CN102958539B - 能够识别血凝素干区上的杂亚型中和表位的IgG同种型全长免疫球蛋白和其作为抗-流感药物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及单克隆抗体，该单克隆抗体是全长IgG-同型免疫球蛋白且其特征在于对A型流感病毒的高的宽范围中和活性并且能够识别不同A型流感病毒亚型之间的高度保守的特定血凝素表位。此外，描述了本发明的全长IgG的治疗、预防和诊断应用。

Description

能够识别血凝素干区上的杂亚型中和表位的IgG同种型全长免疫球蛋白和其作为抗-流感药物的应用
本发明总体属于免疫学领域。更具体地，本发明涉及能够结合并中和A型流感病毒的全长免疫球蛋白。
现有技术中已知针对A型流感病毒的抗体。
国际专利申请PCT/IB2009/051068描述了能够结合多个不同A型流感亚型（杂亚型免疫性（heterosubtypic immunity））的单克隆抗体，优选为Fab片段，这种抗体进一步被赋予重要的中和活性。以上提到的国际专利申请中描述的优选抗体是Fab 28片段，特征在于其包括含氨基酸序列SEQ ID NO:1的重链可变区和含氨基酸序列SEQ ID NO:2的轻链可变区。在PCT/IB2009/051068中也描述了各自的编码核苷酸序列，即SEQ IDNO:3（重链可变区）和SEQ ID NO:4（轻链可变区）。在该说明书中，将抗体片段Fab 28指定为“Fab PN-SIA28”。
在国际专利申请PCT/IB2009/051068中，作者提到发明的抗体对象可以可替换地作为与Fab片段相对的全长免疫球蛋白提供。已知，人的免疫球蛋白分为重链类型不同的5个主要类别：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。但是，在PCT/IB2009/051068中，未单独鉴别特定免疫球蛋白类型，并且未提供如允许本领域技术人员选择特定免疫球蛋白类型的关于重链类型的建议。
此外，在PCT/IB2009/051068中，未提供关于PN-SIA28用作全长免疫球蛋白时的中和效果的实验数据。惊人地，本发明的发明人现在已发现PCT/IB2009/051068中所述的由重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列表征的单克隆抗体，尤其作为全长IgG类免疫球蛋白提供，与相应Fab片段相比，在能力和作用范围两方面，表现出对甲型流感病毒显著增加的中和活性。
已知，IgG由一对轻链（L）和一对重链（C）组成。每条轻链包含两个免疫球蛋白域，一个可变（VL）域一个恒定（CL）域。重链为γ型且每条重链包含一个可变免疫球蛋白域（VH或Vγ）和三个恒定域（CH1/2/3）。γ链又可分为四个不同的亚型，分别指定为γ1、γ2、γ3和γ4。
在PCT/IB2009/051068中所述的由重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列表征的作为全长IgG的单克隆抗体在下文中指定为“IgGPN-SIA28”。
表1示意性地示出了由本发明的发明人获得的以对比表达的关于IgGPN-SIA28的中和活性的结果。
对H3N2亚型的不同株存在显著的高中和活性的证据，而其在相应的Fab片段的情况中较低。
此外，即使在极低的浓度，全长IgG对H1N1亚型的不同株表现出非常强的中和活性，高于相应Fab片段对相同的H1N1株。本发明的发明人还进行了允许评估IgG PN-SIA28也结合属于亚型H2、H5和H9的重组血凝素能力的初步实验。在实验部分中详细地描述的获得的结果允许认为IgG PN-SIA28的中和活性至少扩展至H2、H5和H9亚型，当涉及相应的Fab片段时以前没有描述该中和活性。
给定IgG PN-SIA28特别的中和性，本发明的发明人还进行了允许它们鉴别构成尤其由中和抗体IgG PN-SIA28识别的表位的血凝素区的特别复杂的研究和实验（在下文中详细说明）。由IgG PN-SIA28识别的中和表位的鉴别是非常有用和重要的，使得可以进一步鉴别针对相同表位和赋予与IgG PN-SIA28实质可比的特别的中和性质的人单克隆抗体。
因此，本发明的一个第一目的是全长IgG形式的，尤其针对A型流感病毒血红素抗原和能够结合并中和至少包括H1亚型和H3亚型的多种A型流感病毒亚型的人单克隆抗体，其特征在于抗体识别位于血凝素干区（stem region）的保守表位，所述表位包含HA1血凝素多肽的氨基酸残基His25、His45、Thr315和Asn336以及HA2血凝素多肽的氨基酸残基Thr358、Met360、Ile361或Val361、Asp362、Gly363、Trp364、Yhr384、Thr392、Val395、Glu400，氨基酸残基的编号是基于可在NCBI数据库中获得的在登录号EF467821.1的和在序列表中指定为SEQ ID NO:5的H1N1血凝素氨基酸序列。
在一个优选的实施方式中，作为本发明的对象的全长IgG形式的人单克隆抗体能够结合并中和至少包括H1亚型、H3亚型以及H5、H2和H9中的至少一个的多种甲型流感病毒亚型。在另一优选的实施方式中，作为本发明的对象的全长IgG形式的人单克隆抗体能够结合并中和至少包括H1亚型、H3亚型以及H5、H2和H9亚型中的至少两个的多种甲型流感病毒亚型。
在更优选的实施方式中，作为本发明的对象的全长IgG形式的人单克隆抗体能够结合并中和至少包括H1亚型、H3亚型、H5亚型、H2亚型和H9亚型的多种甲型流感病毒亚型。
