H9N7, H9N8, H9N9 및 H9N10 이 포함된다.
본 발명에 기재된 "H3 서브타입"에는 H3N1, H3N2, H3N3, H3N4, H3N5, H3N6, H3N7, H3N8, H3N9 및 H3N10 이 포함된다.
본 발명에 기재된 "H7 서브타입"에는 H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N5, H7N6, H7N7, H7N8, H7N9 및 H7N10 이 포함된다.
"헤마글루티닌(hemagglutinin, 이하 "HA"라 칭함)"은 인플루엔자 바이러스의 외피(envelope) 당단백질을 나타낸다. HA는 인플루엔자 바이러스가 숙주 세포에 흡착하여 침투하는 것을 매개한다. 현재까지 17 종류의 서브타입이 보고되어 있다.
본 발명에서 사용되는 “결합 분자”는 키메라, 인간화 또는 인간 단일클론 항체와 같은 단일클론 항체를 포함하는 온전한(intact) 이뮤노글로블린(immunoglobulin), 또는 항원에 결합하는 이뮤노글로믈린, 예를 들면 인플루엔자 A 바이러스의 단량체 HA 또는 삼량체 HA와의 결합을 위해 온전한(intact) 이뮤노글로블린과 경쟁하는 이뮤노글로블린 단편을 포함하는 가변성 도메인 또는 기질과 결합 가능한 효소, 수용체, 단백질을 뜻한다. 구조와는 상관없이 항원-결합 단편은 온전한(intact) 이뮤노글로블린에 의해 인식된 동일한 항원과 결합된다. 항원-결합 단편은 결합 분자의 아미노산 서열의 2개 이상의 연속기, 20개 이상의 연속 아미노산 잔기, 25개 이상의 연속 아미노산 잔기, 30개 이상의 연속 아미노산 잔기, 35개 이상의 연속 아미노산 잔기, 40개 이상의 연속 아미노산 잔기, 50개 이상의 연속 아미노산 잔기, 60개 이상의 연속 아미노산 잔기, 70개 이상의 연속 아미노산 잔기, 80개 이상의 연속 아미노산 잔기, 90개 이상의 연속 아미노산 잔기, 100개 이상의 연속 아미노산 잔기, 125개 이상의 연속 아미노산 잔기, 150개 이상의 연속 아미노산 잔기, 175개 이상 연속 아미노산 잔기, 200개 이상의 연속 아미노산 잔기, 또는 250개 이상의 연속 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. “항원-결합 단편”은 특히 Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일-쇄 항체(scFv), 2가(bivalent) 단일-쇄 항체, 단일-쇄 파지 항체, 디아바디(diabody), 트리아바디, 테트라바디, 폴리펩티드로의 특정 항원에 결합하기에 충분한 이뮤노글로브린의 하나 이상의 단편을 함유하는 폴리펩티드 등을 포함한다. 상기 단편은 합성으로 또는 완전한 이뮤노글로블린의 효소적 또는 화학적 분해에 의해 생성되거나, 재조합 DNA 기술에 의해 유전공학적으로 생성될 수 있다. 생성 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명에서 사용되는 “약제학적으로 허용 가능한 부형제”라는 용어는 용인 가능한 또는 편리한 투약 형태를 제조하기 위한 약물, 제제 또는 결합 분자와 같은 활성 분자로 조합되는 불활성 물질을 의미한다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 비독성이거나, 적어도 독성이 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 이의 의도된 용도를 위해 허용될 수 있는 부형제이고, 약물, 제제 또는 결합 분제를 포함하는 제형화의 다른 성분과 양립할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 “치료학적으로 유효한 양”이라는 용어는 인플루엔자 A 바이러스의 노출 전 또는 노출 후에 예방 또는 치료에 유효한 본 발명의 결합 분자의 양을 나타낸다.
본 발명에 따른 물질을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 멸균 주사용액, 사전 충전식 주사(pre-filled syringe)용액제의 형태 또는 동결건조(lyophilized)된 형태로 제형화할 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
진단 조성물에 사용되는 본 발명의 상기 화합물들은 검출가능하게 표식되는 것이 바람직하다. 생분자들을 표식시키는데 사용 가능한 다양한 방법들이 당업자에게 잘 알려져 있고, 본 발명의 범주 내에서 고려된다. 상기 방법들은 Tijssen, 'Practice and theory of enzyme immuno assays', Burden, RH and von Knippenburg (Eds), Volume 15 (1985), 'Basic methods in molecular biology'; Davis LG, Dibmer MD; Battey Elsevier (1990), Mayer et al., (Eds) 'Immunochemical methods in cell and molecular biology' Academic Press, London(1987), 'Methods in Enzymology', Academic Press, Inc.에 기술되어 있다.
당업자에게 공지되어 있는 표식 방법과 많은 다른 표식들이 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 표식 종류의 예로는 효소, 방사성 동위원소, 콜로이드금속, 형광 화합물, 화학발광 화합물 및 생발광 화합물이 있다.
통상적으로 사용되는 표식들은 형광물질(가령, 플루레신, 로다민, 텍사스 레드 등), 효소(가령, 고추냉이 퍼옥시다아제, β-갈락토시다아제, 알칼리포스파타 아제), 방사성 동위원소(가령, 32 P 또는 125I), 바이오틴, 디곡시게닌, 콜로이드 금속, 화학발광 또는 생발광 화합물(가령, 디옥세탄, 루미놀 또는 아크리디늄)을 포함한다. 효소 또는 바이오티닐기의 공유 결합법, 요오드화법, 인산화법, 바이오틴화법 등과 같은 표식 방법들이 당 분야에 잘 알려져 있다.
검출 방법들로는 오토라디오그래피, 형광 현미경, 직접 및 간접 효소반응 등이 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 통상적으로 사용되는 검출 분석법으로는 방사성 동위원소 또는 비-방사성 동위원소 방법이 있다. 이들은 그 중에서도 웨스턴블롯팅, 오버레이-분석법, RIA(Radioimmuno Assay) 및 IRMA(ImmuneRadioimmunometric Assay), EIA(Enzyme Immuno Assay), ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), FIA(Fluorescent Immuno Assay) 및 CLIA(Chemioluminescent Immune Assay)이 있다.
본 발명에 따른 항체는 약제가 결합된 항체-약물 접합체의 형태로 사용될 수 있다. 약물을 국소 전달하기 위해 항체-약물 접합체 (ADC), 즉 면역접합체를 사용하게 되면 상기 약물 모이어티를 감염된 세포에 표적화 전달할 수 있는데, 상기 약물 작용제를 접합시키지 않은 채로 투여하게 되면, 정상 세포에 대해서도 허용될 수 없는 수준의 독성이 야기될 수 있기 때문이다. 약물-연결성 및 약물-방출성 뿐만 아니라 폴리클로날 및 모노클로날 항체 (mAb)의 선택성을 높임으로써 ADC의 최대 효능과 최소 독성을 개선할 수 있다.
약물 모이어티를 항체에 부착시키는, 즉 공유 결합을 통하여 연결시키는 통상적인 수단으로는, 일반적으로 약물 모이어티가 항체 상의 수많은 부위에 부착되는 불균질한 분자 혼합물이 유발된다. 예를 들어, 세포독성 약물을 전형적으로, 종종 항체의 수 많은 리신 잔기를 통하여 항체와 접합시켜 불균질한 항체-약물 접합체 혼합물을 생성킬 수 있다. 반응 조건에 따라서, 이러한 불균질한 혼합물은 전형적으로, 약물 모이어티에 부착된 항체 분포도가 0 내지 약 8 이상이다. 또한, 특별한 정수비의 약물 모이어티 대 항체를 수반한 접합체의 각 아군은, 약물 모이어티가 항체 상의 각종 부위에 부착되는 잠재적으로 불균질한 혼합물이다. 항체는 크고, 복잡하며 구조적으로 다양한 생체 분자이고, 종종 많은 반응성 관능기를 갖고 있다. 링커 시약 및 약물-링커 중간체와의 반응성은 pH, 농도, 염 농도 및 조용매와 같은 요인들에 의해 좌우된다.
본 발명에서는 기 특허출원(한국특허출원 제10-2011-0020061호, 한국특허출원 제10-2012-0107512호)된 항체들을 혼합한 칵테일 조성물의 계통발생 그룹 1 또는 2 서브타입 바이러스에 대한 반응성을 마이크로 중화 시험법(microneutralization test: 이하 "MN 테스트"라 칭함)으로 확인하였다. 이 중 그룹 1에 대하여 특이적으로 중화능을 갖는 CT120과 그룹 1의 일부와 그룹 2에 대하여 중화능을 나타내는 CT149를 혼합하고 그 전후의 결합력과 중화 능력을 확인하였다. 본 출원인이 기출원한 한국특허출원 제10-2011-0020061호 및 한국특허출원 제10-2012-0107512호는 본 발명의 명세서에 참조로서 통합된다.
항체들의 결합력은 표면 플라스몬 공명 기술을 이용한 방법과 H1, H3 또는 H5를 발현하는 세포주를 이용하여 CELISA(CELLULAR ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) 방법으로 확인하였다. 그 결과 CT120과 CT149는 각각 H1과 H5의 HA를 발현하는 세포주에 결합을 하였으며 이들을 혼합하였을 경우 유사한 결합력을 나타내었다. CT149는 H3의 HA를 발현하는 세포주를 이용한 CELISA에서 결합능을 나타내었으나 CT120은 결합을 하지 못했다. 이들을 혼합하여 CELISA를 수행하였을 경우 CT120은 CT149의 결합을 저해하지 않았다.
CT120과 CT149를 혼합하기 전후의 중화 능력은 마이크로 중화 시험법을 이용하여 측정되었다. 그 결과 CT120과 CT149는 각각의 원 중화능을 나타내었으며 두 항체를 혼합하였을 경우 간섭효과 없이 효과가 있는 항체의 중화능을 나타내었으며 그 결과 사용한 그룹 1과 그룹 2의 인플루엔자 A 바이러스에 대하여 모두 중화 효과를 나타내었다.
생체 내에서의 중화 능력을 알아보기 위하여 인플루엔자 A 바이러스를 쥐에 감염시키기 전 후에 CT120과 CT149를 각각, 또는 혼합하여 투여하였다. 그 결과 항체 혼합물(본 발명에서 CT-P27이라 칭함)을 투여할 경우 각 항체의 효능을 각각 반영하거나 합쳐진 효능을 나타내었으며 상호 간섭하여 저해하지는 않았다.
