MX2014003745A - Molecula de union que tiene actividad neutralizadora del virus de la influenza a, producida a partir de celulas b humanas. - Google Patents
Molecula de union que tiene actividad neutralizadora del virus de la influenza a, producida a partir de celulas b humanas.Info
- Publication number
- MX2014003745A MX2014003745A MX2014003745A MX2014003745A MX2014003745A MX 2014003745 A MX2014003745 A MX 2014003745A MX 2014003745 A MX2014003745 A MX 2014003745A MX 2014003745 A MX2014003745 A MX 2014003745A MX 2014003745 A MX2014003745 A MX 2014003745A
- Authority
- MX
- Mexico
- Prior art keywords
- seq
- indicated
- virus
- binding molecule
- influenza
- Prior art date
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 199
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims abstract description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 6
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 title claims description 15
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 claims abstract description 132
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims abstract description 70
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 19
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 123
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 72
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 59
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims description 59
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims description 59
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims description 59
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims description 59
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 58
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 55
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 54
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 53
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 53
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 53
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 52
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 34
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 28
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 20
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims description 5
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims description 5
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 claims description 5
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 claims description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical group C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 46
- 241000252870 H3N2 subtype Species 0.000 description 22
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 22
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 17
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 16
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 13
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 11
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 7
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 6
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 5
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 5
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- 241000197306 H1N1 subtype Species 0.000 description 4
- OCJYIGYOJCODJL-UHFFFAOYSA-N Meclizine Chemical compound CC1=CC=CC(CN2CCN(CC2)C(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)=C1 OCJYIGYOJCODJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282341 Mustela putorius furo Species 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 241001473386 H9N2 subtype Species 0.000 description 3
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 3
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000252864 H7N2 subtype Species 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 2
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 2
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 2
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- OHVLMTFVQDZYHP-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-2-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)C(CN1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)=O OHVLMTFVQDZYHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZEVSDGEBAJOTK-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-2-[5-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]-1,3,4-oxadiazol-2-yl]ethanone Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)C(CC=1OC(=NN=1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)=O KZEVSDGEBAJOTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQNRVGJCPCNMKT-LFVJCYFKSA-N 2-[(e)-[[2-(4-benzylpiperazin-1-ium-1-yl)acetyl]hydrazinylidene]methyl]-6-prop-2-enylphenolate Chemical compound [O-]C1=C(CC=C)C=CC=C1\C=N\NC(=O)C[NH+]1CCN(CC=2C=CC=CC=2)CC1 YQNRVGJCPCNMKT-LFVJCYFKSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001293109 Anas carolinensis Species 0.000 description 1
- 102100024630 Asc-type amino acid transporter 1 Human genes 0.000 description 1
- 101100462537 Caenorhabditis elegans pac-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101150059079 EBNA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 239000001828 Gelatine Substances 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 108700010880 HA-2 agglutinin Proteins 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 206010062717 Increased upper airway secretion Diseases 0.000 description 1
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 101100117764 Mus musculus Dusp2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710202061 N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000845082 Panama Species 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 101150081875 Slc7a10 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- LHMSJZLSCNPWNJ-CPKQKIOSSA-N Wyomin Natural products O(C[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](Oc2c([C@H]3[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O3)c(O)c3C(=O)C=C(c4cc(O)c(O)cc4)Oc3c2)O1)[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C)O1 LHMSJZLSCNPWNJ-CPKQKIOSSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 230000003460 anti-nuclear Effects 0.000 description 1
- 229940121357 antivirals Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N carbonyl sulfide Chemical compound O=C=S JJWKPURADFRFRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- ALEXXDVDDISNDU-JZYPGELDSA-N cortisol 21-acetate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)COC(=O)C)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O ALEXXDVDDISNDU-JZYPGELDSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000008298 dragée Substances 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000007902 hard capsule Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical group 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012966 insertion method Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000002941 microtiter virus yield reduction assay Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical group 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 208000026435 phlegm Diseases 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical group 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M sodium;3-acetamido-5-[acetyl(methyl)amino]-2,4,6-triiodobenzoate;(2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound [Na+].CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- LHMSJZLSCNPWNJ-UHFFFAOYSA-N wyomin Chemical compound OC1C(O)C(O)C(C)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC=2C(=C(O)C=3C(=O)C=C(OC=3C=2)C=2C=C(O)C(O)=CC=2)C2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 LHMSJZLSCNPWNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
Abstract
La presente invención se refiere a una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora del virus de la influenza A, derivado de una célula B humana, y la molécula de unión que tiene la actividad neutralizadora del virus de la influenza A, de acuerdo con la presente invención, es una molécula de unión que se deriva de una célula B que está seleccionada de la sangre de un paciente infectado con un virus de influenza A y tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A y, por lo tanto, es útil para prevenir y tratar enfermedades derivadas del virus de la influenza A y puede ser útil para diagnosticar el virus de la influenza A, usando la molécula de unión de acuerdo con la presente invención.
Description
MOLÉCULA DE UNIÓN QUE TIENE ACTIVIDAD EUTRALIZADO RA
DEL VIRUS DE LA INFLUENZA A, PRODUCIDA A PARTIR DE
CÉLULAS B HUMANAS
Campo técnico
La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal humano que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, que se deriva de células B humanas, seleccionadas de la sangre de pacientes que se recuperaron de infección con el virus de la influenza A.
La técnica de antecedentes
La influenza, una enfermedad provocada por una infección respiratoria con virus de la influenza, ocurre frecuentemente en invierno. Se sabe que tiene infectividad muy alta y que afecta a todos los grupos de edad, en particular a la gente de más edad (Treanor, J., 2004, N. Engl. J. Med., 350(3): 218-20). Los virus de la influenza son virus de ARN (ácido ribonucleico) envuelto que pertenecen a la familia Orthomyxoviridae y tienen un genoma formado por ocho segmentos de ARN (ácido ribonucleico) de un solo filamento, de sentido negativo. Estos virus de influenza están clasificados en tipos A, B y C. Los virus de influenza A se dividen adicionalmente en subtipos, con base en sus principales proteínas de superficie hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). Hasta la fecha se han identificado 16 Ha y 9 NA (Cheung TK y Poon LL, 2007, Ann. N. Y. Acad. Sci., 1102:1-25). Los virus de la influenza pueden
afectar a las aves, los cerdos y los humanos, dependiendo de sus tipos, y tienen un genoma formado por segmentos de ARN y, por esa razón, sus genes pueden mutar continuamente y recombinarse, lo que da por resultado nuevas variaciones genéticas (Treanor, J., 2004. N. Engl. J. Med., 350(3): 218-20). Debido a esta mutación continua, es difícil obtener inmunidad permanente contra los virus de la influenza y, por lo tanto, un método preventivo que se cree actualmente que es el más efectivo, es un método de administrar una vacuna contra un tipo particular de virus de influencia que se espera sea prevalente cada año para desarrollar inmunidad contra el virus de la influenza cada año.
Las vacunas contra los virus de la influenza generalmente son producidas usando huevos; pero este método de producción es tardado y es un método ineficiente. Consecuentemente, este método es un problema, ya que es difícil producir suficientes cantidades de vacunas cada año, dentro de un marco de tiempo limitado. En un intento por solucionar este problema, se han efectuado activamente estudios sobre métodos para producir vacunas mediante cultivo en células, por varias compañías farmacéuticas (GSK, Baxter, etc.). Además, si ocurre una infección pandémica por virus de la influenza, es muy difícil desarrollar una vacuna contra la infección en un tiempo breve. También los fármacos antivirales no son totalmente confiables debido a un problema asociado con la emergencia de virus mutantes, resistentes al fármaco.
Para resolver este problema se han estado desarrollando
recientemente de manera activa anticuerpos contra virus de influenza (Throsby y coautores, 2008, PloS One 3 (e3942) Sui y coautores, 2009, Nature structural & molecular biology, 16 (265-273); Simmons y coautores, 2007, PloS Medicine 4 (e178); Wrammert y coautores, 2011, J. Exp. Med. 208 (181-193); Corti y coautores, 2011, Science 333 (850-856)).
Los productos de la sangre de pacientes recuperados han sido usados para tratar pacientes infectados con varios virus, así como para tratar infecciones de gripe pandémica. Por ejemplo, cuando los pacientes infectados con el virus de la influenza española tuvieron síntomas de neumonía, los productos de la sangre recolectados de pacientes que se recuperaron de la infección con el virus de la influenza son usados para tratar el virus de la influenza (Luke y coautores, 2006, Annals of infernal medicine, 145: 599). De esa manera se purifica la globulina hiperinmune (Iglv) del plasma humano y se la usa para tratar pacientes infectados con varios virus, pero el producto obtenido como se describe arriba puede no ser seguro por agentes infecciosos potenciales en la sangre, y es ineficiente para la producción en masa.
Se usan células 6 humanas para filtrar los anticuerpos monoclonales humanos específicos. Sin embargo, la inmortalización de células B humanas, mediante el virus de Epstein-Barr (EBV) es menos eficiente y es tardado. Para solucionar este inconveniente se han desarrollado y usado nuevas técnicas. Una de esas técnicas es el uso de un método RT-PCR para obtener información genética para
un anticuerpo directamente de célu las B. Por ejem plo, hay un método que comprende manchar célu las B que expresan un anticuerpo para un antígeno específico; aislar las células B usando un FACS más corto; obtener información genética para el anticuerpo a partir de las célu las B individuales, mediante un método RT-PCR; insertar la información genética en un vector de expresión y transfectar el vector de expresión a células animales para producir u na cantidad grande del anticuerpo. Para llevar a cabo este método de producción de u na manera más fácil y más rápida se puede usar la sig uiente técnica. La nueva técn ica "análisis de formación de inmunopuntos en un chip" (ISAAC, ImmunoSpot Array Assay on a Chip) permite que se obtenga un gen de anticuerpo seleccionando células B individuales, que secreten un anticuerpo monoclonal específico, en el térm ino de varias semanas (Jin y coautores, 2009, Nat. Med. , 1 5, 1088-1092). El anticuerpo así obtenido es un anticuerpo humano natural que puede ser más efectivo en términos de cuestiones inm unogénicas.
Descripción
El problema técnico
Es u n objetivo de la presente invención proveer una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A.
Otro objetivo de la presente invención es proveer una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la molécula de unión .
Otro objetivo más de la presente invención es proveer un
vector de expresión que tiene la molécula de ácido nucleico aislada insertada en él.
Otro objetivo más de la presente invención es proveer una línea de células productoras de la molécula de unión, transfectadas con el vector de expresión .
Otro objetivo adicional de la presente invención es proveer un método para seleccionar una molécula de unión.
Otro objetivo más de la presente invención es proveer u na composición que comprende la molécu la de unión.
Otro objetivo más de la presente invención es proveer u n método para tratar una enfermedad provocada por el virus de la influenza A, usando la molécula de unión.
También es un objetivo de la presente invención proveer un método para prevenir una enfermedad provocada por el virus de la influenza A, usando la molécula de unión.
También es otro objetivo de la presente invención proveer u n método para diagnosticar la infección por virus de la influenza A, usando la molécula de unión .
También es un objetivo adicional de la presente invención proveer un equipo para diagnóstico del virus de la influenza A, que comprende la molécula de unión .
La solución técnica
A fin de obtener los objetivos anteriores, la presente invención provee una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A.
La presente invención provee también una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la molécula de unión .
La presente invención provee también un vector de expresión que tiene la molécula de ácido nucleico insertada en él.
a presente invención provee además una línea de células productoras de la molécula de unión , transfectadas con el vector de expresión .
La presente invención provee también un método para seleccionar una molécula de unión.
La presente invención provee además una composición que comprende la molécula de unión .
La presente invención provee también una composición para prevenir y tratar una enfermedad provocada por un virus de influenza
A, que comprende la molécula de unión .
La presente invención provee también una composición para d iagnosticar el virus de influenza A, que comprende la molécula de unión .
La presente invención provee también un método para a tratar una enfermedad provocada por el virus de la influenza A, usando la molécula de unión.
La presente invención provee también un método para prevenir una enfermedad provocada por el virus de la influenza A, usando la molécula de unión .
La presente invención provee también un método para diagnosticar una infección por virus de influenza A, usando la
molécula de unión.
La presente invención provee también un estuche para diagnosticar el virus de influenza A, que comprende la molécula de unión .
Efectos ventajosos
La molécula de u nión de la presente invención tiene afinidad de unión para , y actividad neutralizadora contra, el virus de la influenza A y, por lo tanto, es útil para la prevención y el tratamiento de una enfermedad provocada por el virus de la influenza A, y también es útil para el diagnóstico de una infección por virus de influenza A.
Descripción de los dibujos
La figu ra 1 es una serie de gráficas que m uestran los resu ltados de ELISA efectuado para verificar las afinidades de unión de las moléculas de unión primariamente seleccionadas, para la hemaglutinina H3 (en lo sucesivo denom inada "HA").
La figura 2 muestra mapas de vectores pCT145 (A) y pCT147
(B) .
A: vector pCT145
B: vector pCT147;
pac: un gen que codifica una purom icina N-acetil-transferasa
(PAC); y
DS : La secuencia simétrica de diada (EBNA1 ) se une al elemento de simetría de diada (DS) en oriP).
La figura 3 es un mapa de un vector de expresión que expresa la molécula de unión de la presente invención .
