WO2018038096A1 - モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント及びその使用 - Google Patents

モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント及びその使用 Download PDF

Info

Publication number
WO2018038096A1
WO2018038096A1 PCT/JP2017/029911 JP2017029911W WO2018038096A1 WO 2018038096 A1 WO2018038096 A1 WO 2018038096A1 JP 2017029911 W JP2017029911 W JP 2017029911W WO 2018038096 A1 WO2018038096 A1 WO 2018038096A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
virus
antigen
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/029911
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
河岡　義裕
誠也 山吉
睦美 伊藤
隆太 浦木
Original Assignee
国立大学法人東京大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人東京大学 filed Critical 国立大学法人東京大学
Publication of WO2018038096A1 publication Critical patent/WO2018038096A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to monoclonal antibodies or antigen-binding fragments thereof and uses thereof.
  • the present invention includes a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof, a pharmaceutical composition containing the monoclonal antibody or the antigen-binding fragment thereof, a gene comprising DNA encoding the monoclonal antibody or the antigen-binding fragment thereof, the gene
  • An expression vector comprising
  • the influenza A virus has 8 segmented negative sense virus RNA (vRNA).
  • vRNA segmented negative sense virus RNA
  • Two of the vRNAs are molecules on the surface of the envelope and encode the major antigenic proteins hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA).
  • HA hemagglutinin
  • NA neuraminidase
  • HA of influenza A virus is a trimer type I transmembrane glycoprotein and is classified into 18 subtypes (H1 to H18). These subtypes are divided into two phylogenetic groups, specifically group 1, consisting of H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17 and H18, and H3 , H4, H7, H10, H14, and H15. Furthermore, influenza A viruses are classified into subtypes such as H1N1, H2N2, and H3N2 due to the difference in antigenicity of NA. In particular, in human influenza A viruses, since HA and NA are periodically mutated, even if vaccination corresponding to a conventional subtype is received, the effect is often not expected.
  • HA of influenza A virus is composed of regions having different structures such as a head region (spherical head region, head region) and a stem region (stem region or stalk region).
  • the globular region contains a receptor binding site for the virus to bind to the target cell and is involved in the hemagglutination activity of HA.
  • the stem region contains a fusion peptide necessary for membrane fusion between the viral envelope and the cell endosomal membrane, and is involved in the fusion activity.
  • Most conventional anti-HA antibodies that recognize influenza A viruses recognize the globular head region of HA.
  • zanamivir relenza
  • oseltamiburu Tamiflu
  • amantadine that inhibit proton conductivity of the M2 channel.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof that recognizes the stem region of HA and effectively suppresses the growth of influenza A virus. Also provided is a pharmaceutical composition for treating or preventing an effective influenza A virus disease containing the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof. Moreover, the gene which consists of DNA which codes the said monoclonal antibody or its antigen binding fragment is provided. Also provided is an expression vector comprising the gene.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof binds to influenza A virus and has the activity of suppressing the growth of the virus, the monoclonal antibody against the HA antigen of influenza A virus or the antigen-binding fragment thereof Because (A) CDR-L1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one to several amino acids are deleted, substituted or added; (B) CDR-L2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, wherein one amino acid is deleted, substituted or added; (C) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or CDR-L3 comprising an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, A light chain variable domain comprising: and (D) CDR-H1 comprising the amino acid sequence
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect is shown in CDR-L1 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, CDR-L2 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3.
  • a light chain variable domain comprising CDR-L3 comprising an amino acid sequence
  • a heavy chain variable comprising CDR-H1 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4
  • CDR-H2 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 and CDR-H3 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6
  • You may have a domain.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect has a light chain variable domain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 and a heavy chain variable domain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8. Also good.
  • the pharmaceutical composition according to the second aspect of the present invention is a pharmaceutical composition for treating or preventing influenza A virus disease in a subject, wherein the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to the first aspect is effective. Contains as a component.
  • the gene according to the third aspect of the present invention is a gene comprising any one of the following DNAs (g) to (j) and the following DNAs (k) to (n): It consists of DNA that encodes a protein that binds to influenza A virus and has the activity of inhibiting the growth of the virus.
  • the expression vector according to the fourth aspect of the present invention includes the gene according to the third aspect.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the above aspect can recognize the HA stem region and effectively suppress the growth of influenza A virus. Moreover, the pharmaceutical composition of the said aspect is effective in treating or preventing influenza A virus. Moreover, according to the gene and expression vector of the said aspect, the said monoclonal antibody or its antigen binding fragment is obtained.
  • 2 is a graph showing changes in body weight and survival rate of mice administered with different concentrations of S9-1-10 / 5-1 or PBS and inoculated with each virus in Examples.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof binds to influenza A virus and has an activity of suppressing virus growth.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of this embodiment is a monoclonal antibody against the HA antigen of influenza A virus or an antigen-binding fragment thereof.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present embodiment comprises a light chain variable domain containing the following (a) to (c) and a heavy chain variable domain containing the following (d) to (f): Having one or more selected from the group.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of this embodiment recognizes the HA stem region as shown in the examples described later.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of this embodiment recognizes the HA subtype belonging to both phylogenetic groups of group 1 and 2 of influenza A virus, as shown in the examples described later. Therefore, the proliferation of a wide variety of influenza A viruses can be effectively suppressed.
  • CDR means a complementarity-determining region
  • monoclonal antibody means an antibody having substantially uniform specificity.
  • the monoclonal antibody includes all classes and subclasses of immunoglobulins. Specifically, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE etc. are mentioned, for example. Especially, it is preferable that the monoclonal antibody of this embodiment is IgG.
  • the “antigen-binding fragment” of a monoclonal antibody means a part (partial fragment) of an antibody that specifically recognizes a target protein.
  • Fv variable region fragment
  • scFv single chain Fv
  • Fv diabody
  • multispecificity examples thereof include antibodies and polymers thereof.
  • the “monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof against the HA antigen of influenza A virus” means that the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present embodiment is a hemagglutinin (HA) of influenza A virus.
  • HA hemagglutinin
  • This specific binding is, for example, binding of an antigen to an epitope of an antibody in an in vitro assay, preferably a plasmon resonance assay using purified wild-type antigen (eg, BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Sweden, etc.) Can be quantified.
  • the affinity of binding can be defined by ka (rate constant for antibody binding from antibody-antigen complex), kD (dissociation constant), and KD (kD / ka).
  • the binding affinity (KD) is preferably 10 ⁇ 8 mol / L or less, more preferably 10 ⁇ 9 M to 10 ⁇ 13 mol / L. preferable.
  • neutralizing antibody or “antibody that neutralizes” means an antibody that can neutralize an antigen. That is, it can mean that an antigenic pathogen can prevent, inhibit, reduce, delay or interfere with the ability to initiate or maintain infection of a host.
  • the neutralizing antibody or neutralizing antibody can be used alone or in combination as a prophylactic or therapeutic agent or as a diagnostic tool based on an appropriate formulation in association with an active vaccine.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of this embodiment has a very broad specificity for HA, one or more influenza A virus subtypes belonging to group 1, which is a phylogenetic group of HA, and , One or more influenza A virus subtypes belonging to group 2 can be neutralized. That is, the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present embodiment is within the HA stem region conserved between two or more influenza A virus subtypes selected from the group consisting of Group 1 and Group 2. Can bind to an epitope.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of this embodiment can specifically bind to all 18 types of subtype HA of influenza A virus, as shown in the Examples below. More specifically, the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of this embodiment is a subtype H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12 of influenza A influenza. , H13, H14, H15, H16, H17 and H18. More specifically, the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present embodiment can specifically bind to the subtype of influenza A influenza HA. Representative influenza A virus subtypes include, but are not limited to, those shown below.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of this embodiment can specifically bind to an epitope present in the stem region of HA of influenza A virus as shown in the Examples described later. Therefore, as long as the specific recognition ability of the HA stem region of influenza A virus is maintained, 1 to several amino acids in the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 6 in the above (a) to (f) May be deleted, substituted or added.
  • the number of amino acids that may be deleted, substituted, or added is preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, and even more preferably 1.
  • substitution means substitution with another amino acid residue having a chemically similar side chain.
  • Groups of amino acid residues having chemically similar amino acid side chains are well known in the technical field to which the present invention belongs.
  • acidic amino acids aspartic acid and glutamic acid
  • basic amino acids lysine, arginine, histidine
  • neutral amino acids amino acids with hydrocarbon chains (glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline), hydroxy groups
  • Amino acids with amino acids seerine / threonine
  • amino acids with sulfur cysteine / methionine
  • amino acids with amide groups asparagine / glutamine
  • amino acids with imino groups proline
  • amino acids with aromatic groups phenylalanine / tyrosine / And tryptophan).
  • the amino acid sequence variant in which one to several amino acids are deleted, substituted, or added in the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present embodiment has a binding activity to the antigen of the control antibody (for example, HA of influenza A virus). Higher than the antibody against the stem area of the control antibody (for example, HA of influenza A virus).
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present embodiment includes CDR-L1 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, CDR-L2 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3.
  • a light chain variable domain comprising CDR-L3 comprising the amino acid sequence shown, and CDR-H1 comprising the amino acid sequence depicted in SEQ ID NO: 4, CDR-H2 comprising the amino acid sequence depicted in SEQ ID NO: 5, It preferably has a heavy chain variable domain comprising CDR-H3 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present embodiment is a flexible peptide linker comprising a light chain variable domain and a heavy chain variable domain, which are the minimum units necessary for recognizing an antigen. It is preferably a single variable domain fragment bound by That is, it is preferably an scFv antibody.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present embodiment comprises a light chain variable domain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 and a heavy chain variable domain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8. It is preferable to have this order.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of this embodiment has a high neutralizing titer.
  • the concentration of the antibody of the present invention required to neutralize 50% of influenza A virus can be, for example, about 50 ⁇ g / mL or less.
