CN104011077A - 从人b细胞产生的具有甲型流感病毒中和活性的结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及产生于人B细胞的具有甲型流感病毒中和活性的结合分子，根据本发明的具有甲型流感病毒中和活性的结合分子是这样的结合分子，其产生自从感染甲型流感病毒之患者的血液中选择的B细胞，并且具有针对甲型流感病毒的中和活性，因而可用于预防和治疗来源于甲型流感病毒的疾病，并且可用于通过使用根据本发明的结合分子来诊断流感病毒。

Description

从人B细胞产生的具有甲型流感病毒中和活性的结合分子
技术领域
本发明涉及具有针对甲型流感病毒之中和活性的人单克隆抗体，其来源于人B细胞，所述人B细胞选择自从甲型流感病毒的感染中恢复的患者的血液。
背景技术
流感是由流感病毒的呼吸系统感染引起的疾病，常发生在冬季。已知流感具有很高的感染性，并且影响所有年龄组，特别是老年人(Treanor J，2004，N Engl J Med.350(3)：218-20)。流感病毒是包膜的RNA(核糖核酸)病毒，属于正粘病毒(Orthomyxoviridae)科，具有由八个反义单链RNA(核糖核酸)区段构成的基因组。这些流感病毒被划分为甲型、乙型和丙型。根据其主要表面蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，甲型流感病毒被进一步划分为亚型。到目前为止，已经鉴别了16种HA和9种NA(Cheung TK和Poon LL2007，Ann N YAcad Sci1102：1-25)。流感病毒可根据其类型影响鸟、猪和人，并且具有由RNA区段构成的基因组，因为这个原因，其基因可连续地突变和重组，产生新的遗传改变(Treanor J，2004.N Engl J Med.350(3)：218-20)。由于这种连续的突变，难以获得针对流感病毒的永久免疫力，因此目前被认为最有效的预防方法是这样的方法，每年施用针对预计将流行之特定类型的流感病毒的疫苗以每年产生针对流感病毒的免疫力。
针对流感病毒的疫苗通常使用卵产生，但该生产方法是耗时且低效的方法。因此，该方法的问题在于难以每年在有限的时间框架内生产足够量的疫苗。为了解决这一问题，几家药物公司(GSK、Baxter等)已经积极地进行了通过细胞培养产生疫苗的方法的研究。此外，如果发生流感病毒感染大流行，则在短时间内开发针对感染的疫苗是非常困难的。而且，由于与耐药性突变病毒出现相关的问题，抗病毒药物并非完全可靠的。
为了克服这个问题，最近已积极地开发了针对流感病毒的抗体(Throsby等，2008，PloS One3(e3942)；Sui等，2009，Nature structural &molecular biology16(265-273)；Simmons等，2007，PloS Medicine4(e178)；Wrammert等，2011，J Exp Med.208(181-193)；Corti等，2011，Science333(850-856))。
来自恢复患者的血液产物已经被用于治疗感染多种病毒的患者，以及用于治疗流感感染大流行。例如，当感染西班牙流感病毒的患者具有肺炎症状时，收集自从流感病毒感染恢复之患者的血液产物被用于治疗流感病毒(Luke等，2006.Annals ofinternal medicine.145：599)。因此，从人血浆中纯化超免疫球蛋白(IgIv)并用于治疗感染多种病毒的患者，但如上所述获得的产物由于血液中潜在的感染原而可能是不安全的，并且对于大量生产是低效的。
人B细胞被用于筛选特定人单克隆抗体。然而，通过EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)永生化人B细胞的效率较低且耗时。为了克服这一缺点，已经开发并使用了新技术。这些技术之一是利用RT-PCR法直接从B细胞获得抗体的遗传信息。例如，有一种方法包括：对表达针对特定抗原之抗体的B细胞进行染色，使用FACS分选仪分离B细胞，通过RT-PCR方法从单个B细胞获得抗体的遗传信息，将所述遗传信息插入到表达载体中，并将所述表达载体转染到动物细胞中以产生大量抗体。为了以更简便且更快速的方式进行该生产方法，可以使用以下技术。新技术“芯片上的免疫斑点阵列测定”(immunospot array assay on a chip，ISAAC)能够在几周内通过筛选单个B细胞(分泌特定单克隆抗体)获得抗体基因(Jin等.，2009Nat Med.15，1088-1092)。这样获得的抗体是天然人抗体，其在免疫原性问题方面可以更有效。
公开内容
技术问题
本发明的一个目的是提供具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子。
本发明的另一个目的是提供编码所述结合分子的分离的核酸分子。
本发明的另一个目的是提供具有插入其中的所述分离的核酸分子的表达载体。
本发明的另一个目的是提供用表达载体转染的产生结合分子的细胞系。
本发明的另一个目的是提供用于筛选结合分子的方法。
本发明的另一个目的是提供包含所述结合分子的组合物。
本发明的另一个目的是提供使用所述结合分子治疗由甲型流感病毒引起的疾病的方法。
本发明的另一个目的是提供使用所述结合分子预防由甲型流感病毒引起的疾病的方法。
本发明的另一个目的是提供使用所述结合分子诊断甲型流感病毒感染的方法。
本发明的另一个目的是提供用于诊断甲型流感病毒的试剂盒，其包含所述结合分子。
技术方案
为了实现以上目的，本发明提供了具有针对甲型流感病毒的中和活性的结合分子。
本发明还提供了编码所述结合分子的分离的核酸分子。
本发明还提供了具有插入其中的所述分离的核酸分子的表达载体。
本发明还提供了用所述表达载体转染的产生结合分子的细胞系。
本发明还提供了用于筛选结合分子的方法。
本发明还提供了包含所述结合分子的组合物。
本发明还提供了用于预防和治疗由甲型流感病毒引起的疾病的组合物，其包含所述结合分子。
本发明还提供了用于诊断甲型流感病毒的组合物，其包含所述结合分子。
本发明还提供了使用所述结合分子治疗由甲型流感病毒引起的疾病的方法。
本发明还提供了使用所述结合分子预防由甲型流感病毒引起的疾病的方法。
本发明还提供了使用所述结合分子诊断甲型流感病毒感染的方法。
本发明还提供了用于诊断甲型流感病毒的试剂盒，其包含所述结合分子。
有益效果
本发明的结合分子具有对甲型流感病毒的结合亲和力和针对其的中和活性，因而可用于预防和治疗由甲型流感病毒引起的疾病，并且也可用于诊断甲型流感病毒感染。
附图说明
图1是一组图，其示出为了确认初步筛选的结合分子对H3血凝素(下文称作“HA”)的结合亲和力而进行的ELISA的结果。
图2示出载体pCT145(A)和pCT147(B)的图谱。
A：pCT145载体；
B：pCT147载体；
pac：编码嘌呤霉素N-乙酰基转移酶(PAC)的基因；以及
DS：二重对称(dyad symmetry)序列(EBNA1结合oriP中的二重对称(DS)元件)
图3是表达本发明之结合分子的表达载体的图谱。
图4示出使用本发明的结合分子进行的动物(小鼠)实验结果。
图5示出在使用本发明的结合分子进行动物(雪貂)实验期间，测量感染H3N2(A/香港/68)流感病毒后鼻洗液和肺组织中病毒滴度改变的结果。
图6示出在使用本发明的结合分子进行动物(雪貂)实验期间，测量感染H5N1(A/越南/1203/04)流感病毒后鼻洗液和肺组织中病毒滴度改变的结果。
最佳方式
下文中，将如下定义本文所使用的术语。
本文所用的术语“甲型流感病毒”指属于正粘病毒科并且具有由八个反义单链RNA(核糖核酸)区段构成的基因组的包膜病毒。这些流感病毒被划分为甲型、乙型和丙型，并且根据其主要表面蛋白HA(血凝素)和NA(神经氨酸酶)，甲型流感病毒被进一步划分为亚型。到目前为止，已经报道了16种HA和9种NA。
本文所用的表达“H3亚型病毒”指具有H3亚型HA的病毒，并且因而旨在包括H3N1、H3N2、H3N3、H3N4、H3N5、H3N6、H3N7、H3N8和H3N9病毒。
本文所用的术语“血凝素”(下文中称作“HA”)指流感病毒的包膜糖蛋白。HA介导流感病毒进入宿主细胞的吸附和渗透。到目前为止，已经报道了16种HA亚型。
本文所用的术语“恢复或完全恢复的患者”指这样的患者，其由于甲型流感病毒感染而为甲型流感病毒阳性，但在给定时间阶段后血液中甲型流感病毒为阴性。
本文所用的术语“结合分子”指完整的免疫球蛋白，其包括单克隆抗体，例如嵌合、人源化或人单克隆抗体；或者指免疫球蛋白的抗原结合片段或包含可变结构域的片段，其与完整免疫球蛋白竞争与免疫球蛋白的结合伴侣的特异性结合，例如甲型流感病毒的单体HA或三聚体HA。不论结构为何，抗原结合片段结合被完整免疫球蛋白识别的相同抗原。抗原结合片段可包含肽或多肽，其包含由结合分子之氨基酸序列的至少2、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200或250个连续氨基酸残基组成的氨基酸序列。抗原结合片段尤其包括Fab、F(ab′)、F(ab′)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)、多肽(其含有足以赋予多肽特异性抗原结合的免疫球蛋白的至少一个片段)等。上述片段可以合成产生或者通过完整免疫球蛋白的酶促或化学切割产生，或者它们可以通过重组DNA技术遗传改造。生产方法是本领域公知的。