在更优选的实施方式中，作为本发明的对象的全长IgG形式的人单克隆抗体为IgG PN-SIA28，其特征在于其包括包含氨基酸序列SEQ IDNO:1的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的轻链可变区。
导致由IgG PN-SIA28抗体识别的表位的定义的研究在随后的实验部分中详细地描述。也描述了参考由现有技术的抗-流感单克隆抗体C179、CR6261和F10识别的表位进行的对比研究。由于进行的对比研究，本发明的发明人可证实代表一些最已知和广泛的抗-流感抗体的以上提到的现有技术抗体，可有效识别与由IgG PN-SIA28识别的表位不同的表位。
以下实验部分还说明了IgG PN-SIA28的生产和进行的具有相关结果的中和实验。
本发明的全长IgG对象，优选地，但不限于，IgG PN-SIA28，以游离的形式或以与载体结合的形式制造和使用。载体是设计成与抗体结合并修饰其药代动力学特征的任何分子或化学或生物实体，使其具有免疫原性或提高其免疫原性。载体的非限制性实例是如KLH（“钥孔帽贝血蓝蛋白”）、麻仁球蛋白、甲状腺球蛋白的蛋白质，如牛血清白蛋白（BSA）或人血清白蛋白（HSA）的清蛋白，如绵羊红血细胞（SRBC）、破伤风类毒素、霍乱类毒素的红细胞，诸如例如聚（D-赖氨酸：D-谷氨酸）的聚氨基酸等。为了协助抗体到载体的结合，可以修饰抗体的C-末端或N-末端，例如通过引入额外的氨基酸残基，例如能够形成二硫键的一个或多个半胱氨酸残基。
由于本发明的全长IgG对象的尤其参考IgG PN-SIA28在下面的实验部分详细说明的性质，本发明的全长IgG对象尤其适合用于医疗领域的应用中，特别是用于生产A型流感病毒感染的广谱的预防性或治疗性治疗的药物。
因此，本发明的IgG，优选地，但不限于，IgG PN-SIA28用于制造由A型流感病毒感染引起的病症的预防性或治疗性治疗的药物，诸如例如流行性感冒综合征的应用落在本发明的范围内。
在以下实验部分中进行和显示的中和实验的结果认为，在给予这样的IgG的对象中IgG PN-SIA28在赋予对A型流感病毒的被动免疫中极为有效，并且结果其在由A型流感病毒感染引起的病症的广谱预防性或治疗性治疗中是特别有用的，诸如例如流感综合症，尤其在人体中。任何其它识别相同的被IgG PN-SIA28识别的血凝素表位的全长IgG具有与IgGPN-SIA28基本相同的中和能力。
因此，本发明的另一个目的是包含有效量的本发明的IgG，优选地，但不限于，IgG PN-SIA28作为活性组分以及药物赋形剂和/或稀释剂的药物组合物。
IgG的有效量是设计成在给予组合物的对象中实现良好效果的量，例如通过影响其复制循环阶段来中和A型流感病毒。
在该背景中，术语“对象”是指任何给予组合物并实现其保护效果的动物宿主，优选哺乳动物，更优选人。
用于本发明的药物组合物的药用载体或稀释剂的非限制性实例包括如SPGA、碳水化合物（例如，山梨糖醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖）的稳定剂，如白蛋白或酪蛋白的蛋白质，含有如牛血清或脱脂乳的蛋白质的药剂，和缓冲液（例如磷酸盐缓冲液）。
本发明的IgG，优选但不限于IgG PN-SIA28，也可以有利地用作在体外方法中在先前由患者获得的生物样品中（诸如例如血清、血浆、血液样品或任何其它合适的生物材料，其从患者获得，优选从人获得）检测对A型流感病毒具有杂亚型(heterosubtype)交叉中和活性的抗-A型流感病毒抗体的诊断试剂。这些抗体可在从患者获得的生物样品中发现，例如由于先前暴露于A型流感病毒，或由于本发明的单克隆抗体先前已经为治疗或预防或研究目的给予给患者。
因此，用于在来自患者的生物样品中检测具有杂亚型交叉-中和活性的抗-A型流感病毒抗体存在的检测方法落入本发明的范围内，所述方法包括用本发明的IgG，优选但不限于IgG PN-SIA28，作为特定检测试剂接触所述生物样品。
测定可以是定性或定量的。具有杂亚型交叉中和活性的抗-A型流感病毒抗体的检测和/或定量可以例如通过如竞争性免疫测定实现，例如竞争性ELISA，其中评估了先前自患者获得的生物样品取代本发明的IgG结合血凝素的能力。竞争性免疫测定的一般特征通常对于本领域技术人员来说是已知的并且不需要在此详述。
因此，包括本发明的IgG，优选但不限于IgG PN-SIA28，作为特定试剂的诊断试剂盒也落入本发明的范围，特别设计所述试剂盒以用于在先前从患者获得的生物样品中，对A型流感病毒具有杂亚型交叉中和活性的抗-A型流感病毒抗体的检测和/或定量。
类似地，本发明的IgG，优选但不限于IgG PN-SIA28，在先前制备的免疫原或疫苗组合物中，可在检测和/或定量能够唤醒与本发明的IgG具有相同或类似的中和活性的抗A型流感病毒抗体的表位的测定方法中用作特定试剂，该中和性是对A型流感病毒的杂亚型交叉中和活性，在已经给予这样的组合物的对象中。
预期这种方法可用于任何可用作疫苗或免疫原制剂的评估，如通过本发明的单克隆抗体识别是存在的指示，在免疫原性制剂和/或疫苗中，一种或多种能够刺激能识别有利的表位的抗体克隆的产生的表位，诸如例如能够唤醒针对例如由本发明的发明人鉴定的并在本专利说明书中详述的A型流感病毒的杂亚型免疫的表位。
最后，本发明的IgG，优选但不限于IgG PN-SIA28，可用于制备模拟表位，诸如例如抗-独特型抗体、多肽、截短或人造或其它形式的血凝素，赋予唤醒类IgG PN-SIA28抗体的能力。其中，优选抗-独特型抗体。抗-独特型抗体是特定地针对用于其生产的广谱中和抗体的独特型的抗体，并且因此能够模拟它们所识别的主要表位。抗-独特型抗体的制备通过本身已知的不需要在此处进一步详细解释的方法来实现。以实例的方式提及相同发明人发表的论文（(Burioni et al.(2008)PLoS ONE 3(10):e3423,related to the manufacture of an anti-idiotype antibody capable of mimicking acritical epitope of the human immunodeficiency virus(HIV)gp 120）。