  • the concentration of the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present embodiment required to neutralize 50% of influenza A virus is, for example, about 50 ⁇ g / mL or less, and 30 ⁇ g / mL or less. Is preferably 20 ⁇ g / mL or less, more preferably 10 ⁇ g / mL or less, particularly preferably 5 ⁇ g / mL or less, and most preferably 1 ⁇ g / mL or less. Titers can be measured using standard neutralization assays as known to those skilled in the art.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present embodiment specifically binds to an epitope conserved in the HA stem region of the subtypes of group 1 and group 2 influenza A viruses and releases viral particles.
  • An interfering antibody eg, an isolated antibody or a purified antibody.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of this embodiment binds to an epitope conserved in the HA region of influenza A virus, and the virus Inhibiting virus release from cells by interfering with the particle release process.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of this embodiment may be a chimeric antibody or a specific mammalized antibody (particularly a humanized antibody).
  • the chimeric antibody refers to an antibody in which the constant region portion of the antibody is replaced with the constant region portion of an antibody derived from another mammal.
  • a human antibody is preferable.
  • a humanized antibody is one in which only the CDR in the variable region is derived from a non-human mammal antibody such as a rat, and the framework region (FR) and constant region in the variable region other than the CDR are derived from a human antibody.
  • the class of the chimeric antibody or humanized antibody may be any of IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE. Among these, the class of the chimeric antibody or humanized antibody is preferably IgG.
  • an antibody derived from another mammal eg, a non-human antibody
  • a specific mammal eg, a human
  • an immune response to a heterologous antigen is induced, and serious side effects such as anaphylactic shock may occur.
  • the constant region portion of the antibody is a chimeric antibody or a specific mammalianized antibody (for example, a humanized antibody) in which the antibody is derived from a specific mammal-derived antibody (for example, a human antibody)
  • the mammal examples include humans, mice, rats, hamsters, rabbits, monkeys, goats, pigs, and birds.
  • the mammal is preferably a human.
  • a labeling substance may be bound to the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of this embodiment.
  • the labeling substance for the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof examples include stable isotopes, radioisotopes, fluorescent substances, enzymes, and magnetic substances.
  • the labeling substance for the monoclonal antibody or the antigen-binding fragment thereof is preferably a fluorescent substance or an enzyme because it is easy to detect and highly sensitive. By providing the labeling substance, it can be confirmed simply and with high sensitivity whether HA of influenza A virus is bound.
  • Examples of stable isotopes include, but are not limited to, 13 C, 15 N, 2 H, 17 O, and 18 O.
  • Examples of radioactive isotopes include, but are not limited to, 3 H, 14 C, 13 N, 32 P, 33 P, and 35 S.
  • Examples of the fluorescent substance include, but are not limited to, cyanine dyes (for example, Cy3 and Cy5), rhodamine 6G reagent, and other known fluorescent dyes (for example, GFP, FITC (Fluorescein), TAMRA, and the like).
  • the enzyme examples include alkaline phosphatase and peroxidase (HRP).
  • the labeling substance is an enzyme
  • the enzyme substrate in the case of alkaline phosphatase, p-nitrophenyl phosphate (pNPP), 4-methylumbelliferyl phosphate (4-MUP), etc. can be used, and the enzyme is peroxidase.
  • DAB 3,3′-diaminobenzidine
  • TMB 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine
  • OPD o-phenylenediamine
  • ABTS 2,2-azino-di- (3-ethylbenzothiazoline-6- Sulfonic acid)
  • ADHP 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine
  • magnétique material examples include gadolinium, Gd-DTPA, Gd-DTPA-BMA, Gd-HP-DO3A, iodo, iron, iron oxide, chromium, manganese, or a complex thereof, or a chelate complex.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of this embodiment can be produced by, for example, a hybridoma method or a recombinant DNA method.
  • Examples of the hybridoma method include Kohler and Milstein methods (see, for example, Kohler & Milstein, Nature, 256: 495, 1975).
  • Examples of the antibody-producing cells used in the cell fusion step in this method include animals immunized with antigens (for example, HA of influenza A virus, peptide fragments thereof, cells expressing these, etc.) (for example, mice, Rat, hamster, rabbit, monkey, goat, etc.) spleen cells, lymph node cells, peripheral blood leukocytes and the like.
  • antigens for example, HA of influenza A virus, peptide fragments thereof, cells expressing these, etc.
  • mice for example, mice, Rat, hamster, rabbit, monkey, goat, etc.
  • antibody-producing cells obtained by allowing an antigen to act on the above-described cells or lymphocytes previously isolated from an unimmunized animal in a medium can also be used.
  • the antibody-producing cells and myeloma cells may be derived from different animal species as long as they can be fused, but are preferably derived from the same animal species.
  • a method for obtaining a hybridoma for example, it is produced by cell fusion between a spleen cell obtained from a mouse immunized with an antigen and a mouse myeloma cell, and is then specific for HA of influenza A virus by screening. And a method for obtaining a hybridoma that produces a monoclonal antibody.
  • Examples of a method for obtaining a monoclonal antibody produced by a hybridoma include a method in which a monoclonal antibody against a target protein is obtained by culturing the hybridoma or from the ascites of a mammal administered with the hybridoma.
  • the DNA encoding the monoclonal antibody or the functional fragment of the antibody of the present embodiment is cloned from a hybridoma, a B cell or the like, and incorporated into an appropriate vector, which is then used as a host cell (for example, a mammalian cell).
  • a host cell for example, a mammalian cell.
  • Strains, Escherichia coli, yeast cells, insect cells, plant cells, etc. and a method for producing the monoclonal antibody of the present embodiment as a recombinant antibody (for example, PJ Delves, Antibody Production: Essential Technologies).
  • the host cell may be transformed by separately incorporating DNAs encoding heavy chains or light chains into expression vectors, and encode heavy chains and light chains.
  • the host cell may be transformed by incorporating the DNA into a single expression vector (see, eg, International Patent Application No. 94/11523).
  • the monoclonal antibody of the present embodiment can be obtained in a substantially pure and uniform form by culturing the host cell, separating and purifying the host cell or from the culture medium. Separation and purification of the antibody can be performed by a method used in usual polypeptide purification.
  • transgenic animal production technique for example, a transgenic animal (for example, cow, goat, sheep or pig etc.) into which the antibody gene is incorporated is produced, and the antibody gene is derived from the milk of the transgenic animal. And a method for obtaining a large amount of monoclonal antibodies to be used.
  • a transgenic animal for example, cow, goat, sheep or pig etc.
  • the antibody gene is derived from the milk of the transgenic animal.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the present embodiment may be an amino acid sequence variant as described above as long as it can specifically bind only to an amorphous A ⁇ aggregate having a particle size of 50 nm or more and less than 220 nm. I don't care.
  • Amino acid sequence variants can be made by introducing mutations into the DNA encoding the antibody chain or by peptide synthesis.
  • the site where the amino acid sequence of the antibody is modified may be the constant region of the heavy chain or light chain of the antibody as long as it has an activity equivalent to that of the antibody before modification, and the variable region (framework region and CDR).
  • a method of screening an antibody having an improved affinity for an antigen by modifying CDR amino acids may be used (for example, PNAS, 102: 8466-8471 (2005), Protein Engineering, Design & Selection, 21: 485-493 (2008), International Publication No. 2002/051870, J. Biol. Chem., 280: 24880-24888 (2005), Protein Engineering, Design & Selection, 21: 345-351 (2008)).
  • the binding activity of the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof (including the above-mentioned amino acid sequence variants) of the present embodiment to the antigen is, for example, ELISA, Western blotting, flow cytometry, Western blot, dot blot Evaluation, radioimmunoassay method, immunoprecipitation method, immunostaining method and the like.
  • the pharmaceutical composition according to one embodiment of the present invention is a pharmaceutical composition for treating or preventing influenza A virus disease in a subject, and uses the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the above embodiment as an active ingredient. contains.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment When the pharmaceutical composition of this embodiment is administered to humans, it binds to the HA stem region of influenza A virus and inhibits the release of virus particles. Therefore, the pharmaceutical composition of the present embodiment is effective for treating or preventing influenza A virus.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment may contain a pharmaceutically acceptable additive. Moreover, the pharmaceutical composition of this embodiment may be formulated. Examples of the dosage form of the pharmaceutical composition of the present embodiment include injections. Examples of pharmaceutically acceptable additives include solvents such as water, surfactants, sodium chloride, sodium citrate, anhydrous citric acid, pH adjusters, preservatives, and the like. The pharmaceutical composition of this embodiment may be an injection.
  • the pharmaceutical composition may be supplied as a liquid, may be supplied as a powder, and may be configured to dissolve in water, a buffer solution, or the like before use.
  • the target may be any mammal that can be infected with influenza A virus.
  • mammals include those described above.
  • the mammal is preferably a human.
  • Examples of administration to a subject include intraperitoneal injection, subcutaneous injection, intra-articular injection, intramuscular injection, and the like.
  • the dosage varies depending on the weight and age of the subject, the administration method, etc., but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dosage. For example, 0.1 to 50 mg per kg at a time may be subcutaneously injected at intervals of 2 weeks.
  • the method for treating influenza A of the present invention is a method comprising the step of administering the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the above embodiment to a human.
  • Influenza A can be treated by the treatment method of the present embodiment.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof may be formulated as the above-described pharmaceutical composition.
  • the administration method and dose of the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof are the same as those described above.
  • the present invention provides the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the above embodiment for the treatment of influenza A.
  • the present invention provides the use of the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of the above embodiment for the manufacture of a pharmaceutical composition for treating or preventing influenza A virus disease.
  • the gene according to one embodiment of the present invention is a gene comprising any one of the following DNAs (g) to (j) and any one of the following DNAs (k) to (n). Moreover, the gene of this embodiment consists of DNA which codes the protein which has the activity which couple
  • the gene of the present embodiment encodes the above-described monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof, and the above-described monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof can be easily obtained.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 in (g) above is the base sequence of the signal peptide and the base sequence of the light chain variable domain.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 in (k) above is the base sequence of the signal peptide and the base sequence of the heavy chain variable domain.
  • the gene of the present embodiment includes the following DNA (h) or (l) below as a DNA encoding a protein functionally equivalent to the DNA (g) or (k).
  • the number of bases that may be deleted, substituted, or added is preferably 1 to 14, more preferably 1 to 10, and particularly preferably 1 to 5.
  • the gene of the present embodiment includes the following DNA (i) or (m) below as a DNA encoding a protein functionally equivalent to the DNA of (g) or (k).
  • DNA encoding a functionally equivalent protein In order to be a DNA encoding a functionally equivalent protein to the DNA of (g) or (k), it has 80% or more identity. Such identity is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more. Furthermore, the protein encoded by the DNA of (g) or (k) has an activity of binding to influenza A virus and suppressing the growth of the virus.
  • the gene of the present embodiment includes the following (j) or the following (n) DNA as a DNA encoding a protein functionally equivalent to the above (g) or (k).
  • stringent conditions includes, for example, the method described in Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press).
  • 5 ⁇ SSC composition of 20 ⁇ SSC: 3M sodium chloride, 0.3M citric acid solution, pH 7.0
  • 0.1 wt% N-lauroyl sarcosine 0.02 wt% SDS
  • 2 wt% The hybridization can be performed by incubating at 55 to 70 ° C. for several hours to overnight in a hybridization buffer composed of a blocking reagent for nucleic acid hybridization and 50% formamide.