本文所用的术语“可药用赋形剂”意指任何这样的惰性物质，其与活性分子(例如药、试剂或结合分子)组合用于制备合适的或方便的剂型。可药用赋形剂是这样的赋形剂，其在所使用的剂量和浓度对接受者是无毒的，并且与包括药、试剂或结合分子的制剂的其他成分是相容的。
本文所用的术语“治疗有效量”指对预防或治疗由甲型流感病毒感染导致的病症有效的结合分子的量。
下文中，将详细描述本发明。
本发明人分离了外周血单核细胞(PBMC)，其来自从甲型流感病毒感染恢复之患者收集的血液。使用ISAAC方法从分离的PBMC筛选产生针对H1亚型HA之单克隆抗体的B细胞。通过RT-PCR方法获得用于在筛选的B细胞中产生针对HA之单克隆抗体的遗传信息，并将其插入至pcDNA载体。将该载体转染入CHO细胞系，然后初步选取82种抗体。为了更精确地测量对HA的结合亲和力，将插入pcDNA载体的所有抗体转染到人F2N细胞中，并且通过使用H3亚型的单体HA和三聚体HA作为抗原的HA-ELISA比较分析从转染的细胞产生的抗体，从而二次选择6种抗体(CT129、CT135、CT147、CT149、CT163和CT166抗体)，与单体HA相比它们与三聚体HA以更高程度反应。为了检查所选择的抗体针对多种流感病毒的中和活性，进行了微量中和测试(以下称为“MN测试”)和凝血抑制测试(以下称为“HI测试”)。一些抗体表现出针对多种流感病毒的高或低的中和活性，但所有抗体在HI测试中显示阴性反应。通过MN测试，选择了显示针对多种病毒之中和活性的CT149抗体。将所选择抗体的基因插入到具有高抗体表达效率的MarEx表达载体，然后将载体转染入F2N细胞。将源自经转染细胞的抗体进行用于更多种流感病毒的MN测试。结果显示，CT149抗体不仅具有H1和H3亚型病毒的中和活性，而且还具有H5、H7和H9亚型病毒的中和活性(见表4)。此外，在使用H3亚型流感病毒进行的动物实验中，CT149抗体针对H3N2感染表现出优异的预防和治疗效果(参见图4)。基于上述结果，本发明人已经完成了发明，所述发明涉及针对甲型流感病毒感染进行保护的抗甲型流感病毒单克隆抗体。
因而，本发明提供了具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子。
所述结合分子优选为抗体。所述抗体优选为Fab片段、Fv片段、双抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，但不限于此。
在本发明中，所述结合分子结合甲型流感病毒表面上的HA。另外，所述结合分子优选来源于B细胞，所述B细胞存在于从甲型流感病毒H1N1亚型感染恢复的患者的血液中。
特别地，CT149抗体不仅具有针对组1(H1、H5和H9)流感病毒而且具有针对组2(H3和H7)流感病毒的中和活性。
在本发明中，甲型流感病毒可以是H1N1亚型，并且甲型流感病毒H1N1亚型可以是A/俄亥俄州/07/2009。而且，甲型流感病毒可以是H5N1亚型，并且甲型流感病毒H5N1亚型可以是A/越南/1203/04x PR8。另外，甲型流感病毒可以是H7N2亚型，并且甲型流感病毒H7N2亚型可以是A/火鸡/维吉尼亚/02x PR8。此外，甲型流感病毒可以是H9N2亚型，并且甲型流感病毒H9N2亚型可以是选自以下的任意一种或更多种：A/绿翅水鸭/209/TX/2009和A/ck/HK/G9/97x PR8。在本发明中，甲型流感病毒还可以是H3N2亚型，并且甲型流感病毒H3N2亚型可以是选自以下的任意一种或更多种：A/布里斯班/10/07、A/威斯康星州/67/05、A/怀俄明州/3/03.rg、A/北京/353/89-X109、A/北京/32/92-R-H3、A/约翰内斯堡/33/94R-H3、A/南昌/933/95、A/悉尼/5/97和A/巴拿马/2007/99。
在本发明中，根据由Kabat等设计的系统(参见Kabat等，Sequencesof Proteins of Immunological Interest(第5版)，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))使用常规方法确定可变结构域的互补决定区(CDR)。本发明中使用的CDR计数根据Kabat方法进行，但本发明还涵盖了包含通过其他方法(包括IMGT方法、Chothia方法和AbM方法)确定的CDR的结合分子。
本发明还提供了具有针对甲型流感病毒的中和活性的结合分子，其包含以下轻链多肽序列：轻链，其包含根据Kabat方法确定的选自SEQ IDNO：1、7、13和15所示多肽序列的任一种CDR1区、选自SEQ ID NO：2、8和16所示多肽序列的任一种CDR2区，以及选自SEQ ID NO：3或9所示多肽序列的任一种CDR3区。
本发明还提供了具有针对甲型流感病毒的中和活性的结合分子，其包含以下重链多肽序列：重链，其包含根据Kabat方法确定的选自SEQ IDNO：4或10所示多肽序列的任一种CDR1区、选自SEQ ID NO：5、11、14和17所示多肽序列的任一种CDR2区，以及选自SEQ ID NO：6或12所示多肽序列的任一种CDR3区。
本发明还提供了具有针对甲型流感病毒的中和活性的结合分子，其包含以下轻链和重链多肽序列：轻链，其包含根据Kabat方法确定的选自SEQ ID NO：1、7、13和15所示多肽序列的任一种CDR1区、选自SEQ IDNO：2、8和16所示多肽序列的任一种CDR2区，以及选自SEQ ID NO：3或9所示多肽序列的任一种CDR3区；以及重链，其包含根据Kabat方法确定的选自SEQ ID NO：4或10所示多肽序列的任一种CDR1区、选自SEQ ID NO：5、11、14和17所示多肽序列的任一种CDR2区，以及选自SEQ ID NO：6或12所示多肽序列的任一种CDR3区。
本发明还提供了具有针对甲型流感病毒的中和活性的结合分子，其包含选自以下多肽序列的任一种多肽序列：由以下轻链和重链构成的结合分子，所述轻链包含根据Kabat方法确定的SEQ ID NO：1所示CDR1区，SEQ ID NO：2所示CDR2区和SEQ ID NO：3所示CDR3区；所述重链包含根据Kabat方法确定SEQ ID NO：4所示CDR1区，SEQ ID NO：5所示CDR2区和SEQ ID NO：6所示CDR3区；由以下轻链和重链构成的结合分子，所述轻链包含根据Kabat方法确定的SEQ ID NO：7所示CDR1区，SEQ ID NO：8所示CDR2区和SEQ ID NO：9所示CDR3区；所述重链包含根据Kabat方法确定的SEQ ID NO：10所示CDR1区，SEQ ID NO：11所示CDR2区和SEQ ID NO：12所示CDR3区；由以下轻链和重链构成的结合分子，所述轻链包含根据Kabat方法确定的SEQ ID NO：13所示CDR1区，SEQ ID NO：8所示CDR2区和SEQ ID NO：9所示CDR3区；所述重链包含根据Kabat方法确定的SEQ ID NO：10所示CDR1区，SEQID NO：14所示CDR2区和SEQ ID NO：6所示CDR3区；以及由以下轻链和重链构成的结合分子，所述轻链包含根据Kabat方法确定的SEQ IDNO：15所示CDR1区，SEQ ID NO：16所示CDR2区和SEQ ID NO：9所示CDR3区；所述重链包含根据Kabat方法确定的SEQ ID NO：10所示CDR1区，SEQ ID NO：17所示CDR2区和SEQ ID NO：12所示CDR3区。
在本发明中，所述结合分子优选地由以下轻链和重链构成，所述轻链包含SEQ ID NO：37所示多肽序列，所述重链包含SEQ ID NO：38所示多肽序列。
在本发明中，所述结合分子优选地由以下轻链和重链构成，所述轻链包含SEQ ID NO：39所示多肽序列，所述重链包含SEQ ID NO：40所示多肽序列。
在本发明中，所述结合分子优选地由以下轻链和重链构成，所述轻链包含SEQ ID NO：41所示多肽序列，所述重链包含SEQ ID NO：42所示多肽序列。
此外，所述结合分子优选地由以下轻链和重链构成，所述轻链包含SEQ ID NO：43所示多肽序列，所述重链包含SEQ ID NO：44所示多肽序列。
所述结合分子优选地具有针对选自以下任一种的中和活性：甲型流感病毒H1、H3、H5、H7和H9亚型。而且，甲型流感病毒H3亚型优选为H3N2，但不限于此。
本发明还提供了具有针对甲型流感病毒的中和活性的结合分子，其包含以下轻链多核苷酸序列：轻链，其包含根据Kabat方法确定的选自SEQID NO：18、24、30和34所示多核苷酸序列的任一种CDR1区、选自SEQID NO：19、25和35所示多核苷酸序列的任一种CDR2区，以及选自SEQID NO：20或26所示多核苷酸序列的任一种CDR3区。