La figura 4 muestra los resultados de experimentos en animales (ratones) efectuado usando la molécula de unión de la presente invención.
La figura 5 muestra los resultados de medir el cambio de título de virus en lavado nasal y tejido pulmonar, después de infección con virus de influenza H3N2 (A/Hongkong/68) durante experimentos en animales (en hurones), efectuados usando la molécula de unión de la presente invención.
La figura 6 muestra los resultados de medir el cambio de título de virus en lavado nasal y tejido pulmonar después de infección con el virus de influenza H5N 1 (A/Vietnam/1203/04) durante experimentos en animales (en hurones), efectuados usando la molécula de unión de la presente invención .
La mejor manera
En lo que sigue, los términos usados aqu í tendrán las siguientes definiciones:
El térm ino "virus de influenza A", cuando se usa aquí, se refiere a virus envueltos, que pertenecen a la familia Orthomyxoviridae y q ue tienen un genoma formado por ocho segmentos de ARN (ácido ribonucleico) de un solo filamento, de sentido negativo. Estos virus de influenza están clasificados en tipos A, B y C, y los virus de influenza A están d ivididos en subtipos, con base en sus HA (hemaglutinina) y NA (neuram inidasa) de sus principales proteínas de superficie. Se han informado hasta la fecha 1 6 Ha y 9 Na.
Cuando se usa aquí, la expresión "virus del subtipo H3" se refiere a virus que tienen HA del subtipo H3 y, por lo tanto, se pretende que incluyan: virus H3N1, H3N2, H3N3, H3N4, H3N5, H3N6, H3N7, H3N8 y H3N9.
Cuando se usa aquí, el término "hemaglutinina" (en lo sucesivo denominada "HA", indica la glicoproteína de envolvente del virus de la influenza. Ha media la adsorción y la penetración del virus de influenza en una célula huésped. Se han informado hasta ahora 16 subtipos HA.
El término "pacientes recuperados o completamente recuperados", cuando se usa aquí, se refiere a pacientes que fueron positivos para el virus de la influenza A, debido a infección con virus de la influenza A, pero que son negativos para el virus de la influenza A en la sangre después de un periodo de tiempo dado.
Cuando se usa aquí, el término "molécula de unión" se refiere a una inmunoglobulina intacta que comprende anticuerpos monoclonales, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos, humanizados o humanos, o a un fragmento de una inmunoglobulina de unión a antígeno o que comprende dominio variable, de una inmunoglobulina que compite con la inmunoglobulina intacta por la unión específica al asociado de unión de la inmunoglobulina, por ejemplo, la HA monomérica o la HA trimérica del virus de la influenza A. Independientemente de la estructura, el fragmento de unión al antígeno se une con el mismo antígeno que es reconocido por la inmunoglobulina intacta. Un fragmento de unión a antígeno puede
comprender un péptido o un polipéptido que comprende una secuencia de am inoácidos formada por al menos 2, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 1 00, 125, 1 50, 175, 200 o 250 residuos de aminoácido contiguos de la secuencia de aminoácidos de la molécula de unión . Los fragmentos de unión al antígeno comprenden, entre otros: Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd , fragmentos de región determinante de complementariedad (CDR), anticuerpos de una sola cadena (seFv), anticuerpos bivalentes de una sola cadena, anticuerpos fagos de una sola cadena, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, polipéptidos que contienen por lo menos un fragmento de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir un ión a antígeno específica al polipéptido, etc. Se pueden producir sintéticamente los fragmentos anteriores o mediante descomposición enzimática o química de las inmunoglobulinas intactas, o pueden ser diseñadas genéticamente por medio de técnicas de ADN recombinante. Los métodos de producción son bien conocidos en la técnica.
Cuando se usa aquí, el término "excipiente aceptable para uso farmacéutico" sign ifica cualquier sustancia inerte que se com bine con una molécula activa, tal como un fármaco, un agente o una molécula de unión para preparar una forma de dosis aceptable o conven iente. El excipiente aceptable para uso farmacéutico es u n excipiente que no es tóxico para los receptores a las dosis y las concentraciones usadas, y q ue es compatible con otros ingredientes de la form ulación que comprenden el fármaco, el agente o la
molécula de unión.
Cuando se usa aquí, el término "cantidad eficaz en términos terapéuticos" se refiere a una cantidad de la molécula de unión que es eficaz para prevenir o tratar una condición que resulta de la infección con el virus de la influenza A.
En lo que sigue se describirá con detalle la presente invención. Los inventores de la presente aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes que se recuperaron de infección con el virus de la influenza A. Se aislaron células B que producen anticuerpos monoclonales contra la Ha del subtipo H 1 de las PBMC aisladas, usando el método ISAAC. Se obtuvo la información genética para la producción de los anticuerpos monoclonales contra la HA en las células B seleccionadas, mediante un método RT-PCR, y se insertaron en vectores peADN . Se transfectaron los vectores a una línea de células CHO y luego se seleccionaron primariamente 82 anticuerpos. A fin de med ir con mayor exactitud la afinidad de unión a HA, todos los anticuerpos insertados en el vector pcADN fueron transfectados a células F2N h umanas, y los anticuerpos generados de las células transfectadas fueron analizados comparativamente mediante HA-ELISA, usando HA monomérica y HA trimérica del subtipo H3 como antígenos, seleccionando de esa manera, secundariamente, 6 anticuerpos (anticuerpos CT1 29, CT1 35, CT147, CT149, CT163 y CT166) que reaccionaron con la HA trimérica en mayor grado que con la HA monomérica. A fin de examinar las actividades neutralizadoras de
los anticuerpos seleccionados contra diversos virus de la influenza, se efectuaron una prueba de microneutralización (en lo sucesivo denominada "prueba M N") y una prueba de inhibición de hemaglutinación (en lo sucesivo denom inada "prueba ? G). M uchos de los anticuerpos exhibieron actividades neutralizadoras elevadas o bajas contra varios virus de la influenza, pero todos los anticuerpos mostraron una reacción negativa en la prueba H l . Por medio de la prueba MN se seleccionó el anticuerpo CT149 que mostró actividad neutralizadora contra varios virus. Se insertó el gen del anticuerpo seleccionado en el vector de expresión MarEx que ten ía eficacia elevada de expresión de anticuerpo, y se transfectó entonces el vector a células F2N . El anticuerpo derivado de las células transfectadas se sometió a la prueba M N para otros virus más de la influenza. Como resultado, se mostró que el anticuerpo CT149 ten ía actividad neutralizadora no sólo contra virus del subtipo H 1 y H3, sino también contra virus del subtipo H5, H7 y H9 (ver tabla 4) . Además, los experimentos en animales, efectuados usando virus de influenza del subtipo H3, el anticuerpo CT149 exhibió excelentes efectos preventivos y terapéuticos contra infección H3N2 (ver la figura 4). Con base en los resultados descritos, los inventores de la presente han completado una invención que se relaciona con un anticuerpo monoclonal contra virus de la influenza A, que protege de infección por virus de la influenza A.
Consecuentemente, la presente invención provee una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la
influenza A.
De preferencia la molécula de unión es un anticuerpo. Se prefiere que el anticuerpo sea un fragmento Fab, un fragmento Fv, un diacuerpo, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano, pero no está limitado a ellos.
En la presente invención, la molécula de unión se une a HA sobre la superficie del virus de influenza A. También se prefiere que la molécula de unión se derive de células B presentes en la sangre de pacientes que se recuperaron de infección con el virus del subtipo H1 N1 de la influenza A.
En particular, el anticuerpo CT149 tiene actividad neutralizadora no sólo contra los virus de influenza del grupo 1 (H1, H5 y H9), sino también contra virus de la influenza del grupo 2 (H3 y H7).
En la presente invención el virus de la influenza A puede ser del subtipo H1N1 y el virus de la influenza A del subtipo H1N1 puede ser A/Ohio/07/2009. También el virus de la influenza A puede ser del subtipo H5N1, y el virus de la influenza A del subtipo H5N1 puede ser A/Vietnam/1203/04 x PR8. Adicionalmente, el virus de la influenza A puede ser del subtipo H7N2, y el virus de la influenza A del subtipo H7N2 puede ser A/turkey/Virginia/02 x PR8. Además, el virus de la influenza A puede ser del subtipo H9N2, y el virus de la influenza A del subtipo H9N2 puede ser cualquiera o cualesquiera seleccionado(s) del grupo formado por A/Green-winged teal/209/TX/2009 y A/ck/HK/G9/97 x PR8. También en la presente
invención el virus de la influenza A puede ser del subtipo H3N2, y el virus de la influenza A del subtipo H3N2 puede ser cualquier o cualesquiera, seleccionado(s) del grupo formado por A/Brisbane/10/07, A/Wisconsin/67/05, A/Wyomin/3/03.rg, A/Beijing/353/89-? 109, A/Beijing/32/92-R-H3, A/Johannesburg/33/94 R-H3, A/Nanchang/933/95, A/Sydney/5/97 y A/Panama/2007/99.
En la presente invención, las regiones determinadoras de complementariedad (CRD) de los dominios variables fueron determinadas usando un método convencional de acuerdo con el sistema diseñado por Kabat y coautores (ver Kabat y coautores, Sequences of Proteins of Immunological Interest (5!), National Institutes of Health, Bethesda, MD, E. U. A. (1991)). La numeración de CDR usada en la presente invención fue efectuada de acuerdo con el método Kabat; pero la presente invención comprende también moléculas de unión que comprenden CDR determinados por otros métodos, que comprenden el método IMGT, el método Chothia y el método AbM.
La presente invención provee también una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, que comprende la siguiente secuencia de polipéptidos de cadena ligera: una cadena ligera que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, cualquier región CDR1, seleccionada del grupo formado por secuencias de polipéptido indicadas en SEQ ID NOS: 1, 7, 13 y 15; cualquier región CDR2, seleccionada del grupo formado por la secuencias de polipéptido indicadas en SEQ ID
NOS: 2, 8 y 16; y cualquier reg ión CDR3 seleccionada del g rupo formado por secuencias de polipéptido indicadas en S EQ ID NOS : 3 o 9.
La presente invención provee también una molécu la de u n ión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, que comprende la siguiente secuencia de polipéptidos de cadena pesada: una cadena pesada que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, cualquier reg ión CDR 1 seleccionada del g rupo formado por las secuencias de polipéptido indicadas en SEQ I D NOS: 4 o 10; cualquier región CDR2 seleccionada del g rupo formado por las secuencias de polipéptido indicadas en SEQ I D NOS: 5, 1 1 , 14 y 17; y cualquier región CDR3 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polipéptido indicadas en SEQ I D NOS: 6 o 12.
La presente invención provee también una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, que comprende las siguientes secuencias de polipéptidos de cadena ligera y de cadena pesada: una cadena ligera que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, cualqu ier región CDR1 seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de polipéptidos indicadas en SEQ I D NOS: 1 , 7, 1 3 y 1 5; cualqu ier región CDR2 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polipéptidos indicadas en SEQ I D NOS: 2, 8 y 1 6, y cualquier región CDR3, seleccionada del grupo formado por las secuencias de polipéptidos indicadas en SEQ I D NOS: 3 o 9; y una cadena pesada
que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, cualquier región CDR1 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polipéptidos indicadas en SEQ ID NOS: 4 o 10; cualquier región CDR2 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polipéptido indicadas en SEQ ID NOS: 5, 11, 14 y 17; y cualquier región CDR3, seleccionada del grupo formado por las secuencias de polipéptido indicadas en SEQ ID NOS: 6 o 12.
La presente invención provee también una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, que comprende cualquier secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo formado por las siguientes secuencias de polipéptido: una molécula de unión formada por una cadena ligera que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 indicada en SEQ ID NO: 1, una región CDR2 indicada en SEQ ID NO: 2 y una región CDR3, indicada en SEQ ID NO: 3; y una cadena pesada que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR1 indicada en SEQ ID NO: 4, una región CDR2 indicada en SEQ ID NO: 5, y una región CDR3 indicada en SEQ ID NO: 6; una molécula de unión formada por una cadena ligera que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR1, indicada en SEQ ID NO: 7, una región CDR2 indicada en SEQ ID NO: 8 y una región CDR3 indicada en SEQ ID NO: 9; y una cadena pesada que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR1, indicada en SEQ ID NO: 10, una región CDR2, indicada en SEQ ID
NO: 11, y una región CDR3, indicada en SEQ ID NO: 12; una molécula de unión formada por una cadena ligera que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR1 indicada en SEQ ID NO: 13, una región CDR2 indicada en SEQ ID NO: 8 y una región CDR3 indicada en SEQ ID NO: 9; y una cadena pesada que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR1 indicada en SEQ ID NO: 10, una región CDR2 indicada en SEQ ID NO: 14 y una región CDR3, indicada en SEQ ID NO: 6; y una molécula de unión formada por una cadena ligera que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR1 indicada en SEQ ID NO: 15, una región CDR2 indicada en SEQ ID NO: 16 y una región CDR3 indicada en SEQ ID NO: 9, y una cadena pesada que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR1 indicada en SEQ ID NO: 10, una región CDR2, indicada en SEQ ID NO: 17 y una región CDR3 indicada en SEQ ID NO: 12.