  • the washing buffer used for washing after incubation is preferably a 0.1 ⁇ SSC solution containing 0.1 wt% SDS, more preferably a 0.1 ⁇ SSC solution containing 0.1 wt% SDS.
  • An expression vector according to an embodiment of the present invention includes the gene of the above embodiment.
  • the above-described monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof can be produced by expressing the gene using the expression vector of the present embodiment.
  • a vector suitable for each expression system can be used.
  • pET for expression of E. coli
  • pAUR for expression of yeast
  • pIEx for expression of insect cells
  • pCMV for expression of animal cells
  • adenovirus vector for expression of animal cells
  • retrovirus A viral vector a lentiviral vector, etc.
  • PBMC peripheral blood mononuclear blood cells
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • HAT hypoxanthine-aminopterin-thymidine
  • an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was first performed. Specifically, the culture supernatant of the hybridoma was added to a 96-well plate coated with recombinant HA proteins derived from various influenza A viruses, and reacted. In addition, as influenza A virus from which the coated recombinant HA protein was derived, there were 6 types shown below.
  • H5N1pdm09 type A / California / 07/2009 (H1N1pdm09 type) (hereinafter sometimes referred to as “CA07”) A / Wyoming / 03/2003 (H3N2 type) (hereinafter sometimes referred to as “Wyoming / 03”) A / Perth / 16/2009 (H3N2 type) (hereinafter sometimes referred to as “Perth / 16”) A / Egyptian / N05056 / 2009 (H5N1 type) (hereinafter sometimes referred to as “Egypt / N05056”) ) A / Indonesia / 5/2005 (H5N1 type) (hereinafter sometimes referred to as “Indonesia / 5”) A / Netherland / 219/2003 (H7N7 type) (hereinafter sometimes referred to as “Netherland”) Purified H5N1 type virus (A / geese / Egypt / 0929-NLQP / 2009) (
  • hybridomas and monoclonal antibodies produced by the hybridomas were respectively represented by S9-1-10 / 5-1, 3352E69, 10-4-7 / 1, 4-8-6 / 4, 3381E12, 3381A11, 3352D13. And 3352E71.
  • nucleotide sequence is analyzed and compared with the nucleotide sequence of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database using IgBlast software (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/). did. The results are shown in Table 2.
  • Table 2 revealed that 10-4-7 / 1, 3381E12 and 3381A11 have the sequence of the IGHV3-33 gene. Further, it was revealed that 4-8-6 / 4 and 3352D13 have the sequence of the IGHV1-24 gene. It was also revealed that S9-1-10 / 5-1 has the sequence of the IGHV4-59 gene. It was also revealed that 3352E69 has the sequence of the IGHV1-18 gene, and 3352E71 has the sequence of the IGHV3-11 gene.
  • Human antibodies in 1 L of serum-free medium cultured for 1 week were purified using a HiScreen MabSelect SuRe LX column (GE Healthcare) and an automated chromatography system AKTA pure 25 (GE Healthcare).
  • Fab fragments were also prepared using Pierce (registered trademark) Fab preparation kit (manufactured by Thermo Scientific).
  • mice 1 In vivo monoclonal antibody efficacy evaluation test using mice 1 (1) Preparation of virus The following four types of viruses were used.
  • a / Aich / 2/68 which is a mouse-adapted strain (hereinafter sometimes referred to as “MA-Aich”)
  • a / Vietnam / 1203/2004 (H5N1 type) (hereinafter sometimes referred to as “VN1203”)
  • a / Anhui / 1/2013 (H7N9 type) (hereinafter sometimes referred to as “Anhui / 1”)
  • Each virus was grown on MDCK cells or eggs, and titer measurement was performed using MDCK cells.
  • mice (2) Antibody administration and virus inoculation to mice
  • the body weight of 6-week-old female BALB / c mice manufactured by SLC Japan
  • mice (4 individuals each) were prepared with 7 types of antibodies, 3352E69, 10-4-7 / 1, 4-8-6 / 4, 3381E12, 3381A11, 3352D13 and 3352E71 prepared at 15 mg / kg “1.”
  • S9-1-10 / 5-1 was injected into the abdominal cavity of mice (4 individuals) at a concentration of 0.2, 0.6, 1.7, 5 or 15 mg / kg.
  • mice 1429C6 / 3-3, an antibody conventionally known to recognize HA of influenza B virus, was injected into the peritoneal cavity of mice (4 individuals each) at 15 mg / kg. . Furthermore, as a control, PBS was injected into the abdominal cavity of mice (4 individuals each) at a concentration of 0.2, 0.6, 1.7, 5 or 15 mg / kg. One day after the injection, the mouse was anesthetized and inoculated with each virus prepared in (1) of 50% lethal dose (MLD50) of the mouse.
  • MLD50 50% lethal dose
  • mice administered 15 mg / kg 3352E69, 10-4-7 / 1, 4-8-6 / 4, 3381E12, 3381A11, 3352D13, 3352E71, and 1429C6 / 3-3 include VN1203 (H5N1 type) was inoculated.
  • Mice administered with S9-1-10 / 5-1 at various concentrations and PBS were treated with MA-CA04 (H1N1pdm09 type), MA-Aich (H3N2 type), VN1203 (H5N1 type) prepared in (1) and Anhui / 1 (H7N9 type) was inoculated.
  • FIGS. 1A and 1B The body weight and survival rate of mice were observed daily for 14 days after virus inoculation. The results are shown in FIGS. 1A and 1B.
  • FIG. 1A is a graph showing the survival rate of mice inoculated with VN1203 (H5N1 type) and administered with each antibody.
  • FIG. 1B is a graph showing changes in body weight and survival rate of mice inoculated with each virus and administered with different concentrations of S9-1-10 / 5-1. Mice that lost 25% of body weight before infection were humanely euthanized.
  • S9-1-10 / 5-1 is effective for infection of MA-CA04 (H1N1pdm09 type), MA-Aich (H3N2 type), VN1203 (H5N1 type) epilepsy and Anhui / 1 (H7N9 type). It was confirmed to have a preventive effect.
  • mice Female BALB / c mice of 6 weeks old (manufactured by SLC, Japan) were anesthetized and prepared with (1) of 50% lethal dose (MLD50) of mice. Each virus was inoculated. Then, one day after the virus inoculation, 15 mg / kg of S9-1-10 / 5-1 and PBS (control) were injected into the abdominal cavity of mice (4 mice each).
  • MLD50 50% lethal dose
  • S9-1-10 / 5-1 is effective in the infection of MA-CA04 (H1N1pdm09 type), MA-Aich (H3N2 type), VN1203 (H5N1 type) and Anhui / 1 (H7N9 type). It was confirmed to have a therapeutic effect.
  • Virus growth inhibition test 1 with S9-1-10 / 5-1
  • WHO World Health Organization
  • BSA-MEM bovine serum albumin
  • TCID 50 tissue culture infectious dose
  • TCID 50 tissue culture infectious dose
  • the mixture was then inoculated into MDCK cells and incubated at 37 ° C. for 1 hour. MDCK cells were then washed twice with BSA-MEM. Subsequently, MDCK cells were cultured for 3 days using 1 ⁇ g / mL N-tocyl-L-phenylalanine ketone (TPCK) -treated trypsin-containing BSA-MEM. Then, cytopathic effect (CPE) was measured.
  • the antibody titer (IC 50 ) required to reduce viral replication by 50% was determined using the Spearman-Karber equation. The results are shown in Table 3 (Pre) below. For CR9114, tests using MA-Aich, Egypt, and Anhui / 1 were not performed. Therefore, “ ⁇ ” is shown in Table 3.
  • Virus neutralization test 2 First, MDCK cells were inoculated with 100 TCID 50 (50% tissue culture infectious dose) of each virus prepared in (1) repeatedly 4 times and cultured at 37 ° C. for 1 hour. MDCK cells were then washed twice with BSA-MEM. Next, 37 ⁇ g / mL TPCK-treated trypsin and BSA-MEM containing purified antibody of S9-1-10 / 5-1 or CR9114 (control) serially diluted 2 times 4 times were used for 37 times of MDCK cells. Culturing was carried out at 3 ° C. for 3 days. Then, cytopathic effect (CPE) was measured.
  • CPE cytopathic effect
  • the antibody titer (IC 50 ) required to reduce viral replication by 50% was determined using the Spearman-Karber equation. The results are shown in Table 3 (Post) below. For CR9114, tests using MA-Aich, Egypt, and Anhui / 1 were not performed. Therefore, “ ⁇ ” is shown in Table 3.
  • neutralization test 1 in Table 3, even when S9-1-10 / 5-1 was administered at the highest concentration (50 ⁇ g / mL), none of the viruses could be neutralized.
  • the neutralization test 1 when CR9114 was administered, CA04 and Perth / 16 were neutralized. IC 50 values were 7.4 ⁇ g / mL and 25 ⁇ g / mL, respectively. From this, in neutralization test 1 (Pre), S9-1-10 / 5-1 was removed after virus infection, that is, during the multiple virus replications, the virus was S9- Means not exposed to 1-10 / 5-1. Therefore, the present inventors conducted a neutralization test 2 (Post) in order to examine the virus growth in the presence of S9-1-10 / 5-1.
  • H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H13, H16, H17 and H18 are prominent by S9-1-10 / 5-1. It was confirmed that it was recognized. On the other hand, H12 was weakly detected by S9-1-10 / 5-1.
  • H4 H7, H10, H14 and H15 were recognized by S9-1-10 / 5-1.
  • H3 was not detected by S9-1-10 / 5-1.
  • FIG. 3B it was confirmed that CR9114 recognized HA subtypes other than H2.
  • the binding constant (K D ) was measured by biolayer interferometry (BLI) using an Octet Red 96 apparatus (ForteBio).
  • BBI biolayer interferometry
  • FormeBio Octet Red 96 apparatus
  • each recombinant HA protein prepared in (1) was used.
  • 1 ⁇ kinetic buffer containing 10 ⁇ g / mL of each recombinant HA protein was loaded onto a Ni-NTA biosensor (ForteBio).
  • the composition of the kinetics buffer is 1 ⁇ PBS (pH 7.4), 1% BSA, and 0.002% Tween20. It was then incubated with different concentrations of S9-1-10 / 5-1 or CR9114. All binding data was then collected under 30 ° C conditions.
  • HA protein was loaded onto the biosensor until the shift reached 0.5 nm. 2) A baseline was then obtained (60 seconds). 3) Then, in order to measure k on, to measure the binding of S9-1-10 / 5-1 or CR9114 (300 seconds). 4) Then, in order to measure the k off, it was determined dissociation of S9-1-10 / 5-1 or CR9114 (900 seconds).
  • the binding constant of S9-1-10 / 5-1 for H1-HA was 8.5 ⁇ 10 ⁇ 12 M.
  • the binding constant of S9-1-10 / 5-1 to H3-HA was 3.4 ⁇ 10 ⁇ 8 M, indicating a low affinity.
  • the binding constants of S9-1-10 / 5-1 to H5-HA and H7-HA were 1.4 ⁇ 10 ⁇ 10 M and 9.0 ⁇ 10 ⁇ 10 M, respectively, which were similar.
  • the result of the binding test of CR9114 for each HA showed higher affinity than the result of the binding test for each HA of S9-1-10 / 5-1.
  • a mutant strain (E110V) in which the 110th glutamic acid from the N-terminal is replaced with valine, and a mutant strain in which the 373rd alanine from the N-terminal is replaced with threonine ( A373T) and a mutant strain (E110V / A373T) having the two mutations were prepared.
  • the HA gene introduced with these mutations was cloned into pCAGGS.
  • FIG. 4B From the top of FIG. 4B, it was confirmed that 4-6-19 / 6 recognizes all HA. From the bottom of FIG. 4B, wild type HA, HA-E110V and HA-A373T were recognized by S9-1-10 / 5-1. On the other hand, HA-E110V / A373T and HA-S383P were weakly recognized by S9-1-10 / 5-1. However, HA-T378I was hardly recognized by S9-1-10 / 5-1.
  • a binding buffer containing 2 ⁇ g / mL CR9114, 4-6-19 / 6, or 1429C6 / 3-3 was similarly loaded onto an anti-human IgG Fc capture biosensor (ForteBio).
  • 4-6-19 / 6 is an antibody known to recognize the globular head region of HA.
  • 1429C6 / 3-3 is an antibody known to recognize HA of influenza B virus. It was then incubated with three different concentrations of the produced CA04 / PB02KO virus.
  • the CA04 / PB02KO virus is a non-replicatable PB2 knockout PB8 virus with HA and NA segments derived from CA04. All binding data was then collected under 30 ° C conditions.
  • the test for measuring relative k obs consisted of the following three steps. The results are shown in FIG. 5A (binding of each antibody to the virus particles over time) and FIG. 5B (k obs (apparent rate constant) of S9-1-10 / 5-1 and CR9114). 1) The antibody was loaded onto the biosensor (300 seconds). 2) A baseline was then obtained (60 seconds). 3) The binding of CA04 / PB02KO virus was then measured (600-3600 seconds) to determine relative k obs (apparent rate constant).
  • S9-1-10 / 5-1 was bound to solubilized H1-HA in k on rate of comparable and CR9114. Further, from FIG. 3A, S9-1-10 / 5-1 was bound to HA on the cell surface. However, FIG. 5A and FIG. 5B revealed that S9-1-10 / 5-1 had a lower ability to access HA on the virus surface compared to CR9114.
  • Virus Release Inhibition Test (1) Virus Infection MDCK cells were infected with CA04 to a multiplicity of infection (MOI) of 1, and cultured at 37 ° C. for 1 hour.
  • FIG. 6A shows that S9-1-10 / 5-1 or 4-6-19 / 6 inhibited the release of virus particles in the absence and presence of bacterial sialidase. On the other hand, the release of virus particles was proliferating in the presence of oseltamivir carboxylate (OC).
  • OC oseltamivir carboxylate
  • M1 was not detected in the culture supernatant containing 16 or 64 nM S9-1-10 / 5-1 IgG. On the other hand, M1 was detected in the culture supernatant containing S9-1-10 / 5-1 Fab fragments at all concentrations.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof of this embodiment can recognize the HA stem region and can effectively suppress the proliferation of influenza A virus. Moreover, the pharmaceutical composition of this embodiment is effective for treating or preventing influenza A virus. Moreover, according to the gene and expression vector of the present embodiment, the above-described monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof can be easily obtained.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ａ型インフルエンザウイルスに結合し、ウイルスの増殖を抑制する活性を有する、Ａ型インフルエンザウイルスの血球凝集素抗原に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、（ａ）～（ｃ）を含む軽鎖可変ドメイン、及び、（ｄ）～（ｆ）を含む重鎖可変ドメインからなる群から選択される１種以上を有する。医薬組成物は、対象において、Ａ型インフルエンザウイルス疾患を治療又は予防するための医薬組成物であって、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含有する。遺伝子は、以下の（ｇ）～（ｊ）のいずれかのＤＮＡ、及び、以下の（ｋ）～（ｎ）のいずれかのＤＮＡを含む遺伝子であって、Ａ型インフルエンザウイルスに結合し、ウイルスの増殖を抑制する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる。発現ベクターは、前記遺伝子を含む。