因此，针对本发明的IgG，优选但不限于IgG PN-SIA28的模拟表位，优选抗-独特型抗体，落入本发明的范围内。
完全以说明而不是限制如所附权利要求中限定的本发明范围的方式提供以下实验部分。
实验部分
1．IgG PN-SIA28的制备以及其中和能力的特性
通过使用杆状病毒来生产代表本发明优选实施方式的IgGPN-SIA28。Sf-9细胞系用于转染实验和高效价病毒原料的随后生产，而高五细胞系（H5）用于生产重组蛋白。通过分别使用Sf-900II SFM培养基和Express-Five SFM（Gibco），将两者都保持在无血清条件下。细胞在27℃下温育并保持在约106细胞/ml的浓度的悬浮液中。
重组杆状病毒的制备
开始于Fab片段的全长IgG的生产通过将用于重和轻链的基因克隆到包含与AcNPV杆状病毒基因组（用于启动子P10和多角体蛋白的基因）同源的区域的转移载体中来实现。杆状病毒DNA（BD BiosciencesPharmingen）包含致死缺失，因此一旦转移到昆虫细胞中，它不能影响生产性感染。当杆状病毒线性基因组由互补转移载体共转染到Sf-9细胞中时，同源区之间的重组导致产生重组杆状病毒，再次存活并也能够表达异种蛋白。尤其是，为了产生表达人全长抗体的重组杆状病毒，使用了转移载体pAc-k-Fc(PROGEN)，该转移载体包括人IgG免疫球蛋白的Fc部分并且其中已克隆了用于Fab PN-SIA28的轻链和重链的基因。通过使用限制性位点SacI，EcoRV将用于轻链的基因克隆到转移载体pAc-k-Fc中，而重链通过使用限制性位点XhoI，SpeI。图1示出了转移载体（Progen）的示意图，其中显示了用于重链和轻链的克隆位点。
因此按照制造商（BD Bioscences）推荐的方案，使通过消化和序列测定检验的转移载体与5μg的杆状病毒DNA（BD）共转染。在约6-7天后收集转染后培养基并用ELISA测定分析人免疫球蛋白的存在。该第一上清液指定为“步骤0”（S0）。
为了获得纯重组杆状病毒种群，进行噬斑检测。简单地说，将2x106Sf-9细胞接种到6孔平板中，并且制备上清液S0的连续稀释（从10-4至10-7）。每孔加入1ml的每一稀释，并在1小时后在27℃下除去接种物，并向每个孔中加入半固态培养基（1%琼脂糖溶液）。将平板在27℃下温育约一周，直到在显微镜下出现可检测的溶解噬斑。将一些噬斑分别转移到含105Sf-9细胞的24孔平板的孔中。在约一周后，对于分泌到培养基中的IgG的存在，用ELISA测定测试每一上清液。此外，再次通过ELISA测定来检验抗体维持其对抗原的结合特异性。尤其是，通过常规捕获ELISA测定来检查分泌到培养基中的重组IgG PN-SIA28抗体，通过使用能够结合人Fab片段的多克隆（polyclonal，多克隆抗体），作为捕获试剂，和能够结合人Fc片段的辣根过氧化物酶结合的多克隆（多克隆抗体），用于检测。为了判断重组抗体的特异性，通过使用以前被作为Fab片段的单克隆识别的流感疫苗Inflexal V（season 2007-08）作为抗原进行ELISA测定。
重组杆状病毒的扩增
一旦通过噬斑测定获得重组杆状病毒的纯种群，将其扩增以获得高效价病毒贮液（约109PFU/ml）。进行了四个体外扩增步骤，前三个（S1、S2、S3）在粘附Sf-9细胞中，而最后步骤（S4）在悬浮细胞中。然后将S4在96孔平板中通过终点稀释测定进行滴定并且用Reed-Muench公式计算效价。
重组抗体的表达
为了确定最佳表达条件，以几种感染多态性（MOI1、5和10）来感染悬浮的H5细胞，并且在不同天（感染后3、4、5、6天）收集培养基。为了建立最佳感染条件和检验产生的分子的整合性，用Western Blot测试不同等分部分。产生的重组免疫球蛋白用能够结合人Fc片段的辣根过氧化物酶结合的多克隆进行检测。测定在变性和非还原条件（SDS 10%）下进行。
重组PN-SIA28IgG的纯化和定量
在以106细胞/ml的浓度已侵染1L的H5细胞（MOI5）后，通过台盼蓝染色每天监测细胞存活力。约4天后（约70-80%死亡率），收集、离心培养基并用0.2μm过滤器（Millipore）过滤培养基。然后使用G蛋白通过亲和由培养液上清液纯化重组抗体。以10ml的洗提缓冲液（0.1M柠檬酸，pH3）洗提抗体并通过用Amicon Ultra-15（Millipore）超滤浓缩。通过聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）确定纯化抗体的浓度和纯度和随后用库玛西蓝（Coomassie Blue）染色，通过参考BSA标准曲线。此外，通过参考来自人的商用IgG的标准曲线用ELISA评估重组蛋白的量。
微量中和测定