CT120과 CT149는 항체의 혼합투여뿐 아니라 화학적 화합물과의 병용투여에서도 항진된 중화 효과를 나타내었다. 페라미비르(Peramivir)는 인플루엔자 A 감염 시 사용하는 뉴라미니다제 억제제(neuraminidase inhibitor)이다. 쥐에 인플루엔자 A 바이러스를 감염 시키고 중화효과를 나타내기 힘든 양의 CT120 혹은 CT149를 마찬가지로 낮은 농도의 페라미비르와 병용투여할 경우, 단독 투여와 비교하여 항진된 효능을 나타내었다.
이에 본 발명에서는 CT120으로 대표되는 그룹 1 인플루엔자 A 바이러스에 대하여 효과가 있는 항체 (CT104, CT120, CT123)와 CT149로 대표되는 그룹 2 인플루엔자 A 바이러스에 대하여 효과가 있는 항체 (CT147, CT149, CT164, CT166)를 혼합하여 투여할 경우 그룹 1과 2의 인플루엔자 A 바이러스에 대하여 모두 중화 효능을 나타냄을 확인하였다. 또한 각 항체를 화학적 치료제와 병용 투여하였을 경우에도 항진된 중화 효능을 나타냄을 확인하였다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 인용된 문헌은 본 발명의 명세서에 참조로서 통합된다.
실시예
실시예 1: 독감 회복 환자로부터 혈액으로부터 PBMC 분리 준비
회복 환자군은 신종독감 확진 후 2-4주 된 환자로서 혈액 내에 신종독감 바이러스(H1N1)가 존재하지 않음이 확인되고 신종독감 바이러스에 대한 항체를 보유한 지원자들로 구성되었으며 이는 임상시험심사 위원회(IRB)의 승인을 받고 이루어졌다. 이들 환자군의 특징은 다음과 같다. (1) 계절 독감에 대한 백신을 접종 받지 않았다. (2) 다른 전염성 바이러스 즉 HBsAg 에 대하여 음성 반응을, anti-HCV 항체 및 anti-HIV 항체에 대하여 음성 반응을 보인다. (3) 혈장(plasma)에서 인플루엔자 A 바이러스 H1N1 서브타입의 RT-PCR에 음성 반응을 나타낸다. (4) 혈청에서 인플루엔자 A 바이러스 H1N1 서브타입의 HA(H1N1)에 대한 ELISA에서 1:160 이상의 타이터(titer)를 혈청에서 보인다. 지원자들로부터 약 100 ㎖의 전혈을 수득하여 lymphoprepTM(Axis-Shield, Norway, 1114545) 방법을 사용하여 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)를 분리하였다. 분리된 PBMC는 인산 완충용액으로 3회 세척한 후, KM banker II(Cosmobio, Japan, KOJ-16092010) 냉동 배지(freezing medium)로 2x107 cells/㎖ 농도로 맞추어 액체질소탱크(Liquid Nitrogen Tank)에 보관되었다.
실시예 2: 단일클론 항체 1차 선별
항원 특이 항체를 분비하는 B 세포의 선별 방법은 Jin 등(Jin A. et al ., 2009. Nat Med . 15, 1088-1092)에 의해 설명된 방법을 이용하였다. 간략하게, 상기 실시예 1에서 분리된 PBMC를 준비된 마이크로어레이 칩 상의 각각의 웰에 1개씩 첨가하였다. 단일 세포로부터 분비된 항체는 미리 코팅(precoated)된 항-인간 IgG 항체에 의해 확인되었다. 이를 통해 선별된 항체 분비 세포(antibody secreting cell)를 대상으로 표지된 HA 항원을 이용하여 HA에 결합하는 항체의 분비 여부를 ELISPOT(enzyme linked immunospot assay: Sedgwick J.D., 2005, Methods Mol Biol. Vol.302, pp.314)으로 확인하였다. 확인된 개별 항체 분비 세포로부터 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 방법을 이용하여 항체의 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain) 유전자의 전체 서열을 확보하였다. 확보된 중쇄 및 경쇄 DNA를 pcDNA 3.1(+) 발현 벡터(invitrogen, USA, V790-20)에 삽입하여 항체의 경쇄 및 중쇄를 각각 생산하는 발현 벡터를 제조한 후, 상기 제조된 경쇄 및 중쇄 생산 발현 벡터를 CHO 세포에 형질 감염시켰다. 그 후, 형질 감염된 CHO 세포에서 생산된 항체를 이용하여 하기 실시예 3에 기재된 HA-ELISA 방법을 통해 HA에 결합을 하는 항체를 1차적으로 선별하였다. 이때에는 항체 샘플을 연속적으로 희석하지 않고 HA와의 반응을 보여주는 모든 항체를 1차적으로 선별하였다.
실시예 3: 단일클론 항체의 2차 선별 및 항체 생산
1차적으로 선별된 항체에서 H1N1 인플루엔자 HA에 결합력이 높은 단일클론 항체를 2차적으로 선별하기 위하여, 단량체(monomer) HA와 삼량체(trimer) HA를 확보하여 HA-ELISA를 진행하였다. 인플루엔자 A 바이러스의 재조합 단량체 HA는 Sino Biological Inc.(China)에서 구입하였다. 구입된 A/CA/04/09 (H1N1)의 단량체 HA(11055-V08H)는 C-말단에 10개의 히스티딘(polyhistidine) 잔기를 포함하는 HA의 세포외 도메인(met1 - gln529)으로 구성되어 있고, A/Brisbane/10/07 (H3N2) 재조합 HA1 서브유닛(11056-V08H1)은 C-말단에 히스티딘(polyhistidine) 잔기를 포함하는 HA의 N-말단 분절(Met1 - Arg345)로 구성되어 있으며, 형질 감염된 인간 세포에서 생산되었다. A/CA/04/09 (H1N1)와 A/Brisbane/10/07 (H3N2)의 재조합 삼량체 HA(FR-180, FR-61)는 IRR(Influenza Reagent Resource, USA)에서 제공하였다. 상기 삼량체 HA는 C-말단 펩티드에 트롬빈(thrombin) 절단 자리, 삼량체 형성 유도 도메인(trimerizing domain; foldon) 및 6개의 히스티딘 잔기를 포함하는 구조이며, 바큘로 바이러스 시스템(baculovirus system)을 이용하여 생산되었다.
항체의 항원(HA)과의 반응성은 항원(HA)과 항체를 이용한 효소결합 면역흡수 분석법(ELISA)에 의해 측정되었다. 자세한 방법은 하기와 같다. 먼저 50 ㎕의 단량체 HA 및 삼량체 HA 항원(250 ng/㎖)을 각각 96-웰 마이크로타이터 플레이트(Nunc, Denmark, 449824)의 웰에 흡착시켰다. 상기 플레이트를 1 % 소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)이 함유된 인산 완충용액(Teknova, USA, D5120)으로 처리하여 블로킹한 후, 3 배씩 연속적으로 희석한 항체 샘플(starting concentration: 1 ㎍/㎖)을 플레이트의 각 웰에 추가하였다. 이 후, 실온에서 1 시간 반응(incubation)시킨 다음, 과산화효소가 표지된 염소의 항-인간 감마 항체(Zymed, USA, 62.8420)로 감지하였다. 실온에서 1시간 반응 후 테트라메틸벤즈이딘(Tetramethylbenzydine: TMB, Sigma-Aldrich, USA, T0440)과 반응시키고, 본 반응을 1 N HCl로 중지시켰다. 플레이트 리더기(Spectramax plus 384, Molecular Device)를 사용해 450/570 nm에서 흡광도를 측정하고, 그래프패드 프리즘 프로그램(GraphPad Software Inc. USA)을 이용하여 항원-항체간 반응성을 그래프로 나타내었다.
도 1에서 보여지는 바와 같이 CT104, CT120 및 CT123 항체는 A/CA/04/09 (H1N1)의 삼량체 HA와는 높은 반응을 나타내고 있으나, 단량체 HA와는 거의 반응을 나타내지 않았다.
또한, 도 2에서 보여지는 바와 같이 CT147, CT149, CT164 및 CT166 항체는 A/Brisbane/10/07 (H3N2)의 삼량체 HA에는 잘 결합하였으나 HA1 서브유닛에는 결합하지 않았다. 이는 선별된 항체들이 기존에 알려져 있는 HA1 부분에 있는 에피토프(epitope)가 아니라 HA1과 HA2 분절의 경계면이나 HA2에 결합할 가능성과 정상 컨포메이션(conformation)을 가지고 있는 HA에만 결합할 가능성을 시사하고 있다.
이에 상기 도 1, 2의 결과를 근거하여, 1차적으로 선별된 항체 중에서 삼량체 HA에 높은 반응성을 보여주는 항체를 2차적으로 선별하였으며, 이들 항체의 발현량을 높이기 위해 이들 항체 유전자를 pcDNA 벡터에서 셀트리온 고유의 발현 벡터인 MarEx 발현 벡터에 다음과 같이 재클로닝(recloning)을 진행하였다. 재클로닝 후, 이들 항체 유전자를 포함하는 MarEx 발현 벡터를 이용하여 마이크로 중화시험법(Microneutralization test; MN test) 및 혈구응집 억제시험(Hemagglutination inhibition test: HI test)에 필요한 항체를 생산하였다.
2차적으로 선정된 항체의 중쇄 유전자와 경쇄 유전자를 각각 포함하는 original pcDNA 벡터에 제한효소 Nhe I과 Pme I을 처리하여 중쇄 유전자와 경쇄 유전자를 확보한 후, 확보된 중쇄 유전자와 경쇄 유전자를 각각 동일한 제한효소로 처리된 pCT145 벡터와 pCT147 벡터에 삽입하였다. pCT145 및 pCT147 벡터는 각각 항체의 중쇄와 경쇄를 클로닝하기 위해 제작된 셀트리온 고유의 벡터이다(도 3). 이후, 중쇄 전사단위(프로모터-중쇄 유전자-폴리에이)와 경쇄 전사단위(프로모터-경쇄 유전자-폴리에이)를 함께 같이 포함하는 발현 벡터를 제작하기 위하여, 중쇄 유전자를 포함하는 pCT145 벡터에 제한효소 Pac I과 Asc I을 처리하여 중쇄 전사단위를 확보한 다음, 경쇄 유전자를 포함하는 pCT147 벡터에 동일한 제한효소를 처리하여 중쇄 전사단위를 삽입하였다. 이후 제한효소를 이용하여, 중쇄 전사단위와 경쇄 전사단위를 동시에 포함하는 벡터를 선별하였다(도 4). 선별된 벡터는 Endofree plasmid maxi kit(QIAGEN, Germany, 12362)를 이용하여 추출되었으며, 추출된 DNA 중 일부를 이용하여 염기서열 분석을 통해 최종적으로 항체의 염기서열을 확인하였다.