Description

モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント及びその使用
　本発明は、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント及びその使用に関する。具体的には、本発明は、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する医薬組成物、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡからなる遺伝子、前記遺伝子を含む発現ベクターに関する。
　本願は、２０１６年８月２３日に、米国に仮出願された米国特許第６２／３７８，２３５号明細書に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　Ａ型インフルエンザウイルスは、８つのセグメント化されたネガティブセンスウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を有する。ｖＲＮＡのうち２つは、エンベロープの表面上の分子であり、主要な抗原性タンパク質である赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ；ＮＡ）をコードしている。
　Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡは三量体Ｉ型膜貫通型糖タンパク質であり、１８のサブタイプ（Ｈ１～Ｈ１８）に分類される。これらのサブタイプは、２つの系統発生群に分けられ、具体的には、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７及びＨ１８からなるグループ１と、Ｈ３、Ｈ４，Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５からなるグループ２とに分類される。さらに、ＮＡの抗原性の違いから、Ａ型インフルエンザウイルスは、例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２等の亜型に分類される。特にヒトＡ型インフルエンザウイルスでは、周期的にＨＡやＮＡを変異させるために、従前のサブタイプに対応するワクチン接種を受けても、その効果が期待できないことが多い。
　また、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡは、頭部領域（球状頭部領域、ｈｅａｄ　ｒｅｇｉｏｎ）及び茎領域（ｓｔｅｍ　ｒｅｇｉｏｎ又はｓｔａｌｋ　ｒｅｇｉｏｎ）という構造の異なる領域で構成される。球状部領域はウイルスが標的細胞に結合するための受容体結合部位を含み、ＨＡの血球凝集活性に関与している。茎領域はウイルスのエンベロープと細胞のエンドソーム膜間との膜融合に必要な融合ペプチドを含み、融合活性に関与している。従来のＡ型インフルエンザウイルスを認識する抗ＨＡ抗体は、ＨＡの球状頭部領域を認識するものがほとんどある。
　また、現在、インフルエンザウイルス感染症に対する治療及び予防においては、例えば、初期のウイルス粒子（ビリオン）放出を阻害するノイラミニダーゼ阻害剤であるザナミビル（リレンザ）及びオセルタミブル（タミフル）（例えば、特許文献１～３参照）、Ｍ２チャンネルのプロトン伝導性を阻害するアマンタジン等の低分子化合物が用いられている。
特表平１１－５０１９０８号公報 特開２００２－１６１０７４号公報 特開２００６－０３６７７０号公報
　近年、オセルタミブル（タミフル）、アマンタジン等の抗インフルエンザウイルス作用を有する薬剤に対して耐性株が増加していることが報告されている。
　また、従来の抗ＨＡ抗体が認識する球状頭部領域は最も抗原変異が起こり易い部位である。さらに、従来の抗ＨＡ抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスのサブタイプに共通して反応するものではなく、ウイルスのＨＡの抗原変化に伴い、認識性を消失する場合が多い。
　これらのことから、ＨＡの高度に保存された領域に対して、効果的に中和活性を示す抗体が求められていた。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ＨＡの茎領域を認識し、効果的にＡ型インフルエンザウイルスの増殖を抑制するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。また、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する有効なＡ型インフルエンザウイルス疾患を治療又は予防するための医薬組成物を提供する。また、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡからなる遺伝子を提供する。また、前記遺伝子を含む発現ベクターを提供する。
　すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
　本発明の第１態様に係るモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ａ型インフルエンザウイルスに結合し、ウイルスの増殖を抑制する活性を有する、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ抗原に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び、
（ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、
（ｅ）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、
（ｆ）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインからなる群から選択される１種以上を有する。
　上記第１態様に係るモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び、
　配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有してもよい。
　上記第１態様に係るモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、及び、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインを有してもよい。
　本発明の第２態様に係る医薬組成物は、対象において、Ａ型インフルエンザウイルス疾患を治療又は予防するための医薬組成物であって、上記第１態様に係るモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含有する。
　本発明の第３態様に係る遺伝子は、以下の（ｇ）～（ｊ）のいずれかのＤＮＡ、及び、以下の（ｋ）～（ｎ）のいずれかのＤＮＡを含む遺伝子であって、Ａ型インフルエンザウイルスに結合し、ウイルスの増殖を抑制する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる。
　（ｇ）配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
　（ｈ）配列番号９に示される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなるＤＮＡ、
　（ｉ）配列番号９に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなるＤＮＡ、
　（ｊ）配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなるＤＮＡ、
　（ｋ）配列番号１０に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
　（ｌ）配列番号１０に示される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなるＤＮＡ、
　（ｍ）配列番号１０に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなるＤＮＡ、
　（ｎ）配列番号１０に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなるＤＮＡ
　本発明の第４態様に係る発現ベクターは、上記第３態様に係る遺伝子を含む。
　上記態様のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＡの茎領域を認識し、効果的にＡ型インフルエンザウイルスの増殖を抑制することができる。また、上記態様の医薬組成物は、Ａ型インフルエンザウイルスを治療又は予防するために有効である。また、上記態様の遺伝子及び発現ベクターによれば、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが得られる。
実施例における各抗体を投与し、ＶＮ１２０３（Ｈ５Ｎ１型）を接種したマウスの生存率を示すグラフである。 実施例における異なる濃度のＳ９－１－１０／５－１又はＰＢＳを投与し、各ウイルスを接種したマウスの体重変化及び生存率を示すグラフである。 実施例におけるＳ９－１－１０／５－１又はＰＢＳを投与し、各ウイルスを接種したマウスの生存率を示すグラフである。 実施例におけるＳ９－１－１０／５－１のＡ型インフルエンザウイルスの全１８種類のＨＡサブタイプに対する結合活性を示す画像である。 実施例におけるＣＲ９１１４のＡ型インフルエンザウイルスの全１８種類のＨＡサブタイプに対する結合活性を示す画像である。 実施例におけるＭＡ－ＣＡ０４のＨＡでの変異導入部位を示す図である。 実施例におけるＭＡ－ＣＡ０４のＨＡ（野生型及び各変異型）を接種し、各抗体（Ｓ９－１－１０／５－１又は４－６－１９／６）を投与した２９３Ｔ細胞を免疫染色した結果を示す画像である。スケールバーは１００μｍを示す。 実施例におけるウイルス粒子への各抗体の結合の経時的変化を示すグラフである。 実施例におけるウイルス粒子に対するＳ９－１－１０／５－１及びＣＲ９１１４のｋｏｂｓ（みかけの速度定数）を示すグラフである。 実施例におけるＣＡ０４を感染させ、各種抗ヒトＩｇＧ抗体を投与したＭＤＣＫ細胞の全細胞溶解物及び培養上清の抗Ｍ１抗体及び抗ＡＣＴＢ抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す画像である。 実施例におけるＣＡ０４を感染させ、Ｓ９－１－１０／５－１のＩｇＧ又はＦａｂフラグメントを投与したＭＤＣＫ細胞の全細胞溶解物及び培養上清の抗Ｍ１抗体及び抗ＡＣＴＢ抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す画像である。
≪モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント≫
　本発明の一実施形態に係るモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ａ型インフルエンザウイルスに結合し、ウイルスの増殖を抑制する活性を有する。また、本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ抗原に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。また、本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下の（ａ）～（ｃ）を含む軽鎖可変ドメイン、及び、以下の（ｄ）～（ｆ）を含む重鎖可変ドメインからなる群から選択される１種以上を有する。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、
（ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
（ｅ）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、
（ｆ）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
　本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、後述の実施例に示すように、ＨＡの茎領域を認識する。また、本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、後述の実施例に示すように、Ａ型インフルエンザウイルスのグループ１及び２の両方の系統発生群に属するＨＡサブタイプを認識する。そのため、効果的に幅広い種類のＡ型インフルエンザウイルスの増殖を抑制することができる。
　なお、本明細書において、「ＣＤＲ」はｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎを意味する。
　本明細書において、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な特異性を持つ抗体を意味する。また、本明細書において、モノクローナル抗体には、免疫グロブリンのすべてのクラス及びサブクラスが含まれる。具体的には、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等が挙げられる。中でも、本実施形態のモノクローナル抗体は、ＩｇＧであることが好ましい。
　本明細書において、モノクローナル抗体の「抗原結合フラグメント」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、標的タンパク質を特異的に認識するものを意味する。具体的には、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、及びこれらの重合体等が挙げられる。
　本明細書において、「Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ抗原に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント」とは、本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントがＡ型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；ＨＡ）に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであることを意味する。この特異的な結合は、例えば、試験管内におけるアッセイ、好ましくは精製した野生型抗原を用いたプラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ、ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｕｐｐｓａｌａ，　Ｓｗｅｄｅｎ等）における抗体の抗原のエピトープへの結合等により定量することができる。結合の親和性は、ｋａ（抗体－抗原複合体からの抗体結合に関する速度定数）、ｋＤ（解離定数）、及びＫＤ（ｋＤ／ｋａ）によって規定することができる。抗体が抗原に特異的に結合している場合の結合親和性（ＫＤ）は、１０－８ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、１０－９Ｍ～１０－１３ｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
　本明細書において、「中和抗体」又は「中和する抗体」は、抗原を中和することができるものを意味する。すなわち、抗原である病原体が宿主への感染を開始する能力又は維持する能力を予防、阻害、減少、遅延又は干渉することのできるものを意味する。中和抗体又は中和する抗体は、活性なワクチンと関連させて適切な処方に基づき予防剤又は治療剤として、或いは、診断ツールとして、単独で又は組み合わせて使用することができる。
　本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＡに対し非常に広範な特異性を有し、ＨＡの系統発生群であるグループ１に属する１種以上のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプ、及び、グループ２に属する１種以上のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプを中和することができる。すなわち、本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、グループ１及びグループ２からなる群から選択される２種以上のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプ間で保存されているＨＡの茎領域内のエピトープに結合することができる。
本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、具体的には、後述の実施例に示すとおり、Ａ型インフルエンザウイルスの全１８種類のサブタイプのＨＡに特異的に結合することができる。より具体的には、本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ａ型インフルエンザのＨＡのサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７及びＨ１８に特異的に結合することができる。さらに具体的には、、本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ａ型インフルエンザのＨＡの亜型に特異的に結合することができる。代表的なＡ型インフルエンザウイルス亜型としては、限定するものではないが、以下に示すもの等が挙げられる。
・Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型）（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型）
・Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型）
・Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２型）
・Ａ／Ｔｏｋｙｏ／ＵＴ－ＩＭＳ６－１／２０１３（Ｈ３Ｎ２型）
・Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／０３／２００３（Ｈ３Ｎ２型）
・Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２型) 
・Ａ／ｄｕｃｋ／Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖａｋｉａ／５６（Ｈ４Ｎ６型）
・Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１型)（Ｈ５Ｎ１型）
・Ａ／Ｅｇｙｐｔ／Ｎ０５０５６／２００９（Ｈ５Ｎ１型）
・Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１型）
・Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／３７４０／６５（Ｈ６Ｎ５型）
・Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ／２１９／２００３（Ｈ７Ｎ７型）
・Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９型）（Ｈ７Ｎ９型）
・Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ／６１１８／６８（Ｈ８Ｎ４型）
・Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６６（Ｈ９Ｎ２型）
・Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｇｅｒｍａｎｙ／Ｎ／４９（Ｈ１０Ｎ７型）
・Ａ／ｄｕｃｋ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／５４６／７４（Ｈ１１Ｎ９型）
・Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｌｂｅｒｔａ／６０／７６（Ｈ１２Ｎ５型）
・Ａ／ｇｕｌｌ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／７０４／７７（Ｈ１３Ｎ６型）
・Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／Ａｓｔｒａｋｈａｎ／２６３／８２（Ｈ１４Ｎ５型）
・Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｕｓｔｒａｌｉａ／３４１／８３（Ｈ１５Ｎ８型）
・Ａ／ｂｌａｃｋ－ｈｅａｄｅｄ　ｇｕｌｌ／Ｓｗｅｄｅｎ／５／９９（Ｈ１６Ｎ３型）