本发明还提供了具有针对甲型流感病毒的中和活性的结合分子，其包含以下重链多核苷酸序列：重链，其包含根据Kabat方法确定的选自SEQID NO：21、27和31所示多核苷酸序列的任一种CDR1区、选自SEQ IDNO：22、28、32和36所示多核苷酸序列的任一种CDR2区，以及选自SEQ ID NO：23、29和33所示多核苷酸序列的任一种CDR3区。
本发明还提供了具有针对甲型流感病毒的中和活性的结合分子，其包含以下轻链和重链多核苷酸序列：轻链，其包含根据Kabat方法确定的选自SEQ ID NO：18、24、30和34所示多核苷酸序列的任一种CDR1区、选自SEQ ID NO：19、25和35所示多核苷酸序列的任一种CDR2区，以及选自SEQ ID NO：20或26所示多核苷酸序列的任一种CDR3区；以及重链，其包含根据Kabat方法确定的选自SEQ ID NO：21、27和31所示多核苷酸序列的任一种CDR1区、选自SEQ ID NO：22、28、32和36所示多核苷酸序列的任一种CDR2区，以及选自SEQ ID NO：23、29和33所示多核苷酸序列的任一种CDR3区。
本发明还提供了具有针对甲型流感病毒的中和活性的结合分子，其由选自以下多核苷酸序列的多核苷酸序列构成：由以下轻链和重链构成的结合分子，所述轻链包含根据Kabat方法确定的SEQ ID NO：18所示CDR1区，SEQ ID NO：19所示CDR2区和SEQ ID NO：20所示CDR3区；所述重链包含根据Kabat方法确定的SEQ ID NO：21所示CDR1区，SEQ IDNO：22所示CDR2区和SEQ ID NO：23所示CDR3区；由以下轻链和重链构成的结合分子，所述轻链包含根据Kabat方法确定的SEQ ID NO：24所示CDR1区，SEQ ID NO：25所示CDR2区和SEQ ID NO：26所示CDR3区；所述重链包含根据Kabat方法确定的SEQ ID NO：27所示CDR1区，SEQ ID NO：28所示CDR2区和SEQ ID NO：29所示CDR3区；由以下轻链和重链构成的结合分子，所述轻链包含根据Kabat方法确定的SEQ ID NO：30所示CDR1区，SEQ ID NO：25所示CDR2区和SEQ ID NO：26所示CDR3区；所述重链包含根据Kabat方法确定的SEQID NO：31所示CDR1区，SEQ ID NO：32所示CDR2区和SEQ ID NO：33所示CDR3区；以及由以下轻链和重链构成的结合分子，所述轻链包含根据Kabat方法确定的SEQ ID NO：34所示CDR1区，SEQ ID NO：35所示CDR2区和SEQ ID NO：26所示CDR3区；所述重链包含根据Kabat方法确定的SEQ ID NO：31所示CDR1区，SEQ ID NO：36所示CDR2区和SEQ ID NO：29所示CDR3区。
在本发明中，所述结合分子优选地由以下轻链和重链构成，所述轻链包含SEQ ID NO：45所示多核苷酸序列，所述重链包含SEQ ID NO：46所示多核苷酸序列。
而且，所述结合分子优选地由以下轻链和重链构成，所述轻链包含SEQ ID NO：47所示多核苷酸序列，所述重链包含SEQ ID NO：48所示多核苷酸序列。
此外，所述结合分子优选地由以下轻链和重链构成，所述轻链包含SEQ ID NO：49所示多核苷酸序列，所述重链包含SEQ ID NO：50所示多核苷酸序列。
另外，所述结合分子优选地由以下轻链和重链构成，所述轻链包含SEQ ID NO：51所示多核苷酸序列，所述重链包含SEQ ID NO：52所示多核苷酸序列。
所述结合分子优选地具有针对选自以下任一种的中和活性：甲型流感病毒H1、H3、H5、H7和H9亚型。而且，甲型流感病毒H3亚型优选为H3N2，但不限于此。
本发明的结合分子优选为抗体，但不限于此。所述抗体优选为Fab片段、Fv片段、双抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。此外，本发明还涵盖了具有结合甲型流感病毒HA之能力以及与本发明结合分子竞争性结合HA的所有抗体片段。另外，本发明还涵盖了所述结合分子的功能性变体。如果结合分子的变体可以与本发明结合分子竞争与甲型流感病毒H3亚型或其片段的特异性结合，则认为它们是本发明结合分子的功能性变体。特别地，如果功能性变体可以结合甲型流感病毒HA或其片段，并且具有针对该HA或片段的中和活性，则认为它们是本发明的功能性变体。功能性变体包括但不限于这样的衍生物，其一级结构序列基本相似，但含有例如未在本发明亲本结合分子中发现的体外或体内修饰、化学和/或生物化学。这样的修饰包括，例如乙酰化、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附接、脂质或脂质衍生物的共价附接、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、PEG化、蛋白裂解加工、磷酸化等。或者，功能性变体可以是包含这样的氨基酸序列的结合分子，所述氨基酸序列相比于亲本结合分子的氨基酸序列含有一个或更多个氨基酸的替代、插入、缺失或其组合。此外，功能性变体可包含在氨基或羧基末端的任一或两者的氨基酸序列截断。根据本发明的功能性变体与亲本单克隆抗体相比可以具有相同或不同(更高或更低)的结合亲和力，但仍能结合甲型流感病毒HA或其片段。例如，与本发明的亲本结合分子相比，根据本发明的功能性变体可以对甲型流感病毒HA或其片段有升高或降低的结合亲和力。优选地，对可变区(包括但不限于框架区、高变区特别是CDR3区)的氨基酸序列进行修饰。一般而言，轻链或重链区包含三个高变区(包含三个CDR)以及较保守区(所谓的框架区(FR))。高变区包含来自CDR的氨基酸残基和来自高变环的氨基酸残基。旨在落入本发明范围内的功能性变体与本文所限定的亲本单克隆抗体有至少约50-99％、优选至少约60-99％、更优选至少约80-99％、甚至更优选至少约90-99％、特别是至少约95-99％以及特别是至少约97-99％的氨基酸序列同源性。可以使用本领域技术人员已知的计算机算法例如Gap或最佳拟合(Best fit)以最优比对待比较的氨基酸序列并确定相似或一致的氨基酸残基。可通过本领域已知的一般分子生物学方法(包括PCR、寡核苷酸定向突变和定点突变)或者通过有机合成方法(但不限于此)来改变亲本单克隆抗体或其部分以获得功能性变体。
本发明还提供了编码本发明结合分子的分离的核酸分子。
本发明的核酸分子涵盖根据本领域技术人员已知的方法通过将本发明抗体的氨基酸序列转化为多核苷酸序列所获得的所有核酸分子。因此，可以制备多种具有开放阅读框(ORF)的多核苷酸序列并且它们也包含在本发明核酸分子的范围内。
本发明还提供了具有插入其中的所述分离的核酸分子的表达载体。所述表达载体可优选地来源于选自(但不限于)以下的任一种，由CelltrionInc.(韩国)生产的MarEx表达载体、广泛市售可得的pCDNA载体、F、R1、RP1、Col、pBR322、ToL、Ti载体；黏粒；嗜菌体例如λ(lambda)，λ形(lambdoid)、M13、Mu、P1、P22、Qμ、T-even、T2、T3、T7等；以及植物病毒。本领域技术人员已知的任何表达载体可以用于本发明中，并且表达载体的选择取决于所选宿主细胞的性质。宿主细胞中载体的引入可以通过(但不限于)以下进行：磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介导的转染、lipofectamin转染或电穿孔，并且本领域任何技术人员均可以选择并使用适合所用表达载体和宿主细胞的引入方法。优选地，所述载体含有一个或更多个可选择标记，但不限于此，并且也可以使用不含可选择标记的载体。可选择标记的选择可以取决于所选的宿主细胞，尽管这对于本发明而言不是关键的，因为这是本领域技术人员所公知的。
为了便于本发明核酸分子的纯化，可以将标签序列插入到表达载体中。标签的实例包括但不限于，六组氨酸标签、血凝素标签、myc标签或FLAG标签。本领域技术人员已知的任何便于纯化的标签都可以在本发明中使用。
本发明还提供了细胞系，其产生具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子，所述细胞系具有以上描述的转染到其中的表达载体。
在本发明中，所述细胞系可以包括哺乳动物、植物、昆虫细胞、真菌或细菌来源的细胞，但不限于此。作为哺乳动物细胞，优选使用选自(但不限于)以下的任一种作为宿主细胞：CHO细胞、F2N细胞、CSO细胞、BHK细胞、Bowes黑素瘤细胞、HeLa细胞、911细胞、AT1080细胞、A549细胞、HEK293细胞和HEK293T细胞。可以在本发明中使用本领域技术人员已知的可用作哺乳动物宿主细胞的任何细胞。
本发明还提供了从感染有甲型流感病毒的患者筛选具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子的方法，所述方法包括以下步骤：1)从感染甲型流感病毒的患者中筛选其血液为甲型流感病毒阴性的患者；2)从步骤1)筛选的患者收集血液；3)从步骤2)中收集的患者血液中分离B细胞；4)从步骤3)中分离的B细胞筛选产生结合血凝素(HA)之结合分子的B细胞；5)从步骤4)筛选的B细胞提取RNA；6)从步骤5)中提取的RNA扩增结合分子基因；7)将步骤6)中扩增的基因克隆到表达载体中；8)将步骤7)的表达载体转染到宿主细胞中；9)从来源于步骤8)中构建之经转化细胞的结合分子筛选结合HA的结合分子；10)制备并培养用于经筛选结合分子的细胞系；11)从步骤10)的细胞培养物中纯化结合甲型流感病毒HA的结合分子；12)再确认步骤11)中纯化的结合分子是否具有针对甲型流感病毒的中和活性；以及13)筛选步骤12)中经确认具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子。
上述筛选方法中的结合分子优选为抗体，但不限于此。所述抗体优选为Fab片段、Fv片段、双抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。此外，本发明还涵盖了具有结合甲型流感病毒HA之能力以及与本发明结合分子竞争性结合HA的所有抗体片段。
另外，本发明还涵盖了所述结合分子的功能性变体。如果结合分子的变体可以与本发明结合分子竞争与甲型流感病毒H3亚型或其片段的特异性结合，则认为它们是本发明结合分子的功能性变体。特别地，如果功能性变体可以结合甲型流感病毒HA或其片段，并且具有针对该HA或片段的中和活性，则认为它们是本发明的功能性变体。功能性变体包括但不限于这样的衍生物，其一级结构序列基本相似，但含有例如未在本发明亲本结合分子中发现的体外或体内修饰、化学和/或生物化学。这样的修饰包括，例如乙酰化、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附接、脂质或脂质衍生物的共价附接、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、PEG化、蛋白裂解加工、磷酸化等。或者，功能性变体可以是包含这样的氨基酸序列的结合分子，所述氨基酸序列相比于亲本单克隆抗体的氨基酸序列含有一个或更多个氨基酸的替代、插入、缺失或其组合。此外，功能性变体可包含在氨基或羧基末端的任一或两者的氨基酸序列截断。根据本发明的功能性变体与亲本单克隆抗体相比可以具有相同或不同(更高或更低)的结合亲和力，但仍能结合甲型流感病毒HA或其片段。例如，与亲本结合分子相比，根据本发明的功能性变体可以对甲型流感病毒HA或其片段有升高或降低的结合亲和力。优选地，对可变区(包括但不限于框架区、高变区特别是CDR3区)的氨基酸序列进行修饰。一般而言，轻链或重链区包含三个高变区(包含三个CDR)以及较保守区(所谓的框架区(FR))。高变区包含来自CDR的氨基酸残基和来自高变环的氨基酸残基。旨在落入本发明范围内的功能性变体与本文所限定的亲本单克隆抗体有至少约50-99％、优选至少约60-99％、更优选至少约80-99％、甚至更优选至少约90-99％、特别是至少约95-99％以及特别是至少约97-99％的氨基酸序列同源性。可以使用本领域技术人员已知的计算机算法例如Gap或最佳拟合(Best fit)以最优比对待比较的氨基酸序列并确定相似或一致的氨基酸残基。可通过本领域已知的一般分子生物学方法(包括PCR、寡核苷酸定向突变和定点突变)或者通过有机合成方法(但不限于此)来改变亲本单克隆抗体或其部分以获得功能性变体。
本发明还提供了包含上述结合分子的组合物。
除了具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子之外，本发明的组合物可以包含可药用赋形剂。可药用赋形剂是本领域技术人员公知的。
本发明还提供了用于预防和治疗由甲型流感病毒引起的疾病的组合物，所述组合物包含上述结合分子。
除了具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子之外，本发明的预防性和治疗性组合物可以包含可药用赋形剂。可药用赋形剂是本领域技术人员公知的。
此外，本发明的预防性和治疗性组合物可以包含至少5种其他治疗剂。本发明的预防性和治疗性组合物可以包含结合甲型流感病毒HA或其片段的多种单克隆抗体，并从而表现出中和活性的协同效应。
此外，本发明的预防性和治疗性组合物还可以包含一种或更多种其他治疗剂或诊断剂。所述治疗剂包括但不限于抗病毒药。这种药的实例包括抗体、小分子、有机或无机化合物、酶、多核苷酸序列、抗病毒肽等。
本发明的预防性和治疗性组合物在制造和储存条件下必须是无菌且稳定的。此外，它可以是粉末的形式，以在递送之前或递送时在适当的可药用赋形剂中重构。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冻干，其从预先灭菌过滤的粉末溶液产生活性成分和任何其他期望成分的粉末。或者，本发明的组合物可以是溶液形式，并且可以在递送之前或递送时添加和/或混合适当的可药用赋形剂以提供单位剂量的可注射形式。优选地，本发明中使用的可药用赋形剂适用于高药物浓度，可以维持适当的流动性并且如需要可延缓吸收。
本发明的预防性和治疗性组合物的最佳施用途径的选择将受几种因素的影响，所述因素包括：组合物中活性分子的物理化学性质、临床状况的紧迫性和活性分子的血浆浓度与期望的治疗效果之间的关系。例如，本发明的结合分子可与保护它们免于快速释放的载体一起制备，如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以在本发明中使用生物可降解和生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate)、聚酸酐(polyanhydride)、聚乙醇酸(polyglycolic acid)、胶原、聚原酸酯(polyorthoester)和聚乳酸。此外，本发明的结合分子可以用防止抗体失活的材料或化合物包被或与其共同施用。例如，本发明的结合分子可与适当的载体(例如，脂质体或稀释剂)一起施用。
本发明的预防性和治疗性组合物的施用途径可分为经口和肠胃外途径。优选的施用途径是静脉内、皮下或鼻内途径，但不限于此。
经口剂型可以配制成片剂、药片(troche)、锭剂(lozenge)、水性或油性混悬剂、可分散粉剂或颗粒剂、乳剂、硬胶囊、软明胶胶囊、糖浆或酏剂、丸剂、糖衣丸剂(dragee)、液体、凝胶或浆(slurry)。这些制剂可以包含药用赋形剂，其包括但不限于，惰性稀释剂、粒化剂和崩解剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、着色剂、调味剂或增甜剂、植物油或矿物油、润湿剂和增稠剂。
用于肠胃外施用的制剂可以是水性或非水性等渗无菌无毒注射或输注溶液或悬液的形式。该溶液和悬液可以包含在使用剂量和浓度下对接受者无毒的试剂，例如1，3-丁二醇、林格氏溶液(Ringer′s solution)，Hank′s溶液、等渗氯化钠溶液、油、脂肪酸、局部麻醉剂、防腐剂、缓冲剂、粘度增加剂或溶解性增加剂、水溶性抗氧化剂、油溶性抗氧化剂和金属螯合剂。
本发明还提供了用于诊断甲型流感病毒的组合物，其包含缀合物，所述缀合物包含与具有针对抗甲型流感病毒之中和活性的上述结合分子连接的标签。
根据本发明的用于诊断的组合物包含至少一个可检测标签，例如可检测部分/试剂。所述标签可以非共价连接至本发明的结合分子。所述标签也可以通过共价键合直接连接至结合分子。或者，所述标签也可以通过一个或更多个连接化合物连结至结合分子。用于将标签连接到结合分子的技术是本领域技术人员公知的。优选地，作为标签的可检测部分/试剂为选自以下的任一种：酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子，但不限于此。
本发明还提供了用于治疗由甲型流感病毒引起的疾病的方法，所述方法包括向患有疾病的对象施用治疗有效量的具有针对甲型流感病毒之中和活性的本发明结合分子。
在本发明的治疗方法中，甲型流感病毒优选地为选自以下的任一种：H1、H3、H5、H7和H9亚型，并且甲型流感病毒H3亚型优选为H3N2，但不限于此。
在本发明的治疗方法中，可以将本领域技术人员已知的任何治疗剂与本发明结合分子一起施用。
在本发明的治疗方法中，由甲型流感病毒引起的疾病可以是选自以下的任一种：流感新毒株、大流行流感和季节性流感，但不限于此。
在本发明的治疗方法中，可以调整具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子的剂量以提供最佳的响应。所述剂量为例如0.01-200mg/kg，优选0.1-150mg/kg并且更优选1-100mg/kg，但不限于此。每天可以施用若干分次剂量，或者所述剂量可以按照由个体情况的急切需要所指示地相应地减少或增加。施用模式并不限于本发明，可以由主治医师决定。
在本发明的治疗方法中，具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子的施用途径可以分为经口和肠胃外施用途径。优选的施用途径是静脉内途径，但不限于此。
本发明还提供了用于预防由甲型流感病毒引起的疾病的方法，所述方法将向对象施用治疗有效量的具有针对甲型流感病毒之中和活性的本发明结合分子。
在本发明的预防方法中，可以将本领域技术人员已知的任何预防剂与本发明的结合分子一起施用。
在本发明的预防方法中，可以调整具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子的剂量以提供最佳的响应。所述剂量为例如0.01-200mg/kg，优选0.1-150mg/kg，并且更优选1-100mg/kg，但不限于此。每天可以施用若干分次剂量，或者所述剂量可以按照由个体状情况的急切需要所指示的相应地减少或增加。施用模式并不限于本发明，可以由主治医师决定。
在本发明的预防方法中，具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子的施用途径可以分为经口和肠胃外施用途径。优选的施用途径是静脉内途径，但不限于此。
本发明还提供了用于诊断患者的甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括以下步骤：1)将样品与具有针对甲型流感病毒之中和活性的本发明结合分子相接触；以及2)检测所述结合分子与样品之间的反应。此外，本发明还提供了用于诊断患者的甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括以下步骤：1)将样品与本发明的诊断组合物相接触；以及2)检测结合分子与样品之间的反应。
在本发明的诊断方法中，甲型流感病毒优选为选自以下的任一种：H1、H3、H5、H7和H9亚型，甲型流感病毒H3亚型优选为H3N2，但不限于此。
在本发明的诊断方法中，本发明的结合分子(如果需要)可以根据本领域技术人员已知的任何方法与用于诊断和检测的标签连接。
在本发明的诊断方法中，样品优选地为选自以下的任一种：痰、唾沫(spittle)、血液、肺细胞、肺组织粘液、呼吸系统组织和唾液，但不限于此。样品可以根据本领域技术人员已知的任何常规方法制备。
在本发明的诊断方法中，用于检测反应的方法可以是选自以下的一种：均相和非均相结合免疫测定，例如放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光、免疫细胞化学、FACS、BIACORE和Western印迹分析，但不限于此，在本发明中可以使用本领域技术人员已知的任何检测方法。
本发明还提供了用于诊断甲型流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包含：1)具有针对甲型流感病毒之中和活性的本发明结合分子；以及2)容器。
另外，本发明还提供了用于诊断甲型流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包含：1)用于诊断甲型流感病毒的本发明组合物；以及2)容器。
在本发明的诊断试剂盒中，甲型流感病毒优选地为选自以下的任一种：H1、H3、H5、H7和H9亚型，甲型流感病毒H3亚型优选为H3N2，但不限于此。
在本发明的诊断试剂盒中，容器2)包含固体支持物。本发明的结合分子可以附接到固体支持物，并且该固体支持物可以是多孔或无孔的，平的或非平的。
实施例
实施例1：由从流感恢复之患者的血液分离PMBC
恢复患者组由确认新流感感染后2-4周的患者志愿者组成。这些志愿者被证实在其血液中没有流感病毒(H1N1)并且具有针对新流感病毒的抗体。在机构审查委员会(IRB)的批准下进行这项研究。这个患者组具有以下特性：(1)这些患者没有针对季节性流感进行疫苗接种，(2)这些患者的其他感染性病毒(即HBsAg)为阴性，并对抗HCV抗体和抗HIV抗体为阴性，(3)患者的血浆中流感病毒H1N1亚型的RT-PCR为阴性，(4)患者的血清在对甲型流感病毒H1N1亚型单体HA(H1N1)的ELISA测定中表现出1：160或更高的滴度。从志愿者采集约100ml的全血，并且使用LymphoprepTM(Axis-Shield，挪威，1114545)从所采集的血液分离外周血单核细胞(PBMC)。分离的PBMC用磷酸缓冲盐水洗涤三次，以2×107个细胞/ml的浓度悬浮于KM banker II冷冻培养基(Cosmobio，日本，KOJ-16092010)中，并存储在液氮罐中。
实施例2：单克隆抗体的初步筛选
使用由Jin等(Jin A.等，2009.NatMed.15，1088-1092)描述的方法筛选分泌抗原特异性抗体的B细胞。简言之，将实施例1中分离的PBMC以1个细胞/孔的密度加入到准备的微阵列芯片的各孔中。由预包被的抗人IgG抗体证实从单个细胞分泌的抗体。使用标记的HA抗原检查筛选的抗体分泌细胞是否分泌的HA结合抗体。来自个体抗体分泌细胞的抗体的重链和轻链基因的完整序列通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得。将获得的重链和轻链DNA插入到pcDNA3.1(+)表达载体(Invitrogen，美国，V790-20)中以制备产生各抗体重链和轻链的表达载体。将制备的表达载体共转染到CHO细胞中。然后，使用来源于经转染CHO细胞的抗体，通过在以下实施例3中描述的HA-ELISA方法初步筛选了82种结合HA的抗体。本文中，初步筛选了显示与HA反应的所有抗体而未系列稀释抗体样品。
实施例3：确认单克隆抗体结合HA的能力
为了从82种初步筛选的抗体中二次筛选以高亲和力结合H3N2流感病毒HA的单克隆抗体，使用三聚体HA和单体HA的亚基(HA1)进行HA-ELISA。从Sino Biological Inc.(中国)购买了来自甲型流感病毒的重组单体HA1亚基(11056-V08H1)。购买的HA1亚基由包含C末端的聚组氨酸残基的HA的N末端片段(Met1-Arg345)组成，并且来源于经感染的人细胞。重组三聚体HA(FR-61)由IRR(流感试剂资源(InfluenzaReagent Resource)，美国)提供。三聚体HA包含C末端的凝血酶切割位点，三聚化结构域(折叠子(foldon))和六组氨酸残基，并且是使用杆状病毒系统产生的。
通过使用HA和抗体的ELISA来测量抗体与HA抗原的反应性。具体而言，首先将50μl三聚体HA抗原(250纳克/毫升)吸附到96孔微滴定板(Nunc，丹麦，449824)的各孔上。该板用含有1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲盐水(Teknova，美国，D5120)封闭，然后将3倍系列稀释的抗体样品(起始浓度为1μg/ml)加入到该板的每个孔中。接着将板在室温孵育1小时，然后用过氧化物酶标记的山羊抗人γ抗体(Zymed，美国，62.8420)处理。在室温下孵育1小时后，将板用四甲基联苯胺(TMB；Sigma-Aldrich，美国，T0440)孵育，并通过加入1N HCl停止孵育。使用读板器(Spectramax plus384，Molecular Device)测量在450/570nm的吸光度，并且使用Graphpad prism程序(GraphPad Software Inc.美国)将抗原-抗体反应性以图的形式表示。
大多数抗体不结合H3N2的HA，但如图1所示，CT129、CT135、CT147、CT149、CT164和CT166抗体显示高结合亲和力。特别地，这些抗体的确容易结合三聚体HA，但不结合HA1亚基。这表明，所筛选的抗体不结合先前已知的HA1表位，而具有仅结合HA1和HA2区段之间的边界或者结合HA2或者结合具有正常构型之HA的能力。
基于在图1中显示的结果，从82种初步筛选的抗体中，二次选择了显示对H3N2流感病毒之三聚体HA有高结合亲和力的6种抗体(CT129、CT135、CT147、CT149、CT164和CT166抗体)。为了增加二次选择的抗体的表达水平，以以下方式将这些抗体基因从pcDNA载体再克隆到MarEx表达载体(由Celltrion，Inc.构建并享有专利)中。在再克隆之后，使用含有抗体基因的MarEx表达载体产生微量中和测试(MN测试)和凝血抑制测试(HI测试)所需的抗体。
使用限制性酶NheI和PmeI处理含有六个经二次选择抗体的各重链基因和轻链基因的初始pcDNA载体以获得重链基因和轻链基因。将得到的重链基因和轻链基因分别插入到被相同限制性酶处理过的pCT145载体和pCT147载体中。pCT145和pCT147载体由Celltrion公司构建，以分别克隆各抗体的重链和轻链(图2)。然后，为了构建含有重链转录单元(启动子-重链基因-聚腺苷酸)以及轻链转录单元(启动子-轻链基因-聚腺苷酸)的表达载体，将含有重链基因的pCT145载体用限制性酶PacI和AscI处理以获得重链转录单元，之后用相同的限制性酶处理含有轻链基因的pCT147载体，然后将重链转录单元插入其中。然后，使用限制性酶筛选含有重链转录单元和轻链转录单元二者的载体(图3)。使用Endofree质粒大提试剂盒(Endofree plasmid maxi kit)(QIAGEN，德国，12362)提取经筛选的载体，并且分析部分经提取DNA样品的核苷酸序列，从而确定抗体的核苷酸序列。
然后，将经提取抗体的DNA转染到F2N细胞系(由Celltrion，Inc.，韩国制备)的悬浮培养物中，从而制备产生单克隆抗体的瞬时细胞系。以下面的方式进行转染。使用阳离子聚合物FreeStyleTM Max(Invitrogen，USA，16447-100)按照制造商的说明书进行细胞的瞬时转染。转染前一天，将培养在EX-CELL293无血清培养基(Sigma，LIK，14571C；下文中称作“EX-CELL293培养基”)中的F2N细胞离心，并以1×106细胞/ml的细胞浓度悬浮在经改良EX-CELL293培养基(Sigma，LIK，65237；定制)中，将80ml的细胞悬浮液接种到250ml Elrlenmeyer瓶中，或将200ml的细胞悬浮液接种到1升Elrlenmeyer瓶中。在转染当天，在接种了80ml的细胞悬浮液的情况下，使用OptiPRO SFM II培养基将100μg的单克隆抗体编码DNA和100μl的FreeStyleTM Max试剂各自稀释至1.6ml的体积，随后轻柔搅拌。在接种了200ml的细胞悬浮液的情况下，使用OptiPRO SFM II培养基将250μg的DNA和250μl的FreeStyleTM Max试剂各自稀释至4ml的体积，随后轻柔搅拌。在搅拌过程之后，立即将含有稀释其中的FreeStyleTM Max试剂的溶液与含有稀释其中的DNA的溶液混合，并且将混合的溶液在室温孵育19分钟。在室温孵育19分钟期间，用新鲜的经改良EX-CELL293培养基将接种的F2N细胞稀释到0.8×106个细胞的细胞浓度。孵育19分钟后，处理并且用含有DNA和FreeStyleTM Max试剂的经混合溶液转染F2N细胞。在转染后一天，将相同量的EX-CELL293培养基添加到经转染的细胞，其随后被孵育7-8天，从而产生单克隆抗体。
实施例4：针对病毒的体外中和活性的检测
使在HA-ELISA中筛选的6种抗体进行微量中和(MN)测试以检测其针对多种流感病毒的中和活性。
实施例4-1：MDCK细胞系的培养和病毒浓度的确定
作为Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞系，使用了伦敦系(MDCK-L)。使用含有10％FBS(Atlas Biologicals，美国，F0500A)、1X青霉素/链霉素(Gibco，美国，15140))，25mM HEPES(Gibco，美国，15630)和2mML-谷氨酸(Gibco，美国，25030)的DMEM培养基(Gibco，美国，11965)在5％CO2加湿的孵育箱中于37℃培养MDCK细胞系。
通过基于细胞的ELISA方法定量病毒浓度以确定半数组织培养感染剂量(TCID50)。按以下方式进行病毒浓度的确定。首先，用病毒稀释液[DMEM(Gibco，美国)，3％BSA(Gibco，美国，15260)，1X青霉素/链霉素(Gibco，USA)和25mM HEPES(Gibco，美国)]将病毒储液以10倍系列稀释，并且将100μl的经稀释病毒添加到96孔板的各个孔中。使用不含病毒的病毒稀释液作为阴性对照。然后通过胰蛋白酶处理从培养孵育箱中分离被培养的MDCK细胞系，随后用MDCK培养基处理以中和胰蛋白酶。然后，将细胞沉淀用磷酸缓冲盐水洗涤两次，然后用病毒稀释液稀释至5×105个细胞/ml的细胞浓度。将3-4μg/ml的TPCK-胰蛋白酶(Sigma，美国)添加到含有病毒的96孔板中，然后，立即向该板的各孔添加100μlMDCK细胞系并在5％CO2加湿的孵育箱中于37℃孵育20小时。孵育的板用磷酸缓冲盐水洗涤一次，然后将200μl冷丙酮：磷酸缓冲盐水(PBS)(80：20)的混合溶液添加到该板的各孔中。接着，将细胞固定8分钟，并将板在室温干燥20分钟。该板的各孔用200μl磷酸缓冲盐水洗涤两次。用含有1％BSA的磷酸缓冲盐水(0.1％吐温20)将生物素化的抗核蛋白(NP)单克隆抗体(Milipore，美国，MAB8257B)稀释2000倍，将100μl的稀释液加到板的各个孔中并在室温下孵育1小时。将板用磷酸缓冲盐永(200μl/孔)洗涤三次，然后将100μl链霉亲和素-HRP缀合抗体(在含有1％BSA的磷酸缓冲盐水中)的20000倍稀释液添加到板的各个孔中，并在室压下孵育1小时。用磷酸缓冲盐水洗涤板4次后，向板的各个孔加入100μl的OPD溶液(Sigma，美国，P8287)，将板在室温下显色10分钟并用3M HCl(50μl/孔)处理以终止显色，其后测量各孔的OD490。基于测量的OD490，使用Reed&Muench(The American1938)的方法计算TCID50。
实施例4-2：MN测定
将每种抗体用病毒稀释液稀释至浓度为10μg/ml。从这一起始浓度，将抗体稀释液用病毒稀释液系列稀释两倍，并且将50μl的每种稀释液添加到96孔板的各个孔中。而且，以对应于100TCID50的浓度向板的各个孔添加50μl病毒，并且在5％CO2加湿的孵育箱中于37℃孵育1小时。然后，将3-4μg/ml的TPCK-胰蛋白酶(Sigma，美国，T1426)添加到各个孔中，向各个孔添加100μl的经处理MDCK细胞，随后在5％CO2加湿的孵育箱中于37℃孵育20小时。孵育20小时后，根据与在实施例4-1中描述的病毒定量方法相同的方法进行MN测定，从而测定各个孔的OD490值。显示OD490值高于仅引入细胞之孔的孔被确定为感染病毒。对于未检测到病毒抗原的各抗体的OD490值，抗体的最低浓度(μg/ml)在下表1中显示，并且抗体的较低浓度意味着针对病毒的中和活性较高。
表1：使用经筛选抗体和多种类型的H3N2病毒进行的微量中和测定 (MN测定)的结果
mAb ID A/威斯康星州/67/05 A/香港/68 A/布里斯班/10/07
CT129 ＞10μg/ml ＞10μg/mL ＞10μg/mL
CT135 ＞10μg/ml 5μg/mL 5μg/mL
CT147 2.5μg/mL 2.5μg/mL 0.625μg/mL
CT149 1.25μg/mL 2.5μg/mL 1.25μg/mL
CT164 2.5μg/mL 1.25μg/mL 0.625μg/mL
CT166 5μg/mL 2.5μg/mL 1.25μg/mL
＊单位：μg/ml
从针对H3亚型流感病毒的6个候选抗体的MN测定之结果可以看出，CT129在HA-ELISA中显示高结合亲和力，但未显示针对测定中所用三种病毒类型的中和活性。CT135抗体显示针对两种类型H3N2病毒的中和活性(A/香港/68和A/布里斯班/10/07)，并且CT147、CT149、CT164和CT166抗体示出针对三种H3N2病毒(A/威斯康星州/67/05、A/香港/68和A/布里斯班/10/07)的中和活性。
在上述抗体中选择了CT149抗体，并且通过MN测定分析了其针对多种类型流感病毒的中和活性(表2)。
表2：使用所选择的抗体和多种类型的病毒进行的微量中和测定(MN 测定)的结果
亚型 株 MN滴度(μg/mL)
H1N1 A/OH/07/2009 10μg/mL
H2N2 A/安娜堡/6/60，CA ＞20μg/mL
H5N1 A/越南/1203/04x PR8 2.5μg/mL
H7N2 A/火鸡/维吉尼亚/02x PR8 10μg/mL
H9N2 A/绿翅水鸭/209/TX/2009 0.156μg/mL
H9N2 A/ck/HK/G9/97x PR8 0.625μg/mL
H3N2 A/北京/353/89-X109 0.156μg/mL
H3N2 A/北京/32/92-R-H3 0.078μg/mL
H3N2 A/约翰内斯堡/33/94R-H3 0.625μg/mL
H3N2 A/南昌/933/95 0.625μg/mE
H3N2 A/悉尼/5/97 0.625μg/mL
H3N2 A/巴拿马/2007/99 0.312μg/mL
H3N2 怀俄明州/3/03.rg 5μg/mL
H3N2 A/布里斯班10/07 0.625μg/mL
在以上表2中可以看出，CT149抗体针对在MN测定中使用的H1N1、H5N1、H7N2、H9N2和H3N2亚型流感病毒显示中和活性。
实施例5：检测抗体抑制由病毒引起的凝血反应的能力
将抗体在V底96孔板上2倍系列稀释，加入具有4倍HA单位的病毒并与抗体混合。然后，将板在室温孵育30分钟，随后向板的各个孔添加1％禽血红细胞。凝血抑制终点由观察不到凝血反应的最低抗体浓度确定。
结果，所有测试的抗体不抑制在测试中使用的H3N2亚型病毒(A/布里斯班/10/07)的凝血(即使在高浓度下(＞20μg/ml))(表3)。
表3：经筛选抗体针对H3N2亚型病毒的凝血抑制测试的结果
mAb ID A/布里羝班/10/07
CT129 ＞20μg/ml
CT135 ＞20μg/ml
CT147 ＞20μg/ml
CT149 ＞20μg/ml
CT164 ＞20μg/m1
CT166 ＞20μg/ml
实施例6：通过动物实验检查抗体针对流感病毒的预防和治疗效果
实施例6-1：在小鼠中检查抗体针对流感病毒的预防和治疗效果
为了检查CT149抗体在小鼠中是否具有针对H3N2病毒的预防和治疗效果，进行了以下实验。使由5只小鼠组成的每个组鼻内感染10LD50的A/香港/68病毒。在病毒感染前24小时，或在病毒感染后24小时或48小时，通过腹膜内注射以10mg/kg或20mg/kg的量向小鼠施用CT149抗体。
结果如图4所示，在阴性对照组的情况下，阴性对照组的所有小鼠在病毒感染后11天前死亡，而在病毒感染后24小时或48小时注射10mg/kg或20mg/kgCT149抗体的组的情况下，所有小鼠存活，表明CT149抗体具有针对病毒感染的预防效果。在病毒感染后注射CT149抗体以确认抗体之治疗效果的情况下，当病毒感染后48小时给小鼠注射10mg/kg的抗体时，20％的小鼠死亡，并且当病毒感染后24小时给小鼠注射10mg/kg的抗体或病毒感染后48小时注射20mg/kg的抗体时，所有小鼠存活，表明CT149抗体具有针对病毒感染的治疗效果。
实施例6-2：在雪貂中检查抗体针对流感病毒的治疗效果
雪貂对流感病毒显示出类似人的敏感性和症状，因而经常用在流感病毒的研究中。因此，使用雪貂进行以下实验以检查CT149抗体是否具有针对H3N2和H5N1病毒的治疗效果。
每个测试组由9只雪貂组成。使每个雪貂的鼻腔和器官感染1×106EID50/ml的H3N2(A/香港/68)流感病毒或1×102EID50/ml的H5N1(A/越南/1203/04)流感病毒。病毒感染后一天，每个雪貂静脉内注射一次30mg/kg的阴性对照CT-P6抗体(与流感病毒无关)或者15mg/kg或30mg/kg的CT149抗体，或者静脉内注射30mg/kg的CT149抗体，每天一次，持续三天。
病毒感染后第1、3、5、7和9天，使用1ml含抗生素的PBS从每个测试组的雪貂收集鼻洗液。病毒感染后第3、5和9天，每个测试组处死三只雪貂，提取肺组织并使用受精卵测量其病毒浓度。为使用受精卵进行病毒滴定测试，将鼻洗液离心，将1g的雪貂肺组织添加到1ml含抗生素的PBS中，破裂并离心。每个上清液用含抗生素的PBS进行10倍系列稀释。10-13天龄受精卵用稀释的上清液感染并孵育48小时。然后，将从卵收集的50μl尿囊流体与相同量的0.5％的血红细胞混合，并且将混合物孵育30分钟，然后通过血液的凝集滴定病毒。
测量在感染H3N2(A/香港/68)流感病毒后24小时施用阴性对照(CT-P6)和CT149的测试动物(雪貂)中的病毒滴度。结果是，在阴性对照组情况下，病毒感染后一天观察到约log4EID50/ml或更高的病毒滴度，并且在鼻洗液和肺组织中病毒滴度保持或增加直至感染后第5天。然而，病毒感染后第7天，在对照组中未检测病毒。施用CT149的组在病毒感染后一天显示与阴性对照组相似的病毒滴度，但CT149处理组中病毒滴度在3天后开始减少，并且在9天CT149处理组中未检测到病毒，表明在CT149处理组中病毒被快速移除。特别是，随着抗体施用量的增加，肺组织中的病毒滴度减少地更快(图5)。
测量感染H5N1(A/越南/1203/04)流感病毒后24小时施用阴性对照(CT-P6)和CT149的测试动物(雪貂)中的病毒滴度。结果是，在阴性对照组情况下，病毒感染后一天观察到约log2.4EID50/ml或更高的病毒滴度，并且在鼻洗液和肺组织中病毒滴度增加直至病毒感染后第5天。在病毒感染后第5天，对照组中的6只雪貂仅有一只存活，因此在5天仅在一只雪貂中测量了鼻洗液中的病毒滴度。在病毒感染后第9天，对照组中的所有雪貂均已死亡，因而无法测量病毒滴度。在施用CT149的组中，病毒滴度从病毒感染后第3天开始减少，并且在9天未检测到病毒，表明在病毒被快速移除。此外，在施用CT149的组中，病毒滴度随着抗体施用量的增加而更快速减少。另外，在施用15mg/kg CT149一次的组中，病毒感染后第7天仅有一只雪貂死亡，表明CT149具有针对流感病毒的治疗效果(图6)。

Claims (45)

1.具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子。
2.权利要求1所述的结合分子，其中所述结合分子来源于从甲型流感病毒感染恢复的患者的血液中所存在的B细胞。
3.权利要求2所述的结合分子，其中所述甲型流感病毒是选自以下的任一种：H1、H3、H5、H7和H9亚型。
4.具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子，其包含轻链多肽序列：
轻链，其包含根据Kabat方法确定的选自SEQ ID NO：1、7、13和15所示多肽序列的任一种CDR1区、选自SEQ ID NO：2、8和16所示多肽序列的任一种CDR2区，以及选自SEQ ID NO：3或9所示多肽序列的任一种CDR3区。
5.具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子，其包含以下重链多肽序列：
重链，其包含根据Kabat方法确定的选自SEQ ID NO：4或10所示多肽序列的任一种CDR1区、选自SEQ ID NO：5、11、14和17所示多肽序列的任一种CDR2区，以及选自SEQ ID NO：6或12所示多肽序列的任一种CDR3区。
6.具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子，其包含以下轻链和重链多肽序列：
轻链，其包含根据Kabat方法确定的选自SEQ ID NO：1、7、13和15所示多肽序列的任一种CDR1区、选自SEQ ID NO：2、8和16所示多肽序列的任一种CDR2区，以及选自SEQ ID NO：3或9所示多肽序列的任一种CDR3区；以及
重链，其包含根据Kabat方法确定的选自SEQ ID NO：4或10所示多肽序列的任一种CDR1区、选自SEQ ID NO：5、11、14和17所示多肽序列的任一种CDR2区，以及选自SEQ ID NO：6或12所示多肽序列的任一种CDR3区。
7.具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子，其包含选自以下多肽序列的任一种多肽序列：
由以下轻链和重链构成的结合分子，所述轻链包含根据Kabat方法确定的SEQ ID NO：1所示CDR1区，SEQ ID NO：2所示CDR2区和SEQID NO：3所示CDR3区；所述重链包含根据Kabat方法确定的SEQ IDNO：4所示CDR1区，SEQ ID NO：5所示CDR2区和SEQ ID NO：6所示CDR3区；
由以下轻链和重链构成的结合分子，所述轻链包含根据Kabat方法确定的SEQ ID NO：7所示CDR1区，SEQ ID NO：8所示CDR2区和SEQID NO：9所示CDR3区；所述重链包含根据Kabat方法确定的SEQ IDNO：10所示CDR1区，SEQ ID NO：11所示CDR2区和SEQ ID NO：12所示CDR3区；
由以下轻链和重链构成的结合分子，所述轻链包含根据Kabat方法确定的SEQ ID NO：13所示CDR1区，SEQ ID NO：8所示CDR2区和SEQID NO：9所示CDR3区；所述重链包含根据Kabat方法确定的SEQ IDNO：10所示CDR1区，SEQ ID NO：14所示CDR2区和SEQ ID NO：6所示CDR3区；以及
由以下轻链和重链构成的结合分子，所述轻链包含根据Kabat方法确定的SEQ ID NO：15所示CDR1区，SEQ ID NO：16所示CDR2区和SEQ ID NO：9所示CDR3区；所述重链包含根据Kabat方法确定的SEQID NO：10所示CDR1区，SEQ ID NO：17所示CDR2区和SEQ ID NO：12所示CDR3区。
8.权利要求7所述的结合分子，其中所述结合分子由轻链和重链构成，所述轻链包含SEQ ID NO：37所示多肽序列，所述重链包含SEQ IDNO：38所示多肽序列。
9.权利要求7所述的结合分子，其中所述结合分子由轻链和重链构成，所述轻链包含SEQ ID NO：39所示多肽序列，所述重链包含SEQ IDNO：40所示多肽序列。
10.权利要求7所述的结合分子，其中所述结合分子由轻链和重链构成，所述轻链包含SEQ ID NO：41所示多肽序列，所述重链包含SEQ IDNO：42所示多肽序列。
11.权利要求7所述的结合分子，其中所述结合分子由轻链和重链构成，所述轻链包含SEQ ID NO：43所示多肽序列，所述重链包含SEQ IDNO：44所示多肽序列。
12.权利要求4至7中任一项所述的结合分子，其中所述结合分子具有针对选自以下任一种的中和活性：甲型流感病毒H1、H3、H5、H7和H9亚型。
13.具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子，其包含以下轻链多核苷酸序列：
轻链，其包含根据Kabat方法确定的选自SEQ ID NO：18、24、30和34所示多核苷酸序列的任一种CDR1区、选自SEQ ID NO：19、25和35所示多核苷酸序列的任一种CDR2区，以及选自SEQ ID NO：20或26所示多核苷酸序列的任一种CDR3区。
14.具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子，其包含以下重链多核苷酸序列：
重链，其包含根据Kabat方法确定的选自SEQ ID NO：21、27和31所示多核苷酸序列的任一种CDR1区、选自SEQ ID NO：22、28、32和36所示多核苷酸序列的任一种CDR2区，以及选自SEQ ID NO：23、29和33所示多核苷酸序列的任一种CDR3区。
15.具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子，其包含以下轻链和重链多核苷酸序列：
轻链，其包含根据Kabat方法确定的选自SEQ ID NO：18、24、30和34所示多核苷酸序列的任一种CDR1区、选自SEQ ID NO：19、25和35所示多核苷酸序列的任一种CDR2区，以及选自SEQ ID NO：20或26所示多核苷酸序列的任一种CDR3区；以及
重链，其包含根据Kabat方法确定的选自SEQ ID NO：21、27和31所示多核苷酸序列的任一种CDR1区、选自SEQ ID NO：22、28、32和36所示多核苷酸序列的任一种CDR2区，以及选自SEQ ID NO：23、29和33所示多核苷酸序列的任一种CDR3区。
16.具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子，其包含选自以下多核苷酸序列的任一种多核苷酸序列：
由以下轻链和重链构成的结合分子，所述轻链包含根据Kabat方法确定的SEQ ID NO：18所示CDR1区，SEQ ID NO：19所示CDR2区和SEQ ID NO：20所示CDR3区；所述重链包含根据Kabat方法确定的SEQID NO：21所示CDR1区，SEQ ID NO：22所示CDR2区和SEQ ID NO：23所示CDR3区；
由以下轻链和重链构成的结合分子，所述轻链包含根据Kabat方法确定的SEQ ID NO：24所示CDR1区，SEQ ID NO：25所示CDR2区和SEQ ID NO：26所示CDR3区；所述重链包含根据Kabat方法确定的SEQID NO：27所示CDR1区，SEQ ID NO：28所示CDR2区和SEQ ID NO：29所示CDR3区；
由以下轻链和重链构成的结合分子，所述轻链包含根据Kabat方法确定的SEQ ID NO：30所示CDR1区，SEQ ID NO：25所示CDR2区和SEQ ID NO：26所示CDR3区；所述重链包含根据Kabat方法确定的SEQID NO：31所示CDR1区，SEQ ID NO：32所示CDR2区和SEQ ID NO：33所示CDR3区；以及
由以下轻链和重链构成的结合分子，所述轻链包含根据Kabat方法确定的SEQ ID NO：34所示CDR1区，SEQ ID NO：35所示CDR2区和SEQ ID NO：26所示CDR3区；所述重链包含根据Kabat方法确定的SEQID NO：31所示CDR1区，SEQ ID NO：36所示CDR2区和SEQ ID NO：29所示CDR3区。
17.权利要求16所述的分子，其中所述结合分子由轻链和重链构成，所述轻链包含SEQ ID NO：45所示多核苷酸序列，所述重链包含SEQID NO：46所示多核苷酸序列。
18.权利要求16所述的分子，其中所述结合分子由轻链和重链构成，所述轻链包含SEQ ID NO：47所示多核苷酸序列，所述重链包含SEQID NO：48所示多核苷酸序列。
19.权利要求16所述的分子，其中所述结合分子由轻链和重链构成，所述轻链包含SEQ ID NO：49所示多核苷酸序列，所述重链包含SEQID NO：50所示多核苷酸序列。
20.权利要求16所述的分子，其中所述结合分子由轻链和重链构成，所述轻链包含SEQ ID NO：51所示多核苷酸序列，所述重链包含SEQID NO：52所示多核苷酸序列。
21.权利要求13至16中任一项所述的结合分子，其中所述结合分子具有针对选自以下任一种的中和活性：甲型流感病毒H1、H3、H5、H7和H9亚型。
22.权利要求1、4至7和13至16中任一项所述的结合分子，其中所述结合分子是抗体。
23.权利要求22所述的结合分子，其中所述抗体分子是Fab片段、Fv片段、双抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
24.分离的核酸分子，其编码根据权利要求1、4至7和13至16中任一项所述的具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子。
25.表达载体，其具有插入所述表达载体中的权利要求24所述的分离的核酸分子。
26.产生具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子的细胞系，所述细胞系包含转化入宿主细胞的权利要求25所述的表达载体。
27.权利要求26所述的细胞系，其中所述宿主细胞选自：CHO细胞、F2N细胞、BHK细胞、SP2/0细胞、NS0细胞和HEK293细胞。
28.从感染甲型流感病毒的患者筛选具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子的方法，所述方法包括以下步骤：
1)从感染甲型流感病毒的患者中筛选出其血液为甲型流感病毒阴性的患者；
2)从步骤1)筛选出的所述患者收集血液；
3)从步骤2)收集的所述患者血液分离B细胞；
4)从步骤3)分离的B细胞中筛选出产生结合血凝素(HA)之结合分子的B细胞；
5)从步骤4)筛选出的B细胞提取RNA；
6)从步骤5)提取的RNA扩增结合分子基因；
7)将步骤6)扩增的基因克隆到表达载体中；
8)将步骤7)的表达载体转染到宿主细胞中；
9)从源自步骤8)所制备经转染细胞的结合分子中筛选结合HA的结合分子；
10)制备并培养用于所筛选出的结合分子的细胞系；
11)从步骤10)的细胞培养物中纯化结合甲型流感病毒HA的结合分子；
12)再确认步骤11)中纯化的结合分子是否具有针对甲型流感病毒的中和活性；以及
13)对步骤12)中经确认具有针对甲型流感病毒的中和活性的结合分子进行再筛选。
29.权利要求28所述的方法，其中所述结合分子是抗体。
30.权利要求29所述的方法，其中所述抗体是Fab片段、Fv片段、双抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
31.权利要求28所述的方法，其中所述甲型流感病毒选自：H1、H3、H5、H7和H9亚型。
32.组合物，其包含根据权利要求1、4至7和13至16中任一项所述的具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子。
33.用于预防和治疗由甲型流感病毒引起的疾病的组合物，所述组合物包含根据权利要求1、4至7和13至16中任一项所述的具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子。
34.用于诊断甲型流感病毒的组合物，所述组合物包含缀合物，所述缀合物包含与根据权利要求1、4至7和13至16中任一项所述的具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子连接的标签。
35.权利要求34所述的组合物，其中所述标签是选自以下的任一种：酶、萤光素酶、放射性同位素和毒素。
36.用于治疗由甲型流感病毒引起的疾病的方法，所述方法包括向患有所述疾病的对象施用治疗有效量的根据权利要求1、4至7和13至16中任一项所述的具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子。
37.权利要求36所述的方法，其中所述甲型流感病毒选自：H1、H3、H5、H7和H9亚型。
38.用于预防由甲型流感病毒引起的疾病的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的根据权利要求1、4至7和13至16中任一项所述的具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子。
39.权利要求38所述所述的方法，其中所述甲型流感病毒选自：H1、H3、H5、H7和H9亚型。
40.用于诊断患者的甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括以下步骤：
1)将样品与根据权利要求1、4至7和13至16中任一项所述的具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子相接触；以及
2)检测所述结合分子与所述样品之间的反应。
41.用于诊断患者的甲型流感病毒感染的方法，所述方法包括以下步骤：
1)将样品与权利要求34所述的组合物相接触；以及
2)检测步骤1)中的所述样品与所述组合物之间的反应。
42.权利要求40或41的方法，其中所述甲型流感病毒选自：H1、H3、H5、H7和H9亚型。
43.用于诊断甲型流感病毒的试剂盒，其包含：
1)根据权利要求1、4至7和13至16中任一项所述的具有针对甲型流感病毒之中和活性的结合分子；以及
2)容器。
44.用于诊断甲型流感病毒的试剂盒，其包含：
1)根据权利要求34所述的用于诊断甲型流感病毒的组合物；以及
2)容器。
45.权利要求43或44所述的试剂盒，其中所述甲型流感病毒选自：H1、H3、H5、H7和H9亚型。
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