CN105338994B - 含有至少两种甲型流感病毒中和结合分子的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种组合物，其含有至少两种结合于甲型流感病毒血球凝集素(HA)蛋白干区表位的甲型流感病毒中和结合分子，所述组合物含有：i)第一结合分子，其可中和至少一种选自下组的甲型流感病毒亚型：H1、H2、H5和H9；和ii)第二结合分子，其可中和至少一种选自下组的甲型流感病毒亚型：H1、H3、H5、H7和H9。本发明的混合组合物可有效中和系统发育群1和系统发育群2的多种流感亚型，并能与化学化合物联用；因此，本发明组合物在预防和治疗流感病毒所引起的疾病中非常有效。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种含有至少两种甲型流感病毒中和结合分子的组合物，更具体地，涉及一种含有至少两种具有甲型流感病毒中和活性的人单克隆抗体的组合物，所述单克隆抗体由源自甲型流感病毒感染痊愈的患者血液中的人B细胞产生。
【背景技术】
流感是一种由流感病毒引起的呼吸道感染性疾病，通常发生于冬季。已知其具有非常高的感染性并会影响所有年龄段，尤其是老年人(Treanor J,2004,N Engl J.Med.350(3):218-20)。流感病毒是属于正黏病毒科的包膜RNA(核糖核酸)病毒，其基因组由八条反义单股RNA(核糖核酸)区段构成。这些流感病毒被分为甲型、乙型和丙型。基于主要表面蛋白血球凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)，甲型流感病毒进一步分为各种亚型。截止目前，已鉴定有17种HA和10种NA(Cheung TK和Poon LL 2007,Ann N Y Acad.Sci.1102:1-25；Tong S,等2012,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109:4269-4274)。根据其类型的不同，流感病毒可感染鸟类、猪以及人类，且由于基因组由RNA区段构成这一原因，其基因会持续突变和重组，导致新的遗传变异(Treanor J,2004.N Engl J.Med.350(3):218-20)。鉴于这种持续突变，难以获得针对流感病毒的永久免疫力，因此目前认为最有效的预防方法是施用一种针对当年预计要流行的特定类型流感病毒的疫苗以产生针对当年流感病毒的免疫力。
目前每年施用的流感病毒疫苗是含有甲型流感H1、H3亚型HA和乙型流感HA的三价疫苗。
通常利用鸡蛋来制备抗流感病毒的疫苗，但该制备方法费时且低效。因此，该方法的问题在于每年难以在有限的时间段内生产足够量的疫苗。为了解决这个问题，多个制药公司(GSK、百特(Baxter)等)在积极研究通过细胞培养来生产疫苗的方法。此外，如果发生大规模的流感病毒感染，则很难在短期内生产出抵御该感染的疫苗。同样，由于出现了耐药性突变病毒株的问题，抗病毒药物并非完全可靠。
为了克服这个问题，目前积极开发了抗流感病毒的抗体(Throsby等,2008,PloSOne 3(e3942)；Sui等,2009,Nature structural&molecular biology.16(265-273)；Simmons等,2007,PloS Medicine 4(e178)；Wrammert等,2011,J Exp Med.208(181-193)；Corti等,2011,Science 333(850-856))
采用痊愈患者的血制品来治疗感染了各种病毒的患者并治疗大规模流感感染。例如，当感染了西班牙流感病毒的患者有肺炎症状，则从感染该流感病毒并痊愈的患者处采集血制品以用于治疗流感病毒(Luke等,2006.Annals of internal medicine.145:599)。同样，从人血浆中纯化超免疫球蛋白(IgIv)并用于治疗感染了各种病毒的患者，但是上述得到的产品可能因血液内潜在的感染性物质而不安全，且大规模生产的效率较低。
申请人最近申请专利保护的抗甲流病毒抗体对多种流感亚型显示出中和活性。具体地，韩国专利申请(10-2011-0020061)中公开的抗体主要对系统发育群(phylogeneticgroup)1(H1、H2、H5和H9)表现出中和活性，韩国专利申请(10-2012-0107512)中公开的抗体主要对系统发育群2(H3和H7)表现出中和活性。因此，本发明人对开发含有至少两种抗体的鸡尾酒制剂进行了研究，所述抗体对属于群1和2的所有病毒(可能会流行的)表现出预防和治疗效果。
【内容】
【技术问题】
本发明的目的之一在于提供一种含有至少两种甲型流感病毒中和结合分子的组合物，所述组合物对系统发育群1和系统发育群2表现出中和活性。
本发明的另一目的在于提供一种通过施用所述组合物而诊断、预防或治疗由甲型流感引起的疾病的方法。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述组合物诊断甲型流感病毒感染的方法。
本发明还有另一目的在于提供一种用于诊断甲型流感病毒的试剂盒，其含有所述的组合物。
【技术方案】
为了达成上述目的，本发明提供了一种组合物，其含有至少两种结合于甲型流感病毒血球凝集素(HA)蛋白干区(stem region)表位的甲型流感病毒中和结合分子，所述组合物含有：
i)第一结合分子，其可中和至少一种选自下组的甲型流感病毒亚型：H1、H2、H5和H9；和
ii)第二结合分子，其可中和至少一种选自下组的甲型流感病毒亚型：H1、H3、H5、H7和H9。
在本发明的一实施方式中，所述第一结合分子的表位可含有HA1多肽第18、38、40、291、292和318位的氨基酸残基。此外，第一结合分子的表位可含有HA2多肽第18、19、20、21、41、42、45、48、49、52和53位的氨基酸残基。
在本发明的一实施方式中，所述第一结合分子的表位可含有HA1多肽第18、38、40、291、292和318位的氨基酸残基，且可含有HA2多肽第18、19、20、21、41、42、45、48、49、52和53位的氨基酸残基。
在本发明的一实施方式中，所述第二结合分子的表位可含有HA1多肽第278和318位的氨基酸残基。此外，所述第二结合分子的表位可含有HA2多肽第38、39、41、42、45、48、49、52和53位的氨基酸残基。此外，所述第二结合分子的表位可含有HA第一单体的HA1多肽和/或HA2多肽诸位置的氨基酸残基，还可含有邻近该第一单体的第二单体的HA1多肽第25、32和33位的氨基酸残基。
在本发明的一实施方式中，第二结合分子的表位可含有HA1多肽第278和318位的氨基酸残基，且还可含有HA2多肽第38、39、41、42、45、48、49、52和53位的氨基酸残基。在另一实施方式中，第二结合分子的表位可含有第一HA单体的HA1多肽和HA2多肽诸位置的氨基酸残基，且还可含有邻近该第一单体的第二单体的HA1多肽第25、32和33位的氨基酸残基。
在本发明的一实施方式中，第二结合分子的表位可含有HA1多肽第278和318位的氨基酸残基，且还可含有HA2多肽第38、39、41、42、45、48、49、52、53、58和99位的氨基酸残基。在另一实施方式中，第二结合分子的表位可含有HA第一单体的HA1多肽和HA2多肽诸位置的氨基酸残基，且还可含有邻近该第一单体的第二单体的HA1多肽第25、27、32和33位的氨基酸残基。
在本发明的一实施方式中，第二结合分子的表位可含有HA1多肽第54、55、278、291和318位的氨基酸残基，且还可含有HA2多肽第19、20、21、38、39、41、42、45、46、48、49、52、53、56、57和60位的氨基酸残基。在另一实施例中，所述第二结合分子的表位可含有HA第一单体的HA1多肽和HA2多肽诸位置的氨基酸残基，且还可含有邻近该第一HA单体的第二HA单体的HA1多肽第25、32、33、310、311和312位的氨基酸残基。
所述表位的氨基酸位置的编号基于H3HA的编号。
本发明结合分子可抑制病毒和靶细胞膜的融合。此外，本发明结合分子可通过抗体的Fc功能(即ADCC和CDC)抑制病毒。
本发明第一结合分子可结合甲型流感病毒或其片段，其结合亲和力(KD)低于1.0×10-8M，优选低于1.0×10-9M，较优选地，低于1.0×10-10M，更优选地，低于1.0×10-11M，最优选地，低于1.0×10-12M。
本发明第二结合分子可结合甲型流感病毒或其片段，其结合亲和力(KD)低于1.0×10-6M，优选低于1.0×10-7M，较优选地，低于1.0×10-8M，更优选地，低于1.0×10-9M，还要优选地，低于1.0×10-10M，愈加优选地，低于1.0×10-11M，最优选地，低于1.0×10-12M。
结合亲和力(KD)可通过采用表面等离子体共振测得，例如，BIACORE系统。
在本发明的一实施方式中，所述第一结合分子对于H1亚型的EC50值可为2.0μg/ml或更低，对于H2亚型的EC50值为7.0μg/ml或更低，对于H5亚型的EC50值为7.0μg/ml或更低，或对于H9亚型的EC50值为4.0μg/ml或更低。
在本发明的一实施方式中，所述第二结合分子对于H3亚型的EC50值可为40.0μg/ml或更低，对于H5亚型的EC50值为212.0μg/ml或更低，对于H7亚型的EC50值为8.0μg/ml或更低，或对于H9亚型的EC50值为8.0μg/ml或更低。
在本发明的一实施方式中，所述组合物对于H1亚型的EC50值可为3.0μg/ml或更低，对于H2亚型的EC50值为13.0μg/ml或更低，对于H3亚型的EC50值为70.0μg/ml或更低，对于H5亚型的EC50值为9.0μg/ml或更低，对于H7亚型的EC50值为14.0μg/ml或更低，或对于H9亚型的EC50值为6.0μg/ml或更低。
所述EC50值可通过微量中和法测定。