이후, 추출된 항체의 DNA를 이용하여 부유배양 중인 셀트리온에서 제작한 F2N 세포주(한국등록특허 제10-1005967호 참조)에 형질 감염하여 단일 클론 항체를 생산하는 일시적 세포주를 제조하였으며, 방법은 하기와 같다.　 세포내 일시적 형질 감염을 위하여 양이온성 폴리머(cationic polymer)인 FreeStyleTM Max(Invitrogen, USA, 16447-100)를 사용하였으며, 제조사의 사용설명서에 따라 형질 감염을 수행하였다. 형질 감염 전날, EX-CELL 293 Serum free media(SAFC, LIK, 14571C, 이하 "EX-CELL 293 배지"라 칭함)에서 배양된 F2N 세포를 원심분리를 수행하여 Modified EX-CELL 293 배지(SAFC, LIK, 65237, 맞춤 주문 생산)를 이용하여, ㎖ 당 1x106 개의 세포 농도로 250 ㎖ Erlenmeyer Flask에 80 ㎖ 또는 1 ℓ Erlenmeyer Flask에 200 ㎖ 접종하였다. 형질 감염 당일, 80 ㎖ 접종한 경우, 단일클론 항체를 코딩하는 DNA 100 ㎍와 FreeStyleTM Max 시약 100 ㎕을 각각 OptiPRO SFM II(Invitrogen, USA, 12309) 배지를 이용하여 1.6 ㎖ volume으로 희석한 후, 가볍게 혼합하여 주었다. 200 ㎖ 접종한 경우, DNA 250 ㎍와 FreeStyleTM Max 시약 250 ㎕를 각각 OptiPRO SFM II 배지를 이용하여 4 ㎖ volume으로 희석한 후, 가볍게 혼합하여 주었다. 각각 혼합한 후, 즉시 희석된 FreeStyleTM Max 시약 용액을 DNA가 희석되어 있는 용액과 혼합한 다음, 상온에서 19분 반응하였다. 상온에서 19분 반응하는 동안, 전날 접종된 F2N 세포를 신선한 Modified EX-CELL 293 배지를 이용하여 0.8x106 개의 세포 농도로 희석하였으며, 19분 반응 후, DNA와 FreeStyleTM Max 시약 혼합 용액을 F2N 세포에 처리함으로써 형질 감염을 진행하였다. 형질 감염 다음날, 동량의 EX-CELL 293 배지를 형질 감염된 세포에 첨가하여 7~8일 동안 배양함으로써 단일클론 항체를 생산하였다.
실시예 4: 바이러스에 대한 생체외 ( in vitro ) 중화 활성 조사
본 발명자들이 선별한 항체를 이용하여 다양한 독감 바이러스에 대한 생체 외 중화 활성을 확인하기 위하여 MN(Microneutralization) 분석을 수행하였다.
실시예 4-1: MDCK 세포주 배양과 바이러스 농도 결정
MDCK(Madin-Darby canine kidney)는 London line(MDCK-L)을 사용하였다. MDCK 세포주를 10%의 FBS(Atlas Biologicals, USA, F0500A), 1X 페니실린/스트렙토마이신(pecinillin/streptomycin; Gibco, USA, 15140), 25 mM 헤페스(HEPES; Gibco, USA, 15630) 및 2 mM L-글루타민(glutamine; Gibco, USA, 25030)이 포함된 DMEM(Gibco, USA, 11965) 배지를 이용하여 37℃의 5% CO2 습윤(humidified) 세포배양기에서 배양하였다.
바이러스 농도는 세포 기반 ELISA 방법으로 정량하여, TCID50(Median tissue culture infective dose)를 구하였다. 상기 방법은 아래와 같이 진행되었다. 먼저 바이러스 저장액(Virus stock)을 바이러스 희석제(virus diluent)[DMEM(Gibco, USA), 3% BSA(Gibco, USA, 15260), 1X 페니실린/스트렙토아미신(pecinillin/streptomycin, Gibco, USA), 25 mM 헤페스(HEPES, Gibco, USA)]로 10배씩 연속 희석하여 96 웰 플레이트의 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 음성 대조군(Negative control)으로는 바이러스가 포함되어 있지 않은 바이러스 희석제(virus diluent)를 첨가하였다. 이후 배양 중인 MDCK 세포주에 트립신(trypsin)을 처리하여 배양 용기에서 분리한 후, MDCK 배양 배지를 처리하여 트립신을 중화하였다. 인산 완충용액을 이용하여 2번 세척한 후, 바이러스 희석제로 세포 펠렛(pellet)을 희석하여 5×105 cells/㎖ 농도로 맞추었다. 바이러스가 들어있는 96 웰 플레이트에 3-4 ㎍/㎖ TPCK-트립신(Sigma, USA)을 넣은 이후 즉시 상기 MDCK 세포주 100 ㎕씩 첨가하여 37℃의 5% CO2 습윤(humidified) 세포배양기에서 20시간 반응시켰다. 반응시킨 플레이트를 인산 완충용액으로 1회 세척한 다음 냉각시킨 아세톤(acetone):인산 완충용액(PBS)(80:20) 혼합액을 각 웰에 200 ㎕ 씩 첨가해서 8분간 고정(fix)한 후 상온에서 20분간 건조하였다. 각 플레이트에 인산 완충용액을 웰 당 200 ㎕ 첨가해서 2회 세척하고 비오틴화(biotinylated)된 anti-NP(nuclear protein) 단일클론 항체(Milipore, USA, MAB8257B)를 1% BSA가 포함된 인산 완충용액(인산 완충용액, 0.1% Tween-20)으로 2,000배 희석하여 웰 당 100 ㎕를 첨가하고 상온에서 1시간 반응시켰다. 웰 당 200 ㎕의 인산 완충용액으로 3회 세척한 후 1% BSA가 포함된 인산 완충용액에 20,000배 희석된 스트렙토아비딘(streptoavidin)-HRP 접합 항체를 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 상온에서 1시간 반응시켰다. 인산 완충용액으로 4회 세척한 후 TMB 용액을 웰 당 100 ㎕ 첨가하고 상온에서 10분간 발색시키고, 황산을 처리하여 반응을 종료시킨 후, OD450를 측정하였다. Reed & Muench(The American 1938)에 의한 방법을 이용하여 측정된 OD450에서 TCID50을 계산하였다.
실시예 4-2: MN 분석법
각 항체는 바이러스 희석제를 이용하여 1차적으로 10 ㎍/㎖ 농도로 맞추었다. 이 농도를 초기 농도로 하여, 다시 바이러스 희석제를 이용하여 연속적으로 2배씩 희석하여 96 웰 플레이트의 웰 당 50 ㎕씩 첨가하고 100 TCID50에 해당하는 농도의 바이러스를 웰 당 50 ㎕씩 첨가하여 37℃의 5% CO2 습윤(humidified) 세포 배양기에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 3-4 ㎍/㎖ 농도의 TPCK-trypsin(Sigma, USA, T1426)을 각 웰에 넣고 다시 100 ㎕씩의 처리된 MDCK 세포주를 넣은 후, 37℃의 5% CO2 습윤(humidified) 세포 배양기에서 20시간 반응시켰다. 20 시간 반응시킨 후부터의 과정은 실시예 4-1에 언급된 바이러스 정량화에 사용된 방법과 동일한 방법으로 MN 분석을 진행하여, OD450 수치를 측정하였다. 세포만 넣은 웰의 OD450 수치보다 높은 수치를 보이는 웰은 바이러스가 감염된 것으로 판단하였다. 각 항체별로 바이러스 항원이 검출되지 않는 여러 OD450 수치 중에서 항체의 제일 낮은 농도(㎍/㎖)를 표에 나타내었으며, 항체의 농도가 낮으면 낮을수록 바이러스에 대한 중화 활성이 높음을 의미한다.
H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스에 대한 특정 항체의 중화 능력은 표 1에 나타내었으며, H3 서브타입 인플루엔자 A 바이러스에 대한 특정 항체의 중화 능력은 표 2에 나타내었다. 이 중 보다 효과가 좋은 CT120과 CT149를 이용하여 다양한 그룹의 인플루엔자 A 바이러스를 이용하여 마이크로중화 시험을 시행하였다. 그 결과, CT120은 그룹 1의 인플루엔자 A 바이러스들에 대하여 중화 효능을 나타내었으며, CT149는 그룹 1의 일부와 그룹 2 인플루엔자 A 바이러스들에 대하여 중화 효능을 나타내었다 (표 3).
항체와 H1 subtype 인플루엔자 A 바이러스를 이용한 마이크로중화시험법 결과
mAb ID H1 Pandemic H1 Seasonal
(A/Texas/05/
2009)		 (A/New York/ 18/2009) (A/Solomon Islands/2006) (A/Ohio/83)
CT104 0.313 0.625 0.625 0.313
CT120 0.313 0.313 0.625 0.156
CT123 0.313 0.625 1.25 0.313
* 단위: ㎍/㎖
항체와 H3 subtype 인플루엔자 A 바이러스를 이용한 마이크로중화시험법 결과
mAb ID A/Wisconsin/67/05 A/Hong Kong/68 A/Brisbane/10/07
CT147 2.5 2.5 0.625
CT149 1.25 2.5 1.25
CT164 2.5 1.25 0.625
CT166 5 2.5 1.25
* 단위: ㎍/㎖
그룹 1, 그룹 2 인플루엔자 A 바이러스를 이용한 마이크로중화시험법 결과
Group subtype virus CT120 CT149
1 H1N1 A/Texas/05/2009-RG15 0.156 >10
A/New York/18/2009-RG18 0.313 >10
A/Ohio/07/2009 0.039 5
A/Solomon Islands/2006 0.625 >10
A/Ohio/83 0.156 >10
H2N2 A/Ann Arbor/6/60 ca 0.312 >10
H5N1 A/Vietnam/1203/04 0.156 2.5
Anhui/1/05 0.625 0.625
H9N2 A/ck/HK/G9/97 0.078 0.312
A/Green-winged teal/209/TX/2009 0.625 0.156
2 H3N2 A/Wisconsin/67/05 >10 1.25
A/Hong Kong/68 NA 2.5
A/Brisbane/10/07 >20 1.25
H7N2 A/turkey/Virginia/02 >20 10
* 단위: ㎍/㎖
실시예 5: 바이러스에 의한 적혈구 응집반응에 대한 항체의 억제 능력 조사
본 발명의 항체는 바이러스의 HA를 표적으로 하는 중화 항체이므로 HA의 기능에 대하여 어떤 작용 기전에 의하여 중화능을 나타내는지 확인하고자 하였다. HA의 기능 중 하나는 세포 표면의 수용체에 결합하여 바이러스가 세포에 부착할 수 있도록 하는 것이다. 이는 적혈구 응집반응으로 관찰할 수 있으므로 HA에 의해서 유도되는 적혈구의 응집반응에 대하여 항체의 억제 효과를 확인하고자 하였다. 이를 위하여 v-bottom 96-웰 플레이트 상에서 항체를 2배씩 연속적으로 희석하고 4배의 HA 유니트의 바이러스를 첨가하여 혼합시켰다. 혼합한 플레이트를 상온에서 30분간 반응시킨 후, 각각의 웰에 1% avian red blood cell를 첨가하였다. 혈구응집 억제 엔드 포인트(end point)는 응집 반응이 관찰되지 않는 가장 낮은 항체 농도로 결정하였다.