En la presente invención, de preferencia la molécula de unión está compuesta por una cadena ligera que comprende una secuencia de polipéptidos señalada en SEQ ID NO: 37 y una cadena pesada que comprende una secuencia de polipéptidos indicada en SEQ ID NO: 38.
En la presente invención de preferencia la molécula de unión está formada por una cadena ligera que comprende una secuencia de polipéptidos indicada en SEQ ID NO: 39 y una cadena pesada que comprende una secuencia de polipéptidos indicada en SEQ ID NO:
40.
En la presente invención de preferencia la molécula de unión está formada por una cadena ligera que comprende una secuencia de polipéptidos indicada en SEQ ID NO: 41 y una cadena pesada que comprende una secuencia de polipéptidos indicada en SEQ ID NO: 42.
Además, de preferencia, la molécula de unión está formada por una cadena ligera que comprende una secuencia de polipéptidos indicada en SEQ ID NO. 43 y una cadena pesada que comprende una secuencia de polipéptidos indicada en SEQ ID NO: 44.
Se prefiere que la molécula de unión tenga actividad neutralizadora contra cualquier virus seleccionado del grupo formado por los subtipos H1, H3, H5, H7 y H9 del virus de la influenza A. También se prefiere que el subtipo H3 del virus de la influenza A sea H3N2, pero sin restricción a él.
La presente invención provee también una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, que comprende la siguiente secuencia de polinucleótidos de cadena ligera: una cadena ligera que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método de Kabat, cualquier región CDR1 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polinucleótidos indicadas en SEQ ID NOS: 18, 24, 30 y 34; cualquier región CDR2 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polinucleótidos indicadas en SEQ ID NOS: 19, 25 y 35, y cualquier región CDR3 seleccionada del grupo formado por las secuencias de
polinucleótidos indicadas en SEQ ID NOS: 20 o 26.
La presente invención provee también una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, que comprende la siguiente secuencia de polinucleótidos de cadena pesada: una cadena pesada que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, cualquier región CDR1 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polinucleótidos indicadas en SEQ ID NOS: 21, 27 y 31; cualquier región CDR2 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polinucleótidos indicadas en SEQ ID NOS: 22, 28, 32 y 36, y cualquier región CDR3, seleccionada del grupo formado por las secuencias de polinucleótidos indicadas en SEQ ID NOS: 23, 29 y 33.
La presente invención provee también una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, que comprende las siguientes secuencias de polinucleótidos de cadena ligera y de cadena pesada: una cadena ligera que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, cualquier región CDR1 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polinucleótido indicadas en SEQ ID NOS: 18, 24, 30 y 34; cualquier región CDR2 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polinucleótido indicadas en SEQ ID NOS: 19, 25 y 35, y cualquier región CDR3, seleccionada del grupo formado por las secuencias de polinucleótidos indicadas en SEQ ID NOS: 20 o 26; y una cadena pesada que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, cualquier región CDR1, seleccionada del grupo
formado por las secuencias de polinucleótidos indicadas en SEQ ID NOS: 21, 27 y 31; cualquier región CDR2 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polinucleótidos indicadas en SEQ ID NOS: 22, 28, 32 y 36, y cualquier región CDR3, seleccionada del grupo formado por las secuencias de polinucleótido indicadas en SEQ ID NOS: 23, 29 y 33.
La presente invención provee también una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, que está compuesto por una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo formado por las siguientes secuencias de polinucleótidos: una molécula de unión compuesta por una cadena ligera que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR1 indicada en SEQ ID NO: 18; una región CDR2 indicada en SEQ ID NO: 19 y una región CDR3 indicada en SEQ ID NO: 20; y una cadena pesada que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR1 indicada en SEQ ID NO: 21; una región CDR2 indicada en SEQ ID NO: 22 y una región CDR3 indicada en SEQ ID NO: 23; una molécula de unión compuesta por una cadena ligera que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR1 indicada en SEQ ID NO: 24; una región CDR2, indicada en SEQ ID NO: 25 y una región CDR3 indicada en SEQ ID NO: 26; Y UNA CADENA PESADA QUE COMPRENDE, CUANDO SE DETERMINA DE ACUERDO CON EL MÉTODO Kabat, una región CDR1 indicada en SEQ ID NO: 27; una región CDR2 indicada en SEQ ID NO: 28 y una
región CDR3 indicada en SEQ I D NO: 29; una molécula de unión compuesta por una cadena ligera que comprende, cuando se determ ina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR1 indicada en SEQ I D NO: 30, una región CDR2 indicada en S EQ I D NO: 25 y una región CDR3 indicada en SEQ I D NO: 26; y una cadena pesada que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR 1 indicada en SEQ I D NO: 31 , una región CDR2 indicada en SEQ I D NO: 32 y una región CDR3 indicada en SEQ I D NO: 33; y una molécula de unión compuesta por u na cadena ligera que comprende, cuando se determ ina de acuerdo con el método Kabat, u na región CDR 1 indicada en SEQ I D NO: 34, una región CDR2 ind icada en SEQ ID NO: 35 y una región CDR3 indicada en SEQ I D NO: 26; y una cadena pesada que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR1 indicada en SEQ I D NO: 31 , una región CDR2 indicada en S EQ I D NO 36 y u na región CDR3 indicada en SEQ I D NO: 29.
En la presente invención , la molécula de unión está formada, de preferencia, por una cadena ligera que comprende una secuencia de polinucleótidos indicada en SEQ I D NO: 45 y una cadena pesada que comprende una secuencia de polinucleótidos indicada en SEQ I D NO: 46.
También la molécu la de un ión está formada, de preferencia por una cadena ligera que comprende una secuencia de polinucleótidos indicada en SEQ ID NO: 47 y una cadena pesada que comprende una secuencia de polinucleótidos indicada en SEQ I D NO: 48.
Además, la molécula de unión está formada, de preferencia, por una cadena ligera que comprende una secuencia de polinucleótidos indicada en SEQ ID NO: 49 y una cadena pesada que comprende una secuencia de polinucleótidos indicada en SEQ ID NO: 50.
Adicionalmente, la molécula de unión está formada, de preferencia, por una cadena ligera que comprende una secuencia de polinucleótidos indicada en SEQ ID NO: 51 y una cadena pesada que comprende una secuencia de polinucleótidos indicada en SEQ ID NO: 52.
La molécula de unión de preferencia tiene actividad neutralizadora contra cualquier virus seleccionado del grupo formado por virus de la influenza A de los subtipos H1, H3, H5, H7 y H9. También el virus de la influenza A del subtipo H3 de preferencia es H3N2, pero sin restricción a él.
La molécula de unión de la presente invención de preferencia es un anticuerpo, pero sin restricción a ello. De preferencia el anticuerpo es un fragmento Fab, un fragmento Fv, un diacuerpo, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano. Adicionalmente, la presente invención incluye todos los fragmentos de anticuerpo que tengan la capacidad de unirse al virus HA de la influenza A, y que se unan a HA competitivamente con la molécula de unión de la presente invención. Además, la presente invención incluye también variantes funcionales de la molécula de unión. Si las variantes de la molécula de unión pueden competir con
la molécula de unión de la presente invención para unirse específicamente al subtipo H3 del virus de la influenza A, o sus fragmentos, se considera que son variantes funcionales de la molécula de unión de la presente invención. Específicamente, si las variantes funcionales se pueden unir al virus HA de la influenza A, o a sus fragmentos, y tienen actividad neutralizadora contra dicho HA o sus fragmentos, se considera que son variantes funcionales de la presente invención. Las variantes funcionales comprenden, pero sin restricción a ellos: derivados que son sustancialmente similares en la secuencia estructural primaria, pero que contienen, por ejemplo, modificaciones in vitro o in vivo químicas y/o bioquímicas, que no se encuentran en la molécula de unión antecesora de la presente invención. Dichas modificaciones comprenden, por ejemplo: acetilación, acilación, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, fijación covalente de un lípido o derivado de lípido; entrelazamiento, formación de ligadura disulfuro, glicosilación, hidroxilación, metilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, y otros similares. Alternativamente, las variantes funcionales pueden ser moléculas de unión que comprenden una secuencia de aminoácidos que contienen sustituciones, inserciones, omisiones o combinaciones de ellas, de uno o más aminoácidos, en comparación con las secuencias de aminoácidos de las moléculas de unión antecesoras. Adicionalmente, las variantes funcionales pueden comprender truncamientos de la secuencia de aminoácidos en cualquiera de los
extremos amino o carboxilo, o en ambos. Las variantes funcionales de acuerdo con la presente invención pueden tener la m isma afinidad de unión o diferente, ya sea mayor o menor, en comparación con el anticuerpo monoclonal antecesor, pero todavía ser capaces de unirse al virus HA de la influenza A o a sus fragmentos. Por ejemplo, las variantes funcionales de acuerdo con la invención pueden tener afinidades de unión incrementadas o dism inuidas hacia el virus HA de la influenza A, o sus fragmentos, en comparación con las moléculas de unión antecesoras, de la presente invención.
Es preferible que las secuencias de aminoácidos de las regiones variables que comprenden, pero sin restricción a ellas, las regiones de estructura, las regiones hipervariables, en particular las regiones CDR3, estén modificadas. En general, las reg iones de cadena ligera o de cadena pesada comprenden tres regiones hipervariables, que comprenden tres CDR, y regiones más conservadas, las llamadas regiones de estructura (FR). Las regiones hipervariables comprenden residuos de aminoácidos de la CDR y residuos de aminoácidos de los bucles hipervariables. Las variantes funcionales destinadas a quedar dentro del alcance de la presente invención tienen por lo menos alrededor del 50 al 99 por ciento, de preferencia por lo menos alrededor del 60 a 99 por ciento, más preferible, por lo menos alrededor de 80 a 99 por ciento, todavía más preferible, por lo menos alrededor de 90 a 99 por ciento, en particular, por lo menos alrededor de 95 a 99 por ciento y, m uy en particular, por lo menos alrededor de 97 a 99 por ciento de
homolog ía de las secuencias de aminoácido con el anticuerpo monoclonal antecesor, como se define aqu í. Se pueden usar algoritmos de computadora, tales como Gap o Best fit, conocidos por quienes son expertos en la materia, para alinear óptimamente las secuencias de aminoácidos para compararlas y defin ir los residuos de aminoácido similares o idénticos. Se pueden obtener variantes funcionales ya sea alterando los anticuerpos monoclonales antecesores, o partes de ellos, mediante métodos generales de biolog ía molecular, conocidos en la técnica, que comprenden PCR, m utagénesis d irigida a oligonucleótido y mutagénesis d irigida al sitio; o mediante métodos de síntesis orgánica, pero sin restricción a ellos.
La presente invención provee además una molécu la de ácido nucleico aislada, que codifica la molécula de unión de la presente invención.
La molécula de ácido n ucleico de la presente invención incluye todas las moléculas de ácido n ucleico obtenidas traduciendo las secuencias de aminoácido de los anticuerpos de la presente invención a secuencias de polinucleótido, de acuerdo con métodos conocidos por quienes sean expertos en la materia. Consecuentemente, se pueden preparar varias secuencias de polinucleótido con marcos de lectura abiertos (ORF) y también están incluidas en el alcance de las moléculas de ácido n ucleico de la presente invención .
La presente invención provee también un vector de expresión que tiene la molécula de ácido nucleico aislada insertada en él. El
vector de expresión puede ser derivado, preferentemente, de cualquier vector seleccionado del grupo formado por, pero sin restricción a ellos: un vector de expresión MarEx, producido por Celltrion Inc. (Corea); un vector pCDNA ampliamente d isponible en el comercio; un vector F, R1 , RP 1 , Col , pBR322, ToL, Ti; cósm idos; fagos, tales como lambda, lambdoid , 1 3, Mu, P 1 , P22, Qp , T-even , T2, T4, T7, etc. ; y virus vegetales.
Se puede usar en la presente invención cualq uier vector de expresión conocido por quienes sean expertos en la materia, y la selección del vector de expresión depende de la naturaleza de la célula huésped seleccionada. La introducción del vector en las células huésped se puede efectuar mediante, pero sin restricción a ellas: transfección con fosfato de calcio, infección con el virus, transfección mediada por DEAE-dextrano, tra nsfección en lipofectam ina o electroporación; y cualquier persona experta en la materia puede seleccionar y usar un método de introd ucción adecuado para el vector de expresión y la célula huésped que se están usando. De preferencia, el vector contiene uno o más marcadores seleccionables, pero no está restringido a ello; y tam bién se puede usar u n vector que no contenga marcador seleccionable. La selección de los marcadores seleccionables puede depender de las células huésped de selección, si bien esto no es crítico para la presente invención, como es bien sabido por quienes son expertos en la materia.
Para facilitar la purificación de la molécu la de ácido nucleico
de la presente invención, se puede insertar una secuencia de etiqueta en el vector de expresión . Los ejemplos de las etiq uetas comprenden , pero sin restricción a ellas: una etiqueta de hexa-histidina, una etiqueta de hemaglutin ina, una etiqueta de myc, o una etiqueta FLAG. Se puede emplear en la presente invención cualqu ier etiqueta que facilite la purificación , conocida por los expertos en la materia.
La presente invención provee también una línea de células que produce una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A; teniendo la línea de células el vector de expresión descrito más atrás, transfectado en ella.