在本发明的一实施方式中，所述第一结合分子包括任一选自下组的多肽序列：i)包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:1所示CDR1区、SEQ ID NO.:2所示CDR2区和SEQ IDNO.:3所示CDR3区的序列；ii)包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:4所示CDR1区、SEQ IDNO.:5所示CDR2区和SEQ ID NO.:6所示CDR3区的序列；iii)包括根据Kabat法确定的SEQ IDNO.:7所示CDR1区、SEQ ID NO.:8所示CDR2区和SEQ ID NO.:9所示CDR3区的序列；iv)包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:10所示CDR1区、SEQ ID NO.:11所示CDR2区和SEQ ID NO.:12所示CDR3区的序列；v)包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:13所示CDR1区、SEQ ID NO.:14所示CDR2区和SEQ ID NO.:15所示CDR3区的序列；vi)根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:16所示CDR1区、SEQ ID NO.:17所示CDR2区和SEQ ID NO.:18所示CDR3区的序列。
在本发明的一实施方式中，所述第一结合分子含有：轻链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:1所示CDR1区、SEQ ID NO.:2所示CDR2区和SEQ ID NO.:3所示CDR3区；和重链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:4所示CDR1区、SEQ ID NO.:5所示CDR2区、和SEQ ID NO.:6所示CDR3区。
在本发明的一实施方式中，所述第一结合分子含有：轻链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:7所示CDR1区、SEQ ID NO.:8所示CDR2区和SEQ ID NO.:9所示CDR3区；和重链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:10所示CDR1区、SEQ ID NO.:11所示CDR2区和SEQ ID NO.:12所示CDR3区。
在本发明的一实施方式中，所述第一结合分子含有：轻链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:13所示CDR1区、SEQ ID NO.:14所示CDR2区和SEQ ID NO.:15所示CDR3区；和重链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:16所示CDR1区、SEQ ID NO.:17所示CDR2区和SEQ ID NO.:18所示CDR3区。
在本发明的一实施方式中，所述第二结合分子包括任一选自下组的多肽序列：i)包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:19所示CDR1区、SEQ ID NO.:20所示CDR2区和SEQ IDNO.:21所示CDR3区的序列；ii)包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:22所示CDR1区、SEQ IDNO.:23所示CDR2区和SEQ ID NO.:24所示CDR3区的序列；iii)包括根据Kabat法确定的SEQID NO.:25所示CDR1区、SEQ ID NO.:26所示CDR2区和SEQ ID NO.:27所示CDR3区的序列；iv)包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:28所示CDR1区、SEQ ID NO.:29所示CDR2区和SEQID NO.:30所示CDR3区的序列；v)包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:31所示CDR1区、SEQID NO.:32所示CDR2区和SEQ ID NO.:33所示CDR3区的序列；vi)包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:34所示CDR1区、SEQ ID NO.:35所示CDR2区和SEQ ID NO.:36所示CDR3区的序列；vii)包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:37所示CDR1区、SEQ ID NO.:38所示CDR2区和SEQ ID NO.:39所示CDR3区的序列；和viii)包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:40所示CDR1区、SEQ ID NO.:41所示CDR2区和SEQ ID NO.:42所示CDR3区的序列。
在本发明的一实施方式中，所述第二结合分子含有：轻链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:19所示CDR1区、SEQ ID NO.:20所示CDR2区和SEQ ID NO.:21所示CDR3区；和重链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:22所示CDR1区、SEQ ID NO.:23所示CDR2区和SEQ ID NO.:24所示CDR3区。
在本发明的一实施方式中，所述第二结合分子含有：轻链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:25所示CDR1区、SEQ ID NO.:26所示CDR2区和SEQ ID NO.:27所示CDR3区；和重链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:28所示CDR1区、SEQ ID NO.:29所示CDR2区和SEQ ID NO.:30所示CDR3区。
在本发明的一个实施方式中，所述第二结合分子含有：轻链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:31所示CDR1区、SEQ ID NO.:32所示CDR2区、和SEQ ID NO.:33所示CDR3区；和重链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:34所示CDR1区、SEQ IDNO.:35所示CDR2区和SEQ ID NO.:36所示CDR3区。
在本发明的一个实施方式中，所述第二结合分子含有：轻链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:37所示CDR1区、SEQ ID NO.:38所示CDR2区和SEQ ID NO.:39所示CDR3区；和重链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:40所示CDR1区、SEQ IDNO.:41所示CDR2区和SEQ ID NO.:42所示CDR3区。
在本发明的一个实施方式中，所述第一结合分子含有：轻链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:7所示CDR1区、SEQ ID NO.:8所示CDR2区、和SEQ ID NO.:9所示CDR3区；和重链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:10所示CDR1区、SEQ ID NO.:11所示CDR2区和SEQ ID NO.:12所示CDR3区；和所述第二结合分子含有：轻链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:25所示CDR1区、SEQ ID NO.:26所示CDR2区和SEQ ID NO.:27所示CDR3区；和重链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO.:28所示CDR1区、SEQ IDNO.:29所示CDR2区和SEQ ID NO.:30所示CDR3区。
在本发明中，根据Kabat等设计的系统采用常规方法测定对可变域的互补决定区(CRD)(见see Kabat等,免疫相关蛋白序列(第五版)(Sequences of Proteins ofImmunological Interest(5th))，国立卫生研究院，贝塞斯达(National Institutes ofHealth,Bethesda),MD.(1991))。本发明采用的CDR编号经Kabat法确定，但本发明也覆盖了采用其它方法测定的含有CDR的结合分子，所述其它方法包括IMGT法、乔西亚法(Chothia)以及AbM法。
在本发明的一实施方式中，所述第一结合分子包括含有选自下组的任一序列的多肽序列：SEQ ID NO.:43-48。
在本发明的一实施方式中，所述第一结合分子含有一轻链区，其包括SEQ ID NO.:43所示的多肽序列，以及一重链区，其包括SEQ ID NO.:44所示的多肽序列。
在本发明的一实施方式中，所述第一结合分子含有一轻链区，其包括SEQ ID NO.:45所示的多肽序列，以及一重链区，其包括SEQ ID NO.:46所示的多肽序列。
在本发明的一实施方式中，所述第一结合分子含有一轻链区，其包括SEQ ID NO.:47所示的多肽序列，以及一重链区，其包括SEQ ID NO.:48所示的多肽序列。
在本发明的一实施方式中，所述第二结合分子包括含有选自下组的任一序列的多肽序列：SEQ ID NO.:49-56。
在本发明的一实施方式中，所述第二结合分子含有一轻链区，其包括SEQ ID NO.:49所示的多肽序列，以及一重链区，其包括SEQ ID NO.:50所示的多肽序列。
在本发明的一实施方式中，所述第二结合分子含有一轻链区，其包括SEQ ID NO.:51所示的多肽序列，以及一重链区，其包括SEQ ID NO.:52所示的多肽序列。
在本发明的一实施方式中，所述第二结合分子含有一轻链区，其包括SEQ ID NO.:53所示的多肽序列，以及一重链区，其包括SEQ ID NO.:54所示的多肽序列。
在本发明的一实施方式中，所述第二结合分子含有一轻链区，其包括SEQ ID NO.:55所示的多肽序列，以及一重链区，其包括SEQ ID NO.:56所示的多肽序列。