그 결과 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스에 대한 특정 항체나(표 4) H3 서브타입 인플루엔자 A 바이러스에 대한 특정 항체(표 5) 모두 MN에서는 중화 효과를 보였던 A/Texas/05/2009와 A/New York/18/2009, A/Brisbane/10/07 바이러스에 대하여 고농도(>20 ㎍/㎖)에서도 혈구응집을 억제하지 못하였다.
항체와 H1 subtype 인플루엔자 A 바이러스를 이용한 적혈구 응집반응 억제 결과
mAb ID A/Texas/05/2009 A/New York/18/2009
CT104 >20 >20
CT120 >20 >20
CT123 >20 >20
* 단위: ㎍/㎖
항체와 H3 subtype 인플루엔자 A 바이러스를 이용한 적혈구 응집반응 억제 결과
mAb ID A/Brisbane/10/07
CT147 >20
CT149 >20
CT164 >20
CT166 >20
* 단위: ㎍/㎖
실시예 6: 항체에 의한 막융합 억제 능력에 대한 조사
중화 항체의 작용 기전을 알아보고자 HA의 다른 기능인 막융합 능력에 대하여 항체의 억제 효과를 확인하였다. HA는 바이러스가 endocytosis에 의하여 세포 내로 들어간 후 낮은 pH 환경에 노출 되면 바이러스의 envelope과 endosome의 막융합을 유도하여 바이러스의 유전물질이 세포 내로 침투할 수 있도록 하는데 역할을 한다. 이를 in vitro에서 재현하고자 A/CA/04/09 (H1N1) 또는 A/Japan/305-11957 (H2N2), A/Brisbane/10/07 (H3N2), A/Vietnam/1203/04 (H5N1)에서 유래한 HA를 발현하는 CHO 세포주를 개발하여 실험에 활용하였다. 각 세포주는 낮은 pH에 노출될 경우 여러 세포의 세포막이 융합되어 다핵체(Syncytia)를 형성하게 된다. 각 세포주를 6웰 플레이트에 웰 당 1×105 개의 세포가 들어가도록 분주하여 10% FBS를 포함한 DMEM/F12 배지를 넣은 뒤 37℃의 5% CO2 습윤 세포 배양기에서 2일간 배양하였다. PBS로 세척하고 FBS가 없는 DMEM/F12 배지에 30분간 배양한 뒤 HA를 활성화시키기 위하여 4 ㎍/㎖ 의 TPCK-Trypsin을 넣고 5분간 처리한 후 10% FBS를 포함한 DMEM/F12 로 배지를 교환하여 20분간 배양하였다. 각 중화 항체를 20 ㎍/㎖ 농도로 처리한 후 37℃의 5% CO2 습윤세포 배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 배양액을 PBS로 세척한 후 low pH 버퍼 (150 mM NaCl, 10 mM Hepes, pH 5.0)를 넣고 6분간 처리한 후 10% FBS를 포함한 DMEM/F12 로 배지를 교환하여 1시간 동안 배양하였다. PBS로 세척하고 메탄올로 고정시킨 후 trypan blue로 염색하여 현미경으로 막융합 정도를 관찰하였다. 그 결과 CT120은 A/CA/04/09 (H1N1) 또는 A/Japan/305-11957 (H2N2), A/Vietnam/1203/04 (H5N1)의 HA를 발현하는 CHO 세포주의 막 융합을 억제하였으며, CT149는 A/CA/04/09 (H1N1) 또는 A/Brisbane/10/07 (H3N2), A/Vietnam/1203/04 (H5N1) 의 HA를 발현하는 CHO 세포주의 막 융합을 억제하였다 (도 5a 내지 5d).
따라서, 실시예 5와 6의 결과로 보아 본 발명의 항체는 HA에 결합하여 막융합을 억제하는 방법으로 바이러스에 대한 중화 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 7: 항체의 Fc 기능에 의한 바이러스 억제 효과에 대한 조사
실시예 7-1: in vitro ADCC assay
항체 의존성 세포독성(ADCC, Antibody dependent cell cytotoxicity)을 측정하기 위해 Calcein-AM 방출법을 사용하였다.
인플루엔자 H1N1 (A/California/04/2009)의 HA를 발현하는 CHO K1 세포주를 타겟 세포(target cell)로 사용하기 위해 Calcein-AM을 투입시켰다. Calcein-AM이 유입된 타겟 세포에 CT120, CT149와 음성 대조군 CT-P6(항-Her2 항체)를 농도별로 처리하고, 이어서 주효 세포(effector cell)를 처리하였다. 37℃에서 4시간 반응 후, 플레이트를 원심분리 하여 상층액을 불투명 플레이트로 옮겨 형광값을 측정하였다. 항체 농도 별 % 세포 독성은 최대 형광 방출양(MR, maximal release)과 자연 형광 방출양(SR, Spontaneous release)을 사용하여 계산되었다.
도 6a와 같이, 음성 대조군에서는 항체 농도에 따른 % 세포 독성이 보이지 않았으나, CT120과 CT149에서는 처리 양이 많을수록 높은 % 세포 독성, 즉 높은 ADCC 효능을 보였으며, 그 정도는 CT120이 더 강한 것으로 보였다.
실시예 7-2: in vitro CDC assay
보체 의존성 세포독성(CDC, Complement dependent cell cytotoxicity)은 살아있는 세포의 수에 비례하여 흡광도가 높아지는 CCK-8 (Cell counting kit-8)을 사용하여 측정하였다.
인플루엔자 H1N1 (A/California/04/2009)의 HA를 발현하는 CHO K1 세포주를 플레이트에 부착시켜 타겟 세포(target cell)로 사용하였다. 타겟 세포에 CT120, CT149와 음성 대조군 CT-P6를 농도별로 처리하고, 이어서 보체의 원천으로 인간 혈청을 처리하였다. 37℃에서 2시간 반응 후, CCK-8을 처리하여 밤새 반응시키고 흡광도를 측정하였다. 항체 농도별 % 세포 독성은 실험계의 최대 흡광도와 최소 흡광도를 사용하여 계산하였다.
도 6b와 같이, 음성 대조군에서는 항체 농도에 따른 % 세포 독성이 보이지 않았으나, CT120과 CT149에서는 처리 양이 많을수록 높은 % 세포 독성, 즉 높은 CDC 효능을 보였다.
실시예 7-3: 마우스 Fc 를 가지는 CT149 항체의 생산
마우스 Fc를 가지는 CT149 항체를 만들기 위하여 마우스 IgG1 불변부(constant region)는 NCBI database 상의 5개의 마우스 IgG1 서열 (GenBank Accession No. L27437.1, L35037.1, AB097849.1, Q724328.1, M745099.1)를 비교하여 다른 서열과 가장 identity가 높은 AB097849.1의 불변부 서열을 선정하였다. 마우스 IgG2a 불변부는 NCBI database 상의 2개의 마우스 IgG2a 서열 (GenBank Accession No. X70423.1, AB097847.1)를 비교하였을 때 1bp의 차이가 있으나, 아미노산의 서열은 동일하였으므로, 임의로 X70423.1의 불변부 서열을 선정하였다. 마우스 kappa 불변부는 NCBI database 상의 4개의 마우스 kappa 서열 (GenBank Accession No. U65535.1, BC028540.1, BC094013.1, BC002112.1)을 비교하였을 때 불변부의 서열이 모두 동일함을 확인하였다.
선정된 마우스 IgG1 와 IgG2a의 불변부를 합성하고, CT149의 human 가변부(variable region)와의 overlapping PCR을 통해 human 가변부와 마우스 불변부를 갖는 chimeric IgG1 중쇄(heavy chain)을 확보하였다. 마우스 경쇄(light chain)는 hybridoma RNA로부터 kappa 불변부를 RT-PCR 한 후, overlapping PCR을 통해 human 가변부 와 마우스 불변부를 갖는 chimeric 경쇄 (kappa)를 확보한 후, NCBI database에서의 서열과 동일함을 확인하였다.
만들어진 chimeric 항체 유전자를 셀트리온 발현 벡터에 클로닝 한 후 각각 CHOK1 세포에 도입하고, 8ug/ml농도의 puromycin이 첨가된 SFM4CHO (Hyclone, Cat. No.: SH30549.02) 배지에서 배양하여, stable cell line을 선별하였다. 선별된 cell line을 batch culture 하여 마우스 Fc를 갖는 IgG1 form과 IgG2a form의 항체를 생산하였다.
실시예 7-4: 마우스 Fc 를 가지는 CT149 를 이용한 동물 실험
5 마리로 구성된 마우스의 각 그룹에 비강을 통하여 5LD50의 A/California/04/09 바이러스를 감염 24시간 후에 복강 내 주사를 통해 3 mg/kg 항체를 투여하고 생존률을 측정하였다. 실험에 사용한 항체는 CT149의 항원 결합부위와 과 사람의 Fc 혹은 마우스 항체 중 IgG1 혹은 IgG2a의 Fc를 가지고 있는 것을 사용하였다. 마우스 항체의 경우 IgG2a가 IgG1 보다 FcgR에 대한 친화도가 높다 (Bruhns P, 2012, Blood, 119(24):5640-5649).