将MDCK细胞（4x104每孔）接种到96孔平板中。使Fab PN-SIA28的连续稀释（20μg/ml-0.078μg/ml）和IgG PN-SIA28（10μg/ml-0.039μg/ml）与每一H1N1或H3N2病毒的100 TCID50一起温育。在37℃下1小时后，向每个孔中加入100μl不同浓度的病毒Fab或病毒-IgG混合物（为了侵染控制，混合物仅由病毒构成）。在37℃下1小时后，移除100μl的混合物并向每孔中加入100μl的MEM TPCK-胰蛋白酶。在37℃下约7小时后，固定细胞单层并在室温下用冷乙醇溶液渗透10分钟。然后在37℃下在潮湿室中用以荧光素异氰酸酯（FITC）-结合的抗体检测的抗A型流感单克隆抗体（Argene）温育细胞30分钟。最后，用核染料Hoechst 33342对细胞染色。通过计算与对照病毒相比侵染的细胞数量减少来确定抗体的中和活性，对照病毒是没有与感兴趣的抗体预温育的病毒。在实验中，总是包括阴性对照（病毒+对流感病毒非特异性的抗体），非侵染细胞和所用抗体的毒性对照。各孔中阳性细胞核的数目通过自动GE Healthcare的INCell分析系统来计算。
结果
通过杆状病毒生产全长抗体
全长免疫球蛋白通过将用于Fab PN-SIA28重链和轻链的基因克隆到含Fc部分的转移载体pAc-k-Fc（Progen）中而获得。
在用载体pAc-k-Fc和杆状病毒线性DNA共转染Sf-9细胞后，发明人证实了转染后培养基包括人IgG。此外，对于结合特异的维持，测试了分泌到培养基中的IgG。为此，分别使用能结合人Fab片段的多聚和流感疫苗Inflexal V（season 2007-08）作为抗原，通过ELISA检测转染后培养基。在两个情况中，通过能够结合人Fc片段的辣根过氧化物酶-结合的多克隆（多克隆抗体）来检测单克隆抗体IgG PN-SIA28。1%BSA用作阴性对照抗原。平行地，恰当适合的免疫球蛋白测定也使用Fab PN-SIA28进行。ELISA结果表明新产生的IgG在转染后分泌到培养基中，并维持了它们的能够结合流感疫苗以及源于此的Fab片段的结合特异性。
转染后培养基用于进行噬斑测定，以便获得纯重组杆状病毒的纯种群。通过ELISA测试来自几个独立噬斑的上清液以便评估分泌到培养基中的IgG的存在。不是所有结果为阳性的上清液代表在培养基中存在免疫球蛋白，并因此将其丢弃。
在获得高-效价病毒贮液（108-109 pfu/ml）后，发明人通过使用不同的MOI和不同的时间点监测了IgG PN-SIA28的表达。对于表达测试，使用了H5细胞系并用Western Blot在变性和非还原条件下测试在侵染后3、4、5和6天收集的几种培养基等分部分。基于获得的结果（数据未示出），发明人选择MOI 5并收集侵染后第四天的培养基以在H5细胞生产重组蛋白。
体外生物活性的特性：微量中和测定
在96孔平板中以属于H1N1和H3N2亚型的几种病毒株进行微量中和检测，以便评估抗体的中和活性。通过使用Fab PN-SIA28和IgGPN-SIA28两者进行实验。微量中和测定的结果在以下表1中示出。抗体的中和活性以IC50表示，IC50是能够中和50%个体病毒株侵染的抗体浓度（表示为μg/ml）：
表1
*ND：未进行实验
测定单克隆导致能够中和，作为Fab片段（Fab PN-SIA28）和作为全长免疫球蛋白（IgG PN-SIA28），所有测试的分离体属于H1N1亚型（参照ATCC菌株和2009流行的H1N1株）。但是，全长IgG形式的重组蛋白显示出远高于Fab的中和活性。与Fab PN-SIA28相比，全长免疫球蛋白IgG PN-SIA28也对所有测试的H3N2亚型分离体呈现出重要的中和活性。因此，整体上，全长免疫球蛋白IgG PN-SIA28确切呈现出比Fab低的IC50。
2．表位物质的鉴定和方法
在Fab PN-SIA 28选择压力下能够逃逸抗体反应（抗体逃逸突变体）的突 变体的选择和特性
实验在90%汇合的MDCK细胞上进行，其在T25烧瓶中生长在补充有10%FBS（胎儿牛血清）的MEM中。使用了Fab PN-SIA 28和e509抗-E2/HCV，后者用作阴性对照（模拟对照），在1.5ml的补充有TPCK胰岛素（2μg/ml）的MEM培养基中将它们稀释以获得2μg/ml、10μg/ml和20μg/ml的最终抗体浓度。在1.5ml的相同培养基中制备了A/PR/8/34（ATCC号VR-1469TM）的100TCID50。将含Fab和病毒的两种溶液混合以获得在3ml的最终体积中的1μg/ml、5μg/ml和10μg/ml最终浓度的Fab。然后在37℃下温育混合物1小时。也包括侵染阳性对照（没有PN-SIA28的病毒），以及未侵染细胞。用无菌1X PBS洗涤两次后，将1ml的每个中和混合物加入到含MDCK细胞的烧瓶中，并且侵染在5%CO2的存在下在34℃下进行1小时。在吸收后，去除培养基并用无菌PBS洗涤单层两次。将3毫升的补充有胰岛素（2μg/ml）的MEM培养基加入到侵染阳性对照和非-侵染细胞中。将抗体PN-SIA28和e509加入到预先处理的侵染细胞中，维持在侵染步骤期间使用的浓度。将细胞在34℃下与5%CO2温育并有规律检查致细胞病变效应（CPE）的存在48小时，将侵染阳性对照与处理的侵染细胞进行比较。然后收集、离心（2000rcf 10分钟）并在-80℃下保存上清液。滴定所有病毒贮液并用于侵染新的细胞制品，提高那里可能的Fab浓度。在10次传代后，将侵染阳性对照和阴性对照（模拟对照）细胞与在PN-SIA28选择压力下的侵染细胞进行比较。当强的致细胞病变效应在阳性和阴性（模拟）对照中明显时，评估了PN-SIA28-处理的侵染细胞中CPE的存在或不存在。收集、离心、储存所有上清液并用于流感病毒的编码病毒HA（血凝素）的染色体片段4的全长DNA的测序。
HA的克隆和突变
使用以下PCR寡核苷扩增A/PR/8/34（H1N1）的血凝素（HA）：
APR834_s：5’-CACCATGAAGGCAAACCTACTGGTCCTGTTATGTG-3’(SEQ ID NO：6)；
APR834_as：5’-TCAGATGCATATTCTGCACTGCAAAGATCCATTAGA-3’(SEQ IDNO：7).