・Ａ／ｌｉｔｔｌｅｙｅｌｌｏｗ－ｓｈｏｕｌｄｅｒｅｄ　ｂａｔ／Ｇｕａｔｅｍａｌａ／１６４／２０１０（Ｈ１７Ｎ１０型）
・Ａ／ｆｌａｔ－ｆａｃｅｄｂａｔ／Ｐｅｒｕ／０３３／２０１０（Ｈ１８Ｎ１１型）
また、本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、後述の実施例に示すとおり、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡの茎領域に存在するエピトープに特異的に結合することができる。従って、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡの茎領域の特異的認識能を保持していれば、前記（ａ）～（ｆ）の配列番号１～６に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されていてもよい。ここで、欠失、置換、若しくは付加されてもよいアミノ酸の数としては、１～３個が好ましく、１～２個がより好ましく、１個がさらに好ましい。
　本明細書中において「置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・スレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）等で分類することができる。
　本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントにおける１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列変異体は、抗原への結合活性が対照抗体（例えば、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡの茎領域に対する抗体等）よりも高いことが好ましい。
　中でも、本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントとしては、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有するものであることが好ましい。
　さらに、発現精製が容易であることから、本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、抗原を認識するために必要な最小単位である軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインをフレキシブルなペプチドリンカーで結合した単可変ドメインフラグメントであることが好ましい。即ち、ｓｃＦｖ抗体であることが好ましい。
　具体的には、本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、及び、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインをこの順に有することが好ましい。
本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、高い中和力価を有する。Ａ型インフルエンザウイルスのうち５０％を中和するのに必要とされる、本発明の抗体の濃度は、例えば、約５０μｇ／ｍＬ以下となり得る。Ａ型インフルエンザウイルスのうち５０％を中和するのに必要とされる本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの濃度は、例えば、約５０μｇ／ｍＬ以下であり、３０μｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、２０μｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、１０μｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましく、５μｇ／ｍＬ以下であることが特に好ましく、１μｇ／ｍＬ以下であることが最も好ましい。力価は、当業者に既知の通りの標準的な中和アッセイを用いて測定することができる。
　本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、グループ１及びグループ２のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプのＨＡの茎領域において保存されているエピトープに特異的に結合し、ウイルスの粒子の放出に干渉する抗体（例えば、単離抗体又は精製抗体）である。理論に束縛されるものではないが、後述の実施例に示すとおり、本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡの領域において保存されているエピトープに結合し、ウイルス粒子の放出工程を干渉することにより、細胞からのウイルスの放出を阻害する。
　また、本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントはキメラ抗体又は特定の哺乳動物化した抗体（特に、ヒト化抗体）であってもよい。ここで、キメラ抗体とは、抗体の定常領域部分が、他の哺乳動物由来の抗体の定常領域部分に置き換えられた抗体をいう。ここで、他の哺乳動物由来の抗体としては、ヒト抗体が好ましい。また、ヒト化抗体とは、可変領域中のＣＤＲのみがラット等の非ヒト哺乳動物抗体由来であり、ＣＤＲ以外の可変領域中のフレームワーク領域（ＦＲ）及び定常領域がヒト抗体由来であるものをいう。キメラ抗体又はヒト化抗体のクラスは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのいずれであってもよい。中でも、キメラ抗体又はヒト化抗体のクラスは、ＩｇＧであることが好ましい。
　特定の哺乳動物（例えば、ヒト）に他の哺乳動物由来の抗体（例えば、非ヒト抗体）を投与すると、異種抗原に対する免疫応答が惹起され、アナフィラキシーショック等の重篤な副作用が生じる場合がある。これに対し、抗体の定常領域部分が特定の哺乳動物由来の抗体（例えば、ヒト抗体）に置き換えられたキメラ抗体又は特定の哺乳動物化した抗体（例えば、ヒト化抗体）であれば、このような副作用が低減されるため、安全に特定の哺乳動物（例えば、ヒト）に投与することができる。
　なお、本明細書において、「哺乳動物」としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ、ブタ、トリ等が挙げられる。中でも、哺乳動物としては、ヒトであることが好ましい。
　また、本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは標識物質が結合していてもよい。
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの標識物質としては、例えば、安定同位体、放射性同位体、蛍光物質、酵素、磁性体等が挙げられる。中でも、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの標識物質としては、検出が容易且つ高感度であることから、蛍光物質又は酵素であることが好ましい。上記標識物質を備えることで、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡが結合しているか否かを簡便且つ高感度に確かめることができる。
　安定同位体としては、例えば１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ、１７Ｏ、１８Ｏが挙げられ、これらに限定されない。
放射性同位体としては、例えば３Ｈ、１４Ｃ、１３Ｎ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓが挙げられ、これらに限定されない。
　蛍光物質としては、例えばシアニン色素（例えばＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、その他公知の蛍光色素（例えば、ＧＦＰ、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＴＡＭＲＡ等）等が挙げられ、これらに限定されない。
　酵素としては、例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等が挙げられる。標識物質が酵素である場合、酵素基質を使用することが好ましい。酵素基質としては、アルカリホスファターゼの場合、ｐ－ニトロフェニルリン酸（ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ　ｐｈｏｓｐｈａｓｅ；ｐＮＰＰ）、４－メチルウンベリフェリルリン酸（４－ＭＵＰ）等を用いることができ、酵素がペルオキシダーゼの場合、３，３’－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）、３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）、ｏ－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＯＰＤ）、２，２－アジノ－ジ－（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、１０－アセチル－３，７－ジヒドロキシフェノキサジン（ＡＤＨＰ）等を用いることができる。
　磁性体としては、例えばガドリニウム、Ｇｄ－ＤＴＰＡ、Ｇｄ－ＤＴＰＡ－ＢＭＡ、Ｇｄ－ＨＰ－ＤＯ３Ａ、ヨード、鉄、酸化鉄、クロム、マンガン、又はその錯体、或いはキレート錯体等が挙げられ、これらに限定されない。
＜モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの製造方法＞
　本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法等によって作製することができる。
　ハイブリドーマ法としては、例えば、ケーラー及びミルスタインの方法（例えば、Kohler & Milstein, Nature, 256:495,1975. 参照）等が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞としては、例えば抗原（例えば、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ、そのペプチド断片、又はこれらを発現する細胞等）で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ等）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球等が挙げられる。また、免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞又はリンパ球等に対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することができる。ミエローマ細胞としては、公知の種々の細胞株を使用することができる。抗体産生細胞及びミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、同一の動物種起源のものであることが好ましい。ハイブリドーマを得る方法としては、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る方法等が挙げられる。ハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体を得る方法としては、例えば標的タンパク質に対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得する方法等が挙げられる。
　組換えＤＮＡ法としては、例えば上記本実施形態のモノクローナル抗体又は抗体の機能的断片をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等）に導入し、本実施形態のモノクローナル抗体を組換え抗体として産生させる手法等が挙げられる（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７　ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ　ａｎｄ　Ｃ．Ｄｅａｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００　ＯＸＦＯＲＤ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ　Ａ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７－７７５（１９９０）参照）。
　本実施形態のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（例えば、国際特許出願第９４／１１５２３号参照）。本実施形態のモノクローナル抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液から分離及び精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離及び精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いた方法では、例えば、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジ又はブタ等）を作製し、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得する方法等が挙げられる。
　本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは粒子径５０ｎｍ以上２２０ｎｍ未満の非晶質のＡβ凝集体のみに特異的に結合できるものであれば、上述したようなアミノ酸配列変異体であってもかわない。
アミノ酸配列変異体は、抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、またはペプチド合成によって作製することができる。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖または軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域（フレームワーク領域及びＣＤＲ）であってもよい。また、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法等を用いてもよい（例えば、ＰＮＡＳ，１０２：８４６６－８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：４８５－４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４８８０－２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：３４５－３５１（２００８）参照）。
　本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント（上述のアミノ酸配列変異体等も含む）の抗原への結合活性は、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、フローサイトメトリー法、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、ラジオイムノアッセイ法、免疫沈降法、免疫染色法等により評価することができる。
≪医薬組成物≫
　本発明の一実施形態に係る医薬組成物は、対象において、Ａ型インフルエンザウイルス疾患を治療又は予防するための医薬組成物であって、上記実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含有する。
　本実施形態の医薬組成物をヒトに投与すると、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡの茎領域に結合して、ウイルス粒子の放出を阻害する。
　従って、本実施形態の医薬組成物は、Ａ型インフルエンザウイルスを治療又は予防するために有効である。
　本実施形態の医薬組成物は、薬学的に許容可能な添加剤を含有していてもよい。また、本実施形態の医薬組成物は、製剤化されていてもよい。本実施形態の医薬組成物の剤型としては、注射剤等が挙げられる。また、薬学的に許容可能な添加剤としては、水等の溶媒、界面活性剤、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、無水クエン酸、ｐＨ調整剤、防腐剤等が挙げられる。本実施形態の医薬組成物は、注射剤であってもよい。医薬組成物は、液体で供給されてもよく、粉末で供給され、使用前に水や緩衝液等で溶解するように構成されていてもよい。
　対象としては、Ａ型インフルエンザウイルスに感染し得る哺乳動物であればよい。哺乳動物として具体的には、上述したものと同様のものが挙げられる。中でも、哺乳動物としては、ヒトであることが好ましい。
　対象（特に、ヒト）への投与は、例えば、腹腔内注射、皮下注射、関節内注射、筋肉内注射等が挙げられる。投与量は、被検体の体重や年齢、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。例えば、１回に１ｋｇあたり０．１～５０ｍｇを２週間間隔で皮下注射することが挙げられる。
≪Ａ型インフルエンザの治療方法≫
　一実施形態において、本発明のＡ型インフルエンザの治療方法は、上記実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを、ヒトに投与する工程を含む方法である。
　本実施形態の治療方法により、Ａ型インフルエンザを治療することができる。ここで、上記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、上述した医薬組成物として製剤化されていてもよい。上記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの投与方法、投与量は、上述したものと同様である。
　一実施形態において、本発明は、Ａ型インフルエンザの治療のための、上記実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
　一実施形態において、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス疾患を治療又は予防するための医薬組成物の製造のための、上記実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの使用を提供する。
≪遺伝子≫
　本発明の一実施形態に係る遺伝子は、以下の（ｇ）～（ｊ）のいずれかのＤＮＡ、及び、以下の（ｋ）～（ｎ）のいずれかのＤＮＡを含む遺伝子である。また、本実施形態の遺伝子は、Ａ型インフルエンザウイルスに結合し、ウイルスの増殖を抑制する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる。
　（ｇ）配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
　（ｈ）配列番号９に示される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなるＤＮＡ、
　（ｉ）配列番号９に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなるＤＮＡ、
　（ｊ）配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなるＤＮＡ、
　（ｋ）配列番号１０に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
　（ｌ）配列番号１０に示される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなるＤＮＡ、
　（ｍ）配列番号１０に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなるＤＮＡ、
　（ｎ）配列番号１０に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなるＤＮＡ
　本実施形態の遺伝子は、上述のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントをコードしており、上述のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを簡便に得られる。
　上記（ｇ）における配列番号９に示される塩基配列は、シグナルペプチドの塩基配列及び軽鎖可変ドメインの塩基配列である。
　上記（ｋ）における配列番号１０に示される塩基配列は、シグナルペプチドの塩基配列及び重鎖可変ドメインの塩基配列である。
　本実施形態の遺伝子は、上記（ｇ）又は上記（ｋ）のＤＮＡと機能的な同等なタンパク質をコードするＤＮＡとして、下記（ｈ）又は下記（ｌ）のＤＮＡを含む。