在本发明的一实施方式中，所述第一结合分子含有一轻链区，其包括SEQ ID NO.:45所示的多肽序列，以及一重链区，其包括SEQ ID NO.:46所示的多肽序列；和所述第二结合分子含有一轻链区，其包括SEQ ID NO.:51所示的多肽序列，以及一重链区，其包括SEQID NO.:52所示的多肽序列。
在本发明的一实施方式中，所述结合分子为抗体或其抗原结合片段。所述抗体可具有与其相连的药物。
在本发明的一实施方式中，所述组合物可用于预防或治疗由流感病毒引起的疾病。
在本发明的一实施方式中，所述组合物可用于诊断由流感病毒引起的疾病。
在本发明的一实施方式中，所述组合物可含有药学上可接受的赋形剂。
在本发明的个实施方式中，所述组合物的剂型可以是(但不限于)无菌注射溶液、冻干制剂、注射器预装溶液、口服剂型、外用制剂、或栓剂。
本发明还提供了一种治疗由流感病毒引起的疾病的方法，所述方法包括步骤：向患有所述疾病的对象施用治疗有效量的所述组合物。
本发明还提供了一种诊断、预防或治疗由流感病毒引起的疾病的方法：i)向患有所述疾病的对象同时施用治疗有效量的第一结合分子和第二结合分子；或步骤ii)向患有所述疾病的对象施用治疗有效量的第一结合分子，然后向所述对象施用治疗有效量的第二结合分子；或步骤iii)向患有所述疾病的患者施用治疗有效量的第二结合分子，然后向所述对象施用治疗有效量的第一结合分子。
在一实施方式中，本发明提供了一种治疗由甲型流感病毒引起的疾病的方法，所述方法包括步骤：i)向患有所述疾病的对象施用治疗有效量的第一结合分子；和ii)继步骤i)之后，向所述对象施用治疗有效量的第二结合分子。
在另一实施方式中，本发明提供了一种治疗由甲型流感病毒引起的疾病的方法，所述方法包括步骤：i)向患有所述疾病的对象施用治疗有效量的第二结合分子；和ii)向所述对象施用治疗有效量的第一结合分子。
在本发明的一个实施方式中，诊断、预防、或治疗所述疾病的方法还包括步骤：施用抗病毒药物、病毒进入抑制剂或病毒附着抑制剂。所述抗病毒药物可为(但不限于)神经氨酸酶抑制剂、血球凝集素(HA)抑制剂、唾液酸抑制剂、M2离子通道抑制剂或RNA聚合酶抑制剂。
所述神经氨酸酶抑制剂可以是(但不限于)帕拉米韦(Peramivir)、扎那米韦(Zanamivir)、奥司他韦(Oseltamivir)或拉尼娜米韦(Laninamivir)。
所述M2离子通道抑制剂可以是(但不限于)金刚烷胺(Amantadine)或金刚烷乙胺(Rimantadine)。
所述RNA聚合酶抑制剂可以是(但不限于)法匹拉韦(Favipiravir)。
本发明还提供了一种预防由流感病毒引起的疾病的方法，所述方法包括步骤：向患有所述疾病的对象施用治疗有效量的所述组合物。
在一实施方式中，本发明提供了一种预防由甲型流感病毒引起的疾病的方法，所述方法包括步骤：i)向患有所述疾病的对象施用治疗有效量的第一结合分子；和ii)向所述对象施用治疗有效量的第二结合分子。
在另一实施方式中，本发明提供了一种预防由甲型流感病毒引起的疾病的方法，所述方法包括步骤：i)向患有所述疾病的对象施用治疗有效量的第二结合分子；和ii)向所述对象施用治疗有效量的第一结合分子。
本发明还提供了诊断患者感染流感病毒的方法，所述方法包括步骤：i)将所述组合物与样品接触；和ii)检测所述组合物和所述样品之间的反应。
本发明还提供了一种诊断流感病毒的试剂盒，所述试剂盒含有i)用于诊断流感病毒的组合物；和ii)一容器。
【有益效果】
含有至少两种甲型流感病毒中和结合分子的本发明组合物维持了针对各种亚型的结合分子活性而在各结合分子之间无干扰，从而表现出叠加效应。本发明所述组合物甚至在与化学化合物联合施用时，也能表现出协同效应。本发明所述组合物可有效中和系统发育群1和2中的多种亚型，且可与化学化合物联合使用，因此对于预防和治疗由于流感病毒引起的疾病非常有用。
【附图描述】
图1显示了CT104、CT120和CT123抗体对单体血球凝集素(下文称为“HA”)以及三聚体HA的结合亲和力。
图2显示了CT147、CT149、CT164和CT166抗体对单体HA亚单位(HA1)以及HA三聚体的结合亲和力。
图3显示了pCT145(A)和pCT147(B)载体的图谱：
A：pCT145载体；
B：pCT147载体；
pac：编码嘌呤霉素N-乙酰基-转移酶(PAC)的基因；和
DS：二重对称序列(结合于oriP二重对称序列元件的EBNA1)。
图4为表达本发明抗甲型流感病毒单克隆抗体的表达载体图谱。
图5a-5d显示了采用表达H1(H1N1)、H2(H2N2)、H3(H3N2)或H5(H5N1)亚型HA的细胞系验证CT120和CT149抗体对低pH下暴露HA诱导膜融合的抑制能力的结果。
图6a显示了采用本发明CT120和CT149抗体的体外ADCC实验结果，图6b显示了采用本发明CT120和CT149抗体的体外CDC实验结果。
图7显示了采用含有小鼠Fc的CT149抗体进行的动物实验结果。
图8a描述的氨基酸序列及示意图显示了CT120抗体的A/越南/1203/04(H5N1)病毒HA-结合位点，图8b和8c描述的氨基酸序列及其示意图分别显示了CT149抗体的A/爱知/1968(H3N2)和A/安徽/1/2013(H7N9)HA蛋白结合位点。
图9显示了采用表达H1(H1N1)、H3(H3N2)或H5(H5N1)HA亚型细胞系的CELISA实验验证抗体(CT120、CT149、以及CT120和CT149混合抗体)对HA的结合亲和力。
图10显示了向小鼠单独或联合施用CT120和CT149抗体的动物实验结果，以确认抗体对H1N1的预防或治疗效果。
图11显示了向小鼠单独或联合施用CT120和CT149抗体的动物实验结果，以确认抗体对H3N2的预防或治疗效果。
图12显示了向小鼠单独或联合施用CT120和CT149抗体的动物实验结果，以确认抗体对H5N1的预防或治疗效果。
图13显示了向小鼠施用CT149抗体的动物实验结果，以确认抗体对H7N9的预防或治疗效果。
图14显示了以非最适浓度单独和联合施用帕拉米韦和抗H1N1病毒或H3N2病毒的抗体后，对小鼠死亡率变化的观察结果。
图15显示了对抗H7N9(A/安徽/1/2013,A/上海/2/2013)的CT149抗体以及CT120和CT149抗体混合物的MN实验结果。
图16a显示了抗H7N9(A/上海/2/2013)野生型的CT149抗体以及CT120和CT149抗体混合物的MN实验结果，图16b显示了抗NAI耐药性H7N9(A/上海/2/2013)R292K的CT149抗体或CT120和CT149抗体混合物的MN实验结果。
图17a显示了抗H1N1(A/加利福尼亚/04/2009)野生型的CT120抗体以及CT120和CT149抗体混合物的MN实验结果，图17b显示了抗NAI耐药性H1N1(A/加利福尼亚/04/2009)H275Y的CT120抗体或CT120和CT149抗体混合物的MN实验结果。
图18a显示了抗A/威斯康辛/67/05(H3N2)野生型以及HA D19N突变体的CT120和CT149抗体的免疫荧光染色结果，图18b显示了抗A/安徽/1/2013(H7N9)野生型以及HA D19N突变体的CT120和CT149抗体的免疫荧光染色结果。
【最佳方式】
自此，本发明所用术语定义如下。
如本文所用，术语“甲型流感病毒”指的是属于正黏病毒科的包膜病毒，其基因组由八条反义单股RNA(核糖核酸)区段构成。这些流感病毒被份为甲型、乙型和丙型。基于主要表面蛋白血球凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)，甲型流感病毒进一步分为各种亚型。截止目前，已鉴定有17种HA和10种NA。
本发明所述“H1亚型”包括H1N1、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5、H1N6、H1N7、H1N8、H1N9和H1N10。
本发明所述“H2亚型”包括H2N1、H2N2、H2N3、H2N4、H2N5、H2N6、H2N7、H2N8、H2N9和H2N10。
本发明所述“H5亚型”包括H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N5、H5N6、H5N7、H5N8、H5N9和H5N10。
本发明所述“H9亚型”包括H9N1、H9N2、H9N3、H9N4、H9N5、H9N6、H9N7、H9N8、H9N9和H9N10。
本发明所述“H3亚型”包括H3N1、H3N2、H3N3、H3N4、H3N5、H3N6、H3N7、H3N8、H3N9和H3N10。
本发明所述“H7亚型”包括H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N5、H7N6、H7N7、H7N8、H7N9和H7N10。
如本文所用，术语“血球凝集素”(下文称为“HA”)表示流感病毒的包膜糖蛋白。HA介导了流感病毒对宿主细胞的吸附和穿透。日前已报道了17种HA亚型。
如本文所用，术语“结合分子”指的是完整免疫球蛋白，包括单克隆抗体，例如嵌合的、人源化的或人单克隆抗体，或指可变区、底物结合酶、受体或蛋白，其包括与完整免疫球蛋白竞争特异性结合免疫球蛋白结合伴侣的免疫球蛋白片段，例如甲型流感病毒的HA单体或HA三聚体。无论结构如何，所述抗原结合片段结合完整免疫球蛋白识别的相同抗原。抗原结合片段可含有一肽或多肽，其包括的氨基酸序列由结合分子氨基酸序列中至少2、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、或250个连续氨基酸残基构成。“抗原结合片段”还包括的Fab、F(ab′)、F(ab′)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双体、三体、四体、多肽(含有至少一个足以使得特异性抗原结合于该多肽的免疫球蛋白片段)等。上述片段可经合成、或酶法、或通过对完整免疫球蛋白的化学剪切而制备，或通过重组DNA技术的基因工程而得。其生产的方法在本领域中众所周知。
如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”指的是任何惰性物质，其与活性分子(例如药物、试剂、或结合分子)组合用于制备适用的或便捷的剂型。所述药学上可接受的赋形剂是一种在所用剂量和浓度下对受者无毒的赋形剂，其能与制剂的其它成分(包括药物、试剂或结合分子)相容。
如本文所用，术语“治疗有效量”指的是可有效预防或治疗由甲型流感病毒引起的情况的结合分子用量。