실험 결과, 도 7에서와 같이 마우스 IgG2a의 Fc를 가지는 CT149는 다른 형태의 항체보다 더 생존률을 증가시켰다. 따라서 본 발명의 항체는 생체 내에서도 Fc에 의한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예 8: CT120 및 CT149 항체의 H5 및 H3 서브타입 HA 상의 결합부위 결정
본 발명의 항체가 HA에 결합하는 부위를 결정하기 위하여 X선 회절분석법을 이용하여 항체 분절이 HA단백질 상에 결합하는 아미노산 서열을 분석하였다 (도 8A, 8B). 그 결과 CT120 에피토프의 주요 구성 요소는 A/Vietnam/1203/04 (H5N1)의 HA2 서브유닛의 헬릭스 면을 중심으로 위치하고 있었다(도 8a). CT149의 경우, A/Aichi/1968 (H3N2)의 HA2 서브유닛의 헬릭스 면을 중심으로 위치하면서 인접하는 다른 단량체에도 결합하여 하나의 HA 삼량체에서 세 개의 서브유닛에 걸쳐 결합을 하였다(도 8b).
실시예 8-1: 재조합 HA 단백질의 발현
X선 회절 분석에 사용하기 위한 재조합 HA 단백질을 생산하기 위하여 A/Vietnam/1203/04 (H5N1)와 A/Aichi/1968 (H3N2)바이러스의 HA 유전자의 ectodomain을 baculovirus 벡터인 pAcGP67-A (BD Pharmingen) 에 각각 클로닝하였다. 상기 벡터를 이용하여 제작된 baculovirus를 5-10 MOI (multiplicity of infection)로 Tricoplusia ni (High 5) 세포주(Invitrogen)와 섞어 28℃에서 72시간 동안 감염시켰다. 발현, 분비된 HA 단백질은 배양액을 모아 metal affinity chromatography와 size exclusion gel filtration chromatography (Superdex 200 16/60 column; GE Healthcare) 방법으로 정제하였다. 정제된 HA는 결정을 만들기 전에 3 유닛의 트롬빈과 4℃에서 18시간 반응하여 C-말단에 있는 foldon/histidine tag을 제거하였다.
실시예 8-2: 항체 분절의 정제
CT120과 CT149 항체를 Papain (Roche REF#:10108014001)과 100:1의 비율로 혼합한 후 37℃에서 1시간 처리한 후 20 mM IAA(Sigma:A3221)를 넣고 다시 37℃에서 45분간 반응을 시켰다. 반응액은 HiPrep 26/10 Desalting Column (GE Healthcare Cat No. 17-5087-01)을 사용하여 20 mM Sodium Phosphate, 25 mM NaCl pH7.0 버퍼로 교체한 후 Mabselect Sure column (GE Healthcare Cat No. 17-5438-03)을 이용하여 Fc 부분을 제거하고 Amicon Ultra Centrifugal Filter unit (Millipore, REF#:UFC901096)을 사용하여 10 mg/ml 농도로 Fab 분절을 농축하였다. 농축된 Fab 분절은 PBS 버퍼를 이용하여 size exclusion gel filtration chromatography (Superdex200 10/300 GL GE Healthcare, Cat No:17-5175-01)를 수행하여 추가 정제를 하였다
실시예 8-3: 항체 분절과 HA 단백질의 동시-결정화
CT120의 Fab 분절은 삼량체 형태로 상기 실시예 7-1의 방법으로 발현 정제된 A/Vietnam/1203/04 (H5N1)의 HA 단백질과, CT149 Fab 분절은 A.Aichi/2/68 (H3N2)의 HA 단백질과 5:1의 비율로 혼합하여 결정화였다. 생성된 결정은 size exclusion gel filtration chromatography (Superdex 200 10/30 column; GE Healthcare)와 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl 버퍼를 이용하여 분리한 후 각각 15 mg/ml과 12 mg/ml의 농도로 농축하였다.
최초의 희소행렬 결정화 스크린은 TopazTM 자유 계면 확산 (Free Interface Diffusion (FID), (Fluidigm Corporation, San Francisco, CA) 결정화 시스템을 이용하였다. CT120 Fab-H5 복합체의 초기 결정화 조건은 PEG 6,000 침전제가 포함된 여러 조건의 용액에서 24시간 내에 얻어졌으며 계속적인 결정 최적화 작업을 통해 회절분석이 가능한 정도의 결정을 만들 수 있는 조건을 확립하였다. 최종적으로 23℃에서 부유 방울 증기 확산법을 이용하여 1.0 μL의 CT120-H5 복합체와 동일한 부피의 10% PEG 6,000, 100 mM Na Cacodylate (pH 6.5), 400 mM Na Formate를 혼합으로써 결정을 성장시켰다. CT120 Fab-H5 복합체의 회절 데이터 세트를 4.0 Å 해상도로 Advanced Photon Source (APS) SER CAT 22-ID 빔라인에서 측정해서 모았다. CT120 Fab-H5의 결정군은 p1 원시삼사정계로 결정화되었다.
CT149 Fab-H3 복합체의 초기 결정화 조건은 PEG 3,000 침전제가 포함된 여러 조건의 용액에서 24시간 내에 얻어졌으며 계속적인 결정 최적화 작업을 통해 회절분석이 가능한 정도의 결정을 만들 수 있는 조건을 확립하였다. 최종적으로 23℃에서 부유 방울 증기 확산법을 이용하여 1.0 μL의 CT149 Fab-H3 복합체를 동일한 부피의 20% PEG 3,000, 100 mM Na Citrate, (pH 5.5)와 혼합으로써 결정을 성장시켰다. CT149 Fab-H3 복합체의 회절 데이터세트를 3.5 Å 해상도로 Advanced Photon Source (APS) SER CAT 22-ID 빔라인에서 측정해서 모았다. CT149 Fab-HA3의 결정군은 p31 원시삼방정계로 결정화되었다.
실시예 8-4: X선 회절 분석법
데이터 수집과 보정통계는 표 6에 기록을 하였다. 데이터 프로세싱과 스케일링에는 HKL2000과 Denzo 프로그램을 패키지로 처리하였다. CT120 Fab-HA3 복합체와 CT149 Fab-HA3 복합체 구조는 Phaser 프로그램의 몰레큘라 리플레이스먼트(Molecular Replacement) 방법으로 결정하였다. 몰레큘라 리플레이스먼트 방법으로 얻어진 쏠루션을 REFMAC5 프로그램을 이용하여 리지드바디(Rigid-body)와 리스트레인(restrained) 보정하였고 모델 재건은 쿠트(Coot)로 진행하였다. 모델 전반에 걸쳐 2Fo-Fc 전자밀도는 잘 정의되었고 구조의 리스트레인(restrained) 보정은 REFMAC5를 통해 마무리하였다.
데이터 수집과 보정 통계
CT120 / H5 CT149 / H3
Data
collection		 Space group P1 P31
Cell dimensions 146.3Å, 145Å, 260.5Å,
69.9˚, 69.9˚, 59.9˚		 128.7Å, 128.7Å, 428.3Å,
90˚, 90˚, 120˚
Resolution (Å) 50-4.0 (4.07-4.0) 50-3.5 (3.50-3.56)*
Rsym (%) 8.2(60.7) 13.6(71.8)
I/σ 10.1(1.2) 11.9(1.7)
Completeness (%) 98.0(96.4) 99.5(100)
Redundancy 2.0(1.9) 3.7(3.9)
Refinement Resolution (Å) 239-4.0(4.1-4.0) 142.8-3.5(3.49-3.59)
No. of reflections (total) 132730 94527
No. of reflections (test) 7050 4981
Rwork/Rfree 28.7/31.1 25.9/28.8
No. of atoms 88404 43357
r.m.s.d.-bond length (Å) 0.105 0.005
r.m.s.d.-bond angle (˚) 1.754 0.80
MolProbity# scores Favored(%) 91.0 93.3
Allowed(%) 98.6 99.6
Outliers(%) ( No . of residues ) 1.4 (153/11202) 0.4 (21/5450)
실시예 8-5: 구조 데이터의 평가와 분석
두 개의 복합체의 HA부위의 잔기는 HA1, HA2 서브유니트의 완전한 단백질 형태를 기준으로 각 각 번호를 부여하였다. 구조의 평가는 Procheck과 RCSB PDB 평가 서버를 이용하여 평가하였다. 탄수화물성분의 연결성과 명명은 PDBCARE (Glycosciences.de) site에서 평가를 하였다. 모델의 취급과 RMSD 계산 및 거리 분자간 거리 측정은 쿠트(Coot)와 파이몰(Pymol)을 이용하였다. 용제 접근가능 표면 영역의 계산은 피사(PISA)와 프로토프(Protorp)를 이용하였다.
실시예 9: CT149 항체의 H7 서브타입 HA 상의 결합부위 결정
본 발명의 CT149 항체가 H7 서브타입(H7N9, A/Anhui/1/2013)의 HA에 결합하는 부위를 결정하기 위하여 X선 회절분석법을 이용하여 항체 분절이 HA 단백질 상에 결합하는 아미노산 서열을 분석하였다 (도 8c).
데이터 수집과 보정 통계
CT149 / H7
Data collection Space group R32
Cell dimensions 126.9Å, 126.9Å, 409.6Å,
90˚, 90˚, 120˚
Resolution (Å) 50.0-2.8 (2.9-2.8)
Rsym (%) 11.5 (88.3)
I /σ 17.2 (2.4)
Completeness (%) 99.5 (99.9)
Redundancy 7.8 (7.7)
Refinement Resolution (Å) 48.4-2.8 (2.9-2.8)
No. of reflections (total) 31755
No. of reflections (test) 1606
R work / R free 26.4 / 31.1
No. of atoms 5675
r.m.s.d.-bond lengths (Å) 0.004
r.m.s.d.- Bond angles (˚) 0.780
Ramachandran Plot favoured regions (%) 84.5
allowed regions (%) 13.9
Generously allowed regions (%) 1.6
Disallowed regions (%) 0
실시예 10: 표면 플라스몬 공명 기술을 이용한 항원-항체 친화도 결정
표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance) 검정(Biocore Inc.)은 정반응 속도 상수 및 역반응 속도 상수의 역학적 측정에 의해 항체의 결합친화도를 결정한다.