（ｈ）配列番号９に示される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｌ）配列番号１０に示される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなるＤＮＡ
　ここで、欠失、置換、若しくは付加されてもよい塩基の数としては、１～１４個が好ましく、１～１０個がより好ましく、１～５個が特に好ましい。
　本実施形態の遺伝子は、上記（ｇ）又は上記（ｋ）のＤＮＡと機能的な同等なタンパク質をコードするＤＮＡとして、下記（ｉ）又は下記（ｍ）のＤＮＡを含む。
　（ｉ）配列番号９に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなるＤＮＡ、
　（ｍ）配列番号１０に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなるＤＮＡ、
上記（ｇ）又は上記（ｋ）のＤＮＡと機能的な同等なタンパク質をコードするＤＮＡであるためには８０％以上の同一性を有する。係る同一性としては、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上が更に好ましく、９８％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
更に、上記（ｇ）又は上記（ｋ）のＤＮＡがコードするタンパク質は、Ａ型インフルエンザウイルスに結合し、ウイルスの増殖を抑制する活性を有する。
　本実施形態の遺伝子は、上記（ｇ）又は上記（ｋ）のＤＮＡと機能的な同等なタンパク質をコードするＤＮＡとして、下記（ｊ）又は下記（ｎ）のＤＮＡを含む。
　（ｊ）配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなるＤＮＡ、
　（ｎ）配列番号１０に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなるＤＮＡ
　本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ　ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ 塩化ナトリウム，０．３Ｍ クエン酸溶液，ｐＨ７．０）、０．１重量％ Ｎ－ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％フォルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、５５～７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
≪発現ベクター≫
　本発明の一実施形態に係る発現ベクターは、上記実施形態の遺伝子を含む。
　本実施形態の発現ベクターにより、上記遺伝子を発現させ、上述のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを作製することができる。
ベクターとしては、各発現系に応じたものを用いることができ、例えば、大腸菌発現用のｐＥＴ、酵母発現用のｐＡＵＲ、昆虫細胞発現用のｐＩＥｘ、動物細胞発現用のｐＣＭＶ、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられる。
　以下、実施例及び比較例等を挙げて本発明をさらに詳述するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。
［実施例１］
１．Ａ型インフルエンザウイルスに対するヒトモノクローナル抗体の調製
（１）血液の採取
　１又は２種のＨ５Ｎ１型インフルエンザワクチン（Ａ／Ｅｇｙｐｔ／Ｎ０３０７２／２０１０（クレード２．２．１）、又は、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／２００５（クレード２．１．３．２）の不活性化アジュバント化全ウイルスワクチン）を受けた健常者（Ｎ＝３７名）から、ワクチン接種の１週間後に血液を１０ｍＬずつ採取した。
（２）ハイブリドーマの調製
次いで、採取した血液から、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　Ｐｌｕｓ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）による密度勾配遠心分離法を用いて、末梢血単核血球（ＰＢＭＣ）を単離した。次いで、単離されたＰＢＭＣとＳＰＹＭＥＧ細胞とを融合させた。次いで、得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、９６ウェルプレート内で１５％ウシ胎児血清及びヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン（ＨＡＴ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて、１０～１４日間培養した。
（３）スクリーニング
　次いで、Ａ型インフルエンザウイルスに対して特異的な抗体をスクリーニングするために、まず、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を行った。具体的には、各種Ａ型インフルエンザウイルスに由来する組換えＨＡタンパク質でコートされた９６ウェルプレートにハイブリドーマの培養上清を添加し、反応させた。なお、コートされた組換えＨＡタンパク質の由来となるＡ型インフルエンザウイルスとしては、以下に示す６種類であった。
・Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型）（以下、「ＣＡ０７」と称する場合がある）
・Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／０３／２００３（Ｈ３Ｎ２型）（以下、「Ｗｙｏｍｉｎｇ／０３」と称する場合がある）
・Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２型)（以下、「Ｐｅｒｔｈ／１６」と称する場合がある
・Ａ／Ｅｇｙｐｔ／Ｎ０５０５６／２００９（Ｈ５Ｎ１型）（以下、「Ｅｇｙｐｔ／Ｎ０５０５６」と称する場合がある）
・Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１型）（以下、「Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５」と称する場合がある）
・Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ／２１９／２００３（Ｈ７Ｎ７型）（以下、「Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ」と称する場合がある
・精製されたＨ５Ｎ１型ウイルス（Ａ／ｇｅｅｓｅ／Ｅｇｙｐｔ／０９２９－ＮＬＱＰ／２００９）（以下、「Ｅｇｙｐｔ」と称する場合がある）
次いで、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ－ＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）を反応させた。これにより、陽性反応を示すハイブリドーマを選択した。次いで、得られた特異的モノクローナル抗体陽性細胞を限界希釈し、再度ＥＬＩＳＡを行い、第２のスクリーニングを行って、クローニングした。次いで、ＥＬＩＳＡ陽性であった単一コロニーから採取したハイブリドーマが８種類（Ｓ９－１－１０／５－１、３３５２Ｅ６９、１０－４－７／１、４－８－６／４、３３８１Ｅ１２、３３８１Ａ１１、３３５２Ｄ１３及び３３５２Ｅ７１）得られた。以下、８種類のハイブリドーマ及び該ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体をそれぞれ、Ｓ９－１－１０／５－１、３３５２Ｅ６９、１０－４－７／１、４－８－６／４、３３８１Ｅ１２、３３８１Ａ１１、３３５２Ｄ１３及び３３５２Ｅ７１と称する。
　ＥＬＩＳＡによるスクリーニングにおいて、Ｓ９－１－１０／５－１はＨＡタンパク質のうち、Ｈ１、Ｈ５及びＨ７を認識した。また、３３５２Ｅ７１はＨＡタンパク質のうち、Ｈ１、Ｈ３及びＨ７を認識した。また、他の６種類のクローンは、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５及びＨ７を認識した。また、Ｂ型インフルエンザウイルスに由来するＨＡタンパク質を認識するクローンはなかった。
（４）可変領域のシークエンシング及び遺伝的解析
　次いで、８種類のハイブリドーマからＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）又はＩＳＯＧＥＮ（日本遺伝子研究所製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。次いで、各ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の塩基配列をＧｅｎｅＲａｃｅｒ（登録商標）　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてシークエンシングした。決定された塩基配列をアミノ酸配列に置換したものを以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、決定された塩基配列を分析し、ＩｇＢｌａｓｔソフトウェア（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）を使用して、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）データベースの塩基配列と比較した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２から、１０－４－７／１、３３８１Ｅ１２及び３３８１Ａ１１は、ＩＧＨＶ３－３３遺伝子の配列を有することが明らかとなった。また、４－８－６／４及び３３５２Ｄ１３は、ＩＧＨＶ１－２４遺伝子の配列を有することが明らかとなった。また、Ｓ９－１－１０／５－１は、ＩＧＨＶ４－５９遺伝子の配列を有することが明らかとなった。また、３３５２Ｅ６９は、ＩＧＨＶ１－１８遺伝子の配列を有し、３３５２Ｅ７１は、ＩＧＨＶ３－１１遺伝子の配列を有することが明らかとなった。
（５）ヒトモノクローナル抗体の精製
次いで、各抗体のＶＨ及びＶＬの配列を、定常領域のγ重鎖（ＩｇＧ１）及びκ軽鎖をコードする配列と共に、Ｍａｍｍａｌｉａｎ　ＰｏｗｅｒＥｘｐｒｅｓｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、発現ベクターにクローニングした。次いで、得られたプラスミドをＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、２０μｇ／ｍＬのプロマイシンで選択することにより安定な抗体産生細胞を樹立した。次いで、得られた抗体産生細胞を無血清培地ＣＤＭ４ＣＨＯ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に適合させた。１週間培養した無血清培地１Ｌ中のヒト抗体を、ＨｉＳｃｒｅｅｎ　ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ　ＬＸカラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）及び自動クロマトグラフィーシステムＡＫＴＡ　ｐｕｒｅ　２５（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて精製した。また、ヒトＩｇＧクローンＳ９－１－１０／５－１については、Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）　Ｆａｂ調製キット（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、Ｆａｂフラグメントも調製した。
２．マウスを用いたインビボでのモノクローナル抗体の有効性評価試験１
（１）ウイルスの調製
　ウイルスとして、以下の４種を用いた。
・Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型）（以下、「ＣＡ０４」と称する場合がある）のマウス適応株（以下、「ＭＡ－ＣＡ０４」と称する場合がある）（参考文献：Sakabe S et al., “Mutations in PA, NP, and HA of a pandemic (H1N1) 2009 influenza virus contribute to its adaptation to mice.”, Virus Research, Vol. 158, Issues1-2, p124-129, 2011.）
・マウス適応株であるＡ／Ａｉｃｈ／２／６８（Ｈ３Ｎ２型）（以下、「ＭＡ－Ａｉｃｈ」と称する場合がある）
・Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１型)（以下、「ＶＮ１２０３」と称する場合がある）
・Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９型）（以下、「Ａｎｈｕｉ／１」と称する場合がある）
　各ウイルスはＭＤＣＫ細胞又は卵で増殖させ、ＭＤＣＫ細胞を用いて力価測定を行った。
（２）マウスへの抗体の投与及びウイルスの接種
　まず、６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本ＳＬＣ社製）の試験開始前の体重を測定した。次いで、１５ｍｇ／ｋｇの「１．」で調製した３３５２Ｅ６９、１０－４－７／１、４－８－６／４、３３８１Ｅ１２、３３８１Ａ１１、３３５２Ｄ１３及び３３５２Ｅ７１の７種類の抗体をマウス（４個体ずつ）の腹腔内に注射した。また、Ｓ９－１－１０／５－１については、０．２、０．６、１．７、５又は１５ｍｇ／ｋｇの濃度をふって、マウス（４個体ずつ）の腹腔内に注射した。なお、コントロールとして、Ｂ型インフルエンザウイルスのＨＡを認識することが従来から知られている抗体である１４２９Ｃ６／３－３を１５ｍｇ／ｋｇとなるようにマウス（４個体ずつ）の腹腔内に注射した。さらに、コントロールとして、ＰＢＳを０．２、０．６、１．７、５又は１５ｍｇ／ｋｇの濃度をふって、マウス（４個体ずつ）の腹腔内に注射した。注射から１日後、マウスに麻酔をかけて、マウス５０％致死量（ＭＬＤ５０）の（１）で調製した各ウイルスを接種した。具体的には、１５ｍｇ／ｋｇの３３５２Ｅ６９、１０－４－７／１、４－８－６／４、３３８１Ｅ１２、３３８１Ａ１１、３３５２Ｄ１３、３３５２Ｅ７１、及び、１４２９Ｃ６／３－３を投与したマウスには、ＶＮ１２０３（Ｈ５Ｎ１型)を接種した。濃度をふってＳ９－１－１０／５－１及びＰＢＳを投与したマウスには、（１）で調製したＭＡ－ＣＡ０４（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型）、ＭＡ－Ａｉｃｈ（Ｈ３Ｎ２型）、ＶＮ１２０３（Ｈ５Ｎ１型)及びＡｎｈｕｉ／１（Ｈ７Ｎ９型）を接種した。
（３）体重の測定及び生存率の確認
　ウイルス接種から１４日間、マウスの体重及び生存率を毎日観察した。結果を図１Ａ及び図１Ｂに示す。図１Ａは、ＶＮ１２０３（Ｈ５Ｎ１型）を接種し、各抗体を投与したマウスの生存率を示すグラフである。図１Ｂは、各ウイルスを接種し、異なる濃度のＳ９－１－１０／５－１を投与したマウスの体重変化及び生存率を示すグラフである。なお、感染前よりも２５％体重が減少したマウスは人道的に安楽死させた。
　図１Ａから、Ｓ９－１－１０／５－１を投与したマウスでは、ウイルスの接種から１４日間での生存率が１００％であった。一方、他の７種の抗体を投与したマウスでは、ウイルスの接種から１４日間での生存率が２５％以下であった。特に、ＰＢＳ及び１４２９Ｃ６／３－３を投与したマウスはすべて、ウイルスの接種から１０日以内に死亡した。
　このことから、インビボの試験系において、Ｓ９－１－１０／５－１がＨ５Ｎ１型ウイルスの感染に有効であることが確かめられた。
　図１Ｂから、ＭＡ－ＣＡ０４（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型）及びＶＮ１２０３（Ｈ５Ｎ１型)を接種した場合では、１．７ｍｇ／ｋｇ以上の高い濃度のＳ９－１－１０／５－１の投与により、１４日間の観察において、ほとんど体重の減少は見られず、生存率が７５～１００％と高く保たれた。一方、０．６ｍｇ／ｋｇ以下の低い濃度のＳ９－１－１０／５－１の投与では、少しの体重の減少は見られたが、一部のマウスの生存が確認された。このことから、０．６ｍｇ／ｋｇ以下の低い濃度のＳ９－１－１０／５－１の投与であっても、ＭＡ－ＣＡ０４（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型）及びＶＮ１２０３（Ｈ５Ｎ１型)の感染に対して有効であることが示された。
　また、ＭＡ－Ａｉｃｈ（Ｈ３Ｎ２型）及びＡｎｈｕｉ／１（Ｈ７Ｎ９型）を接種した場合では、５ｍｇ／ｋｇ以上の高い濃度のＳ９－１－１０／５－１の投与により、１４日間の観察において、生存率が７５～１００％と高く保たれたが、わずかな体重の減少が見られた。一方、１．７ｍｇ／ｋｇの低い濃度のＳ９－１－１０／５－１の投与では、ほとんどのマウスがウイルスの接種から８日以内に死亡した。
　以上のことから、Ｓ９－１－１０／５－１は、ＭＡ－ＣＡ０４（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型）、ＭＡ－Ａｉｃｈ（Ｈ３Ｎ２型）、ＶＮ１２０３（Ｈ５Ｎ１型) 及びＡｎｈｕｉ／１（Ｈ７Ｎ９型）の感染に有効であり、予防効果を有することが確かめられた。
３．マウスを用いたインビボでのモノクローナル抗体の有効性評価試験２
（１）ウイルスの調製
　「２．」の（１）と同様の方法を用いて、４種のウイルスを調製した。
（２）マウスへのウイルスの接種及び抗体の投与
　まず、６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本ＳＬＣ社製）に麻酔をかけて、マウス５０％致死量（ＭＬＤ５０）の（１）で調製した各ウイルスを接種した。次いで、ウイルスの接種から１日後に、１５ｍｇ／ｋｇのＳ９－１－１０／５－１及びＰＢＳ（コントロール）をマウス（４個体ずつ）の腹腔内に注射した。
（３）生存率の確認
　ウイルス接種から１４日間、生存率を毎日観察した。結果を図２に示す。
　図２から、Ｓ９－１－１０／５－１は、ＭＡ－ＣＡ０４（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型）、ＭＡ－Ａｉｃｈ（Ｈ３Ｎ２型）、ＶＮ１２０３（Ｈ５Ｎ１型) 及びＡｎｈｕｉ／１（Ｈ７Ｎ９型）の感染に有効であり、治療効果を有することが確かめられた。
４．Ｓ９－１－１０／５－１によるウイルス増殖抑制試験１
　Ｓ９－１－１０／５－１の中和活性は、ウイルス感染細胞からのウイルス粒子の放出を阻害することによるものであることを証明するために、ウイルス中和試験を行った。なお、試験は、２００２年にリリースされた動物のインフルエンザの診断とサーベランスについて、世界保健機関（ＷＨＯ）のマニュアルに従って実施した。具体的には、以下に示すとおりである。
（１）ウイルスの調製
　「２．」の（１）と同様の方法を用いて、以下に示す５種のウイルスを調製した。
・ＣＡ０４（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型）
・Ｐｅｒｔｈ／１６（Ｈ３Ｎ２型）
・ＭＡ－Ａｉｃｈ（Ｈ３Ｎ２型）
・Ｅｇｙｐｔ（Ｈ５Ｎ１型）
・Ａｎｈｕｉ／１（Ｈ７Ｎ９型）
（２）ウイルス中和試験１
　まず、０．３％ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ；ＢＳＡ）含有ＭＥＭ（以下、「ＢＳＡ－ＭＥＭ」と称する場合がある）を用いて、Ｓ９－１－１０／５－１の精製抗体（５０μｇ／ｍＬ）を４回連続的に２倍希釈した。また、コントロールとしてＣＲ９１１４（Ａ型インフルエンザウイルスの茎領域を認識し、グループ１及び２両方に対して中和活性を有することが知られている）（参考文献：Dreyfus C. et al., “Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses.”, Science Vol. 337, p1343-1348, 2012.）も同様に４回連続的に２倍希釈した。次いで、希釈した各抗体に１００ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染用量）の（１）で調整した各ウイルスを混合し、３７℃で３０分間培養した。次いで、混合物をＭＤＣＫ細胞に接種し、３７℃で１時間培養した。次いで、ＭＤＣＫ細胞をＢＳＡ－ＭＥＭで２回洗浄した。次いで、１μｇ／ｍＬのＮ－ｔｏｃｙｌ－Ｌ－ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　ｋｅｔｏｎｅ（ＴＰＣＫ）処理トリプシン含有ＢＳＡ－ＭＥＭを用いて、ＭＤＣＫ細胞を３日間培養した。次いで、細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ：ＣＰＥ）を測定した。なお、ウイルス複製を５０％減少させるのに必要な抗体力価（ＩＣ５０）は、Ｓｐｅａｒｍａｎ－Ｋａｒｂｅｒの式を用いて決定した。結果を以下の表３（Ｐｒｅ）に示す。なお、ＣＲ９１１４については、ＭＡ－Ａｉｃｈ、Ｅｇｙｐｔ及びＡｎｈｕｉ／１を用いた試験を実施しなかった。そのため、表３において、「－」と示している。