含有本发明结合分子的组合物可被制成口服剂型，包括粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆和喷雾剂，也可制成外用制剂、栓剂、无菌注射溶液、注射器预装溶液或冻干制剂。具体地，本发明组合物可与常用稀释剂或赋形剂，例如填充剂、扩充剂、粘结剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等制成制剂。口服施用的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等，且所述固体制剂除了所述组合物以外还含有，至少一种赋形剂，例如，淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶。除了简单的赋形剂以外，还可采用如硬脂酸镁或滑石粉等润滑剂。口服施用的液体制剂还可包括混悬剂、溶液、乳剂和糖浆，且除了水和液体石蜡这种常用的简单的稀释剂以外，还可含有多种赋形剂，例如润湿剂、调味剂、芳香剂和防腐剂。胃肠外施用的制剂包括无菌水性溶液、非水性溶液、混悬剂、乳剂、冻干制剂以及栓剂。可采用丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)、可注射酯类(如油酸乙酯)等作为非水性溶剂或悬浮剂。可采用witepsol、聚乙二醇、吐温61、可可油、月桂酯、甘油明胶等作为栓剂的基质。
优选对用于本发明的诊断组合物的结合分子进行可检测标记。生物分子标记可采用多种本领域技术人员熟知的技术，应理解其落在本发明范围内。这些技术有，例如，Tijssen所述“酶联免疫测定操作与理论”(Practice and theory of enzyme immunoassays)，Burden,RH和von Knippenburg(Eds),卷15(1985)“分子生物学基础方法”(Basicmethods in molecular biology)，Davis LG,Dibmer MD；Battey Elsevier(1990),Mayer等，(Eds)“细胞及分子生物学中的免疫化学方法”(Immunochemical methods in cell andmolecular biology)，学术出版社，伦敦(Academic Press,London(1987))，“酶学方法”，学术出版社公司(Academic Press,Inc)。
本领域普通技术人员熟知的不同标记和标记方法有很多。常用的标记还包括，荧光染料(例如荧光黄、若丹明、德州红等)，酶(如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶)、放射性同位素(如32P或125I)，生物素、地高辛、胶体金属、化学或生物性发光化合物(例如二氧杂环丁烷、发光氨或吖啶黄)。标记方法，例如将酶或生物素基团进行共价连接、碘化反应、磷酸化作用、生物素酰化等，均为现有技术熟知。
检测方法包括(但不限于)：放射自显影技术、荧光显微镜、直接或间接酶反应等。常用的检测试验包括放射性同位素或非放射性同位素法。其还尤其包括：RIA(放射性同位素试验)和IRMA(免疫放射性免疫试验)、EIA(酶免疫试验)、ELISA(酶联免疫试验)、FIA(荧光免疫试验)和CLIA(化学发光免疫试验)。
本发明抗体还可用于抗体-药物偶联物的形式。由于给予未偶联的药物会导致无法接受程度的对正常细胞的毒性，利用抗体-药物偶联物(ADC)(例如免疫偶联物)进行局部药物递送，能够使药物靶向递送至感染细胞。通过提高多克隆和单克隆抗体(mAB)的选择性以及药物连接和药物释放特性，能够使ADC达到最大的效应以及最小的毒性。
将药物部分附着于抗体的常用方法(例如通过共价键连接)通常形成分子的非均质混合物，其中药物部分附着于抗体的多个位点。例如，通常将细胞毒性药物通过抗体上常见的赖氨酸残基与抗体偶联，从而形成抗体-药物非均质偶联混合物。基于反应条件，所述非均质混合物通常含有附着于药物部分的约0到约8或更多个抗体的分布。此外，具有特定整数比(药物部分和抗体)的偶联物的各亚组可能是非均质混合物，其中药物部分附着于抗体的不同位点。抗体为较大的、复杂且结构多异的生物分子，常具有多个反应性功能基团。其与接头试剂和药物-接头中间体的反应性取决于如pH、浓度、盐浓度和共溶剂等因素。
在本发明中，鸡尾酒组合物(通过将申请专利保护的抗体(韩国专利申请10-2011-0020061和韩国专利申请10-2012-0107512)和系统发育群1和2的病毒亚型进行混合而获得)的反应性通过微量中和试验(下文称为“MN试验”)进行测定。其中，将对群1具有特异性中和活性的CT120和对群1的部分病毒及群2病毒表现出中和活性的CT149进行混合，并对CT120和CT149混合之前和之后的结合亲和力以及中和活性进行了分析。申请人所提交的韩国专利申请10-2011-0020061和韩国专利申请10-2012-0107512在此作为参考纳入引用。
利用表达H1、H3或H5的细胞系，通过表面等离子体共振法和CELISA(细胞酶联免疫吸收试验)试验对抗体的结合活性进行了测试。结果为，CT120和CT149分别结合于表达H1和H5HA的细胞系，且CT120和CT149的混合物显示出与CT120和CT149各自相似的结合亲和力。当采用表达H3HA的细胞系时，在CELISA试验中CT149表现出结合亲和力，但CT120则未表现出结合亲和力。当采用CELISA试验分析CT120和CT149的混合物时，可发现CT120不会干扰CT149的结合。
CT120和CT149混合之前和之后的中和活性经由微量中和试验测定。结果可见，CT120和CT149各自表现出原始的中和活性，而其间并无干扰，这表明CT120和CT149展示出对群1和群2得到所有甲型流感病毒的中和活性。
为了检测体内的中和活性，在小鼠感染甲型流感病毒之前和之后向小鼠施用CT120和CT149或CT120和CT149的混合物。结果可见，施用抗体混合物(在此记为CT-P27)反映出抗体各自的效果，或显示出所抗体的联合效应，且抗体之间并无相互干扰。
将CT120和CT149以混合物施用或与化学化合物联合施用时，其表现出增强的中和效应。帕拉米韦是一种抵御甲型流感病毒的神经氨酸酶抑制剂。当小鼠感染了甲型流感病毒，向小鼠联合施用难以表现出中和效应的用量的CT120或CT149和低浓度帕拉米韦，则表现出比单独施用CT120或CT149有所增强的效果。
因此，在本发明中，将对群1甲型流感病毒有效的抗体(CT104、CT120和CT123)(由CT120表示)以及对群2甲型流感病毒有效的抗体(CT147、CT149、CT164和CT166)(由CT149表示)进行相互混合并进行施用。结果可见，所述抗体的混合物表现出针对群1和2的所有甲型流感病毒的中和效果。此外，还发现，当所述抗体各自与化学治疗剂联合施用时，可表现出增强的中和效果。
自此，本发明将参考实施例进行具体描述。然而应理解，这些用于说明目的的实施例并不作为对本发明范围的限制。本发明引用的参考文献在此纳入作为参考。
实施例
实施例1：从流感痊愈患者血内分离PBMC
一组由确诊新流感感染后2-4周的患者志愿者组成的患者组。志愿者经确认血液中无流感病毒(H1N1)并具有针对新流感病毒的抗体。该研究经过机构审查委员会(IRB)审批后进行。该患者组具有以下特征：(1)这些患者并未接种季节性流感疫苗；(2)这些患者的其它传染性病毒(即HBsAg)阴性，且抗HCV抗体和抗HIV抗体阴性；(3)这些患者血浆的流感病毒H1N1亚型呈RT-PCR反应阴性；(4)在甲型流感病毒H1N1亚型的HA(H1N1)的ELISA试验中，这些患者的血清显示滴度为1:160或更高。从志愿者中采集100ml的全血，采用LymphoprepTM(Axis-Shield，挪威(1114545)，1114545)，从所采集的血液中分离外周血单核细胞(PBMC)。所分离的PBMC用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次，以2×107个细胞/ml悬浮于KM库II(KM banker II)冷冻剂(Cosmobio，日本，KOJ-16092010)，并在液氮柜中保存。
实施例2：单克隆抗体的初步筛选
采用Jin等所述的方法(Jin A.等.,2009.Nat.Med.15,1088-1092)，筛选分泌抗原特异性抗体的B细胞。简而言之，将实施例1中分离的PBMC按一个细胞/孔的密度加入准备好的微阵列芯片的各个孔中。从单个细胞中分泌的抗体经预包被的抗人IgG抗体确认。利用经标记的HA抗体，采用ELISPOT(酶联免疫斑点试验：塞奇威克(enzyme linked immunospotassay：Sedgwick J.D.,2005,Methods Mol Biol.卷302,314页))对所筛选的抗体分泌细胞是否分泌HA结合抗体进行分析。通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得来源于各个抗体分泌细胞的重链和轻链基因完整序列。将所获得的重链和轻链DNA插入pcDNA 3.1(+)表达载体(英杰公司，美国(Invitrogen,USA,V790-20))以制备产生各抗体重链和轻链的表达载体。将所制备的表达载体转染至CHO细胞。然后，利用所转染的CHO细胞中产生的抗体，通过下述实施例3中的HA-ELISA法对结合于HA的抗体进行初步选择。在此，在未连续稀释抗体样本的情况下将所有显示出HA反应性的抗体进行了初步筛选。
实施例3：单克隆抗体的二次筛选及抗体生产产物
为了从初次筛选的抗体中进行单克隆抗体的二次筛选(其对H1N1流感病毒HA具有高结合能力)，利用HA单体和HA三聚体进行HA ELISA。重组的甲型流感病毒HA1单体购自中国北京义翘神州生物技术有限公司(Sino Biological Inc.China)。所购A/CA/04/09(H1N1)的HA单体(11055-V08H)由HA胞外区(met1-gln529)构成，其在C末端含有10个多组氨酸残基，A/布里斯班/10/07(H3N2)的重组HA1亚单位(11056-V08H1)由HA N末端的片段(Met1-Arg345)构成，其在C末端含有多组氨酸残基并在转染的人细胞中生产。A/CA/04/09(H1N1)和A/布里斯班/10/07(H3N2)的重组HA三聚体(FR-180和FR-61)由IRR提供(流感试剂资源，美国(Influenza Reagent Resource,USA))。各HA三聚体在C末端含有凝血酶剪切位点、三聚体区(折叠)和六个组氨酸残基，并采用杆状病毒体系制备。