정제된 재조합 인플루엔자 HA 단백질에 대한 CT120 및 CT149 항체의 결합은 25℃에서 실행 완충액 HBS-EP (10 mM HEPES [pH 7.4], 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005% 계면활성제 P20)을 사용하는 Biacore T200 (GE Healthcare) 장비로 표면플라스몬 공명-기본 측정에 의해 결정되었다. 10 mM 아세트산나트륨 (Sodium Acetate, pH 5.0) 중에 희석된 약 5000 RU의 anti-6x his tag 항체를 1 ㎍/ml로 제조사의 지침 및 절차에 따라 표준 아민 커플링 키트(Amine coupling kit)를 사용하여 CM5 연구용 바이오센서 칩에 직접적으로 고정시켰다. 바이오센서 표면에서 반응하지 않은 부분을 에탄올아민(ethanolamine)으로 차단하였다. 반응 분석을 위해 Biacore T200 콘트롤 소프트웨어, Biacore T200 이벨루에이션 소프트웨어를 사용하였다. CT120 과 CT149 항체는 HBS-EP 완충액에 희석하였다. 라이게이트(ligate)로서 포획될 재조합 인플루엔자 HA 단백질은 10 ㎕/분의 유속으로 반응 매트릭스상에 주입하였다. 검정 동안에, 모든 측정은 포획된 재조합 인플루엔자 HA가 없는 포획 표면을 대조군으로 사용하였다. 결합 및 분리 속도 상수 Ka (M-1s-1) 및 Kd (s-1)은 30 ㎕/분의 유속에서 결정하였다. 속도 상수는 3배의 희석 시리즈로서 1.23 - 100 nM 범위의 상이한 항원 농도에서 반응 결합 측정을 실시하고 완충액만 포함된 주사액을 중복 대조군으로 사용함으로써 획득하였다. 이어서, 항체와 표적 항원 사이의 반응에 대한 평형 해리 상수 KD (M)를 반응 속도 상수로부터 다음의 등식에 의해 계산하였다: KD = Kd/Ka. 결합은 시간과 반응 속도 상수의 함수를 계산하여 기록한다.
정제된 다양한 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질에 대하여 CT120과 CT149의 결합친화도를 결정하였다(표 8 내지 18). CT120은 H1에 대하여 CT149에 비하여 높은 결합친화도를 나타내었으나, H3에 대해서는 친화력이 없는 것으로 나타났다. CT149는 H3에 대하여 바이러스의 strain에 따라 다르나 전반적으로 높은 친화도를 나타내었다. H5에 대해서는 CT120과 CT149가 모두 높은 친화도를 나타내었다. H7에 대해서는 CT120은 친화력이 없는 것으로 나타났으나, CT149는 높은 친화도를 나타내었다.
H1N1 (A/California/04/09)의 HA 단백질을 이용한 결합친화도 측정
Ka (M-1s-1) Kd (s-1) KD(M) Average
CT120 6.15E+05 9.94E-04 1.62E-09 1.62E-09
6.31E+05 0.001023 1.62E-09
CT149 1.29E+06 3.88E-02 3.02E-08 3.06E-08
1.29E+06 3.99E-02 3.10E-08
H1N1 (A/Texas/05/09)의 HA 단백질을 이용한 결합친화도 측정
Ka (M-1s-1) Kd (s-1) KD(M) Average
CT120 6.06E+05 1.19E-03 1.97E-09 1.76E-09
6.32E+05 9.80E-04 1.55E-09
CT149 1.66E+06 5.58E-02 3.36E-08 3.38E-08
1.65E+06 5.62E-02 3.41E-08
H1N1 (A/Solomon Island/03/06)의 HA 단백질을 이용한 결합친화도 측정
Ka (M-1s-1) Kd (s-1) KD(M) Average
CT120 2.45E+05 6.84E-04 2.79E-09 2.82E-09
2.46E+05 7.03E-04 2.85E-09
CT149 2.46E+05 9.04E-02 3.68E-07 3.45E-07
3.24E+05 1.05E-01 3.23E-07
H1N1 (A/Ohio/07/09)의 HA 단백질을 이용한 결합친화도 측정
Ka (M-1s-1) Kd (s-1) KD(M) Average
CT120 3.76E+05 6.63E-04 1.76E-09 2.00E-09
3.52E+05 7.89E-04 2.24E-09
CT149 7.46E+05 3.79E-02 5.09E-08 5.13E-08
7.47E+05 3.87E-02 5.17E-08
H3N2 (A/Philippines/2/82)의 HA 단백질을 이용한 결합친화도 측정
Ka (M-1s-1) Kd (s-1) KD(M) Average
CT149 2.92E+05 1.47E-05 5.02E-11 4.56E-11
2.85E+05 1.17E-05 4.11E-11
H3N2 (A/Wisconsin/67/05)의 HA 단백질을 이용한 결합친화도 측정
Ka (M-1s-1) Kd (s-1) KD(M) Average
CT149 8.41E+04 7.23E-03 8.60E-08 8.86E-08
8.16E+04 7.45E-03 9.13E-08
H3N2 (A/Brisbane/10/07)의 HA 단백질을 이용한 결합친화도 측정
Ka (M-1s-1) Kd (s-1) KD(M) Average
CT149 1.73E+05 3.19E-04 1.85E-09 1.81E-09
1.79E+05 3.16E-04 1.77E-09
H5N1 (A/Vietnam/1203/04)의 HA 단백질을 이용한 결합친화도 측정
Ka (M-1s-1) Kd (s-1) KD(M) Average
CT120 1.13E+09 4.23E+00 3.74E-09 3.97E-09
9.24E+08 3.88E+00 4.20E-09
CT149 1.32E+06 3.91E-03 2.96E-09 2.94E-09
1.32E+06 3.86E-03 2.93E-09
H7N7 (A/England/268/96)의 HA 단백질을 이용한 결합친화도 측정
Ka (M-1s-1) Kd (s-1) KD(M) Average
CT149 4.01E+05 1.76E-03 4.40E-09 4.41E-09
4.06E+05 1.80E-03 4.43E-09
H7N9 (A/Shanghai/1/2013)의 HA 단백질을 이용한 결합친화도 측정
Ka (M-1s-1) Kd (s-1) KD(M) Average
CT149 1.97E+07 2.80E-03 1.42E-10 1.49E-10
1.83E+07 2.85E-03 1.55E-10
H7N9 (A/Anhui/1/2013)의 HA 단백질을 이용한 결합친화도 측정
Ka (M-1s-1) Kd (s-1) KD(M) Average
CT149 1.98E+07 3.26E-03 1.65E-10 1.83E-10
1.57E+07 3.16E-03 2.01E-10
실시예 11: Cellular ELISA ( CELISA ) 방법
항체들의 HA에 대한 결합력은 H1, H3 또는 H5 유래의 HA를 발현하는 세포주를 이용하여 CELISA 방법으로 확인하였다. H1 발현 세포주는 A/CA/04/09 바이러스의 HA 유전자 정보를 이용하여 유전자를 합성한 뒤 발현벡터에 넣어 CHO-K1 세포주에 넣은 후 발현하는 세포를 선별하였다. H3 발현 세포주는 A/Brisbane/10/07 바이러스의 HA 유전자 정보를 이용하여 확립하였다. H5 발현 세포주는 A/Vietnam/1203/04 바이러스의 HA 유전자 정보를 이용하여 확립하였다. 각 HA 발현 세포주는 10% 우혈청이 포함된 DMEM 배지를 이용하여 37℃의 5% CO2 습윤(humidified) 세포배양기에서 배양되었다. 배양된 세포주는 트립신으로 세포배양용기에서 분리한 후 배양 배지로 중화하고 원심분리하여 2×105 cells/㎖ 농도로 배양 배지에 희석하였다. 희석된 세포배양액 100 ㎕를 96웰 플레이트에 넣고 18시간 동안 37℃의 5% CO2 습윤 세포배양기에서 배양하여 96웰 플레이트에 부착시켰다. 배양 후 각 웰을 200 ㎕의 차가운 PBS 용액으로 2회 세척한 후 3.7 % 포름알데하이드(Formaldehyde) 용액 150 ㎕를 넣고 상온에서 15분간 반응시켜 세포들을 고정하였다. 각 웰을 0.05 % Tween 20를 포함하는 PBS 용액 200 ㎕로 3회 세척한 후 희석버퍼 (dilution buffer; TEKNOVA, Cat. No. D5120) 200 ㎕를 넣고 상온에서 60분간 블로킹하였다. 각 항체 시료(CT120 또는 CT149)의 농도(ug/ml)를 희석 버퍼로 4배씩 단계별로 희석한 후 항체 시료를 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 상온에서 60분간 반응하였다. 0.05 % Tween 20를 포함하는 PBS 용액 200 ㎕로 3회 세척한 후 HRP가 결합된 항-인간 kappa 체인 항체를 희석버퍼에 1000배 희석하여 100 ㎕씩 각 웰에 넣고 상온에서 40분간 반응시켰다. 0.05 % Tween 20를 포함하는 PBS 용액 200 ㎕로 3회 세척한 후 TMB 용액 (Sigma, Cat. No. T0440) 100 ㎕를 넣고 상온에서 6분간 반응시키고 1 N 황산 100 ㎕ 를 넣어 반응을 중지시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, CT120과 CT149는 각각 H1과 H5의 HA를 발현하는 세포주에 결합을 하였으며 이들을 1:1로 혼합한 CT-P27의 경우 유사한 결합력을 나타내었다 (도 9A, 9C). CT149는 H3의 HA를 발현하는 세포주를 이용한 CELISA에서 결합능을 나타내었으나, CT120은 결합을 하지 못했다. CT-P27의 경우, CT149와 비슷한 정도의 결합력을 나타내는 것으로 보아 CT120은 CT149의 결합을 저해하지 않는 것을 알 수 있었다 (도 9B).
실시예 12: 혼합 전 후에 따른 항체의 인플루엔자 A 바이러스에 대한 중화 활성
CT120과 CT149를 1:1의 비율로 섞어 CT-P27로 명명하고, 실시예 4의 마이크로 중화 시험법을 변형하여 다양한 인플루엔자 바이러스 서브타입에 대하여 EC50 값을 구하였다. EC50 값을 구하기 위해서는 바이러스의 초기 농도를 800~6400 ㎍/㎖로 맞춘 후 연속적으로 4배씩 희석하여 감염 바이러스를 준비하였다. OD450 수치를 측정한 후에는 웰에서 배지만 넣었을 때 나오는 기저값을 제한 후 Sigma plot 프로그램을 사용하여 농도에 따른 4-파라미터 그래프를 그리고 최고 OD450 수치에서 50% 감소될 때의 농도를 구하여 EC50 값을 도출하였다.
EC50는 항체가 바이러스에 대해 최대 중화활성의 50%를 나타내는 항체의 농도로서, 수치가 낮으면 낮을수록 항체의 중화활성이 높음을 의미한다.