将PCR产物克隆到载体pcDNA 3.1D/V5-His-TOPO(Invitrogen)中。
随后，通过使用Gene Tailor Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen)生成用于H1N1血凝素（HA）和H3N2 HA的突变体。总共产生20个用于H1N1的HA突变体和4个用于H3N2的HA突变体。
FACS结合测定
通过使用野生型和由如以上描述克隆的突变全长HA蛋白评估PN-SIA28的结合活性。简言之，用4μg的含HA核酸序列的载体pcDNA3.1D/V5-His-TOPO转染人上皮肾（HEK）细胞293T。之后离心并以4%低聚甲醛固定，转染细胞与IgG PN-SIA28(10μg/ml)或与鼠抗-H1或抗-H3（1μg/ml）在室温下温育30分钟。然后洗涤细胞并在室温下与人或鼠FITC-结合的单克隆抗-Fab抗体温育30分钟。此后，洗涤细胞并用FACS分析。在每个实验中也包括未转染的细胞作为阴性对照。使用针对线性表位的单克隆抗-鼠H1或H3亚型抗体评估每个HA的转染效率。对细胞进行FACS分析，其中减去从这些仅用第二抗体染色的细胞获得的信号。PN-SIA28与不同突变的结合表示为与野生型相比的结合百分比。
软件
以下软件用于序列的分析：SeqScape（Applied Biosystems）、ClustalX（Toby Gibson）、Bio Edit（Tom Hall,Ibis Therapeutics）和Treeview（GubuSoft）。RasMol（Roger Sayle）、Jmol（Jmol:a Java open-source viewerfor 3D chemical structures.http://www.jmol.org/）、Cn3D（United StatesNational Library of Medicine,NLM）、Pepitope server（Pepitope:mapping ofepitopes from affinity-selected peptides.Bioinfrmatics 2007 23（23）:3244-3246.）、Mimox（BMC Bioinformatics 2006,7:451doi:10.1186/1471-2105-7-451）用于可视化和再现分子。最后，GraphPadPrism用于数据的分析和绘图编辑。
结果
由单克隆抗体识别的H1N1病毒血凝素表位的特性
在Fab PN-SIA 28选择压力下能够逃逸抗体反应的突变体的选择和特性
在使细胞经历在方法中描述的许多步骤之后，以野生型A/PR/8/34HINl病毒侵染的细胞在不存在抗体PN-SIA28和存在用作阴性对照的抗体e509抗-E2/HCV的情况下呈现出强的致细胞病变效应（CPE）。用野生型病毒侵染的细胞在存在10μg/ml浓度的PN-SIA28的情况下表现出不显著的CPE。相反，用所选的变异病毒侵染的细胞不论是否存在10μg/ml浓度的PN-SIA28都表现出强的CPE。能够逃逸抗体反应的产生的变体的测序显示出两个不同的突变体，与野生型病毒的氨基酸序列相比，每一突变体在血凝素干区的HA2亚单位中具有单氨基酸突变。两个突变是Ile361Thr和Asp362Gly（编号参考线性A/PR/8/34（H1N1）HA氨基酸序列，NCBI登录号EF467821.1，序列表中的SEQ ID NO:5）。
在不同亚型的不同株的361位自然存在异亮氨酸（I）或缬氨酸（V）。如随后描述，I361V变异不影响PN-SIA28与HA的结合。不存在在361位具有Thr或在362位具有Gly的自然分离体。
结合mAb PN-SIA28的HA区的鉴别
抗体PN-SIA28对A型流感病毒具有强的中和活性。尤其是，PN-SIA28对分别属于组1和组2的H1-（如H1N1）和H3-（如H3N2）亚型病毒具有杂亚型中和活性。
在血凝素抑制测定中进行测试时，PN-SIA28不抑制病毒引起的红细胞凝集。
Western blot分析表明PN-SIA28仅识别了未成熟形式的HA（HAO）
基本上，由抗体逃逸突变体的产生、血凝素抑制测定和Western blot分析获得的数据表明由中和抗体识别的区并不位于HA球状区而是位于干区。
在这些观察的基础上，生产包含可阻止以上提到的抗体结合的氨基酸取代的HA分子以便鉴别由PN-SIA28识别的表位。
在以下描述中，氨基酸残基基于线性A/PR/8/34(H1N1)HA序列、NCBI登录号EF467821.1、序列表中的SEQ ID NO:5进行编号。
首先，发明人认为在PN-SIA28选择压力下，产生了两个不同的A/PR/8/34(H1N1)HA2抗体逃逸突变体，在一个突变体中残基Ile361突变为Thr，并且在另一个突变体中残基Asp362突变为Gly。这两个突变体不再被PN-SIA28识别。基于这些结果，产生在361位具有丙氨酸（取代Ile361Ala）或在362位具有丙氨酸/甘氨酸（取代Asp362Ala、Asp362Gly）的HA突变体并通过FACS分析评估了PN-SIA28结合突变体的能力。PN-SIA28仅可以微弱地结合至突变的HAs（Ile361Ala、Asp362Ala、Asp362Gly），说明这两个残基包括在由该抗体识别的表位中。重要的是要注意氨基酸残基Ile361和Asp362在许多血凝素亚型（H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H10、H14、H15）中是高度保守的。
为了详细表征PN-SIA28HA的表位设计了具有靶向被该IgG识别的可能区的突变的第二组突变体。共产生了在几个氨基酸位置，包括Ile361Ala和Asp362Ala含取代丙氨酸的20种突变体，参见表2。