En la presente invención , la línea de células puede comprender células de mam íferos, vegetales, células de insecto, de origen fungal o bacteriano, pero sin restricción a ellas. En cuanto a las células de mam íferos, se usa preferiblemente como célula huésped cualq uiera seleccionada del grupo formado por, pero sin restricción a ellas: células CHO, células F2N, células CSO, células BH K, células de melanoma de Bowes, células HeLa, células 91 1 , células AT1 080, células A549, células HEK 293 y células H EK 293T. Se puede usar en la presente invención cualquier célula utilizable como una célula huésped de mam ífero, conocida por los expertos en la materia.
La presente invención provee también un método para seleccionar una molécula de unión que tenga actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, procedente de pacientes infectados con virus de influenza A; el método comprende
los pasos de: 1 ) seleccionar un paciente cuya sangre sea negativa para el virus de la influenza A, de entre pacientes infectados con el virus de la influenza A; 2) recolectar sangre del paciente seleccionado en el paso 1 ); 3) aislar células B de la sangre del paciente recolectada en el paso 2); 4) seleccionar las células B que produzcan una molécula de unión que se una a hemaglutinina (HA) de las células B aisladas en el paso 3); 5) extraer los ARN de las células B seleccionadas en el paso 4); 6) amplificar los genes de molécula de unión procedentes de los ARN extraídos en el paso 5); 7) clonar los genes amplificados en el paso 6), en vectores de expresión; 8) transfectar los vectores de expresión del paso 7) a células huéspedes; 9) seleccionar moléculas de unión que se unan a HA, de las moléculas de unión derivadas de las células transfectadas construidas en el paso 8); 1 0) preparar y cultivar una línea de células para las moléculas de unión seleccionadas; 1 1 ) purificar moléculas de u nión que se unen a la HA del virus de la influenza A, del cultivo de células del paso 10); 1 2) reconfirmar si las moléculas de unión purificadas en el paso 1 1 tienen actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A; y 1 3) seleccionar una molécula de unión que tenga confirmada la actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, en el paso 12).
La molécula de unión en el método de selección descrito arriba de preferencia es un anticuerpo, pero no está restringido a ella. Se prefiere que el anticuerpo sea un fragmento Fab, un fragmento Fv, un diacuerpo, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o
un anticuerpo humano. Además, la presente invención comprende todos los fragmentos de anticuerpo que tengan la capacidad de unirse a la HA del virus de la influenza A y que se unan competitivamente a la HA con la molécula de unión de la presente invención.
Además, la presente invención comprende también variantes funcionales de la molécula de unión. Si las variantes de la molécula de unión pueden competir con la molécula de unión de la presente invención, para unirse específicamente al subtipo H3 del virus de la influenza A, o sus fragmentos, se pueden considerar variantes funcionales de la molécula de unión de la presente invención. Específicamente, si las variantes funcionales se pueden unir a la HA del virus de la influenza A, o sus fragmentos, y tienen actividad neutralizadora contra dicha HA o sus fragmentos, se consideran variantes funcionales de la presente invención. Las variantes funcionales comprenden, pero sin restricción a ellos, los derivados que son sustancialmente similares en la secuencia estructural primaria, pero que contienen, por ejemplo, modificaciones in vitro o in vivo, químicas y/o bioquímicas, que no se encuentran en la molécula de unión precursora de la presente invención. Dichas modificaciones comprenden, por ejemplo: acetilación, acilación, conexión covalente de un nucleótido o un derivado de nucleótido, conexión covalente de un lípido o derivado lípido, entrelazamiento, formación de ligadura disulfuro, glicosilación, hidroxilación, metilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico,
fosforilación, y otros similares. Alternativamente, las variantes funcionales pueden ser moléculas de unión que comprenden una secuencia de aminoácidos que contiene sustituciones, inserciones, omisiones o sus combinaciones, de uno o más aminoácidos, en comparación con las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos monoclonales precursores. Adicionalmente las variantes funcionales pueden comprender truncamientos de la secuencia de aminoácidos en cualquiera de los extremos amino o carboxilo, o en ambos. Las variantes funcionales de acuerdo con la presente invención pueden tener las mismas o diferentes afinidades de unión, mayores o menores, en comparación con el anticuerpo monoclonal precursor, pero que todavía son capaces de unirse a la HA del virus de la influenza A o a sus fragmentos. Por ejemplo, las variantes funcionales de acuerdo con la invención pueden tener afinidades de unión incrementadas o disminuidas para la HA del virus de la influenza A o sus fragmentos, en comparación con las moléculas de unión precursoras. Se prefiere que las secuencias de aminoácidos de las regiones variables, que comprenden, pero sin restricción a ellas, las regiones de estructura, las regiones hipervariables, en particular las regiones CDR3, sean modificadas. En general, las regiones de cadena ligera o de cadena pesada comprenden tres regiones hipervariables que comprenden tres CDR y regiones más conservadas, las llamadas regiones de estructura (FR). Las regiones hipervariables comprenden residuos de aminoácido de las CDR y residuos de aminoácidos de los bucles hipervariables. Las variantes
funcionales destinadas a quedar dentro del alcance de la presente invención tienen por lo menos alrededor de 50 a 99 por ciento, de preferencia por lo menos alrededor de 60 a 99 por ciento, más preferible, por lo menos alrededor de 80 a 99 por ciento, todavía más preferible, por lo menos alrededor de 90 a 99 por ciento, en particular por lo menos alrededor de 95 a 99 por ciento y, m uy en particular, por lo menos alrededor de 97 a 99 por ciento de homolog ía en la secuencia de am inoácidos, con el anticuerpo monoclonal precursor, como se define aqu í. Se pueden usar algoritmos de computadora , tales como Gap o Best Fit, conocidos por las personas expertas en la materia, para alinear óptimamente las secuencias de aminoácidos que se van a comparar y para definir resid uos de am inoácidos sim ilares o idénticos. Se pueden obtener variantes fu ncionales, ya sea alterando los anticuerpos monoclonales precursores o sus partes, mediante métodos generales de biolog ía molecular, conocidos en la técnica, que comprenden PCR, mutagénesis dirigida al oligonucleótido y mutagénesis dirig ida al sitio, o mediante métodos de síntesis orgánica, pero sin restricción a ellos.
La presente invención provee también una composición que comprende la molécula de unión descrita más atrás.
La composición de la presente invención puede comprender, además de la molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, un excipiente aceptable para uso farmacéutico. Los excipientes aceptables para uso farmacéutico son
bien conocidos por los expertos en la materia.
La presente invención provee también una composición para prevenir y tratar una enfermedad provocada por el virus de la influenza A; donde la composición comprende la molécula de u nión descrita con anterioridad.
La composición preventiva y terapéutica de la presente invención puede comprender, además de la molécula de unión q ue tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, un excipiente aceptable para uso farmacéutico. Los excipientes aceptables para uso farmacéutico son bien conocidos por quienes son expertos en la materia.
Además, la composición preventiva y terapéutica de la presente invención puede com prender por lo menos otros cinco agentes terapéuticos. La composición preventiva y terapéutica de la presente invención puede comprender varios anticuerpos monoclonales que se unen a la HA del virus de la influenza A, o a sus fragmentos y, por lo tanto, pueden exhibir un efecto sinerg ístico sobre la actividad neutralizadora.
Además, la composición preventiva y terapéutica de la presente invención puede comprender adicionalmente uno o más de otros agentes terapéuticos o agentes de diagnóstico. Los agentes terapéuticos comprenden , pero sin limitación a ellos, fármacos antivirales. Los ejemplos de tales fármacos comprenden anticuerpos, moléculas pequeñas, compuestos orgán icos o inorgánicos, enzimas, secuencias de polinucleótidos, péptidos
antivirales, etc.
La composición preventiva y terapéutica de la presente invención debe ser estéril y estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. También puede estar en forma de polvo que se va a reconstitu ir en un excipiente apropiado, aceptable para uso farmacéutico, antes del suministro o en el momento del su ministro. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones estériles inyectables, los métodos de preparación preferidos son secado al vacío y secado por congelación , que producen un polvo del ingrediente activo y cualquier ing rediente adicional deseado, a partir de una solución previamente filtrada de manera estéril, del polvo. Alternativamente, la composición de la presente invención puede estar en solución y se puede añadir un excipiente apropiado, aceptable para uso farmacéutico y/o se puede mezclar antes de, o en el momento del suministro, para proveer u na forma inyectable de dosis unitaria. Se prefiere que el excipiente aceptable para uso farmacéutico que se está usando en la presente invención sea adecuado para la concentración elevada de fármaco, pueda mantener la capacidad de flujo apropiado y, de ser necesario, pueda retardar la absorción.
La selección de la ruta de adm inistración óptima de la composición preventiva y terapéutica de la presente invención será influenciada por varios factores que comprenden: las propiedades físico-qu ímicas de las moléculas activas dentro de la composición, la urgencia de la situación clínica y la relación de las concentraciones
de plasma de las moléculas activas respecto al efecto terapéutico deseado. Por ejemplo, la molécula de unión de la presente invención puede ser preparada con portadores que la protejan de la liberación rápida, tal como form ulaciones de liberación controlada, que comprenden implantes y sistemas de sum in istro m icroencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocom patibles, tales como vinilacetato de etileno, polianh idridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico, en la presente invención. Adicionalmente, se puede revestir la molécula de unión de la presente invención o se la puede coadm inistrar con un material o un compuesto que impida la inactivación del anticuerpo. Por ejemplo, se puede administrar la molécula de u nión de la presente invención junto con un portador apropiado, por ejemplo, un liposoma o un diluyente.
Las rutas de administración de la composición preventiva y terapéutica de la presente invención se pueden divid ir en rutas oral y parenteral. La ruta de administración preferida es una ruta intravenosa, subcutánea o intranasal, pero no está restringida a ellas.
Se pueden formular formas de dosis oral, tales como: tabletas, trociscos, caramelos, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránu los dispersables, em ulsiones, cápsulas duras, cápsulas de gelatina blandas, jarabes o elixires, pildoras, grageas, líq uidos, geles o suspensiones. Estas formu laciones pueden contener excipientes farmacéuticos q ue comprenden, pero sin restricción a
ellos: diluyentes inertes, agentes granuladores y desintegradores, agentes aglutinantes, agentes lubricantes, conservadores, agentes colorantes, agentes saborizantes o edulcorantes, aceites vegetales o minerales, agentes humectantes y agentes espesadores.
Las formulaciones para administración parenteral pueden tener la forma de soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas, isotónicas, estériles, no tóxicas, para inyección o infusión. Las soluciones o suspensiones pueden comprender agentes que sean no tóxicos para los receptores a las dosis y las concentraciones empleadas, tales como: 1 ,3-butanodiol, solución de Ringer, solución de Hank, solución isotónica de cloruro de sodio, aceite, ácidos grasos, agentes anestésicos locales, conservadores, reguladores, agentes incrementadores de viscosidad o de solubilidad, antioxidantes solubles en agua, antioxidantes solubles en aceite, y agentes quelatadores de metales.
La presente invención provee también una composición para diagnosticar el virus de la influenza A, que comprende un conjugado que comprende una etiqueta enlazada a la molécula de unión ya descrita, que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A.
La composición para diagnóstico de acuerdo con la presente invención comprende por lo menos una etiqueta detectable, tal como una porción/un agente detectables. La etiqueta puede estar enlazada no covalentemente con la molécula de unión de la presente invención. La etiqueta también puede estar enlazada directamente
con la molécula de unión , a través de una unión covalente. Alternativamente, la etiqueta también puede estar enlazada a la molécula de unión por medio de uno o más compuestos enlazadores. Las técnicas para enlazar la etiqueta a la molécula de unión son bien conocidas por los expertos en la materia. La porción/el agente detectable, como la etiqueta, de preferencia es cualquiera seleccionado del grupo formado por: enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales emisores de positrones, así como iones metálicos paramagnéticos no radiactivos; pero no están restringidos a ellos.
La presente invención provee también un método de tratamiento de una enfermedad provocada por el virus de la influenza A; el método comprende administrar a un sujeto que tiene la enfermedad, una cantidad eficaz en términos terapéuticos, de la molécula de unión de la invención , que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A.
En el método terapéutico de la presente invención , el virus de la influenza A de preferencia es uno seleccionado del grupo formado por los subtipos H 1 , H3, H5, H7 y H9; y el subtipo H3 del virus de la influenza A de preferencia es H3N2, pero sin restricción a él.
En el método terapéutico de la presente invención se puede adm inistrar cualquier agente terapéutico conocido por quienes son expertos en la materia, junto con la molécula de unión de la presente invención.
En el método terapéutico de la presente invención la enfermedad provocada por el virus de la influenza A puede ser cualquiera seleccionada del grupo que consiste de una nueva cepa de gripe, gripe pandémica y gripe estacional, pero sin restricción a ellas.
En el método terapéutico de la presente invención la dosis de la molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A se puede ajustar para proveer la respuesta óptima. Por ejemplo, la dosis es de 0.01 a 200 mg/kg, de preferencia de 0.1 a 1 50 mg/kg y, más preferible, de 1 a 100 mg/kg , pero no está lim itada a esto. Se pueden admin istrar d iariamente varias dosis divididas, o la dosis se puede reducir o incrementar proporcionalmente, según esté ind icado por las exigencias de u na situación individual. El modo de adm inistración no está limitado en la presente invención y lo puede decidir el médico que atiende
En el método terapéutico de la presente invención las rutas de administración de la molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, se pueden dividir en rutas de administración oral y parenteral. La ruta de adm inistración preferida es la ruta intravenosa, pero sin restricción a Ha.