对HA抗原的抗体反应活性通过采用HA和所述抗体的ELISA测定。具体地，各取50μl的HA抗原单体和HA抗原三聚体(250ng/ml)并吸附于96孔微量滴定板(Nunc，丹麦(Nunc,Denmark,449824))的各孔内。用含有1％小牛血清蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(Teknova,美国,D5120)封闭滴定板，并向滴定板的各孔内加入3倍连续稀释的抗体样本(起始浓度：1μg/ml)。然后，将滴定板在室温下孵育1小时，再用过氧化物酶标记的山羊抗人γ抗体(Zymed,美国,62.8420)进行处理。在室温下孵育1小时后，将滴定板与四甲基联苯胺(TMB；西格马-奥德里奇(Sigma-Aldrich)，美国，T0440)共孵育，然后加入1N HCl终止孵育。采用滴定板读数器测定450/570nm下的吸光度(Spectramax plus 384，分子器件(MolecularDevice))，并采用医学图表绘制程序(Graphpad prism program)(图表绘制软件公司，美国，(GraphPad Software Inc.USA))将抗原-抗体反应以图表形式示出。
如图1所示，CT104、CT120和CT123抗体对A/CA/04/09(H1N1)HA三聚体表现出高反应性，但对HA单体则表现出较少或未表现出反应性。
如图2所述，CT147、CT149、CT164和CT166抗体轻易地结合于A/布里斯班/10/07(H3N2)的HA三聚体，但未结合于HA1亚单位。这提示，所筛选出的抗体并不结合于已知的HA1表位，但具有仅结合HA1和HA2区段之间交界处或具有正常构象的HA2或HA的能力。
基于图1和2所示的结果，从初次筛选的抗体中二次筛选得到与HA三聚体表现出高结合亲和力的抗体。为了提高二次筛选抗体的表达水平，按以下方式将这些抗体的基因从pcDNA载体中再次克隆到MarEx表达载体(由塞尔特龙(Celltrion)公司构建并获专利)中。再次克隆后，利用含有抗体基因的MarEx表达载体来制备微量中和法(MN试验)和血球凝集素抑制实验(HI试验)所需的抗体。
采用限制性酶NheI和PmeI处理含有二次筛选抗体各重链基因和轻链基因的原始pcDNA载体从而获得重链基因和轻链基因。将所获重链基因和轻链基因分别插入到经相同限制性酶处理的pCT145载体和pCT147载体中。pCT145和pCT147载体由塞尔特龙公司构建，用于分别克隆各抗体的重链和轻链(图3)。然后，为了构建同时含有重链转录单元(启动子-重链基因-多聚A)和轻链转录单元(启动子-重链基因-多聚A)的表达载体，将含有重链基因的pCT145载体经限制性酶PacI和AscI处理并获得重链转录单元，然后将含有轻链基因的pCT147载体经相同的限制性酶处理，再插入重链转录单元。再利用限制性酶筛选出同时含有重链转录单元和轻链转录单元的载体(图4)。所筛选的载体利用Endofree质粒试剂盒(凯杰(QIAGEN)，德国，12362)进行提取，对提取的DNA样本的部分核苷酸序列进行分析，从而确定抗体的核苷酸序列。
随后，将所提取抗体的DNA转染到F2N细胞系(见韩国专利10-1005967)(由韩国塞尔特龙公司制备)的悬浮培养物中，从而制备产生单克隆抗体的瞬时细胞系。转染按以下方式进行。按生产商说明书，采用阳离子聚合物FreeStyleTMMax(英杰公司，美国(Invitrogen,USA,16447-100))进行细胞瞬时转染。在转染前一天，将培养于EX-CELL 293无血清培养基(SAFC,LIK,14571C；自此称为“EX-CELL 293培养基”)中的F2N细胞进行离心并按1×106个细胞/ml的细胞浓度悬浮于改良的EX-CELL 293培养基中(SAFC，LIK，65237；定制)，取80ml细胞悬浮液接种至250ml锥形烧瓶，或取200ml的细胞悬浮液接种于1L锥形烧瓶。在转染当天，在接种了80ml的细胞悬浮液情况中，采用OptiPRO SFM II培养基(英杰公司，USA，12309)将100μg的单克隆抗体编码DNA和100μl的FreeStyleTM Max试剂各稀释到1.6ml体积，然后轻柔搅拌。在接种了200ml的细胞悬浮液情况中，采用OptiPRO SFM II培养基(英杰公司，USA，12309)将250μg的单克隆抗体编码DNA和250μg的FreeStyleTM Max试剂各稀释到4ml体积，然后轻柔搅拌。在搅拌操作后，立即将含有FreeStyleTM Max的稀释溶液与含有DNA的稀释溶液混合，将混合溶液在室温下孵育19分钟。在室温下孵育19分钟期间，采用新鲜的改良EX-CELL 293培养基将所接种的F2N细胞稀释到0.8×106个细胞的细胞浓度。在孵育19分钟后，用含有DNA和FreeStyleTM Max试剂的混合溶液对F2N细胞进行处理并转染。在转染当天，向转染细胞中加入相同量的EX-CELL 293培养基，然后孵育7-8天，由此制备了单克隆抗体。
实施例4：针对病毒中和活性的体外测定
对本发明人筛选出的抗体进行微量中和(MN)测试，从而测定其对于多种流感病毒的中和活性。
实施例4-1：MDCK细胞系的培养以及病毒浓度的测定
采用伦敦系(MDCK-L)作为马-达氏犬肾(MDCK)细胞系。采用含有10％FBS(阿特拉斯生物制剂，美国(Atlas Biologicals,USA,F0500A))、1×青霉素/青霉素(Gibco，美国，15140)、25mM HEPES(Gibco，美国，15630)和2mM的左旋谷氨酰胺(Gibco，美国，25030)的DMEM培养基(Gibco，美国(Gibco,USA,11965))，在37℃、5％的CO2湿化孵育器中培养MDCK细胞系。
采用细胞基ELLISA法对病毒浓度进行定量并测定中值组织培养感染量(TCID50)。病毒浓度的测定按以下方式进行。首先，采用病毒稀释液[DMEM(Gibco，美国)，3％BSA(Gibco，美国，15260)、1×青霉素/青霉素(Gibco，美国)和25mM HEPES(Gibco，美国)]对病毒原液作10倍连续稀释，将100μl经稀释的病毒加入96孔板的各孔。采用不含病毒的病毒稀释液作为阴性对照。然后，通过胰蛋白酶处理将培养的MDCK细胞系与培养孵育器分离，然后用MDCK培养基处理以中和胰蛋白酶。然后，用磷酸盐缓冲盐水对细胞沉淀洗涤两次，然后用病毒稀释剂稀释至细胞浓度为5×105个细胞/ml。向含有病毒的96孔板中加入3-4μl/ml的TPCK-胰蛋白酶(西格马，美国)，然后向板中各孔内立即加入100μl的MDCK细胞系并在37℃、5％的CO2湿化孵育器中孵育20小时。用磷酸盐缓冲盐水洗涤孵育板一次，然后向板中各孔加入200μl的冷丙酮：磷酸盐缓冲盐水(PBS)(80：20)混合溶液。然后，细胞固定8分钟，将板在室温下干燥20分钟。板中各孔用200μl的磷酸盐缓冲盐水洗涤2次。采用含有1％BSA的磷酸缓冲盐水(0.1％吐温20)稀释生物素化的抗核蛋白(NP)单克隆抗体(密理博公司-Milipore，美国，MAB8257B))2000倍，然后向板中各孔加入100μl的稀释液并在室温下孵育1小时。用200μl/孔的磷酸缓冲盐水对板进行洗涤三次，然后向板中各孔加入100μl用含1％BSA的磷酸缓冲盐水配制的链霉亲和素-HRP偶联抗体的20000倍稀释液，然后在室温下孵育1小时。在将板经磷酸盐缓冲盐水洗涤四次后，向板中各孔加入100μl的TMB溶液，将板置于室温下10分钟显色，并用硫酸处理以终止显色，然后测定各孔的OD450。基于所测定的OD450，采用Reed&Muench法(The American 1938)对TCID50进行计算。
实施例4-2：MN试验
采用病毒稀释液将各抗体稀释至10μg/ml的浓度。用病毒稀释液将将抗体稀释液从该初始浓度开始连续稀释至2倍，然后取50μl各稀释液加入96孔板的各孔。同样，50μl病毒按对应于100TCID50的浓度加入各孔中，并于37℃、5％CO2湿化孵育器中孵育1小时。然后，向各孔中加入3-4μg/ml的TPCK胰蛋白酶(西格马，美国，T1426)，并将100μl经处理的MDCK细胞加入各孔，然后在37℃、5％CO2湿化孵育箱中孵育20小时。在孵育20小时后，根据实施例4-1所述病毒定量方法相同的方法进行MN试验，从而测定各孔的OD450值。比仅引入细胞的孔表现出更高OD450值的孔确认为感染了病毒。在未检测到病毒抗原的各抗体OD450中，抗体的最低浓度(μg/ml)如下表1所示，抗体浓度越低意味着对病毒的中和活性越高。
甲型流感病毒H1亚型的特异性抗体的中和能力如下表1所示，甲型流感病毒H3亚型的特异性抗体的中和能力如下表2所示。在这些抗体中，利用不同群的甲流病毒，对效果较佳的CT120和CT149进行微量中和试验。结果，CT120表现出针对群1甲流病毒的中和效应，而CT149表现出针对部分群1病毒和群2甲流病毒的中和效应(表3)。
表1：采用抗体和甲流病毒H1亚型进行的微量中和试验结果
*单位：μg/ml
表2：采用抗体和甲流病毒H3亚型进行的微量中和试验结果
| mAb ID | A/威斯康辛/67/05 | A/香港/68 | A/布里斯班/10/07 |
| CT147 | 2.5 | 2.5 | 0.625 |
| CT149 | 1.25 | 2.5 | 1.25 |
| CT164 | 2.5 | 1.25 | 0.625 |
| CT166 | 5 | 2.5 | 1.25 |
*单位：μg/ml
表3：采用群1和群2流感病毒进行的微量中和试验结果
*单位：μg/ml
实施例5：测定抗体抑制病毒引起的血凝反应的能力
由于本发明抗体为针对病毒HA的中和抗体，对本发明抗体对HA功能显示中和活性的机制进行了研究。HA的功能之一是结合于细胞表面的受体使病毒能粘附于细胞。由于该功能可通过血凝反应进行观察，就可研究抗体针对HA诱发的血凝反应的抑制效果。为此，将抗体在V型底96孔板中连续2倍稀释，加入4倍HA单位的病毒并将其与抗体混合。然后，将板在室温下孵育30分钟，然后向板中各孔加入1％的禽红细胞。在观察不到血凝反应时，将血凝反应抑制的结束点确定为最低抗体浓度。
结果可见，即使在高浓度下(20μg/ml)，所有抗甲流病毒H1亚型的抗体(表4)或抗甲流病毒H3亚型的抗体(表5)均未抑制A/德克萨斯/05/2009和A/纽约/18/2009、A/布里斯班/10/07的血凝反应，而针对它们的抗体在MN试验中表现出中和效应。