表2
在表2中，编号基于线性A/PR/8/34(H1N1)HA序列、NCBI登录号EF467821.1、序列表中的SEQ ID NO:5。在括号中提供了基于已经描述的抗体F10、CR6261和C179的原始公开的编号。
由IgG PN-SIA28识别的血凝素区的氨基酸残基
FACS分析表明抗体PN-SIA28的结合在以下突变体中降低：HA1-I、-II、-III和-IV；HA2-II、-IV、-V、-VI、-VII、-VIII、-IX、-XI、XII和XIV(参看表2)。这些结果表明残基His25、His45、Thr315、Asn336、Thr358、Met360、Ile361、Asp362、Gly363、Trp364、Thr384、Thr392、Val395和Glu400对PN-SIA28和HA之间的相互作用是关键的。因此，这些残基参与抗体到HA干区的结合。表2中显示的所有其它突变体不导致PN-SIA28与HA的结合的降低。
对于位置HA2-Ile361产生了额外的HA突变体，其中原始残基变为缬氨酸。在相同的亚型中，在位置362中包括自然序列，异亮氨酸残基或缬氨酸残基。当测试PN-SIA28与突变体HA Ile361Val的相互作用时，未观察到相互作用的降低。这些结果表明抗体PN-SIA28能够结合两种病毒变体，在位置361具有异亮氨酸的病毒变体和在相同位置具有缬氨酸的病毒变体两者。这表明PN-SIA28能够结合并中和所有病毒株，不管在位置361处是否存在两个残基。
由IgGPN-SIA28和由抗体C179识别的表位之间的差异
现有技术中描述的鼠单克隆抗体C179能够结合HA的干区中的由亚型H1、H2和H5的HA共享的共用表位。抗体C179与该区域的结合抑制HA的融合活性并因此导致病毒的中和。由C179识别的表位由两个不同的位点构成，一个位于HA1亚单位并由残基318-322限定，并且另一个位于HA2亚单位并由残基47-58限定。
由于两个位点在HA分子的干区中央位于一起，C179表现共同识别这些位点。
能够逃逸抗体反应的突变体病毒，包含带有在HA1亚单位的位置318中一个Thr到Lys取代或在HA2亚单位的位置52中一个Val到Glu取代的HA，不再被C179识别和中和。
比较由PN-SIA28识别的表位与由C179识别的表位。
来自FACS分析的结果表明氨基酸His25、His45、Thr315、Thr358、Met360、Ile361、Asp362、Gly363、Trp364、Thr384和Val395（对应于突变体HA1-I、-II、和-III；HA2-II、-IV、-V、-VI、-VII、-VIII、-IX、和–XII，参见表2)对于PN-SIA28与HA的结合是重要的。对C179与HA的结合这些残基没有被描述为关键残基。此外，Asn336、Thr392、Val395和Glu400（对应于突变体HA1-IV；HA2-XI、-XII和-XIV）对于HA与PN-SIA28的相互作用是关键残基，以及对C179。另外，残基Asn396（对应于突变体HA2-XIII）涉及C179和HA之间的相互作用，而其不涉及PN-SIA28和HA之间的相互作用。
总之，由PN-SIA28抗体识别的表位和由C179抗体识别的表位不同。
由IgG PN-SIA28识别的和由抗体CR6261识别的表位之间的差异
现有技术中描述的抗体CR6261针对A型流感病毒H1、H2、H5、H6、H8和H9亚型具有杂亚型中和活性。对CR6261-A/SouthCarolina/1/1918相互作用进行的结晶研究表明抗体识别在位于接近HA1（残基18、38、40、42、292）和HA2（残基21、41、45、49、52、56）的膜的干区中的高度保守螺旋区。抗体通过阻止构象重排联合膜融合来中和病毒。
比较由PN-SIA28识别的表位与由CR6261识别的表位。
残基Thr315、Thr358、Met360、Ile361、Asp362、Gly363、Trp364和Thr384（对应于突变体HA1-III；HA2-II、-IV、-V、-VI、-VII、-VIII和IX、参见表2)对于PN-SIA28与HA的结合是重要的，但对CR6261与HA的结合没有被描述为关键残基。残基His25、His45（对应于突变体HA1-I和II,参见表2）、Thr392和Val395（对应于突变体HA2-XII和XII，参见表2）对HA与PN-SIA28和CR6261的相互反应是关键残基。残基Ile388（对应于HA2-X突变体，参见表2）对PN-SIA28与HA的结合没有显示重要性，而此残基显示与抗体CR6261直接接触。
总之，由PN-SIA28和CR6261识别的表位不同。
由IgG PN-SIA28识别的和由抗体F10识别的表位之间的差异
现有技术中描述的抗体F10是针对血凝素的高度亲和中和抗体，针对H5N1和H1N1病毒的高致病性亚型极为有效。在通过识别位于血凝素干区的高度保守表位的连接后，该抗体抑制融合过程。确定了F10与来自A/Vietnam/1203/04株H5复合的结晶结构。由F10识别的表位包括由位于一侧的与HA1残基旁侧的HA2融合多肽和位于另一侧的HA2αA螺旋形成的疏水袋。被F10识别的HA1区包括残基18和38，而HA2包括残基18-21、41、45、49、52、53、56。由突变体实现的研究表明在HA2αA中的段内的与F10进行重要相互作用的残基Val52、Asn53和Ile56强烈减少或完全消除抗体的结合。
比较由PN-SIA28识别的表位与由F10识别的表位。