La presente invención provee también un método para la prevención de una enfermedad provocada por el virus de la influenza A; el método comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz en térm inos terapéuticos, de la molécula de unión de la invención que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A.
En el método preventivo de la presente invención se puede
administrar cualquier agente preventivo conocido por quienes son expertos en la materia, junto con la molécula de unión de la presente invención.
En el método preventivo de la presente invención la dosis de la molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A se puede ajustar para proveer la respuesta óptima. La dosis, por ejemplo, es 0.01 a 200 mg/kg, de preferencia de 0.1 a 150 mg/kg y, más preferible, de 1 a 100 mg/kg, pero no está limitada a ellas. Se puede administrar varias dosis divididas diariamente, o se puede reducir o incrementar proporcionalmente la dosis, según se indique por las exigencias de una situación individual. El modo de administración no está limitado en la presente invención y puede ser decidido por el médico que atiende.
En el método de prevención de la presente invención, las rutas de administración de la molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A se pueden dividir en rutas de administración oral y parenteral. La ruta de administración preferida es una ruta intravenosa, pero no está limitada a ella.
La presente invención provee también un método para diagnosticar una infección por virus de la influenza A en un paciente; el método comprende los pasos de: 1) llevar una muestra hasta contacto con la molécula de unión de la invención que tenga actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A; y 2) detectar una reacción entre la molécula de unión y la muestra. Además, la presente invención provee también un método de
diagnóstico de infección por el virus de la influenza A en un paciente; el método comprende los pasos de: 1) llevar una muestra hasta contacto con la composición de diagnóstico de la presente invención; y 2) detectar una reacción entre la molécula de unión y la muestra.
En el método de diagnóstico de la presente invención, el virus de la influenza A de preferencia es uno seleccionado del grupo formado por los subtipos H1, H3, H5, H7 y H9, y el subtipo H3 del virus de la influenza A de preferencia es H3N2, pero no está limitado a él.
En el método de diagnóstico de la presente invención, la molécula de unión de la presente invención, de ser necesario, está enlazada con una etiqueta para diagnosis y detección, de acuerdo con cualquier método conocido por los expertos en la materia.
En el método de diagnóstico de la presente invención se prefiere que la muestra sea cualquiera seleccionada del grupo formado por flema, esputo, sangre, célula pulmonar, moco de tejido pulmonar, tejido respiratorio y saliva, pero sin limitación a ellas. La muestra puede ser preparada de acuerdo con cualquier método convencional conocido por los expertos en la materia.
En el método de diagnóstico de la presente invención, el método para detectar la reacción puede ser uno seleccionado del grupo formado por inmunoanálisis de unión homogéneos y heterogéneos, tales como radioinmunoanálisis (RIA), análisis inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA), inmunofluorescencia,
inmunocitoquímica, FACS, BIACORE y análisis de mancha Western, pero sin restricción a ellos; y se puede usar en la presente invención cualquier método de detección conocido por los expertos en la materia.
La presente invención también provee un estuche de diagnóstico del virus de la influenza A, que comprende: 1 ) la molécula de unión de la invención que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A; y 2) y contenedor.
Además, la presente invención provee un equipo para diagnóstico del virus de la influenza A, que comprende: 1 ) la composición de la invención para el diag nóstico del virus de la influenza A; y 2) un contenedor.
En el equipo de diagnóstico de la presente invención el contenedor 2) comprende un soporte sólido. La molécula de unión de la presente invención puede estar fijada a un soporte sólido y este soporte sólido puede ser poroso o no poroso, plano o no plano.
Ejem plos
Ejem plo 1 : Aislamiento de PBMC de la sangre de pacientes que se recuperaron de gripe
Un grupo de pacientes recuperados consistió de pacientes voluntarios que ten ían de 2 a 4 semanas después de confirmar nuevas infecciones de gripe. Se confirmó que los voluntarios no tuvieran virus de influenza (H 1 N 1 ) en su sangre ni tuvieran un anticuerpo contra el nuevo virus de influenza. Se efectuó este estudio bajo aprobación del I nstitutional Review Board (I RB). El
grupo de pacientes tenía las siguientes características: (1) los pacientes no estaban vacunados contra la gripo estacional; (2) los pacientes eran negativos para otros virus infecciosos, es decir, HBsAg, y eran negativos para anticuerpo anti-VCH y anticuerpo anti-VIH; (3) el plasma del paciente era negativo en RT-PCR para el virus de la influenza del subtipo H1N1; (4) el suero del paciente mostraba un título de 1:160 o más en análisis ELISA para la HA monomérica del subtipo H1N1 del virus de influenza A. Se recogió aproximadamente 100 mL de sangre entera de los voluntarios y se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de la sangre recogida, usando Lymphoprep™ (Axis-Shiel, Noruega, 1114545). Se lavaron tres veces las PBMC aisladas, con salina regulada con fosfato, se suspendieron en medio de congelación KM banker II (Cosmobio, Japón, KOJ-16092010) a una concentración de 2 x 107 células/mL y se guardaron en un tanque de nitrógeno líquido. Ejemplo 2: Selección primaria de anticuerpos monoclonales
Se seleccionaron células B que secretan anticuerpos específicos para el antígeno, usando el método descrito por Jin y coautores (Jin A. y coautores, 2009, Nat. Med., 15, 1088-1092). En pocas palabras, se añadieron las PBMC aisladas en el ejemplo 1 a un chip de microformación preparado, a una densidad de una célula por concavidad. Se confirmaron los anticuerpos secretados de las células individuales mediante el anticuerpo anti-lgG humana prerrevestido. Se examinó si las células seleccionadas que secretaron anticuerpos secretaron anticuerpos de unión a HA,
usando el antígeno HA marcado. Se obtuvieron las secuencias completas de los genes de cadena pesada y de cadena ligera de los anticuerpos de las células individuales que secretan el anticuerpo mediante reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR). Se insertaron los ADN de cadena pesada y de cadena ligera obtenidos en vectores de expresión pcADN 3.1(+) (Invitrogen, USA V790-20) para preparar vectores de expresión que produzcan cada una de las cadenas pesadas y las cadenas ligeras de los anticuerpos. Se cotransfectaron los vectores de expresión preparados a células CHO. Luego, usando los anticuerpos derivados de las células CHO transfectadas, se seleccionaron primariamente 82 anticuerpos que se unen a HA, mediante el método A-ELISA descrito en el ejemplo 3 que sigue. Aquí se seleccionaron primariamente todos los anticuerpos que muestran una reacción con la HA, sin diluir seriadamente las muestras de anticuerpo.
Ejemplo 3: Verificación de la capacidad de los anticuerpos mono-clónales de unirse a la HA
A fin de seleccionar secundariamente los anticuerpos monoclonales, que tienen alta capacidad de unión a la HA del virus de influenza H3N2, se efectuó el HA-ELISA de los 82 anticuerpos primariamente seleccionados, usando la subunidad (HA1) de la HA monomérica y la HA trimérica. Se adquirió una subunidad HA1 monomérica recombinante (11056-V08H1 ) del virus de influenza A, de Sino Biological Inc. (China). La subunidad HA1 adquirida consistió del fragmento N-terminal (del Metí a la Arg345) de la HA
que comprende los residuos polihistidina del extremo C, y se derivó de células humanas transfectadas. Se proporcionó HA trimérica recombinante (FR-61) por IRR (Influenza Reagent Resource, E. U. A.). La HA trimérica comprendía un sitio de división trombina en el extremo C, un dominio trimerizante (fondón) y seis residuos histidina, y fue producida usando un sistema de baculovirus.
Se midió ia reactividad del anticuerpo con el antígeno de HA mediante ELISA, usando la HA y el anticuerpo. Específicamente, se adsorbió primero 50 µ? de antígeno de HA trimérica (250 ng/mL) en cada concavidad de una placa de microtitulación de 96 concavidades (Nunc, Dinamarca, 449824). Se bloqueó la placa con salina regulada con fosfato (Teknova, E. U. A., D5120) que contenía 1 por ciento de albúmina de suero bovino (BSA) y luego se añadió la muestra de anticuerpo diluida seriadamente al triple (concentración inicial: 1 pg/mL) a cada concavidad de la placa. A continuación se incubó la placa a la temperatura ambiente durante 1 hora y después se trató con anticuerpo anti-gamma humano de cabra, marcado con peroxidasa (Zymed, E. U. A., 62.8420). Después de incubar durante una hora a la temperatura ambiente, se incubó la placa con tetrametilbencidina (TMB; Sigma-Aldrich, E. U. A., T0440) y se detuvo la incubación añadiendo HCI 1N. Se midió la absorbencia a 450/570 nm, usando un lector de placa (Spectramax plus 384, Molecular Device) y se expresó gráficamente la reactividad de antígeno-anticuerpo, usando el programa Graphpad prism (GraphPad Software Inc., E. U. A.).
La mayoría de los anticuerpos no se unió a la HA de H3N2, pero, como se muestra en la figura 1, los anticuerpos CT129, CT135, CT147, CT149, CT164 Y CT166 mostraron afinidades elevadas de unión. En particular, estos anticuerpos se unieron fácilmente a la HA trimérica, pero no se unieron a la subunidad HA1. Esto sugiere que los anticuerpos seleccionados no se unen al epítope de HA1 previamente conocido, sino que tienen la capacidad de unirse únicamente a las porciones limítrofes entre los segmentos HA1 y HA2, o a HA2 o a HA con una conformación normal.
Con base en los resultados mostrados en la figura 1, de los 82 anticuerpos seleccionados primariamente, se seleccionaron secundariamente seis anticuerpos (CT129, CT135, CT147, CT149, CT164 Y CT166) que muestran elevadas afinidades de unión para la HA trimérica del virus de influenza H3N2. A fin de incrementar los niveles de expresión de los anticuerpos seleccionados secundariamente, se reclonaron estos genes de anticuerpo a partir de los vectores de pcADN en vectores de expresión MarEx (construidos y patentados por Celltrion, Inc.) de la siguiente manera. Después de reclonar, se usaron los vectores de expresión MarEx que contenían los genes de anticuerpo para producir anticuerpos requeridos para la prueba de microneutralización (prueba Mn) y la prueba de inhibición de hemaglutinación (prueba Hl).
Los vectores originales de pcADN que contienen cada uno de los genes de cadena pesada y los genes de cadena ligera de los seis anticuerpos seleccionados secundariamente fueron tratados con las
enzimas de restricción Nhe\ y Pme\ para obtener genes de cadena pesada y genes de cadena ligera. Se insertaron respectivamente los genes de cadena pesada y los genes de cadena ligera obtenidos en vectores pCT145 y en vectores pCT147, que habían sido tratados con las mismas enzimas de restricción. Se construyeron los vectores pCT145 y pCT147 por Celltrion, Inc., a fin de clonar la cadena pesada y la cadena ligera de cada uno de los anticuerpos, respectivamente (figura 2). A continuación, a fin de construir los vectores de expresión que contuvieran una unidad de transcripción de cadena pesada (gen-poli A promotor de cadena pesada) junto con una unidad de transcripción de cadena ligera (gen-poli A promotor de cadena ligera), se trataron los vectores pCT145 que contenían los genes de cadena pesada con las enzimas de restricción Pací y Asc\, para obtener unidades de transcripción de cadena pesada; y luego se trataron los vectores pCT147 que contenían los genes de cadena ligera con las mismas enzimas de restricción, y se insertaron en ellas las unidades de transcripción de cadena pesada. Luego se seleccionaron los vectores que contenían tanto la unidad de transcripción de cadena pesada como la unidad de transcripción de cadena ligera, usando enzimas de restricción (figura 3). Se extrajeron los vectores seleccionados usando un maxi equipo de plásmido Endofree (QIAGEN, Alemania, 12362), y se analizaron las secuencias de nucleótidos de las porciones de las muestras de ADN extraídas, determinándose de esa manera las secuencias de nucleótidos de los anticuerpos.
A continuación se transfectó el ADN de los anticuerpos extraídos en un cultivo de suspensión de una línea de células F2N (preparada por Celltrion , Inc., Corea), preparando de esa manera una línea de células transitoria que produce anticuerpos monoclonales. Se llevó a cabo la transfección de la siguiente manera: Se efectuó la transfección transitoria de las células usando el polímero catiónico FreeStyle™ Max (Invitrogen, E. U . A. , 1 6447-1 00) de acuerdo con el instructivo del fabricante. La víspera de la transfección se centrifugaron las células F2N cultivadas en medio EX-CELL 293 libre de suero (SAFC, LI K, 14571 C; en lo sucesivo denominado "medio EX-CELL 293") y se suspendieron a u na concentración de 1 x 1 06 células/mL en med io EX-CE LL 293 modificado (SAFC, LIK, 65237; preparado a la orden) y se sembraron 80 m L de la suspensión de células en un matraz Erlenmeyer de 250 mL, o se sembraron 200 m L de la suspensión de células en un matraz Erlenmeyer de 1 litro. El d ía de la transfección, en el caso en el que se sembró 80 m L de la suspensión de células, se diluyó cada uno de 100 pg de un ADN codificador de anticuerpo monoclonal y 100 pL de reactivo de Max FreeStyle™, a un volumen de 1 .6 m L, usando medio OptiPRO SFM I I , seguido por agitación moderada. En el caso en que se sembraron 200 m L de la suspensión de células, se mezcló cada uno de 250 pg de ADN y 250 pg de reactivo de Max FreeStyle™ diluido en él, con la solución que contenía el ADN diluido en ella, y se incubó la solución mezclada a la temperatura ambiente, durante 19 minutos. Durante la incubación a la temperatura
ambiente durante 19 minutos, se diluyeron las células F2N sembradas a una concentración de células de 0.8 x 106 células, usando medio EX-CELL modificado, fresco. Después de incubar durante 19 minutos se trataron las células F2N y se transfectaron con la solución mezclada que contenía ADN y reactivo de Max FreeStye™. El día después de la transfección se añadió la misma cantidad de medio EX-CELL 293 a las células transfectadas, que se incubaron luego durante 7-8 días, produciéndose de esa manera anticuerpos monoclonales.