表4：采用抗体和甲流病毒H1亚型的血凝抑制实验结果
| mAb ID | A/德克萨斯/05/2009 | A/纽约/18/2009 |
| CT104 | >20 | >20 |
| CT120 | >20 | >20 |
| CT123 | >20 | >20 |
*单位：μg/ml
表5：采用抗体和甲流病毒H3亚型的血凝抑制实验结果
| mAb ID | A/布里斯班/10/07 |
| CT147 | >20 |
| CT149 | >20 |
| CT164 | >20 |
| CT166 | >20 |
*单位：μg/ml
实施例6：抗体抑制膜融合的能力的研究
为了研究中和抗体的作用机制，研究了抗体对HA另一功能(膜融合能力)的抑制作用。当病毒通过内吞作用进入细胞后，HA暴露于低pH值环境，其作用是诱导核内体和病毒包膜之间的膜融合，从而使病毒的基因组穿透细胞。为了在体外重现这种作用，建立了表达A/CA/04/09(H1N1)、A/日本/305/11957(H2N2)、A/布里斯班/10/07(H3N2)或A/越南/1203/04(H5N1)的HA的CHO细胞系并在试验中使用。当各细胞系暴露于低pH时，细胞膜进行融合并形成合胞体。具体地，将各细胞系按1×105个细胞/孔的密度接种于6孔板中，并向各孔中加入含10％FBS的DMEM/F12培养基，再于37℃、5％CO2湿化孵育器中孵育2天。然后，用PBS洗涤细胞，然后在无FBS的DMEM/F12培养基中孵育30分钟，再用4μg/ml的TPCK-胰蛋白酶对细胞进行5分钟处理以活化HA。然后，将培养基替换为含10％FBS的DMEM/F12培养基，再孵育20分钟。用20μg/ml的各中和抗体对细胞进行处理，然后在37℃、5％CO2的湿化孵育箱中孵育1小时。用PBS洗涤孵育的细胞，然后用低pH缓冲液(150mM NaCl、10mM Hepes、pH 5.0)处理6分钟。然后，将培养基换成含10％FBS的DMEM/F12培养基，然后孵育1小时。随后用PBS洗涤细胞，用甲醇固定，并用台盼蓝染色，用显微镜观察细胞的膜融合程度。结果可见，CT120抑制了表达A/CA/04/09(H1N1)、A/日本/305/11957(H2N2)或A/越南/1203/04(H5N1)HA的CHO细胞系的膜融合，CT149抑制了表达A/CA/04/09(H1N1)、A/布里斯班/10/07(H3N2)或A/越南/1203/04(H5N1)HA的细胞系的膜融合(图5a-5d)。
因此，实施例5和6表明本发明抗体所表现出的针对病毒的中和效应是基于其与HA结合而抑制其膜融合的机制。
实施例7：抗体的Fc功能介导抗病毒效应的研究
实施例7-1：体外ADCC实验
为了测定抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，采用了钙黄绿素-AM释放试验。
将钙黄绿素-AM加入表达流感H1N1(A/加利福尼亚/04/2009)的HA的CHO K1细胞系以将改细胞系用作靶细胞。加入了钙黄绿素-AM的靶细胞经不同浓度的CT120和CT149以及阴性对照CT-P6(抗-Her2抗体)处理，然后用效应细胞处理。在将板进行37℃孵育4小时后再进行离心，将上清液转移到不透明板中，然后测定其荧光。采用最大发射(MR)和自发发射(SR)对各抗体浓度下的细胞毒性百分比(％)进行了计算。
如图6a所示，在不同抗体浓度下，阴性对照未表现出细胞毒性，但CT120和CT149在较高浓度下表现出较高的细胞毒性(例如，较高的ADCC)，且CT120所表现出的细胞毒性高于CT149。
实施例7-2：体外CDC实验
采用细胞计数试剂盒-8(CCT-8)检测补体依赖性细胞毒性(CDC)，其中吸光度与活细胞数成比例。
具体地，将表达流感H1N1(A/加利福尼亚/04/2009)的HA的CHO K1细胞系附于平板，用作靶细胞。所述靶细胞经不同浓度的CT120、CT149和阴性对照CT-P6处理，然后用作为补体来源的人血清进行处理。将板在37℃下孵育2小时，然后用CCK-8处理并孵育过夜，然后测定板的吸光度。采用试验系统中最大吸光度和最小吸光度对各抗体浓度下的细胞毒性百分比(％)进行计算。
如表6b可见，在不同的抗体浓度下，阴性对照未表现出细胞毒性，但CT120和CT149在较高浓度下表现出较高的细胞毒性(例如，较高的ADCC)。
实施例7-3：具有小鼠Fc的CT149抗体的制备
为了使CT149抗体具有小鼠的Fc，将NCBI数据库中5个小鼠IgG1序列(GenBank登录号.L27437.1,L35037.1,AB097849.1,Q724328.1和M745099.1)进行了互相比对，将与其它序列具有最高同一性的AB097849.1的恒定区序列作为小鼠IgG1恒定区。任选序列X70423.1的恒定区作为小鼠IgG2a恒定区，因为即便NCBI数据库中两个小鼠IgG2a序列(GenBank登录号.X70423.1和AB097847.1)之间有1bp的差异，二者具有相同的氨基酸序列。此外，对NCBI数据库中四个小鼠κ序列(GenBank登录号U65535.1,BC028540.1,BC094013.1和BC002112.1)进行了互相比对，结果可见，κ序列彼此相同。
合成所选小鼠的IgG1和IgG2a恒定区，通过与人CT149可变区的重叠PCR，获得了具有人可变区和小鼠恒定区的嵌合IgG1重链。为了获得小鼠轻链，通过RT-PCR，从杂交瘤细胞RNA获得κ恒定区，然后通过重叠PCR获得了具有人可变区和小鼠恒定区的嵌合轻链(κ)。发现所获得的轻链和重链序列与NCBI数据库中的序列相同。
将所制备的嵌合抗体基因克隆到表达载体中(由塞尔特龙公司构建)，然后引入CHO K1细胞。将细胞在含有8μg/ml嘌呤霉素的SFM4CHO培养基(Hyclone,目录号:SH30549.02)中进行孵育，然后从细胞中选取稳定细胞系。对所选细胞系进行分批培养来产生具有小鼠Fc的IgG1形式和IgG2a形式抗体。
实施例7-4：利用含小鼠Fc的CT149的动物实验
对由5只小鼠组成的各小鼠组进行5LD50的A/加利福尼亚/04/09病毒滴鼻感染。在病毒感染后24小时，通过腹膜内注射，向每只小鼠施用3mg/kg的各抗体，然后测定小鼠的生存率。实验中所采用的抗体具有CT149的抗原结合位点以及人Fc或小鼠IgG1或IgG2a Fc。在用小鼠抗体的情况下，IgG2比IgG1具有更高的FcgR亲和性(Bruhns P,2012,Blood,119(24):5640-5649)。
结果如图7所示，具有小鼠IgG2a Fc的CT149比其它抗体表现出更高的生存率。因此，可见即使在体内，本发明抗体也通过Fc表现出了它的效果。
实施例8：CT120和CT149抗体结合于H5和H3亚型HA位点的测定
为了测定本发明抗体的HA结合位点，采用X射线晶体成像术(图8a和8b)对结合于HA蛋白的抗体片段氨基酸序列进行了分析。结果可见，CT120表位的主要元件位于A/越南/1203/04(H5N1)的HA2亚单位的螺旋侧(图8a)。CT149位于A/爱知/1968(H3N2)HA2亚单位的螺旋侧，同时它结合HA2亚单位附近的其它单体，这意味着其确实结合单一HA三聚体中的三个亚单位(图8b)。
实施例8-1：重组HA蛋白的表达
为了生产用于X射线衍射分析的重组HA蛋白，将A/越南/1203/04(H5N1)和A/爱知/1968(H3N2)各自的HA基因的胞外段克隆至杆状病毒载体pAcGP67-A(BD Pharmingen)。用杆状病毒(构建自该载体)按5-10的MOI(感染复数)在28℃下感染粉纹夜蛾(Tricoplusia ni)(高5)细胞系(英杰公司)72小时。通过金属亲和色谱法和尺寸排阻凝胶过滤层析(Superdex200 16/60柱；GE医疗)，从所收集的培养基中纯化表达并分泌的HA蛋白。为进行结晶，将纯化的HA与3个单位的凝血酶在4℃下孵育，从而除去C-末端折叠/组氨酸标签。
实施例8-2：抗体片段的纯化
将CT120和CT120抗体各自与木瓜蛋白酶(罗氏(Roche)，REF#:10108014001)以100:1的比例混合后在37℃下用木瓜蛋白酶处理1小时，然后加入20mM的IAA(西格马：A3221)，再于37℃下孵育45分钟。用HiPrep 26/10脱盐柱(GE医疗，目录号17-5087-01)将培养基换成含有20mM磷酸盐和25mM NaCl(pH7.0)的缓冲液，然后将孵育材料上样至Mabselect Sure柱(GE医疗，目录号17-5438-03)以去除Fc区，采用超滤过滤器单元(Amiconultra centrifugal filter unit(密理博公司,REF#:UFC901096))将Fab片段浓缩至浓度为10mg/ml。经浓缩的Fab片段利用PBS缓冲液并通过尺寸排阻凝胶过滤层析(Superdex20010/300GL GE医疗，目录号17-5175-01)作进一步纯化。
实施例8-3：抗体片段和HA蛋白的共结晶
CT120的Fab片段为三聚体形式，并将其以5:1的比例与根据实施例7-1方法纯化的A/越南/1203/04(H5N1)的HA蛋白进行混合，然后进行结晶，将CT149Fab片段按5:1的比例与A.爱知/2/68(H3N2)的HA蛋白进行混合，然后进行结晶。所获结晶用含有50mM Tris-HCl(pH8.0)和150mM NaCl的缓冲液通过尺寸排阻凝胶过滤层析(Superdex 200 10/30柱；GE医疗)进行分离，然后分别浓缩至15mg/ml和12mg/ml。
采用TopazTM自由界面扩散(Free Interface Diffusion(FID))结晶系统(富路达公司，旧金山，CA(Fluidigm Corporation,San Francisco,CA))进行初步稀疏矩阵结晶筛选。在含有沉淀剂、聚乙二醇(PEG)6000的多个条件下，在24小时内获得CT120Fab-H5复合物的基础结晶条件。通过优化，建立了能够制备能作衍射分析的晶体的条件。最后，通过将1.0μL的CT120/H5复合物与同样体积的10％PEG 6000、100mM甲次砷酸钠(pH6.5)和400mM的甲酸钠混合，采用悬滴蒸汽扩散结晶法，在23℃下生长晶体。在分辨率的高级光子源(APS)SER CAT 22-ID光束线下收集CT120Fab-H5复合物的衍射数据集。CT120Fab-H5以p1初级三斜晶系空间群形式(primitive triclinic space group)结晶。