실험 결과 CT120과 CT149는 각각 원래 중화활성을 나타내었던 바이러스에 대하여 비슷한 양상의 중화능력을 나타내었으며, 두 항체를 혼합하였을 경우 간섭효과 없이 효과가 있는 항체의 중화능력을 나타내었다. 따라서 CT120과 CT149를 혼합하여 사용할 경우 그룹 1과 그룹 2의 인플루엔자 A 바이러스에 대하여 모두 중화 효과를 나타내었다 (표 19).
다양한 인플루엔자 A 바이러스를 이용한 EC50 측정 결과
Subtype Virus EC 50 (μg/ mL )
CT - P22 CT - P23 CT - P27
H1N1 A/PuertoRico/8/34 0.33 W* 0.67
A/Texas/05/09-RG15 1.19 W* 2.05
A/Solomon Islands/3/2006 0.25 W* 0.27
A/Ohio/83 0.26 W* 0.73
A/CA/04/09 (mouse adapted) 1.18 W* 2.78
A/CA/04/09 0.21 NT 0.62
A/Ohio/ 07/09 0.14 W* 0.29
H2N2 A/Ann Arbor/6/60 ca 6.53 N** 12.7
H3N2 A/Hong Kong/68 (mouse adapted) N** 0.76 10.8
A/Philippines/2/82 (mouse adapted) N** 0.57 1.64
A/Sydney/5/97 N** 2.93 6.53
A/Beijing/32/92-R-H3N2 PR8 N** 1.36 3.1
A/Perth/16/09 N** 2.06 3.99
H5N1 A/Vietnam/1203/04XPR8 3.46 212 7.29
A/Anhui/01/2005(H5N1)-PR8 6.92 11 8.02
H7N9 A/Anhui/1/20131 NT 0.9 2.38
A/Shanghai/2/20131 NT 1.17 3.55
A/Shanghai/2/20132 NT 7.71 13.14
H9N2 A/ck/HK/G9/97(H9N2)/PR8 3.12 7.39 5.09
W*: Weak neutralization effect　 / N**: No neutralization effect
NT: Not tested / To be tested
1: Tested in Contract Lab A
2: Tested in Contract Lab B
실시예 13: 동물실험을 통한 혼합 항체의 인플루엔자 A 바이러스에 대한 예방 및 치료 효과
CT120항체와 CT149 항체를 각각 투여하거나 혼합하여 투여하였을 경우 인플루엔자 A 바이러스에 대하여 마우스에서 예방 및 치료 효과를 가지는지 조사하기 위하여 마우스의 생존률 실험을 진행하였다. 5-10 마리로 구성된 마우스의 각 그룹에 비강을 통하여 5-10 LD50의 인플루엔자 바이러스를 감염시켰다. 항체는 kg 당 7.5 ㎎ 또는 15 ㎎, 30 ㎎의 양을 바이러스 감염 24시간 전, 또는 바이러스 감염 후 24 시간 후에 복강 내 주사를 통해 마우스에 투여되었다. CT-P27은 CT120과 CT149를 1:1로 혼합하여 총량을 표시하였으므로 각 성분은 표시되는 양의 절반과 같다.
실험결과, CT-P27은 CT120과 CT149 항체의 각 효능을 유지하였으며 혼합에 의한 간섭 효과는 나타나지 않았다.
13-1. 혼합 항체의 H1N1 에 대한 예방 및 치료 효과
5-10 마리로 구성된 마우스의 각 그룹에 비강을 통하여 5-10 LD50의 A/California/04/09 바이러스를 감염시키기 24시간 전, 또는 감염 24시간 후에 복강 내 주사를 통해 항체를 투여하고 생존률을 측정하였다.
실험 결과, 도 10에서와 같이 CT120과 CT149, CT-P27 항체를 바이러스 감염 24시간 전에 투여하였을 경우 농도에 관계없이 모든 마우스가 실험 종료 시까지 생존하였다. 감염 24시간 후에 투여하였을 경우 CT120과 CT149, CT-P27은 모두 투여 항체 농도가 증가함에 따라 생존률이 증가하였다. CT120의 경우 CT149에 비하여 조금 더 생존률을 증가시켰다. CT-P27의 경우 CT120과 CT149의 합과 비슷한 생존률을 나타내고 있어(additive 효과) 혼합에 의한 효능 저하는 일어나지 않는 것으로 관찰되었다.
13-2. 혼합 항체의 H3N2 에 대한 예방 및 치료 효과
5-10 마리로 구성된 마우스의 각 그룹에 비강을 통하여 10 LD50의 A/Brisbane/10/07 또는 5 LD50의 A/Philippines/2/82 바이러스를 감염시켰다. 감염 24시간 전 또는 24 시간 후에 복강 내 주사를 통해 항체를 투여하고 생존률을 측정하였다.
실험 결과, 도 11에서와 같이 A/Brisbane/10/07 바이러스 감염 24시간 전에 항체를 투여하였을 때 CT120는 생존률에 도움이 되지 않은 반면 CT149과 CT-P27 항체 투여군은 농도에 관계없이 모든 마우스가 실험 종료 시까지 생존하였다. A/Philippines/2/82 바이러스를 감염시키고 24시간 후에 항체를 투여하였을 경우 CT120 항체는 생존률에 도움이 되지 않았으나 CT149와 CT-P27의 경우 농도가 증가함에 따라 생존률이 증가하였다. CT-P27의 경우 구성 성분 중의 CT149 항체의 농도만큼의 생존률을 나타내어 CT120과 CT149의 혼합에 의한 간섭효과는 없는 것으로 나타났다.
13-3. 혼합 항체의 H5N1 에 대한 치료 효과
5-10 마리로 구성된 마우스의 각 그룹에 비강을 통하여 10 LD50의 A/Vietnam/1203/04 바이러스를 감염시키고 24 시간 후에 복강 내 주사를 통해 항체를 투여하여 생존률을 측정하였다.
실험 결과, 도 12에서와 같이 A/Vietnam/1203/04 바이러스를 감염시키고 24시간 후에 항체를 투여하였을 경우 농도에 관계없이 모든 마우스가 실험 종료시까지 생존하였다.
13-4. CT149 항체의 H7N9 에 대한 치료 효과
10 마리로 구성된 마우스의 각 그룹에 비강을 통하여 106 PFU의 A/Anhui/1/2013 바이러스를 감염시키고 감염 24시간 후에 복강 내 주사를 통해 항체를 투여하고 생존률을 측정하였다.
실험 결과, 도 13에서와 같이 음성대조용 항체를 투여하였을 경우 3일 이후부터 마우스가 죽기 시작하여 7일 이후 모든 마우스가 사망하였다. 이에 반해 CT149 항체를 감염 24시간 후에 투여하였을 경우에는 투여 항체 농도가 증가함에 따라 생존률이 증가하였다.
실시예 14: 혼합항체와 화학적 화합물의 병용투여 효과
5 마리로 구성된 마우스의 각 그룹에 비강을 통하여 5 LD50의 mouse adapted A/CA/04/09 또는 5 LD50의 A/Philippines/2/82 바이러스를 감염시켰다. 감염 24시간 후에 복강 내 주사를 통해 뉴라미니다제 억제제인 페라미비르(Peramivir)를 단 회(x1) 또는 5일 연속(x5) 투여하거나 여러 농도의 항체를 단독 또는 페라미비르와 병용투여하고 생존률을 측정하였다.
실험 결과, 도 14의 A에서와 같이 A/CA/04/09 바이러스 감염 24시간 후에 15 mg 페라미비르 또는 1 mg CT120을 단독으로 투여하였을 때에는 생존률이 각각 40%와 20%이였으나, 15 mg 페라미비르와 1 mg CT120을 병용 투여하였을 때, 80%라는 훨씬 좋은 생존률을 나타내었다. 마찬가지로, 도 14의 B에서와 같이 A/Philippines/2/82 바이러스를 감염시키고 24시간 후에 15 mg의 페라미비르를 단독 투여하였을 때에는 40%의 생존률을 나타내고 1 mg의 CT149의 경우 8일째에 모든 마우스가 사망한 것에 반하여 페라미비르와 CT149를 병용 투여하였을 때에는 80%라는 훨씬 좋은 생존률을 나타내었다. 단독 투여의 경우 최적화되지 않은 농도이므로 높은 사망률을 나타내는데 반하여 병용 투여할 경우 항진된 효과 (synergistic)를 나타내었다.
실시예 15: 혼합 항체의 뉴라미니다아제 억제제 저항성 H7N9 돌연변이 R292K 에 대한 중화 효과
바이러스 A/Shanghai/2/2013와 A/Anhui/1/2013 에 대하여, CT149(CT-P23)와 CT-P27의 in vitro 중화실험을 통하여 해당바이러스의 감염력에 대한 중화능을 시험하였다. 실시예 4에서 기술한 바와 같이 실험 수행하였으며 이에 대한 결과를 도15에 나타내었다. CT149과 CT-P27 모두 해당 바이러스에 대해 중화능을 보였으며, IC50값은 도 15에 표시하였다.
바이러스 A/Shanghai/1/2013 (wild type) 과 이의 돌연변이형(R292K)에 대해서도 마찬가지로 in vitro 중화 실험을 통해 그 효능을 검정하였다. 실시예 4에서 기술한 바와 같이 실험수행하였으며, 이에 대한 결과를 도 16 a,b에 각각 나타내었다. CT149과 CT-P27 모두 해당 바이러스에 대해 중화능을 보였으며, IC50값은 표 20에 표시하였다.
상하이 1 야생형과 돌연변이형에 대한 CT149/CT-P27의 중화능 (IC50)
Virus strain type CT-P23 CT-P27
A/Shanghai/1/2013 Wild type 7.705 13.14
A/Shanghai/1/2013 R292K 14.87 16.28
* 단위: ug/mL
실시예 16: 혼합 항체의 뉴라미니다아제 억제제 저항성 H1N1 돌연변이 H275Y 에 대한 중화 효과
CT120 단독으로 그리고 CT120(CT-P22)와 CT149(CT-P23)를 1:1의 비율로 섞어 CT-P27로 명명하고, 실시예 4의 마이크로 중화 시험법을 이용하여 뉴라미니다아제 억제제 저항성 H1N1 돌연변이 H275Y에 대한 EC50 값을 구하였다. EC50 값을 구하기 위해서는 바이러스의 초기 농도를 CT120의 경우 800 ㎍/㎖, CT-P27의 경우 400 ㎍/㎖로 맞춘 후 연속적으로 4배씩 희석하여 감염 바이러스를 준비하였다. OD450 수치를 측정한 후에는 웰에서 배지만 넣었을 때 나오는 기저값을 제한 후 Sigma plot 프로그램을 사용하여 농도에 따른 4-파라미터 그래프를 그리고 최고 OD450 수치에서 50% 감소될 때의 농도를 구하여 EC50 값을 도출하였다.