Ejemplo 4: Examen de la actividad neutralizadora in vitro contra virus
Se sometieron los seis anticuerpos seleccionados en HA-ELISA a una prueba de microneutralización (MN) a fin de examinar su actividad neutralizadora contra varios virus de influenza.
Ejemplo 4-1: Cultivo de la línea de células MDCK y determinación de la concentración de virus
Se usó como línea de células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) la línea London (MDCK-L). Se cultivó la línea de células MDCK en una incubadora humidificada al 5 por ciento de C02, a 37 °C, usando un medio DMEM (Gibco, E. U. A., 119654) que contenía 10 por ciento de FBS (Atlas Biologicals, E. U. A., F0500A=, 1X de penicilina/estreptomicina (Gibco, E. U. A. 15140), 25 mM de HEPES (Gibco, E. U. A., 15630) y 2 mM de L-glutamina (Gibco, E. U. A., 25030).
Se cuantificó la concentración del virus mediante un método
ELISA basado en células para determinar la dosis infectiva del cultivo medio de tejido (TCID50). Se efectuó la determinación de la concentración de virus de la siguiente manera. Primero, se diluyó seriadamente al décuplo con un diiuyente de virus [DMEM (Gibco, E. U. A.), 3% de BSA (Gibco, E. U. A. 15260), 1X de penicilina /estreptomicina (Gibco, E. U. A.) y 25 mM de HEPES (Gibco, E. U. A.)] y se añadió a cada concavidad de una placa de 96 concavidades 100 µ?_ del virus diluido. Como control negativo se usó diiuyente de virus que no contenía virus. Entonces se separó la línea de células MDCK que se había estado cultivando, de la incubadora de cultivo, mediante tratamiento con tripsina, y después se trató con medio de cultivo MDCK para neutralizar la tripsina. Se lavaron entonces las pellas de células tres veces con salina regulada con fosfato; se diluyeron con un diiuyente de virus a una concentración de células de 5 x 105 células/mL. Se añadió 3 a 4 pg/mL de TPCK-tripsina (Sigma, E. U. A.) a la placa de 96 concavidades que contenía el virus; luego, inmediatamente, se añadió a cada concavidad de la placa 100 µ?_ de la línea de células MDCK y se incubó en una incubadora humidificada con 5% de C02 , a 37 °C durante 20 horas. Se lavó una vez la placa incubada con salina regulada con fosfato y después se añadió a cada concavidad de la placa 200 pl_ de una solución mezclada de acetona fría, salina regulada con fosfato (PBS) (80:20). A continuación se fijaron las células durante 8 minutos y se secó la placa a la temperatura ambiente durante 20 minutos. Se lavó dos veces cada concavidad de la placa con 200 pL de salina
regulada con fosfato. Se diluyó a 2000 veces el anticuerpo monoclonal de proteína antinuclear (N P) biotinilada (M ilipore, E . U . A. , AB8257B) con salina regulada con fosfato que conten ía 1 % de BSA (0.1 % de Tween 20) y se añadió a cada concavidad de la placa 100 pl_ de la dilución y se incubó a la temperatura ambiente durante una hora. Se lavó tres veces la placa con 200 pL/concavidad de salina regulada con fosfato y luego se añadió a cada concavidad de la placa 100 µ ?_ de una dilución a 20,000 veces del anticuerpo conjugado con estreptavidina-H RP en salina regu lada con fosfato que contenía 1 % de BSA y se incubó a la presión ambiente du rante 1 hora. Después de lavar la placa cuatro veces con salina regulada con fosfato se añadió a cada concavidad de la placa 1 00 µ ?_ de solución de OPD (Sigma, E . U . A. , P8287) y se reveló la placa a la temperatura ambiente durante 1 0 m inutos y se trató con 50 µ ?_ por concavidad de HCI 3M para detener el desarrollo de color; después de lo cual se m idió el OD490 de cada concavidad. Con base en el OD490 medido, se calculó el TC I D50 usando el método de Reed 6y Muench (The American 1938).
Ejem plo 4-2: Análisis MN
Se diluyó cada anticuerpo con un diluyente de virus, a una concentración de 10 pg/m L. A partir de esta concentración inicial, se diluyó seriadamente al doble la dilución de anticuerpo con u n diluyente de virus, y se añadió a cada concavidad de u na placa de 96 concavidades, 50 µ ?_ de cada una de las diluciones. También se añadieron 50 µ?_ de virus a cada concavidad de la placa, a una
concentración que corresponde a 1 00 TCI D50 y se incubaron en u na incubadora humidificada al 5 por ciento de C02, a 37 °C durante una hora. Luego se añadió 3 a 4 pg/m L de TPCK-tripsina (Sigma, E. U. A. , T1426) a cada concavidad y se añadió a cada concavidad 1 00 µ ?_ de las células MDCK tratadas, seg uidas por incubación en u na incubadora hum idificada, con 5% de C02, a 37 °C, durante 20 horas. Después de incubar d urante 20 horas se llevó a cabo un análisis M N de acuerdo con el m ismo método que el método de cuantificación de virus descrito en el ejemplo 4-1 , determ inando de esa manera el valor OD490 de cada concavidad. Se determinó que estaban infectadas con virus las concavidades q ue m uestran valores OD490 superiores al de la concavidad en la que sólo se introd ujeron las células. Entre los valores OD490 para cada anticuerpo a los q ue no se detectó antígeno de virus, se muestra a continuación en la tabla 1 la concentración más baja (pg/m L) del anticuerpo, y la concentración más baja del anticuerpo significa una actividad neutralizadora mayor contra el virus.
Tabla 1 : Resultados del análisis de m icroneutralización (análisis MN) efectuado usando anticuerpos seleccionados y varios tipos de virus H3N2.
* U nidad : g/m L
Como se puede ver de los resultados de los análisis M N de seis anticuerpos candidatos contra los virus de influenza del subtipo H3, el anticuerpo CT129 mostró g ran afinidad de un ión en HA-E LISA, pero no mostró actividad neutralizadora contra los tres tipos de virus usados en los análisis. El anticuerpo CT135 m ostró actividad neutralizadora contra dos tipos de virus H3N2 (A/H ong Kong/68 y A/Brisbane/10/07) y los anticuerpos CT147, CT149, CT1 64 y CT1 66 mostraron actividad neutralizadora contra tres clases de virus H3N2 (A/Wisconsin/67/05, A/Hong King/68 y A/Brisbane/1 0/07).
Entre los anticuerpos mencionados arriba , se seleccionó el anticuerpo CT149 y se analizaron sus actividades neutralizadoras contra varios tipos de virus de influenza, mediante u n análisis M N (tabla 2).
Tabla 2: Resultados del análisis de m icroneutralización (anál isis MN) efectuado usando el anticuerpo seleccionado y varios tipos de virus
Como se puede ver en la tabla 2 anterior, el anticuerpo CT149 mostró actividad neutralizadora contra los virus de influenza del subtipo H 1 N 1 , H5N 1 , H7N2, H9N2 y H3N2, usados en el análisis M N . Ejem plo 5: Examen de la capacidad del anticuerpo para inhibir la reacción de hemaglutinación provocada por virus
Se diluyó seriadamente un anticuerpo al doble en una placa de 96 concavidades, con fondo en V, y se añadieron al anticuerpo virus que ten ían unidades HA cuádruples, y se mezclaron con él . A continuación se incubó a la temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se añadieron a cada concavidad de la placa 1 por ciento de células de glóbulos rojos de aves. Se determinó el punto final de inhibición de la hemaglutinación a la concentración más baja de anticuerpo a la que no se observó reacción de hemaglutinación .
Como resultado, todos los anticuerpo probados no in h ibieron la hemaglutinación para el virus del subtipo H3N2 (A/Brisbane/1 0/07) usando en la prueba, ni siquiera a concentraciones elevadas (>20 g/m L) (Tabla 3).
Tabla 3: Resultados de la prueba de inhibición de la hemaglutinación para anticuerpos seleccionados contra el virus del subti po H3N2.
Ejem plo 6; Examen de los efectos preventivos y terapéuticos del anticuerpo contra virus de influenza en experimento animal Ejem plo 66-1 : Examen de los efectos preventivos y terapéuticos del anticuerpo contra virus de influenza en ratones
A fin de examinar si el anticuerpo CT149 tiene efectos preventivos y terapéuticos contra el virus H3N2 en ratones, se llevó a cabo el siguiente experimento. Cada grupo que consistía de cinco ratones fue infectado intranasalmente con 10 LD50 del virus A/Hong Kong/68. Se administró el anticuerpo CT149 a ratones mediante inyección intraperitoneal en una cantidad de 1 0 o 20 mg/kg a las 24 horas antes de la infección viral, o a las 24 horas o 48 horas después de la infección viral.
Como resultado, como se m uestra en la figura 4, en el caso del grupo de control negativo, todos los ratones del grupo de control negativo m urieron antes de 1 1 días después de la infección viral, mientras que, en el caso del grupo inyectado con 1 0 mg/kg o 20 mg/kg del anticuerpo CT149 24 horas o 48 horas después de la infección viral, todos los ratones sobrevivieron, lo que sugiere que el anticuerpo CT149 tiene efecto preventivo contra la infección viral. En el caso en que se inyectó el anticuerpo CT149 después de la infección viral a fin de confirmar el efecto terapéutico del anticuerpo, cuando se inyectaron los ratones con 10 mg/kg del anticuerpo 48 horas después de la infección viral, el 20 por ciento de los ratones murió, y cuando se inyectó en los ratones 1 0 mg/kg del anticuerpo 24
horas después de la infección viral, o con 20 mg/kg del anticuerpo 48 horas después de la infección viral, todos los ratones sobrevivieron, lo q ue sugiere que el anticuerpo CT149 tiene un efecto terapéutico contra la infección viral.
Ejem plo 6-2: Examen del efecto terapéutico del anticuerpo contra el virus de la influenza en hurones
Los hu rones muestran sensibilidad y síntomas sim ilares a los de los humanos, al virus de la influenza y, por lo tanto, son usados frecuentemente en estud ios sobre el virus de la influenza. Así, se llevó a cabo el siguiente experimento usando hurones a fin de exam inar si el anticuerpo CT149 tiene efectos terapéuticos contra los virus H3N2 y H5N 1 .
Cada grupo de prueba estuvo formado por 9 hurones. Se infectó la cavidad nasal y el órgano nasa de cada hurón con 1 x 1 06 EID50/m L de virus de influenza H3N2 (A/Hongkong/68) o 1 x 1 02 EI D50/m L de virus de influenza H5N 1 (A/Vietnam/1 203/04). Un día después de la infección viral se inyectó intravenosamente cada h u rón con 30 mg/kg del anticuerpo CT-P6 de control negativo (independientemente del virus de la influenza) o 1 5 mg/kg o 30 mg/kg del anticuerpo CT149, o intravenosamente con 30 mg/kg del anticuerpo CT149 una vez al día durante 3 días.
Se recogió el lavado nasal 1 , 3, 5, 7 y 9 días después de la infección viral, de los hurones de cada grupo de prueba, usando 1 ml_ de PGS que contenía antibiótico. Tres, 5 y 9 días después de la infección viral, se sacrificó tres hurones de cada grupo, y se extrajo
el tejido pulmonar y se midió su concentración viral, usando huevos fértiles. Para efectuar una prueba de titulación de virus usando huevos fértiles, se centrifugó el lavado nasal y se añadió 1 g de tejido pulmonar de hurón a 1 mL de PBS que contenía antibiótico, se descompuso y se centrifugó. Se diluyó seriadamente cada uno de los sobrenadantes con el décuplo de PBS que contenía antibiótico. Se infectaron huevos fértiles de 10 a 13 días de antigüedad con el sobrenadante y se los incubó durante 48 horas. Luego se mezcló 50 pL del fluido alantoico recogido de los huevos, con la misma cantidad de glóbulos rojos de la sangre al 0.5 por ciento, y se incubó la mezcla durante 30 minutos, y luego se tituló con el virus mediante aglutinación de la sangre.