在含有沉淀剂、聚乙二醇(PEG)3000的多个条件下，在24小时内获得了CT149Fab-H3复合物的基础结晶条件。通过优化，建立了能够制备能作衍射分析的晶体的条件。最后，通过将1.0μL的CT149Fab-H3复合物与同样体积的20％PEG 3000和100mM柠檬酸钠(pH5.5)混合，采用悬滴蒸汽扩散结晶法，在23℃下生长晶体。在分辨率的高级光子源(APS)SER CAT 22-ID光束线下收集CT149Fab-H3复合物的衍射数据集。CT149Fab-H5以p31初级三方晶系空间群形式(primitive trigonal space group)结晶。
实施例8-4：X射线衍射分析
数据收集及精修统计如下表6所示。采用HKL 2000和Denzo程序对数据进行了处理和定标。采用Phaser程序，通过分子置换解析CT120Fab-HA3复合物和CT149Fab-HA3复合物的结构。采用REFMAC5程序对分子置换所得溶液进行刚体和限制性精修，采用Coot建模。通过模型良好界定2Fo-Fc电子密度，并在REFMAC5中完成结构的限制性精修。
表6：数据收集以及精修统计
实施例8-5：结构数据的确认和分析
根据完整的HA1和HA2亚单位，对两个复合物的HA区的残基进行编号。采用Procheck和RCSB PDB验证服务器进行了结构验证。采用PDBCARE(Glycosciences.de)网站对碳水化合物部分的联系和命名进行验证。采用Coot和Pymol进行模型操作、RMSD计算和距离检测。采用PISA和Protorp计算溶剂可及表面积。
实施例9：CT149抗体与H7亚型HA的结合位点测定
为了测定本发明CT149抗体在H7亚型(H7N9,A/安徽/1/2013)的HA上的结合位点，通过X射线结晶学分析了与抗体片段结合之处的HA蛋白的氨基酸序列(图8c)。
表7：数据收集和精修分析
实施例10：通过表面等离子体共振技术进行抗原-抗体亲和力测定
表面等离子体共振实验(Biacore公司)通过动力学检测结合速率和解离速率常数测定抗体的结合亲和力。
25℃，利用运行缓冲液HBS-EPB(10mM HEPES[pH 7.4],150mM NaCl,3mM EDTA,0.1mg/ml BSA和0.005％表面活性剂P20)，利用Biacore T200(GE医疗)通过表面等离子体共振实验测定CT120和CT149抗体与纯化的重组流感HA蛋白的结合。根据生产商说明书以及在1μg/ml操作，采用标准胺偶联试剂盒将10mM醋酸钠(pH5.0)稀释的约500RU的抗-6×his标签抗体直接固定在CM5研究级生物传感器芯片上。在生物传感器表面未反应的部分用乙醇胺封闭。采用Biacore T200控制软件和Biacore T200评估软件进行动力学分析。用HBS-EP缓冲液稀释CT120和CT149抗体。将要作为结合物捕获的重组流感HA蛋白以10μl/min的流速注入反应矩阵。在该实验中，所有测定均以未捕获重组流感HA的捕获表面为参照。在30μl/min的流速下，测定结合和解离速率常数Ka(M-1s-1)和Kd(s-1)。由通过在1.23-100nM的不同抗原浓度下进行动力学结合测定得到速率常数(以3倍连续稀释)，并包括了仅含缓冲液的注射从而用于双重参考。然后抗体和靶抗原之间的平衡解离常数KD(M)可经以下公式从动力学速率常数计算获得：KD＝Kd/Ka。结合记录为时间的函数并计算动力学速率常数。
测定了CT120和CT149与各流感病毒的纯化重组HA的结合亲和力(表8-18)。CT120表现出比CT149更高的H1亲和力，但无H3亲和力。取决于病毒毒株，CT149表现出较高的H3亲和力。CT120和CT149均表现出高H5亲和力。对于H7，CT120则未表现出亲和力，但CT149表现出高亲和力。
表8：H1N1的HA蛋白结合亲和力的测定(A/加利福尼亚/04/09)
表9：H1N1的HA蛋白结合亲和力的测定(A/德克萨斯/05/09)
表10：H1N1的HA蛋白结合亲和力的测定(A/所罗罗罗/03/06)
表11：H1N1的HA蛋白结合亲和力的测定(A/俄亥俄/07/09)
表12：H3N2的HA蛋白结合亲和力的测定(A/菲律宾/2/82)
表13：H3N2的HA蛋白结合亲和力的测定(A/威斯康辛/67/05)
表14：H3N2的HA蛋白结合亲和力的测定(A/布里斯班/10/07)
表15：H5N1的HA蛋白结合亲和力的测定(A/越南/1203/04)
表16：H7N7的HA蛋白结合亲和力的测定(A/英格兰/268/96)
表17：H7N9的HA蛋白结合亲和力的测定(A/上海/1/2013)
表17：H7N9的HA蛋白结合亲和力的测定(A/安徽/1/2013)
实施例11：细胞ELISA(CELESA)实验
利用表达H1、H3或H5HA的细胞系，通过CELISA实验分析抗体对HA的结合亲和力。为了获得H1表达细胞系，采用A/CA/04/09病毒HA的遗传信息来合成基因，然后亚克隆至表达载体，再转染至CHO-K1细胞系，其后，对H1表达细胞系进行筛选。采用A/布里斯班/10/07病毒HA的遗传信息获得了H3表达细胞系。采用A/越南/1203/04病毒HA的遗传信息获得了H5表达细胞系。采用含10％FBS的DMEM培养基，在37℃、5％CO2湿化孵育器中培养各HA表达细胞系。通过胰蛋白酶处理，将培养的细胞系与培养瓶分离，然后在加入培养基以中和胰蛋白酶后进行离心，接着，按2×105细胞/ml的浓度在培养基中稀释。向96孔板各孔中加入100μl的稀释细胞，并在37℃、5％CO2湿化孵育器中培养18小时从而使其附着于96-孔板。培养后，用200μl的冷PBS洗涤各孔两次，然后向各孔中加入150μl的3.7％福尔马林溶液并在室温下孵育15分钟以固定细胞。各孔用含0.05％吐温20的200μl PBS洗涤三次，再用200μl的稀释缓冲液(TEKNOVA,目录号D5120)在室温下封闭60分钟。采用稀释缓冲液对各抗体样本(CT120或CT149)浓度(ug/ml)作4-倍连续稀释，然后向各孔中加入100μl的抗体样本，并在室温下孵育60分钟。各孔用含0.05％吐温20的200μl PBS缓冲液洗涤三次，然后向各孔中加入100μl 1:1000稀释的HRP偶联抗人κ链抗体，并在室温下孵育40分钟。各孔用含0.05％吐温20的200μl PBS缓冲液洗涤三次，然后向各孔中加入100μl TMB缓冲液(西格马，目录号T0440)并在室温下孵育6分钟。接着，向各孔中加入100μl的1N硫酸以终止孵育，并测定450nm下的吸光度。
结果，CT120和CT149各自结合于表达H1和H5HA的细胞系，将CT120和CT149按1:1比例混合的CT-P27表现出与CT120和CT149各自相似的结合亲和力(图9A和9C)。在采用表达H3HA的细胞系进行的CELISA中，CT149表现出结合亲和力，但CT120未有与H3HA的结合。CT-P27表现出与CT149相似的结合亲和力，暗示着CT120并不干扰CT149的结合(图9B)。
实施例12：在混合之前和之后，抗体对甲型流感病毒的中和活性。
将CT120和CT149按1:1的比例互相混合，该混合物被称为“CT-P27”。采用实施例4所述微量中和试验的改进方案，测定不同流感病毒亚型抗体的EC50值。为了测定EC50值，将抗体调整到初始浓度800-6400μg/ml，然后连续稀释四倍以制备传染性病毒。检测各孔在OD450的吸收度，确定仅引入培养基的孔获得的基础值，此后，采用西格马作图程序绘制与浓度呈函数关系的4参数图，计算对应于50％OD450下最大吸光度的浓度，从而确定了EC50值。
EC50为抗体对病毒表现出50％最大中和活性的浓度，EC50值越低表示抗体的中和活性越高。
结果，CT120和CT149各自对它们原来就表现出中和活性的病毒表现出相似的中和能力，两种抗体的混合物表现出有效的中和能力而两个抗体之间均没有干扰。因此，CT120和CT149的混合物对群1和群2的所有甲型流感病毒表现出中和效应(表19)。
表19：不同甲型流感病毒的EC50测定的结果
W*：弱中和效果/N**：无中和效果
NT：未测试/将被测试
1：在接触实验室A进行的测试
2：在接触实验室B进行的测试
实施例13：通过动物实验检测抗体混合物对甲流病毒的预防和治疗性效果
为了测定是CT120和CT149抗体的单独施用还是混合施用在小鼠中甲流病毒表现出预防和治疗效应，对小鼠的生存率进行了测定。对由5-10只小鼠构成的各组进行5-10LD50的流感病毒经鼻感染。在病毒感染前24小时或病毒感染后24小时，将抗体以7.5、15、30mg/kg的量经腹膜内注射施用于小鼠。CT-P27是CT120和CT149的1:1混合物，其总量已示出，因此抗体混合物中CT120和CT149各自的量就等于所示量的一半。
结果，CT-P27维持了CT120和CT149抗体各自的效果，且未为显示出抗体之间的干扰。
13-1：抗体混合物对H1N1的预防和治疗效果
对由5-10只小鼠构成的各组进行5-10LD50的A/加利福尼亚/04/09经鼻感染。在病毒感染前24小时或病毒感染后24小时，将抗体经腹膜内注射施用于小鼠并测定小鼠的生存率。
结果如图10所示，当在病毒感染前24小时施用CT120、CT149或CT-P27抗体，所有小鼠在实验期间以抗体浓度依赖性的方式得以存活。当在病毒感染后施用抗体时，施用CT120、CT149或CT-P27抗体的小鼠的生存率随着抗体浓度的上升而上升。施用CT120的小鼠生存率略高于施用CT149的小鼠。CT-P27表现出CT120和CT149总生存率相似的生存率(叠加效应)，这表明并未发生抗体混合导致的效果下降。
13-2：抗体混合物对H3N2的预防和治疗效果
对由5-10只小鼠构成的各组进行10LD50的A/布里斯班/10/07或5LD50的A/菲律宾/2/82的经鼻感染。在病毒感染前24小时或病毒感染后24小时，将抗体经腹膜内注射施用于小鼠并测定小鼠的生存率。
结果如图11所示，在病毒感染前24小时施用各抗体后，CT120并未能提高小鼠的生存率，而施用了CT149或CT-P27的小鼠在所测试的任何抗体浓度的实验期间均得以存活。当在感染了A/菲律宾/2/82病毒后24小时施用各抗体，CT120并未能提高小鼠的生存率，而CT149和CT-P27则随着浓度的上升表现出生存率的上升。CT-P27在对应于CT149抗体的浓度下表现出生存率，表明在抗体混合物中的CT120和CT149之间并没有干扰。
13-3：抗体混合物对H5N1的治疗效果