对PN-SIA28的结合重要的残基His25、His45、Ile361、Asp362、Gly363、Trp364、Thr384、Thr392和Val395（对应于突变体HA1-I和–II；HA2-V、-VI、-VII、-VIII、-IX、-XI和XII，参见表2）被描述为F10与HA结合的关键残基。相反，残基Thr315、Asn336、Thr358、Met360和Glu400（对应于突变体HA1-III、-IV；HA2-II、-IV和–XIV，表2）对于PN-SIA28与HA的相互作用是关键残基但对F10不是。另外，Ile388和Asn396（对应于突变体HA2-X、-XIII，参见表2）对PN-SIA28与HA的结合没有显示重要性，而此残基显示与F10直接接触。
总之，由PN-SIA28和F10识别的表位不同。
在与HA结合中IgG和Fab PN-SIA28之间的不同
当HA原有残基Thr315、Asn336、Pro338、Thr392、Glu400变异为丙氨酸时，其最终仅被IgG PN-SIA28识别。相反，Fab PN-SIA28仍可与这些突变体强烈结合。本发明的发明人假设结合特性的不同可能是由由于IgGs比Fab片段有更大尺寸的空间位阻引起的。
由人单克隆抗体PN-SIA28识别的H3N2病毒血凝素表位的特性
为了评估是否H1N1HA上的被PN-SIA28识别的表位也被H3N2HA共享，创建了基于H3N2HA（A/Aichi/2/68）的第二组HA突变体被，参见表3。
表3
HA1                     HA2
His34(His25H1N1)        Ile363(Ile361H1N1)
Asn54(His45H1N1)        Asp364(Asp362H1N1)
编号基于线性H3N2HA序列，NCBI登录号EF614251.1、序列表中的SEQ ID NO:8。
由PN-SIA28识别的H3N2HA氨基酸残基
FACS分析表明在突变体HA1-I和-II；HA2-I、-II，参见表3中PN-SIA28与H3N2HA的结合减少。这些结果说明残基His34、Asn54、Ile363和Asp364对于PN-SIA28与HA之间的相互作用是关键的，因此它们是被抗体识别的表位的一部分并位于HA的干区。
对H3N2HA进行的关于突变体的研究证实不管在两种蛋白质的线性序列中发现的许多氨基酸不同被PN-SIA28识别的表位被H1N1和H3N2血凝素共享。
涉及抗体PN-SIA28与HA相互作用的残基在大多数A型流感病毒亚型中位于高度保守区。
3．IgG PN-SIA28针对另外的A型流感病毒亚型的中和活性
对于抗体IgG PN-SIA28和其识别的区发现的中和活性允许考虑关于该单克隆也对其它流感病毒亚型的中和活性。在该情况，有利的是记住到现在16HA亚型已经被鉴别，在人类有记载的它们中的仅三个能够确定广泛流行（H1、H2和H3），而它们中的另外三个（H5、H9和H7）偶尔从人类分离，但到现在不能导致广泛流行(Fouchier RA,Munster V，WallenstenA,et al.Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype（H16）obtained from black-headed gulls.J Virol 2005;79(5):2814-22)。
基于16亚型之间的系统发生距离（phylogenic distance）（从40%至60%同源），典型地鉴别了两个系统发生组：H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13和H16所属的组1，和H3、H4、H7、H10、H14、和H15所属的组2（Lambert LC,Fauci AS.Influenza vaccines for the future.N Engl JMed 2010;363(21):2036-44;Nabel GJ,Fauci AS.Induction of unnaturalimmunity:prospects for a broadly protective universal influenza vaccine.NatMed 2010;16(12):1389-91）。图2示出几种血凝素（H）亚型的系统发生树。组1可进一步分为3个群，为类群1（H1、H2、H5、H6），类群11（H11、H13和H16）和类群H9（H9、H8和H12）。类似地，组2可分为另两个群：类群H3（H3、H4和H14）和类群H7（H7、H10和H15）。
基于由IgG PN-SIA28表明的宽中和活性（也扩展到测试的3分离体）和不同亚型之间的相互系统发生距离，其中和活性可能也对属于其它亚型的分离体。尤其是，我们可以推论：
1)中和活性极可能扩大到所有作为H2、H5和H6的属于类群H1亚型的分离体。
2)中和活性很可能扩大到作为H9、H8或H12的属于类群9亚型的分离体。
3)中和活性可能扩大到作为H11、H13或H12的属于类群11亚型的分离体。
4)对属于组2亚型的活性不容易预测。在该情况，我们可陈述：
a．PN-SIA28的活性很可能扩大到属于H3亚型的除这些已经考虑的其它分离体。
b．PN-SIA28的活性可能扩大到作为H4和H14的属于类群H3亚型的分离体。
c．PN-SIA28的活性不太可能扩大到作为H7、H10和H15的属于类群H7亚型的分离体。
进行了初步实验以检验这些假定，为了评估IgG PN-SIA28抗体结合属于至今已在人物种中分离的亚型的重组蛋白的能力。考虑被PN-SIA28识别的区是高度中和表位，该发现允许联系结合某亚型的能力与实际中和它的能力。