Se midieron los títulos virales en los animales de prueba (hurones) a los que se administró control negativo (CT-P6) y CT149 a las 24 horas después de la infección con el virus de la influenza H3N2 (A/Hongkong/68). Como resultado, en el caso del grupo de control negativo, se observó un título viral de alrededor de log 4 EID50/mL o mayor un día después de la infección viral, y se mantuvieron o se incrementaron los títulos virales en el lavado nasal y en el tejido pulmonar hasta 5 días después de la infección. Sin embargo, 7 días después de la infección viral no se detectó ningún virus en el grupo de control. El grupo al que se administró CT149 mostró un título viral similar al del grupo de control negativo el día uno después de la infección viral; pero el título viral en el grupo tratado con CT149 comenzó a disminuir después de 3 días y no se
detectó ningún virus en el grupo tratado con CT149 el día 9, lo q ue indica que se eliminó rápido el virus en el grupo tratado con CT149. En particular, el título viral en el tejido pulmonar disminuyó más rápido a medida que se incrementó la cantidad de anticuerpo administrada (figura 5).
Se m idieron los títulos virales en los animales de prueba (hurones) a los que se adm inistró el control negativo (CT-P6) y CT149 a las 24 horas después de la infección con el virus de influenza H5N 1 (A/Vietnam/1 203/04). Como resultado, en el caso del grupo de control negativo, se observó un título viral de alrededor de log 2.4 EI D50/m L o más un día después de la infección viral, y los títulos virales en el lavado nasal y el tejido pulmonar aumentaron hasta 5 días después de la infección viral. A los 5 días después de la infección viral solamente uno de seis hu rones del grupo de control sobrevivió y, por lo tanto, se midió el título de virus en el lavado nasal en sólo un hurón a los 5 d ías. A los 9 días después de la infección viral todos los hurones del grupo de control habían m uerto y, por lo tanto, no se pudo medir el título viral. En el grupo al q ue se adm inistró CT149, el título de virus comenzó a descender desde los 3 d ías después de la infección viral, y no se detectaron virus a los 9 días, lo que indica que se eliminó rápido el virus. También el título viral del g rupo al que se admin istró CT149 d isminuyó más rápido a medida que aumentó la cantidad de anticuerpo adm inistrado. Además, en el grupo al que se administró 1 5 mg/kg de T149 sólo un hurón murió a los 7 días después de la infección viral, lo que sugiere
que CT149 tiene efecto terapéutico contra el virus de la influenza.
Claims (45)
1. Una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A.
2. La molécula de unión de la reivindicación 1, en la que la molécula de unión se deriva de células B, presentes en la sangre de pacientes que se recuperaron de infección con el virus de la influenza A.
3. La molécula de unión de la reivindicación 2, en la que el virus de la influenza A es cualquiera seleccionado del grupo formado por los subtipos H1, H3, H5, H7 y H9.
4. Una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, que comprende una secuencia de polipéptidos de cadena ligera; una cadena ligera que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, cualquier región CDR1 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polipéptidos indicadas en SEQ ID NOS: 1, 7, 13 y 15; cualquier región CDR2 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polipéptido indicadas en SEQ ID NOS: 2, 8 y 16, y cualquier región CDR3 seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de polipéptidos indicadas en SEQ ID NOS: 3 o 9.
5. Una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, que comprende la siguiente secuencia de polipéptidos de cadena pesada: una cadena pesada que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, cualquier región CDR1 seleccionada el grupo formado por las secuencias de polipéptido indicadas en SEQ ID NOS: 4 o 10; cualquier región CDR2 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polipéptido indicadas en SEQ ID NOS: 5, 11, 14 y 17; y cualquier región CDR3 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polipéptido indicadas en SEQ ID NOS: 6 o 12.
6. Una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, que comprende las siguientes secuencias de polipéptido de cadena ligera y de cadena pesada: una cadena ligera que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, cualquier región CDR1 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polipéptido indicadas en SEQ ID NOS: 1, 7, 13 y 15; cualquier región CDR2 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polipéptido indicadas en SEQ ID NOS: 2, 8 y 16; y cualquier región CDR3 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polipéptido indicadas en SEQ ID NOS: 3 o 9; y una cadena pesada que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, cualquier región CDR1 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polipéptido indicadas en SEQ ID NOS: 4 o 10; cualquier región CDR2 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polipéptido indicadas en SEQ ID NOS: 5, 11, 14 y 17; y cualquier región CDR3 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polipéptido indicadas en SEQ ID NOS: 6 o 12.
7. Una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, que comprende cualquier secuencia de polipéptidos seleccionada del grupo que consiste de las siguientes secuencias de polipéptido: una molécula de unión formada por una cadena ligera que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1 indicada en SEQ ID NO: 1; una región CDR2 indicada en SEQ ID NO: 2 y una región CDR3, indicada en SEQ ID NO: 3; y una cadena pesada que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR1 indicada en SEQ ID NO: 4; una región CDR2 indicada en SEQ ID NO: 5 y una región CDR3 indicada en SEQ ID NO: 6; una molécula de unión formada por una cadena ligera que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR1 indicada en SEQ ID NO: 7; una región CDR2 indicada en SEQ ID NO: 8 y una región CDR3 indicada en SEQ ID NO: 9; y una cadena pesada que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR1 indicada en SEQ ID NO: 10, una región CDR2 indicada en SEQ ID NO: 11 y una región CDR3, indicada en SEQ ID NO: 12; una molécula de unión compuesta por una cadena ligera que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR1 indicada en SEQ ID NO: 13; una región CDR2 indicada en SEQ ID NO: 8, y una región CDR3 indicada en SEQ ID NO: 9; y una cadena pesada que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, una región indicada en SEQ ID NO: 13, una región CDR2 indicada en SEQ ID NO: 8 y una región CDR3 indicada en SEQ ID NO: 9, y una cadena pesada que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR1 indicada en SEQ ID NO: 10; una región CDR2 indicada en SEQ ID NO: 14 y una región CDR3 indicada en SEQ ID NO: 6; y una molécula de unión compuesta por una cadena ligera que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR1, indicada en SEQ ID NO: 15; una región CDR2 indicada en SEQ ID NO: 16 y una región CDR3 indicada en SEQ ID NO: 9, y una cadena pesada que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR1 indicada en SEQ ID NO: 10, una región CDR2 indicada en SEQ ID NO: 17 y una región CDR3 indicada en SEQ ID NO: 12.
8. La molécula de unión de la reivindicación 7, en la que la molécula de unión está compuesta por una cadena ligera que comprende una secuencia de polipéptido indicada en SEQ ID NO: 37; y una cadena pesada que comprende una secuencia de polipéptido indicada en SEQ ID NO: 38.
9. La molécula de unión de la reivindicación 7, en la que la molécula de unión está compuesta de una cadena ligera que comprende una secuencia de polipéptido indicada en SEQ ID NO: 3 y una cadena pesada que comprende una secuencia de polipéptido indicada en SEQ ID NO: 40.
10. La molécula de unión de la reivindicación 7, en la que la molécula de unión está compuesta por una cadena ligera que comprende una secuencia de polipéptido indicada en SEQ ID NO: 41 y una cadena pesada que comprende una secuencia de polipéptido indicada en SEQ ID NO: 42.
11. La molécula de unión de la reivindicación 7, en la que la molécula de unión está compuesta por una cadena ligera que comprende una secuencia de polipéptido indicada en SEQ ID NO: 43 y una cadena pesada que comprende una secuencia de polipéptido indicada en SEQ ID NO: 44.
12. La molécula de unión de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en la que la molécula de unión tiene actividad neutralizadora contra cualquier virus de influenza A seleccionado del grupo que consiste de los subtipos H1, H3, H5, H7 y H9 del virus de la influenza A.
13. Una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, que comprende la siguiente secuencia de polinucleótidos de cadena ligera: una cadena ligera que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, cualquier región CDR1 seleccionada del grupo que consiste de secuencias de polinucleótido indicadas en SEQ ID NOS: 18, 24, 30 y 34; cualquier región CDR2 seleccionada del grupo formado por secuencias de polinucleótido indicadas en SEQ ID NOS: 19, 25 y 35; y cualquier región CDR3 seleccionada del grupo formado por secuencias de polinucleótido indicadas en SEQ ID NOS: 20 o 26.
14. Una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, que comprende la siguiente secuencia de polinucleótido de cadena pesada: una cadena pesada que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, cualquier región CDR1 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polinucleótido indicadas en SEQ ID NOS: 21, 27 y 3; cualquier región CDR2 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polinucleótido indicadas en SEQ ID NOS: 22, 28, 32 y 36; y cualquier región CDR3 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polinucleótido indicadas en SEQ ID NOS: 23, 29 y 33.
15. Una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, que comprende las siguientes secuencias de polinucleótido de cadena ligera y de cadena pesada: una cadena ligera que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, cualquier región CDR1 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polinucleótido indicadas en SEQ ID NOS: 18, 24, 30 y 34; cualquier región CDR2 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polinucleótido indicadas en SEQ ID NOS: 19, 25 y 35, y cualquier región CDR3, seleccionada del grupo formado por las secuencias de polinucleótido indicadas en SEQ ID NOS: 20 o 26; y una cadena pesada que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, cualquier región CDR1 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polinucleótido indicadas en SEQ ID NOS: 21, 27 y 31; cualquier región CDR2 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polinucleótido indicadas en SEQ ID NOS: 22, 28, 32 y 36; y cualquier región CDR3 seleccionada del grupo formado por las secuencias de polinucleótido indicadas en SEQ ID NOS: 23, 29 y 33.
16. Una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, que comprende cualquier secuencia de polinucleótido seleccionada del grupo formado por las siguientes secuencias de polinucleótido: una molécula de unión compuesta por una cadena ligera que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método de Kabat, una región CDR1, indicada en SEQ ID NO: 18, una región CDR2 indicada en SEQ ID NO. 19 y una región CDR3 indicada en SEQ ID NO: 20; y una cadena pesada que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR1 indicada en SEQ ID NO: 21; una región CDR2 indicada en SEQ ID NO: 22; y una región CDR3 indicada en SEQ ID NO: 23; una molécula de unión compuesta por una cadena ligera que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR1 indicada en SEQ ID NO: 24; una región CDR2 indicada en SEQ ID NO: 25 y una región CDR3, indicada en SEA ID NO: 26; y una cadena pesada que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR1 indicada en SEQ ID NO: 27; una región CDR2 indicada en SEQ ID NO: 28, y una región CDR3 indicada en SEQ ID NO: 29; una molécula de unión compuesta por una cadena ligera que comprende, cuando se determina de acuerdo con el método Rabat, una región CDR 1 indiada en SEQ I D NO: 30, una región CDR2 indicada en SEQ I D NO: 25 y una región CDR3 indicada en S EQ I D NO: 26; y una cadena pesada que comprende, cuando se determ ina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR1 indicada en SEQ ID NO: 31 , una región CDR2 indicada en SEQ I D NO: 32 y una región CDR3 indicada en SEQ I D NO: 33; y una molécula de u nión compuesta por una cadena ligera que comprende, cuando se determ ina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR 1 indicada en SEQ ID NO: 34, una región CDR2 indicada en SEQ I D NO: 35 y una región CDR3 indiada en S EQ I D NO: 26; y una cadena pesada que comprende, cuando se determ ina de acuerdo con el método Kabat, una región CDR1 indicada en SEQ ID NO: 31 ; u na región CDR2 indicada en SEQ ID NO: 36; y una región CDR3, indicada en SEQ I D NO 29.
1 7. La molécula de unión de la reivindicación 1 6, en la que la molécula de unión está compuesta por una cadena ligera q ue comprende una secuencia de polinucleótido indicada en SEQ I D NO: 45 y una cadena pesada que comprende una secuencia de polinucleótido indicada en SEQ I D NO: 46
1 8. La molécula de unión de la reivindicación 1 6, en la que la molécula de unión está compuesta por una cadena ligera que comprende una secuencia de polin ucleótido indicada en S EQ I D NO: 47 y una cadena pesada que comprende una secuencia de polinucleótido indicada en SEQ ID NO: 48.
19. La molécula de unión de la reivindicación 16, en la que la molécula de unión está compuesta por una cadena ligera que comprende una secuencia de polinucleótido indicada en SEQ ID NO: 49 y una cadena pesada que comprende una secuencia de polinucleótido indicada en SEQ ID NO: 50.
20. La molécula de unión de la reivindicación 16, en la que la molécula de unión está compuesta por una cadena ligera que comprende una secuencia de polinucleótido indicada en SEQ ID NO. 51 y una cadena pesada que comprende una secuencia de polinucleótido indicada en SEQ ID NO: 52.
21. La molécula de unión de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en la que la molécula de unión tiene actividad neutralizadora contra cualquier virus seleccionado del grupo formado por los subtipos H1, H3, H5, H7 y H9 del virus de la influenza A.
22. La molécula de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 a 7 y 13 a 16, en la que la molécula de unión es un anticuerpo.
23. La molécula de unión de la reivindicación 22, en la que el anticuerpo es un fragmento Fab, un fragmento Fv, un diacuerpo, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
24. Una molécula de ácido nucleico aislada, que codifica una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de influenza A, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 a 7 y 13 a 16.
25. Un vector de expresión que tiene insertada en él la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 24.
26. Una línea de células que produce una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A; Iqa línea de células comprende un vector de expresión de la reivindicación 25 transfectado en una célula huésped.
27. La línea de células de la reivindicación 26, en la que la célula huésped está seleccionada del grupo que consiste de células CHO, células F2N, células BHK, células SP2/0, células NSO y células HEK293.