（３）ウイルス中和試験２
　まず、ＭＤＣＫ細胞に１００ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染用量）の（１）で調整した各ウイルスを４回反復して接種し、３７℃で１時間培養した。次いで、ＭＤＣＫ細胞をＢＳＡ－ＭＥＭで２回洗浄した。次いで、１μｇ／ｍＬのＴＰＣＫ処理トリプシン、及び、４回連続的に２倍希釈したＳ９－１－１０／５－１又はＣＲ９１１４（コントロール）の精製抗体含有ＢＳＡ－ＭＥＭを用いて、ＭＤＣＫ細胞を３７℃で３日間培養した。次いで、細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ：ＣＰＥ）を測定した。なお、ウイルス複製を５０％減少させるのに必要な抗体力価（ＩＣ５０）は、Ｓｐｅａｒｍａｎ－Ｋａｒｂｅｒの式を用いて決定した。結果を以下の表３（Ｐｏｓｔ）に示す。なお、ＣＲ９１１４については、ＭＡ－Ａｉｃｈ、Ｅｇｙｐｔ及びＡｎｈｕｉ／１を用いた試験を実施しなかった。そのため、表３において、「－」と示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３の中和試験１（Ｐｒｅ）では、Ｓ９－１－１０／５－１を最高濃度（５０μｇ／ｍＬ）で投与しても、いずれのウイルスも中和することができなかった。一方、中和試験１（Ｐｒｅ）において、ＣＲ９１１４を投与した場合では、ＣＡ０４及びＰｅｒｔｈ／１６を中和した。ＩＣ５０値は、それぞれ７．４μｇ／ｍＬ及び２５μｇ／ｍＬであった。
　このことから、中和試験１（Ｐｒｅ）では、ウイルス感染後にＳ９－１－１０／５－１が除去されており、すなわち、これは、複数回のウイルスの複製の間に、ウイルスがＳ９－１－１０／５－１に曝露されなかったことを意味する。よって、本発明者らは、Ｓ９－１－１０／５－１存在下でのウイルス増殖を調べるために、中和試験２（Ｐｏｓｔ）を行った。
　表３の中和試験２（Ｐｏｓｔ）では、Ｓ９－１－１０／５－１の投与により、ＣＡ０４、Ｅｇｙｐｔ及びＡｎｈｕｉ／１の３種のウイルスの増殖を阻害した。ＩＣ５０値は、０．５５～８．８μｇ／ｍＬであった。しかしながら、Ｐｅｒｔｈ／１６及びＭＡ－Ａｉｃｈの２種のウイルス増殖を抑制できなった。一方、中和試験２（Ｐｏｓｔ）において、ＣＲ９１１４を投与した場合では、ＣＡ０４及びＰｅｒｔｈ／１６の２種のウイルス増殖を阻害した。
　以上のことから、インビトロ試験系において、Ｓ９－１－１０／５－１は、Ａ型インフルエンザウイルスの増殖を抑制することが確かめられた。
５．Ｓ９－１－１０／５－１のＡ型インフルエンザウイルスの全１８種類のサブタイプに対する活性確認試験
　上記「１．」～「４．」における結果から、Ｓ９－１－１０／５－１は、グループ１及び２の系統発生群に属するＨＡのサブタイプを認識することが示唆された。Ｈ１～Ｈ１８に対するＳ９－１－１０／５－１の活性を確認するために以下に示す試験を行った。
（１）プラスミドの構築
　以下に示すＨＡ遺伝子のオープンリーディングフレームをｐＣＡＧＧＳにクローニングした。
・ＣＡ０４（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型）
・Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２型）
・Ａ／Ｔｏｋｙｏ／ＵＴ－ＩＭＳ６－１／２０１３（Ｈ３Ｎ２型）
・Ａ／ｄｕｃｋ／Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖａｋｉａ／５６（Ｈ４Ｎ６型）
・ＶＮ１２０３（Ｈ５Ｎ１型）
・Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／３７４０／６５（Ｈ６Ｎ５型）
・Ａｎｈｕｉ／１（Ｈ７Ｎ９型）
・Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ／６１１８／６８（Ｈ８Ｎ４型）
・Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６６（Ｈ９Ｎ２型）
・Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｇｅｒｍａｎｙ／Ｎ／４９（Ｈ１０Ｎ７型）
・Ａ／ｄｕｃｋ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／５４６／７４（Ｈ１１Ｎ９型）
・Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｌｂｅｒｔａ／６０／７６（Ｈ１２Ｎ５型）
・Ａ／ｇｕｌｌ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／７０４／７７（Ｈ１３Ｎ６型）
・Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／Ａｓｔｒａｋｈａｎ／２６３／８２（Ｈ１４Ｎ５型）
・Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｕｓｔｒａｌｉａ／３４１／８３（Ｈ１５Ｎ８型）
・Ａ／ｂｌａｃｋ－ｈｅａｄｅｄ　ｇｕｌｌ／Ｓｗｅｄｅｎ／５／９９（Ｈ１６Ｎ３型）
・Ａ／ｌｉｔｔｌｅｙｅｌｌｏｗ－ｓｈｏｕｌｄｅｒｅｄ　ｂａｔ／Ｇｕａｔｅｍａｌａ／１６４／２０１０（Ｈ１７Ｎ１０型）
・Ａ／ｆｌａｔ－ｆａｃｅｄｂａｔ／Ｐｅｒｕ／０３３／２０１０（Ｈ１８Ｎ１１型）
（２）トランスフェクション
Ｔｒａｎｓ－ＩＴ　２９３（タカラバイオ社製）を用いて、各ＨＡ発現プラスミドを２９３Ｔ細胞に導入した。なお、コントロールとしてＨＡを含まないプラスミド（Ｍｏｃｋ）を２９３Ｔ細胞に導入した。
（３）免疫染色
次いで、導入から２４時間後に、２９３Ｔ細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した。次いで、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００を用いて、透過処理した。次いで、１次抗体として、Ｓ９－１－１０／５－１又はＣＲ９１１４を用い、次いで、２次抗体としてＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８結合ロバ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ－Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）、又は、ペルオキシダーゼ結合ロバ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ－Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）及びＳＩＧＭＡＦＡＳＴ　３，３’－Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ錠（シグマ社製）を用いて、免疫染色した。結果を図３Ａ（Ｓ９－１－１０／５－１）及び図３Ｂ（ＣＲ９１１４）に示す。
　図３Ａから、グループ１に属するＨＡサブタイプのうち、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７及びＨ１８は、Ｓ９－１－１０／５－１により、顕著に認識されたことが確かめられた。一方、Ｓ９－１－１０／５－１により、Ｈ１２は弱く検出された。
　また、グループ２に属するＨＡサブタイプのうち、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５は、Ｓ９－１－１０／５－１により、認識されたことが確かめられた。一方、この試験系では、Ｓ９－１－１０／５－１により、Ｈ３は検出されなかった。
　一方、図３Ｂから、ＣＲ９１１４はＨ２以外のＨＡサブタイプを認識したことが確かめられた。
　これらの結果から、Ｓ９－１－１０／５－１は、グループ１及び２の両方の系統発生群に属するＨＡサブタイプに対し活性を有することが示された。
６．結合定数の測定
　次いで、Ｓ９－１－１０／５－１と各ＨＡタンパク質との結合定数を測定した。具体的には、以下に示す方法により行った。
（１）組換えＨＡタンパク質の調製
　以下の４種の組換えＨＡタンパク質をＳｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社から購入した。
・ＣＡ０７（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型）
・Ｐｅｒｔｈ／１６（Ｈ３Ｎ２型）
・Ｅｇｙｐｔ（Ｈ５Ｎ１型）
・Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ（Ｈ７Ｎ７型）
（２）結合定数の測定
　結合定数（ＫＤ）は、Ｏｃｔｅｔ　Ｒｅｄ　９６装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）を用いたバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）により測定した。また、測定には、（１）で調製した各組換えＨＡタンパク質を用いた。まず、１０μｇ／ｍＬの各組換えＨＡタンパク質を含む１×カイネティクスバッファーをＮｉ－ＮＴＡバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）にロードした。なお、カイネティクスバッファーの組成は、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１％ＢＳＡ及び０．００２％Ｔｗｅｅｎ２０である。次いで、異なる濃度のＳ９－１－１０／５－１又はＣＲ９１１４と共にインキュベーションした。次いで、全ての結合データを３０℃条件下において収集した。
なお、結合定数を測定するための試験は、以下の４つの工程からなった。
１）０．５ｎｍにシフトが達するまで、バイオセンサー上にＨＡタンパク質をロードした。
２）次いで、ベースラインを取得した（６０秒間）。
３）次いで、ｋｏｎを測定するために、Ｓ９－１－１０／５－１又はＣＲ９１１４の結合を測定した（３００秒間）。
４）次いで、ｋｏｆｆを測定するために、Ｓ９－１－１０／５－１又はＣＲ９１１４の解離を測定した（９００秒間）。
　３～５の異なる濃度のＳ９－１－１０／５－１又はＣＲ９１１４を使用し、親和性に応じて、３７～３３３ｎＭの濃度に変化させた。また、ベースライン及び解離工程は、カイネティクスバッファーのみで実施した。ｋｏｎとｋｏｆｆと比から、結合定数（ＫＤ）を決定した。結果を以下の表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４から、Ｓ９－１－１０／５－１のＨ１－ＨＡに対する結合定数は８．５×１０－１２Ｍであった。また、Ｓ９－１－１０／５－１のＨ３－ＨＡに対する結合定数は３．４×１０－８Ｍであり、親和性が低かった。また、Ｓ９－１－１０／５－１のＨ５－ＨＡ及びＨ７－ＨＡに対する結合定数はそれぞれ１．４×１０－１０Ｍ及び９．０×１０－１０Ｍであり、同程度であった。
　一方、ＣＲ９１１４の各ＨＡに対する結合試験の結果は、Ｓ９－１－１０／５－１の各ＨＡに対する結合試験の結果よりも高い親和性を示した。
　これらの結果から、Ｓ９－１－１０／５－１は、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５及びＨ７を異なる程度で認識していることが示された。
７．Ｓ９－１－１０／５－１のエピトープ解析
（１）ＭＡ－ＣＡ０４のＨＡ遺伝子への突然変異の導入
　ＭＡ－ＣＡ０４のＨＡ遺伝子の突然変異は、所望の変異を導入可能なプライマーを用いたＰＣＲにより作製した。すべての変異導入遺伝子において、シークエンスにより配列を決定し、望ましくない突然変異がないことを確認した。ＨＡにおける変異導入部位を図４Ａに示す。図４Ａの上に示すように、ＨＡの茎領域において、Ｎ末端から３７８番目のトレオニンをイソロイシンに変換した変異株（Ｔ３７８Ｉ）及びＮ末端から３８３番目のセリンをプロリンに置換した変異株（Ｓ３８３Ｐ）を作製した。また、図４Ａの下に示すように、ＨＡの茎領域において、Ｎ末端から１１０番目のグルタミン酸をバリンに置換した変異株（Ｅ１１０Ｖ）、Ｎ末端から３７３番目のアラニンをトレオニンに置換した変異株（Ａ３７３Ｔ）、及び、前記２つの変異を有する変異株（Ｅ１１０Ｖ／Ａ３７３Ｔ）を作製した。これらの突然変異を導入したＨＡ遺伝子をｐＣＡＧＧＳにクローニングした。
（２）トランスフェクション
　「５．」の（２）と同様の方法を用いて、２９３Ｔ細胞に各プラスミド（野生型及び変異型のＨＡ遺伝子を含む）を導入した。
（３）免疫染色
　次いで、Ｓ９－１－１０／５－１を投与した。また、コントロールとして、ＨＡの球状頭部領域を認識することが知られている抗体である４－６－１９／６を投与した。次いで、「５．」の（３）と同様の方法を用いて、免疫染色した。結果を図４Ｂに示す。
　図４Ｂの上から、４－６－１９／６は、全てのＨＡを認識することが確かめられた。
図４Ｂの下から、野生型ＨＡ、ＨＡ－Ｅ１１０Ｖ及びＨＡ－Ａ３７３Ｔは、Ｓ９－１－１０／５－１により認識された。一方、ＨＡ－Ｅ１１０Ｖ／Ａ３７３Ｔ及びＨＡ－Ｓ３８３Ｐは、Ｓ９－１－１０／５－１により弱く認識された。しかしながら、ＨＡ－Ｔ３７８Ｉは、Ｓ９－１－１０／５－１によりほとんど認識されなかった。
　これらの結果から、Ｓ９－１－１０／５－１がＨＡの茎領域を認識することが示唆された。
８．ウイルス粒子への抗体の結合確認試験
（１）相対ｋｏｂｓ（みかけの速度定数）の測定
　相対ｋｏｂｓ（みかけの速度定数）を推定するために、Ｏｃｔｅｔ　Ｒｅｄ　９６装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）を用いたバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）による測定を行った。具体的には、まず、２μｇ／ｍＬのヒトモノクローナル抗体Ｓ９－１－１０／５－１を含む結合バッファーを抗ヒトＩｇＧ　Ｆｃ捕捉バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）にロードした。なお、結合バッファーの組成は、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（０．１％ＢＳＡ含有）である。また、コントロールとして、２μｇ／ｍＬのＣＲ９１１４、４－６－１９／６、又は、１４２９Ｃ６／３－３を含む結合バッファーも同様に、抗ヒトＩｇＧ　Ｆｃ捕捉バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）にロードした。４－６－１９／６は、ＨＡの球状頭部領域を認識することが知られている抗体である。また、１４２９Ｃ６／３－３は、Ｂ型インフルエンザウイルスのＨＡを認識することが知られている抗体である。次いで、３つの異なる濃度の生成されたＣＡ０４／ＰＢ０２ＫＯウイルスと共にインキュベーションした。ＣＡ０４／ＰＢ０２ＫＯウイルスとは、ＣＡ０４に由来するＨＡ及びＮＡセグメントを有する、複製不能なＰＢ２ノックアウトＰＢ８ウイルスである。次いで、全ての結合データを３０℃条件下において収集した。
　なお、相対ｋｏｂｓ（みかけの速度定数）を測定するための試験は、以下の３つ工程からなった。また、結果を図５Ａ（ウイルス粒子への各抗体の経時的な結合）及び図５Ｂ（Ｓ９－１－１０／５－１及びＣＲ９１１４のｋｏｂｓ（みかけの速度定数））に示す。
１）バイオセンサー上へ抗体をロードした（３００秒間）。
２）次いで、ベースラインを取得した（６０秒間）。
３）次いで、相対ｋｏｂｓ（みかけの速度定数）を測定するために、ＣＡ０４／ＰＢ０２ＫＯウイルスの結合を測定した（６００～３６００秒間）。
　図５Ａから、ウイルス粒子へのＳ９－１－１０／５－１の結合は、ＣＲ９１１４の結合よりもわずかに低かった。また、４－６－１９／６はウイルス粒子に効果的に結合したが、抗Ｂ型インフルエンザウイルスのＨＡ抗体である１４２９Ｃ６／３－３は、ウイルス粒子に結合しなかった。
　図５Ｂから、ウイルス粒子に対するＣＲ９１１４のみかけの速度定数ｋｏｂｓは、ウイルス粒子に対するＳ９－１－１０／５－１のみかけの速度定数ｋｏｂｓよりも１１．６倍であった。
　上記表４から、Ｓ９－１－１０／５－１は、ＣＲ９１１４と同程度ののｋｏｎ速度で可溶化Ｈ１－ＨＡに結合していた。また、上記図３Ａから、Ｓ９－１－１０／５－１は細胞表面上のＨＡに結合していた。しかしながら、図５Ａ及び図５Ｂから、Ｓ９－１－１０／５－１は、ＣＲ９１１４と比較して、ウイルス表面上のＨＡにアクセスする能力が低いことが明らかとなった。
　これらの結果から、Ｓ９－１－１０／５－１がウイルス表面上のＨＡにアクセスする能力が低いことで、Ｓ９－１－１０／５－１がウイルスの侵入を阻止できないことが示唆された。
９．ウイルス放出阻害試験
（１）ウイルスの感染
　ＭＤＣＫ細胞に、感染多重度（ＭＯＩ）１となるようにＣＡ０４を感染させ、３７℃で１時間培養した。
（２）抗体の投与
　次いで、１μｇ／ｍＬのＴＰＣＫ処理トリプシン、及び、ヒトＩｇＧ抗体又はＳ９－１－１０／５－１のＦａｂフラグメント含有ＢＳＡ－ＭＥＭを添加し、３７℃で１８時間培養した。ヒトＩｇＧ抗体としては、Ｓ９－１－１０／５－１、並びに、コントロールとして４－６－１９／６を使用した。また、各ヒトＩｇＧ抗体の投与量（濃度）は、０．４又は２μｇ／ｍＬであった。また、Ｓ９－１－１０／５－１のＩｇＧ又はＦａｂフラグメントの投与量（濃度）は、１、４、１６又は６４ｎＭであった。一部のサンプルは、１００μＭのオセルタミビルカルボキシレート（ＯＣ）（Ｒｏｃｈｅ社製）、及び、２０ｍＵのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来の細菌シアリダーゼ（Ｒｏｃｈｅ社製）からなる群から選択される１種以上存在下で試験を行った。
（３）ウエスタンブロッティング
　次いで、培養後のＭＤＣＫ細胞を用いて、ウエスタンブロッティングを行った。具体的には、まず、サンプルバッファー（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で調製した全細胞溶解物（Ｃｅｌｌ　ｌｙｓａｔｅ）及び培養培地サンプル（Ｓｕｐ）を、ｋＤ　Ｍｉｎｉ－Ｐｒｏｔｅａｎ　ＴＧＸプレキャストゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）にロードした。次いで、分離したタンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｉｏｎ－Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写した。次いで、マウスモノクローナル抗Ｍ１抗体であるクローンＣ１１１（タカラバイオ社製）を用いて免疫染色した。マウスモノクローナル抗ＡＣＴＢ抗体であるクローンＡＣ－７４（シグマ社製）をローディングコントロールとして用いた。結果を図６Ａ（各ヒトＩｇＧ抗体投与）及び図６Ｂ（Ｓ９－１－１０／５－１のＩｇＧ又はＦａｂフラグメント投与）に示す。なお、図６Ａ及び図６Ｂにおいて、「ＯＣ」はオセルタミビルカルボキシレートを示している。また、Ｓ９は「Ｓ９－１－１０／５－１」を示しており、「４－６」は４－６－１９／６を示している。
　図６Ａから、細菌シアリダーゼの非存在下及び存在下において、Ｓ９－１－１０／５－１又は４－６－１９／６はウイルス粒子の放出を阻害した。一方、オセルタミビルカルボキシレート（ＯＣ）の存在下においてウイルス粒子の放出が増殖していた。
　これらの結果から、Ｓ９－１－１０／５－１はウイルスノイラミニダーゼの活性に影響を与えないことが示唆された。
　図６Ｂから、１６又は６４ｎＭのＳ９－１－１０／５－１のＩｇＧを含む培養上清では、Ｍ１は検出されなかった。一方、全ての濃度のＳ９－１－１０／５－１のＦａｂフラグメントを含む培養上清においてＭ１が検出された。
　これらの結果から、Ｓ９－１－１０／５－１のＩｇＧはウイルス粒子放出の阻害剤として働くことが示唆された。
　以上のことから、ヒトモノクローナル抗体Ｓ９－１－１０／５－１は、主に、ウイルス感染細胞からのウイルス粒子の放出を阻害することが明らかになった。これにより、インビトロ及びインビボの両方の試験系において、Ｓ９－１－１０／５－１が、幅広い種類のＡ型インフルエンザウイルスの増殖を抑制することが確かめられた。
　本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＡの茎領域を認識し、効果的にＡ型インフルエンザウイルスの増殖を抑制することができる。また、本実施形態の医薬組成物は、Ａ型インフルエンザウイルスを治療又は予防するために有効である。また、本実施形態の遺伝子及び発現ベクターによれば、上述のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが簡便に得られる。