在该背景中，通过应用以前已经由本发明的发明人使用的实验方法确定初步实验进行，其包括编码属于不同亚型的全长血凝素的人造基因的合成，和随后在以个体构建物转染的细胞表面上的该基因的表达（Burioni R,Canducci F,Mancini N,et al.Monoclonal antibodies isolated from human Bcells neutralize a broad range of H1 subtype influenza A viruses includingswine-origin Influenza virus(S-OIV).Virology 2010;399(1):144-52;Burioni R,Canducci F,Mancini N,et al.Molecular cloning of the first human monoclonalantibodies neutralizing with high potency swine-origin influenza A pandemicvirus(S-OIV).New Microbiol 2009;32(4):319-24）。因而，编码来自属于已影响人的亚型，除H1和H3外，的分离体的HA的基因序列选自在线数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore；http://openflu.vitalit.ch/browse.php#results）。
以下是选择的分离体：
-A/Ann Arbor/6/60(H2N2)
-A/Vietnam/1203/2004 clade 1(H5N1)
-LAIV A/chicken/Hong Kong/G9/97(H9N2)
-A/New York/107/2003(H7N2)
然后通过荧光免疫检测法和FACS用PN-SIA28分析转染的细胞，并且结果总结在表4中。基于不同亚型之间的系统发生距离进行的假设被获得的结果充分证实。因此，可以相信PN-SIA28的活性至少可扩展到亚型H2N2、H5N1和H9N2。
表4.PN-SIA28对用属于不同亚型的血凝素转染的细胞的结合能力

Claims (15)

1.一种特异性针对A型流感病毒血凝素抗原并且能够结合和中和至少包括H1亚型和H3亚型的多种A型流感病毒亚型的人单克隆抗体，其特征在于，所述人单克隆抗体为全长IgG，并且进一步的特征在于，所述人单克隆抗体识别位于血凝素干区中的保守表位，所述表位包括HA1血凝素亚单位的氨基酸残基His25、His45、Thr315和Asn336和HA2血凝素亚单位的氨基酸残基Thr358、Met360、Ile361或Val361、Asp362、Gly363、Trp364、Yhr384、Thr392、Val395和Glu400，所述氨基酸残基的编号是基于指定为SEQ ID NO:5的H1N1血凝素氨基酸序列，所述人单克隆抗体包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的重链可变区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的轻链可变区。
2.根据权利要求1所述的人单克隆抗体，所述人单克隆抗体能够结合并中和至少包括H1亚型、H3亚型和H5亚型的多种A型流感病毒亚型。
3.根据权利要求1所述的人单克隆抗体，所述人单克隆抗体能够结合并中和至少包括H1亚型、H3亚型和H2亚型的多种A型流感病毒亚型。
4.根据权利要求1所述的人单克隆抗体，所述人单克隆抗体能够结合并中和至少包括H1亚型、H3亚型和H9亚型的多种A型流感病毒亚型。
5.根据权利要求1所述的人单克隆抗体，所述人单克隆抗体能够结合并中和至少包括H1亚型、H3亚型、H5亚型和H2亚型的多种A型流感病毒亚型。
6.根据权利要求1所述的人单克隆抗体，所述人单克隆抗体能够结合并中和至少包括H1亚型、H3亚型、H5亚型和H9亚型的多种A型流感病毒亚型。
7.根据权利要求1所述的人单克隆抗体，所述人单克隆抗体能够结合并中和至少包括H1亚型、H3亚型、H2亚型和H9亚型的多种A型流感病毒亚型。
8.根据权利要求1所述的人单克隆抗体，所述人单克隆抗体能够结合并中和至少包括H1亚型、H3亚型、H5亚型、H2亚型和H9亚型的多种A型流感病毒亚型。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的人单克隆抗体，其中，所述重链可变区由核苷酸序列SEQ ID NO:3编码，并且所述轻链可变区由核苷酸序列SEQ ID NO:4编码。
10.一种药物组合物，包含有效量的根据权利要求1至9中任一项所述的至少一种抗体以及药用赋形剂和/或稀释剂。
11.根据权利要求1至8中任一项所述的人单克隆抗体，用作针对直接或间接由A型流感病毒感染引起的病症的治疗性或预防性药物。
12.根据权利要求11所述的应用的人单克隆抗体，其中，所述由A型流感病毒感染引起的病症是流行性感冒综合症。
13.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体在制备用于在来自患者的生物样品中检测具有杂亚型交叉中和活性的抗流感病毒抗体存在的诊断试剂中的用途，所述检测包括使所述生物样品与作为特异性测定试剂的所述诊断试剂接触的步骤。
14.一种诊断试剂盒，包括根据权利要求1至9中任一项所述的抗体作为特异性试剂，所述试剂盒特别用于在来自患者的生物样品中检测或定量具有杂亚型交叉中和活性的抗-A型流感病毒抗体的方法。
15.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体在制备用于在免疫原性或疫苗组合物中检测A型流感病毒表位存在的特定试剂中的用途，所述A型流感病毒表位在给予其的对象中能够诱发对A型流感病毒具有杂亚型交叉中和活性的抗-A型流感病毒抗体，所述检测包括使所述组合物与作为特定测定试剂的所述特定试剂接触的步骤。
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