28. Un método para seleccionar una molécula de unión, que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, a partir de pacientes infectados con el virus de la influenza A; el método comprende los pasos de: 1) seleccionar un paciente cuya sangre sea negativa para el virus de la influenza A, de entre pacientes infectados con el virus de la influenza A; 2) recolectar sangre del paciente seleccionado en el paso 1); 3) aislar las células B de la sangre del paciente recolectada en el paso 2); 4) seleccionar las células B que produzca una molécula de unión que se una a la hemaglutinina (HA) de entre las células B aisladas en el paso 3); 5) extraer los ARN de las células B seleccionadas en el paso 4); 6) amplificar los genes de la molécula de unión a partir de los ARN extraídos en el paso 5); 7) clonar los genes amplificados en el paso 6), en vectores de expresión; 8) transfectar los vectores de expresión del paso 7) en células huéspedes; 9) seleccionar las moléculas de unión que se unan a HA, a partir de moléculas de unión derivadas de las células transfectadas preparadas en el paso 8); 10) preparar y cultivar una línea de células para las moléculas de unión seleccionadas; 11) purificar las moléculas de unión que se unen a la HA del virus de la influenza A, a partir del cultivo de células del paso 10); 12) reconfirmar si las moléculas de unión purificadas en el paso 11) tienen actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A; y 13) volver a seleccionar una molécula de unión que se haya confirmado que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, en el paso 12).
29. El método de la reivindicación 28, en el que la molécula de unión es un anticuerpo.
30. El método de la reivindicación 29, en el que el anticuerpo es un fragmento Fab, un fragmento Fv, un diacuerpo, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o u n anticuerpo humano.
31 . El método de la reivindicación 28, en el que el virus de la influenza A es seleccionado del grupo formado por los subtipos H 1 , H3, H5, H7 y H9.
32. Una composición que comprende una molécula de u n ión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 4 a 7 y 1 3 a 1 6.
33. U na composición para prevenir y tratar una enfermedad provocada por un virus de influenza A; la composición comprende: una molécu la de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 4 a 7 y 1 3 a 16.
34. U na composición para diagnosticar un virus de influenza A; la com posición comprende un conjugado que comprende una etiqueta enlazada a una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 4 a 7 y 1 3 a 16.35.
35. La composición de la reivind icación 34, en la que la etiqueta es cualquiera seleccionada del grupo formado por enzimas, luciferasas, isótopos radiactivos y toxina.
36. U n método para tratar una enfermedad provocada por un virus de influenza A; el método comprende adm inistrar a un sujeto que tenga la enfermedad, una cantidad eficaz en términos terapéuticos de una molécula de unión que tenga actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 a 7 y 13 a 16.
37. El método de la reivindicación 36, en el que el virus de la influenza A es seleccionado del grupo que consiste de los subtipos H1, H3, H5, H7 y H9.
38. Un método para prevenir una enfermedad provocada por el virus de la influenza A; el método comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz en términos terapéuticos, de una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 a 7 y 13 a 16.
39. El método de la reivindicación 38, en el que el virus de la influenza A es seleccionado del grupo formado por los subtipos H1, H3, H5, H7 y H9.
40. Un método para diagnosticar infección por virus de influenza A en un paciente; el método comprende los pasos de: 1) llevar una muestra hasta contacto con una molécula de unión que tenga actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 a 7 y 13 a 16; y 2) detectar una reacción entre la molécula de unión y la muestra.
41. Un método para diagnosticar una infección por virus de influenza A en un paciente; el método comprende los pasos de: 1) llevar una muestra hasta contacto con la composición de la reivindicación 34; y 2) detectar u na reacción entre la composición y la muestra en el paso 1 ).
42. El método de la reivindicación 40 o 41 , en el que el virus de la influenza A es seleccionado del grupo formado por los subtipos H 1 , H3, H5, H7 y H9.
43. U n equipo para diagnosticar un virus de la influenza A, que comprende: 1 ) una molécula de unión que tiene actividad neutralizadora contra el virus de la influenza A, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 4 a 7 y 1 3 a 16; y 2) un contenedor.
44. U n equ ipo para diagnosticar un virus de la influenza A, que comprende: 1 ) una composición para diagnosticar el virus de la influenza A de acuerdo con la reivindicación 34; y 2) un contenedor.
45. El método de la reivindicación 43 o 44, en el q ue el virus de la influenza A es seleccionado del grupo formado por los subtipos H 1 , H3, H5, H7 y H9.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20110099646 | 2011-09-30 | ||
| PCT/KR2012/007835 WO2013048153A2 (ko) | 2011-09-30 | 2012-09-27 | 인간 ｂ 세포에서 생산된 인플루엔자 ａ 바이러스 중화 활성을 가지는 결합 분자 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| MX2014003745A true MX2014003745A (es) | 2014-07-22 |
| MX350282B MX350282B (es) | 2017-09-01 |
Family
ID=47996632
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| MX2014003745A MX350282B (es) | 2011-09-30 | 2012-09-27 | Molecula de union que tiene actividad neutralizadora del virus de la influenza a, producida a partir de celulas b humanas. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9475861B2 (es) |
| EP (1) | EP2762491B1 (es) |
| JP (1) | JP5998222B2 (es) |
| KR (1) | KR101514682B1 (es) |
| CN (1) | CN104011077B (es) |
| AU (1) | AU2012316930B2 (es) |
| CA (2) | CA2850720C (es) |
| EA (1) | EA026527B1 (es) |
| ES (1) | ES2641257T3 (es) |
| IL (1) | IL231779B (es) |
| MX (1) | MX350282B (es) |
| WO (1) | WO2013048153A2 (es) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9969794B2 (en) | 2012-05-10 | 2018-05-15 | Visterra, Inc. | HA binding agents |
| KR20140118682A (ko) * | 2013-03-29 | 2014-10-08 | (주)셀트리온 | 2 이상의 인플루엔자 ａ 바이러스 중화 결합 분자를 포함하는 조성물 |
| CN104892753B (zh) * | 2014-03-07 | 2019-11-29 | 神州细胞工程有限公司 | 一种中和人感染h7n9甲型流感病毒的抗体及其用途 |
| JPWO2016010160A1 (ja) * | 2014-07-18 | 2017-06-01 | 国立感染症研究所長 | 抗インフルエンザウイルス抗体及びその利用 |
| US20180008702A1 (en) * | 2014-12-05 | 2018-01-11 | Celltrion Inc. | Adjuvant composition containing at least one influenza virus neutralizing and binding molecule and vaccine composition containing same |
| WO2016089181A1 (ko) * | 2014-12-05 | 2016-06-09 | (주)셀트리온 | 1 이상의 인플루엔자 바이러스 중화 결합 분자를 포함하는 애주번트 조성물 및 이를 포함하는 백신 조성물 |
| CN107750253B (zh) * | 2015-04-08 | 2022-10-04 | 达纳－法伯癌症研究所公司 | 人源化流感单克隆抗体及其使用方法 |
| WO2017083627A1 (en) | 2015-11-13 | 2017-05-18 | Visterra, Inc. | Compositions and methods for treating and preventing influenza |
| US10877021B2 (en) * | 2016-04-21 | 2020-12-29 | Osaka University | Device for biological material detection, detection apparatus for biological material detection, method for measuring ion current, and method for identifying biological material |
| WO2018030777A1 (ko) * | 2016-08-10 | 2018-02-15 | ㈜셀트리온 | 항-인플루엔자 바이러스 항체의 안정한 액체 약제학적 제제 |
| KR102320280B1 (ko) * | 2018-05-31 | 2021-11-29 | 주식회사 센트릭스바이오 | CD300c의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
| KR20200060969A (ko) * | 2018-11-23 | 2020-06-02 | (주)셀트리온 | 인플루엔자 바이러스 질환을 치료하기 위한 투여 요법 |
| EP3946613A1 (en) | 2019-03-25 | 2022-02-09 | Visterra, Inc. | Compositions and methods for treating and preventing influenza |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2008134426A (ru) | 2006-01-26 | 2010-03-10 | ЭйчИкс ДИАГНОСТИКС, ИНК. (US) | Моноклональные антитела, связывающиеся с вирусом птичьего гриппа |
| WO2007134327A2 (en) * | 2006-05-15 | 2007-11-22 | Sea Lane Biotechnologies, Llc. | Neutralizing antibodies to influenza viruses |
| US8148085B2 (en) * | 2006-05-15 | 2012-04-03 | Sea Lane Biotechnologies, Llc | Donor specific antibody libraries |
| CN102046656A (zh) * | 2008-03-28 | 2011-05-04 | 航道生物技术有限责任公司 | 针对病毒抗原的中和性分子 |
| MX2011000768A (es) * | 2008-07-25 | 2011-10-05 | Inst Research In Biomedicine | Anticuerpos neutralizantes del virus anti-influenza a y usos de los mismos. |
| CN102482345A (zh) | 2009-05-13 | 2012-05-30 | 航道生物技术有限责任公司 | 针对流感病毒的中和分子 |
| AU2011210840B2 (en) * | 2010-01-27 | 2014-12-11 | Massachusetts Institute Of Technology | Engineered polypeptide agents for targeted broad spectrum influenza neutralization |
| CN102791734B (zh) | 2010-03-08 | 2014-10-15 | 赛特瑞恩股份有限公司 | 源自人b细胞且具有抗甲型流感病毒的中和活性的人单克隆抗体 |
| WO2012009790A1 (en) * | 2010-07-22 | 2012-01-26 | Schrader John W | Cross-protective pathogen protection, methods and compositions thereof |
| AU2012205663B2 (en) * | 2011-01-10 | 2017-02-02 | Emory University | Antibodies directed against influenza |
-
2012
- 2012-09-27 CA CA2850720A patent/CA2850720C/en active Active
- 2012-09-27 MX MX2014003745A patent/MX350282B/es active IP Right Grant
- 2012-09-27 US US14/348,284 patent/US9475861B2/en active Active
- 2012-09-27 EP EP12835569.0A patent/EP2762491B1/en active Active
- 2012-09-27 CN CN201280047234.0A patent/CN104011077B/zh active Active
- 2012-09-27 WO PCT/KR2012/007835 patent/WO2013048153A2/ko active Application Filing
- 2012-09-27 JP JP2014533206A patent/JP5998222B2/ja active Active
- 2012-09-27 AU AU2012316930A patent/AU2012316930B2/en active Active
- 2012-09-27 EA EA201400274A patent/EA026527B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2012-09-27 ES ES12835569.0T patent/ES2641257T3/es active Active
- 2012-09-27 KR KR1020120107512A patent/KR101514682B1/ko active IP Right Grant
- 2012-09-27 CA CA2900712A patent/CA2900712A1/en not_active Abandoned
-
2014
- 2014-03-27 IL IL231779A patent/IL231779B/en active IP Right Grant
-
2016
- 2016-09-08 US US15/259,823 patent/US9856312B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2014530008A (ja) | 2014-11-17 |
| EP2762491B1 (en) | 2017-07-05 |
| EA026527B1 (ru) | 2017-04-28 |
| ES2641257T3 (es) | 2017-11-08 |
| MX350282B (es) | 2017-09-01 |
| US9856312B2 (en) | 2018-01-02 |
| EA201400274A1 (ru) | 2014-09-30 |
| KR101514682B1 (ko) | 2015-04-23 |
| CA2900712A1 (en) | 2013-04-04 |
| EP2762491A2 (en) | 2014-08-06 |
| KR20130035916A (ko) | 2013-04-09 |
| CN104011077B (zh) | 2017-06-20 |
| US9475861B2 (en) | 2016-10-25 |
| CA2850720C (en) | 2016-03-29 |
| JP5998222B2 (ja) | 2016-09-28 |
| IL231779B (en) | 2019-01-31 |
| WO2013048153A3 (ko) | 2013-05-23 |
| EP2762491A4 (en) | 2015-05-20 |
| US20170037113A1 (en) | 2017-02-09 |
| AU2012316930A1 (en) | 2014-04-17 |
| IL231779A0 (en) | 2014-05-28 |
| CA2850720A1 (en) | 2013-04-04 |
| WO2013048153A2 (ko) | 2013-04-04 |
| AU2012316930B2 (en) | 2016-06-09 |
| CN104011077A (zh) | 2014-08-27 |
| US20140234336A1 (en) | 2014-08-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9856312B2 (en) | Binding molecule having influenza A virus-neutralizing activity produced from human B cell | |
| US9573991B2 (en) | Human monoclonal antibodies derived from human B cells and having neutralizing activity against influenza A viruses | |
| EP3011968B1 (en) | Composition comprising at least two influenza a virus-neutralizing-binding molecules | |
| US20130289246A1 (en) | Influenza virus antibodies and immunogens and uses therefor | |
| Huang et al. | Structure–function analysis of neutralizing antibodies to H7N9 influenza from naturally infected humans | |
| EP2207804B1 (en) | Monoclonal antibodies specific to hemagglutinin from influenza virus h5-subtype and uses thereof | |
| KR20140112495A (ko) | 인플루엔자 a 바이러스 특이적 항체 | |
| SG183031A1 (en) | Monoclonal antibodies specific to hemagglutinin and neuraminidase from influenza virus h5-subtype or n1-subtype and uses thereof | |
| CN103030693B (zh) | 高致病性禽流感的中和分子及其制备方法 | |
| US9834594B2 (en) | Human monoclonal antibodies derived from human B cells and having neutralizing activity against influenza A viruses |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Grant or registration |