对由5-10只小鼠构成的各组进行10LD50的A/越南/1203/04的经鼻感染。在病毒感染后24小时，将抗体经腹膜内注射施用于小鼠并测定小鼠的生存率。
结果如图12所示，当在感染了A/越南/1203/04病毒后24小时给小鼠施用抗体，所有小鼠在各抗体测试浓度的实验期间，均得以存活。
13-4：CT149抗体对H7N9的治疗效果
对由10只小鼠构成的各组进行106PFU的A/安徽/1/2013的经鼻感染。在病毒感染后24小时，将抗体经腹膜内注射施用于小鼠并测定小鼠的生存率。
结果如图13所示，当施用阴性对照抗体时，在施用后3天，小鼠开始死亡，并在7天后几乎全部死亡。然而，在病毒感染24小时后施用了CT149抗体的小鼠的生存率随着抗体浓度的上升而上升。
实施例14：将抗体混合物与化学化合物联合施用的效果
由5只小鼠构成的各组进行5LD50A/CA/04/09病毒或5LD50A/菲律宾/2/82病毒的经鼻感染。在病毒感染后24小时，将神经氨酸酶抑制剂帕拉米韦通过腹膜内注射对小鼠进行1次给药(×1)，连续5天。或者，将不同浓度的抗体单独或与帕拉米韦联合施用，并测定生存率。
结果如图14A所示，当在感染了A/CA/04/09病毒后24小时，向小鼠单独施用15mg帕拉米韦或1mg CT120，小鼠的生存率分别提高了40％和20％，但联合施用15mg帕拉米韦和1mg CT120时，小鼠的生存率高达80％。类似地，如图14B所示，在感染了A/菲律宾/2/82病毒后24小时，单独施用15mg帕拉米韦，出现了40％的生存率，当单独施用1mg CT149时，所有小鼠在第8天死亡。然而，将CT149和帕拉米韦联合施用时，则表现出高达80％的生存率。单独施用抗体或帕拉米韦表现出的死亡率较高，因为抗体或帕拉米韦的浓度并非为最优浓度，而抗体和帕拉米韦的联合使用则表现出了协同效应。
实施例15：抗体混合物对神经氨酸酶抑制剂耐药的H7N9突变株R292K的中和效果
对于A/上海/2/2013病毒和A/安徽/1/2013病毒，采用体外中和试验分析CT149(CT-P23)和CT-P27对病毒感染的性能。按实施例4所述进行分析，分析结果如图15所述。CT149和CT-P27表现出中和病毒的能力，其IC50值如图15所示。
对于A/上海/1/2013(野生型)病毒及其突变型(R292K)，也同样通过体外中和试验分析了抗体的病毒中和能力。按实施例4所述进行分析，分析的结果如图16a和16b所示。CT149和CT-P27均表现出中和病毒的能力，其IC50值如下表20所示。
表20：CT149和CT-P27对A/上海/1/2013(野生型)及其突变株的中和能力(IC50)
| 病毒毒株 | 类型 | CT-P23 | CT-P27 |
| A/上海/1/2013 | 野生型 | 7.705 | 13.14 |
| A/上海/1/2013 | R292K | 14.87 | 16.28 |
*单位：μg/mL
实施例16：抗体混合物对神经氨酸酶抑制剂耐药性H1N1突变株H275Y的中和效应
CT120(CT-P22)和CT149(CT-P23)按1:1比例相互混合，将混合物命名为“CT-P27”。按实施例4所述的微量中和试验，测定CT120和CT-P27对神经氨酸酶抑制剂耐药性H1N1突变株H275Y的EC50值。为了测定EC50值，将抗体调整为初始浓度：CT120：800μg/ml，CT-P27：400μg/ml，然后作4倍连续稀释。检测各孔OD450下的吸光度，确定仅引入培养基的孔获得的基础值，此后，采用西格马作图程序绘制与浓度呈函数关系的4参数图，计算对应于50％OD450下最大吸光度的浓度，从而确定了EC50值。
EC50为抗体对病毒表现出50％最大中和活性的浓度，EC50值越低表示抗体的中和活性越高。
结果如图17a和17b所示，CT120和CT-P27表现出对神经氨酸酶抑制剂耐受性H1N1突变株H275Y病毒的中和能力，尤其是两种抗体的混合物(CT-P27)显示出了对突变病毒的中和能力，而两种抗体间没有干扰。
实施例17：抗体混合物对HA突变株的结合亲和力
如文献中报道，与CT149相似，对群2的流感病毒表现出中和效应的CR8020抗体对天然存在的HA D19N突变株表现出较低的结合亲和力(Ekiert DC.等2011,Science 333(6044):843-50)。因此，将D19N突变人工引入A/威斯康辛/67/05(H3N2)和/安徽/1/2013(H7N9)的各HA(CT149具有结合活性的)，从而制备表达HA的CHO细胞系。采用CT149对细胞系作免疫荧光染色。
结果，无结合活性的CT120未染色CHO细胞，而CT149不但轻易染色了野生型CHO细胞，还染色了引入了D19N突变的表达HA的CHO细胞(图18a和18b)。
Claims (14)
1.一种组合物，其含有至少两种结合于甲型流感病毒血球凝集素(HA)蛋白干区表位的甲型流感病毒中和结合分子，所述组合物含有：
i)第一结合分子，其可中和至少一种选自下组的甲型流感病毒亚型：H1、H2、H5和H9；和
ii)第二结合分子，其可中和至少一种选自下组的甲型流感病毒亚型：H1、H3、H5、H7和H9，
其中，所述第一结合分子的表位含有选自H1、H2、H5和H9亚型的HA1多肽的第18、38、40、291、292和318位的氨基酸残基，且含有选自H1、H2、H5和H9亚型的HA2多肽的第18、19、20、21、41、42、45、48、49、52和53位的氨基酸残基；和
且所述第二结合分子的表位含有选自H1、H3、H5、H7和H9的HA1多肽的第278和318位的氨基酸残基，且含有选自H1、H3、H5、H7和H9的HA2多肽的第38、39、41、42、45、48、49、52和53的氨基酸残基；
其中所述第一结合分子包含的多肽含有轻链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ IDNO:7所示CDR1区、SEQ ID NO:8所示CDR2区和SEQ ID NO:9所示CDR3区；和重链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO:10所示CDR1区、SEQ ID NO:11所示CDR2区和SEQ ID NO:12所示CDR3区；
其中所述第二结合分子含有的多肽，其含有轻链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQID NO:25所示CDR1区、SEQ ID NO:26所示CDR2区和SEQ ID NO:27所示CDR3区；和重链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO:28所示CDR1区、SEQ ID NO:29所示CDR2区和SEQ IDNO:30所示CDR3区。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一结合分子的结合亲和力(KD)低于1×10-8M。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二结合分子的结合亲和力(KD)低于1×10-6M。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一结合分子对H1亚型的EC50值为2.0μg/ml或更低，对H2亚型的EC50值为7.0μg/ml或更低，对H5亚型的EC50值为7.0μg/ml或更低，或对H9亚型的EC50值为4.0μg/ml或更低。
5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二结合分子对H3亚型的EC50值为40.0μg/ml或更低，对H5亚型的EC50值为212.0μg/ml或更低，对H7亚型的EC50值为8.0μg/ml或更低，或对H9亚型的EC50值为8.0μg/ml或更低。
6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物对H1亚型的EC50值为3.0μg/ml或更低，对H2亚型的EC50值为13.0μg/ml或更低，对H3亚型的EC50值为70.0μg/ml或更低，对H5亚型的EC50值为9.0μg/ml或更低，对H7亚型的EC50值为14.0μg/ml或更低，或对H9亚型的EC50值为6.0μg/ml或更低。
7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一结合分子含有：
一多肽，其含有一轻链区，包括SEQ ID NO:45所示的多肽序列，以及一重链区，其包括SEQ ID NO:46所示的多肽序列。
8.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二结合分子含有：
一多肽，其含有一轻链区包括SEQ ID NO:51所示的多肽序列，以及一重链区，其包括SEQ ID NO:52所示的多肽序列。
9.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一结合分子含有一轻链区，其包括SEQ ID NO:45所示的多肽序列，以及一重链区，其包括SEQ ID NO:46所示的多肽序列；和
所述第二结合分子含有一轻链区，其包括SEQ ID NO:51所示的多肽序列，以及一重链区，其包括SEQ ID NO:52所示的多肽序列。
10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其特征在于，所述结合分子是抗体或其抗原结合片段。
11.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述抗体上还连接有抗病毒药物。
12.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物是无菌注射溶液、冻干制剂、注射器预装溶液、口服剂型、外用制剂、或栓剂的形式。
13.如权利要求1-9中任一所述组合物的用途，其特征在于，用于制备诊断由甲型流感病毒引起的疾病的试剂盒、和/或制备预防或治疗由甲型流感病毒引起的疾病的药物组合物。
14.一种诊断流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有：
i)权利要求1所述的组合物；和
ii)一容器。
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