EC50는 항체가 바이러스에 대해 최대 중화활성의 50%를 나타내는 항체의 농도로서, 수치가 낮으면 낮을수록 항체의 중화활성이 높음을 의미한다.
실험 결과(도 17a, b), CT120과 CT-P27은 각각 뉴라미니다아제 억제제 저항성 H1N1 돌연변이 H275Y에 바이러스에 대하여 중화능력을 나타내었으며, 특히, 두 항체를 혼합하였을 경우(CT-P27) 간섭효과 없이 효과가 있는 항체의 중화능력을 나타내었다.
실시예 17: 혼합 항체의 HA 돌연변이에 대한 결합 능력
문헌 조사에 의하면 CT149와 비슷하게 그룹2에 대해서 중화효과를 나타내는 CR8020 항체의 경우 자연적으로 나타나는 HA D19N 변이체에 대하여 낮은 결합력을 나타내었다 (Ekiert DC. et. al. 2011, Science 333(6044):843-50). 이에 CT149가 결합하는 A/Wisconsin/67/05 (H3N2)와 A/Anhui/1/2013 (H7N9)의 HA에 인위적으로 D19N 돌연변이를 도입한 HA 를 발현하는 CHO 세포주를 만들고 CT149를 이용하여 면역형광염색을 수행하였다.
그 결과, 원래 결합력이 없는 CT120은 전혀 CHO 세포를 염색시키지 못하는 반면, CT149는 wild type은 물론 D19N 돌연변이가 도입된 HA가 발현된 CHO 세포를 모두 잘 염색하였다. (도 18 a, b)
<110> CELLTRION INC. <120> Composition comprising two or more influenza A viruses neutralizing binding molecules <130> CPD2016029KR <160> 112 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CT104 light chain CDR1 <400> 1 Arg Ala Ser Gln Ser Leu Ser Ser Ser Ser Leu Val 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CT104 light chain CDR2 <400> 2 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CT104 light chain CDR3 <400> 3 Gln Gln Tyr Gly Asn Ser Pro Tyr Thr 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CT104 heavy chain CDR1 <400> 4 Asn Asn Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CT104 heavy chain CDR2 <400> 5 Gly Gly Ile Ser Pro Ile Phe Gly Thr Leu Asn Tyr Ala Glu Arg Phe 1 5 10 15 Gln Gly <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CT104 heavy chain CDR3 <400> 6 Gly Cys Gly Tyr Asn Cys Tyr 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<223> CT149 light chain <400> 107 gaagttgtgt tgacacagtc tcccggcacc ctggctttgc ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca ccgtgttggc agcacctaca tagcctggta tcagcagaag 120 tctggccagg ctcccaggcg cctcatctat ggtgcatcca acagggccac tgacatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtccgggaca gacttcactc tcaccatcag gagactggag 240 cctgaagatt ctgcagtgta ttactgtcag cagtttagtg tttcaccgtg gacgttcggc 300 caagggacca gggtggaaat caagcgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 648 <210> 108 <211> 1371 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT149 heavy chain <400> 108 caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaaga cttctggtta ttccttttcc acttatggag 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catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 648 <210> 110 <211> 1371 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT164 heavy chain <400> 110 caggttcagc tggtccagtc tggagtagag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaaga cttctggtta tccgttttcc acttatggag tcagctgggt ccgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg ggtgggatgg atcagcggtt atactggtat cacagactac 180 gcacagaagt ctcagggcag agtcactctg acgacagacg caagcacggc caccgccttc 240 ttggagctga ggagtctgag gcctgacgac acggccacct atttttgtgc gagagacaaa 300 gtgcaggggc gcgttgaagc gggatctggg ggtcgtcacg actactgggg acagggaacc 360 ctggtcatcg tctcctcagc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 420 tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 480 gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 540 gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 600 agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg 660 gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 720 cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 780 atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 840 gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 900 cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 960 gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1020 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1080 cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1140 ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1200 aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1260 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgagggt 1320 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaatg a 1371 <210> 111 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT166 light chain <400> 111 gaagttgtgt tgacgcagtc tcccggcacc ctggctttgc ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca cagtattggc agcacctaca tagcctggta tcagcagaag 120 tctggccagg ctcccaggcg cctcatctat ggtgcatcca acagggcctc tgacatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtccgggaca gacttcactc tcaccatcag gagactggag 240 cctgaagatt ctgcagtgta ttactgtcag cagtttagtg tttcaccgtg gacgttcggc 300 caagggacca gggtggaaat caagcgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 648 <210> 112 <211> 1371 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT166 heavy chain <400> 112 caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaaga cttctggtta ttccttttcc acttatggag tcagctgggt ccgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg ggtgggatgg atcagcggtt acactggtat cacagactac 180 gcacagaagt ttcagggcag agtcactctg accacagacg caaccacggc caccgccttc 240 ctggagctga ggagtctgag acctgacgac acggccacct atttctgtgc gagagataag 300 gtgcaggggc gcgttgaagt gggatctggg ggtcgtcatg actactgggg acagggaacc 360 ctggtcatcg tctcctcagc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 420 tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 480 gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggg gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 540 gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 600 agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg 660 gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 720 cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 780 atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 840 gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 900 cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 960 gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1020 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1080 cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1140 ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1200 aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1260 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgagggt 1320 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaatg a 1371

Claims (35)

  1. 인플루엔자 Ａ 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 단백질의 줄기 영역(stem region) 내 에피토프에 결합하는 인플루엔자 Ａ 바이러스 중화 결합 분자로서,
    상기 결합 분자의 에피토프는
    (A/Aichi/1968) 및 (A/Anhui/1/2013)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 인플루엔자 A 바이러스 H3 또는 H7 서브타입의 HA 제1 단량체(monomer)의 HA1 폴리펩티드의 위치 278 및 318의 아미노산 잔기(residue);
    상기 HA 제1 단량체(monomer)의 HA2 폴리펩티드의 위치 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52, 및 53의 아미노산 잔기; 및
    상기 HA 제1 단량체에 인접한 HA 제2 단량체의 HA1 폴리펩티드의 위치 25, 32 및 33의 아미노산 잔기를 포함하고,
    서열번호 25의 CDR1 영역, 서열번호 26의 CDR2 영역, 및 서열번호 27의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역, 및 서열번호 28의 CDR1 영역, 서열번호 29의 CDR2 영역, 및 서열번호 30의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 갖는 결합 분자를 포함하지 않는, 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자의 에피토프는 상기 HA 제1 단량체의 HA2 폴리펩티드의 위치 58 및 99의 아미노산 잔기를 추가로 포함함을 특징으로 하는 결합 분자.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 결합 분자의 에피토프는 상기 HA 제1 단량체에 인접한 HA 제2 단량체의 HA1 폴리펩티드의 위치 27 아미노산 잔기를 추가로 포함함을 특징으로 하는 결합 분자.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 결합 분자의 에피토프는
    상기 HA 제1 단량체의 HA1 폴리펩티드의 위치 54, 55 및 291의 아미노산 잔기 및 상기 HA 제1 단량체의 HA2 폴리펩티드의 위치 19, 20, 21, 46, 56, 57 및 60의 아미노산 잔기를 추가로 포함함을 특징으로 하는 결합 분자.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 결합 분자의 에피토프는 상기 HA 제1 단량체에 인접한 HA 제2 단량체의 HA1 폴리펩티드의 위치 310, 311, 및 312의 아미노산 잔기를 추가로 포함함을 특징으로 하는 결합 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 분자는 항체 또는 그것의 항원 결합 단편임을 특징으로 하는 결합 분자.
  7. 인플루엔자 Ａ 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 단백질의 줄기 영역(stem region) 내 에피토프와의 결합여부를 확인하여, 인플루엔자 A 바이러스 유래 질환의 진단, 예방, 또는 치료용 결합 분자를 선별하는 방법으로서,
    상기 에피토프는 (A/Aichi/1968) 및 (A/Anhui/1/2013)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 인플루엔자 A 바이러스 H3 또는 H7 서브타입의 HA 제1 단량체(monomer)의 HA1 폴리펩티드의 위치 278 및 318의 아미노산 잔기(residue);
    상기 HA 제1 단량체(monomer)의 HA2 폴리펩티드의 위치 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52, 및 53의 아미노산 잔기; 및
    상기 HA 제1 단량체에 인접한 HA 제2 단량체의 HA1 폴리펩티드의 위치 25, 32 및 33의 아미노산 잔기를 포함하고,
    상기 에피토프 및 결합 분자가 1x10-7M 미만의 결합친화도(KD)를 보이는 경우 상기 결합 분자를 인플루엔자 A 바이러스 유래 질환의 진단, 예방 또는 치료용 후보 물질로 판단하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 결합 분자는 항체 또는 그것의 항원 결합 단편임을 특징으로 하는, 방법.
  9. 인플루엔자 Ａ 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 단백질의 줄기 영역(stem region) 내 에피토프와의 결합여부를 확인하여, 인플루엔자 A 바이러스 유래 질환의 진단, 예방, 또는 치료용 결합 분자를 생산하는 방법으로서,
    상기 에피토프는 (A/Aichi/1968) 및 (A/Anhui/1/2013)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 인플루엔자 A 바이러스 H3 또는 H7 서브타입의 HA 제1 단량체(monomer)의 HA1 폴리펩티드의 위치 278 및 318의 아미노산 잔기(residue);
    상기 HA 제1 단량체(monomer)의 HA2 폴리펩티드의 위치 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52, 및 53의 아미노산 잔기; 및
    상기 HA 제1 단량체에 인접한 HA 제2 단량체의 HA1 폴리펩티드의 위치 25, 32 및 33의 아미노산 잔기를 포함하고,
    상기 에피토프 및 결합 분자가 1x10-7M 미만의 결합친화도(KD)를 보이는 경우 상기 결합 분자를 인플루엔자 A 바이러스 유래 질환의 진단, 예방 또는 치료용 결합 분자로 판단하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 결합 분자는 항체 또는 그것의 항원 결합 단편임을 특징으로 하는, 방법.
  11. 1) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 인플루엔자 A 바이러스 중화 결합 분자; 및
    2) 용기
    를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 진단용 키트.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 결합 분자는 항체 또는 그것의 항원 결합 단편임을 특징으로 하는, 키트.

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