Claims (6)

  1. 　Ａ型インフルエンザウイルスに結合し、ウイルスの増殖を抑制する活性を有する、Ａ型インフルエンザウイルスの血球凝集素抗原に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
    （ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、
    （ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、
    （ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、
    を含む軽鎖可変ドメイン、及び、
    （ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、
    （ｅ）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、
    （ｆ）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、
    を含む重鎖可変ドメインからなる群から選択される１種以上を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
  2. 　配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び、
    　配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有する請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
  3. 　配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、及び、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインを有する請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
  4. 　対象において、Ａ型インフルエンザウイルス疾患を治療又は予防するための医薬組成物であって、
    請求項１～３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含有する医薬組成物。
  5. 　以下の（ｇ）～（ｊ）のいずれかのＤＮＡ、及び、以下の（ｋ）～（ｎ）のいずれかのＤＮＡを含む遺伝子であって、Ａ型インフルエンザウイルスに結合し、ウイルスの増殖を抑制する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。
    　（ｇ）配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
    　（ｈ）配列番号９に示される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなるＤＮＡ、
    　（ｉ）配列番号９に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなるＤＮＡ、
    　（ｊ）配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなるＤＮＡ、
    　（ｋ）配列番号１０に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
    　（ｌ）配列番号１０に示される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなるＤＮＡ、
    　（ｍ）配列番号１０に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなるＤＮＡ、
    　（ｎ）配列番号１０に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなるＤＮＡ
  6. 　請求項５に記載の遺伝子を含む発現ベクター。
PCT/JP2017/029911 2016-08-23 2017-08-22 モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント及びその使用 WO2018038096A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662378235P 2016-08-23 2016-08-23
US62/378,235 2016-08-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018038096A1 true WO2018038096A1 (ja) 2018-03-01

Family

ID=61245006

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2017/029911 WO2018038096A1 (ja) 2016-08-23 2017-08-22 モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント及びその使用

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2018038096A1 (ja)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014523254A (ja) * 2011-07-18 2014-09-11 インスティテュート・フォー・リサーチ・イン・バイオメディシン Ａ型インフルエンザウイルス中和抗体及びその使用法
JP2014527403A (ja) * 2011-07-14 2014-10-16 クルセル ホランド ベー ヴェー 系統グループ１及び系統グループ２のインフルエンザａ型ウイルス、並びにインフルエンザｂ型ウイルスを中和することが可能なヒト結合分子
US20140370032A1 (en) * 2011-08-27 2014-12-18 Universitat Zurich Multi-strain-reactive Antibodies for Therapy and Diagnosis of Influenza
JP2016516090A (ja) * 2013-03-29 2016-06-02 セルトリオン・インコーポレイテッド ２以上のインフルエンザａウイルス中和結合分子を含む組成物

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014527403A (ja) * 2011-07-14 2014-10-16 クルセル ホランド ベー ヴェー 系統グループ１及び系統グループ２のインフルエンザａ型ウイルス、並びにインフルエンザｂ型ウイルスを中和することが可能なヒト結合分子
JP2014523254A (ja) * 2011-07-18 2014-09-11 インスティテュート・フォー・リサーチ・イン・バイオメディシン Ａ型インフルエンザウイルス中和抗体及びその使用法
US20140370032A1 (en) * 2011-08-27 2014-12-18 Universitat Zurich Multi-strain-reactive Antibodies for Therapy and Diagnosis of Influenza
JP2016516090A (ja) * 2013-03-29 2016-06-02 セルトリオン・インコーポレイテッド ２以上のインフルエンザａウイルス中和結合分子を含む組成物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHO, A. ET AL.: "Implications of broadly neutralizing antibodies in the development of a universal influenza vaccine", CURRENT OPINION IN VIROLOGY, vol. 17, March 2016 (2016-03-01), pages 110 - 115, XP055604030 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2014244668B2 (en) Composition comprising at least two influenza A virus-neutralizing-binding molecules
EP3418300B1 (en) Neutralizing anti-influenza a virus antibodies and uses thereof
KR101732056B1 (ko) 중화 항-인플루엔자 ａ 바이러스 항체 및 이의 용도
JP6325451B2 (ja) Ａ型インフルエンザに特異的な抗体
JP2024009962A (ja) 抗ｔｍｐｒｓｓ２抗体および抗原結合断片
US9856312B2 (en) Binding molecule having influenza A virus-neutralizing activity produced from human B cell
US20110274702A1 (en) Neutralizing anti-influenza a virus antibodies and uses thereof
EP2793945B1 (en) Antibodies useful in passive influenza immunization
RU2721706C2 (ru) Нейтрализующие связывающие молекулы, направленные против вируса гриппа, и пути их применения
CA2809780A1 (en) Influenza virus neutralizing antibody and method for screening same
JP2015120738A (ja) インフルエンザの治療および診断のための組成物および方法
Ko et al. A non-neutralizing antibody broadly protects against influenza virus infection by engaging effector cells
US20120315277A1 (en) Compositions and Methods for the Therapy and Diagnosis of Influenza
EP3348568B1 (en) Monoclonal antibodies targeting neutralizing epitopes on h7 influenza viruses
WO2018038096A1 (ja) モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント及びその使用
CN116547005A (zh) 靶向SARS-CoV-2的抗原结合分子
EP3122772A1 (en) Chimerization and characterization of a monoclonal antibody with potent neutralizing activity across multiple influenza a h5n1 clades

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17843575

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17843575

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP