JPWO2016010160A1

JPWO2016010160A1 - 抗インフルエンザウイルス抗体及びその利用

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Publication number: JPWO2016010160A1
Application number: JP2016534514A
Authority: JP
Inventors: 慎二齊藤; 忠樹鈴木; 長谷川　秀樹; 秀樹長谷川; 章相内; 希代子後藤; 智規上野
Original assignee: DIRECTOR-GENERAL OF NATIONAL INSTITUTE OF INFECTIOUS DISEASES; Nippi Inc
Current assignee: DIRECTOR-GENERAL OF NATIONAL INSTITUTE OF INFECTIOUS DISEASES; Nippi Inc
Priority date: 2014-07-18
Filing date: 2015-07-21
Publication date: 2017-06-01
Also published as: WO2016010160A1

Abstract

Ａ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する、抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメント；抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含有する、インフルエンザウイルスによる感染症の治療又は予防剤；抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸及びベクター。

Description

本発明は、抗インフルエンザウイルス抗体及びその利用に関する。本願は、２０１４年７月１８日に、日本に出願された特願２０１４−１４８３２９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

抗体の最大の特徴は、標的である抗原にだけ強く結合し、それ以外には結合しないという抗原結合活性と特異性の高さである。抗体は、この抗原結合活性と特異性の総和により中和活性等の機能活性を有しており、抗体医薬、診断薬、生物学研究ツール等としてバイオ産業全般で幅広く利用されている。

近年、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体の大量製造系が確立され、抗体医薬は主要な医薬品の１つとなっている。しかしながら、ほとんどのモノクローナル抗体はＩｇＧ型であり、特に抗体医薬に関してはＩｇＧ型のみしか実用化されていない。

一方、抗体には、ＩｇＧの他にＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等の様々なアイソタイプが存在しており、それぞれ生体内での機能が異なっている。例えば、ＩｇＧは生体内血液中の主たる抗体であるが、粘膜上皮を覆う粘液や分泌液中の主たる抗体はＩｇＡであり、粘膜感染症における生体防御機構の最前線として機能していることが知られている（例えば、非特許文献１を参照）。

また、ＩｇＡやＩｇＭ等の一部の抗体は、同一の可変領域を有する抗体同士が二量体や五量体などの多量体を形成し、生体内で機能していることが知られている。例えば、多発性骨髄腫の患者の血清、初乳や唾液等の分泌液中には、多量体ＩｇＡが存在することが知られている。

そして、多発性骨髄腫の患者血清中には、単量体、二量体、三量体、四量体のＩｇＡが様々な割合で含まれていることが明らかにされている。また、分泌液中には、二量体と四量体が含まれることが報告されている。しかしながら、これらの多量体抗体の生理学的意義については、ほとんど分かっていない。

また、人為的に二量体ＩｇＡを作製する技術は既に報告されているが、その収率は悪く、ＩｇＧをＩｇＡ型に変換したことによる高機能化が達成された例はない。また、人為的に三量体以上の多量体ＩｇＡを作製する技術は知られていない。

Woof J.M. and Russell M.W., Structure and function relationships in IgA, Mucosal immunology, 4(6), 590-597, 2011

本発明は、複数の型のインフルエンザウイルスに対する中和活性を有する抗体又はそのフラグメントを提供することを目的とする。本発明はまた、インフルエンザウイルスによる感染症の治療又は予防剤、及び抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸及びベクターを提供することを目的とする。

本発明は以下の通りである。
［１］Ａ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する、抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメント。

［２］（ａ１）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｂ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｃ１）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ１）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｅ１）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｆ１）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメインを有する、［１］に記載の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメント。

［３］配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメインを有する、［２］に記載の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメント。

［４］配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、及び／又は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを有する、［２］又は［３］に記載の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメント。

［５］（ａ２）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｂ２）配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｃ２）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ２）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｅ２）配列番号１３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｆ２）配列番号１４に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメインを有する、［１］に記載の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメント。

［６］配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメインを有する、［５］に記載の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメント。

［７］配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、及び／又は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを有する、［５］又は［６］に記載の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメント。

［８］ＩｇＡ型である、［１］〜［７］のいずれかに記載の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメント。

［９］多量体ＩｇＡ型である、［１］〜［８］のいずれかに記載の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメント。

［１０］［１］〜［９］のいずれかに記載の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含有する、インフルエンザウイルスによる感染症の治療又は予防剤。

［１１］［１］〜［８］のいずれかに記載の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸。

［１２］（ｇ１）配列番号１７に示される塩基配列からなる核酸、
（ｈ１）配列番号１７に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の重鎖可変ドメインをコードする核酸、
（ｉ１）配列番号１７に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の重鎖可変ドメインをコードする核酸、又は、
（ｊ１）配列番号１７に示される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の重鎖可変ドメインをコードする核酸。

［１３］（ｇ２）配列番号１８に示される塩基配列からなる核酸、
（ｈ２）配列番号１８に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の軽鎖可変ドメインをコードする核酸、
（ｉ２）配列番号１８に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の軽鎖可変ドメインをコードする核酸、又は、
（ｊ２）配列番号１８に示される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の軽鎖可変ドメインをコードする核酸。

［１４］（ｇ３）配列番号１９に示される塩基配列からなる核酸、
（ｈ３）配列番号１９に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の重鎖可変ドメインをコードする核酸、
（ｉ３）配列番号１９に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の重鎖可変ドメインをコードする核酸、又は、
（ｊ３）配列番号１９に示される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の重鎖可変ドメインをコードする核酸。

［１５］（ｇ４）配列番号２０に示される塩基配列からなる核酸、
（ｈ４）配列番号２０に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の軽鎖可変ドメインをコードする核酸、
（ｉ４）配列番号２０に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の軽鎖可変ドメインをコードする核酸、又は、
（ｊ４）配列番号２０に示される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の軽鎖可変ドメインをコードする核酸。

［１６］［１１］〜［１５］のいずれかに記載の核酸を発現ベクターに挿入してなる組換えベクター。

本発明によれば、複数の型のインフルエンザウイルスに対する中和活性を有する抗体又はそのフラグメントを提供することができる。本発明はまた、インフルエンザウイルスによる感染症の治療又は予防剤、及び抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸及びベクターを提供することができる。

発現及び精製した遺伝子組換えモノクローナルＩｇＧ１抗体の各クローンをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した結果を示す写真である。発現及び精製した遺伝子組換えモノクローナルＩｇＡ１抗体の各クローンをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した結果を示す写真である。Ｊ鎖非共発現下もしくはＪ鎖共発現下で発現及び精製したＩｇＡ１抗体を未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＢＮ−ＰＡＧＥ）に供し、染色液（０．０２％クーマシーＲ−２５０，３０％メタノール，１０％酢酸）で染色した結果を示す写真である。多量体ＩｇＡ１抗体をサイズ分画したゲル濾過クロマトグラフィーのチャート及び各分画を未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＢＮ−ＰＡＧＥ）に供し、染色液（０．０２％クーマシーＲ−２５０，３０％メタノール，１０％酢酸）で染色した結果を示す写真である。単量体ＩｇＧ１型抗体のインフルエンザウイルス中和活性を１とした場合における、単量体ＩｇＡ１型抗体、二量体ＩｇＡ１型抗体及び四量体ＩｇＡ１型抗体の中和活性比を示すグラフである。単位タンパク質量当たりの中和活性比を示す。単量体ＩｇＧ１型抗体のインフルエンザウイルス中和活性を１とした場合における、単量体ＩｇＡ１型抗体、二量体ＩｇＡ１型抗体及び四量体ＩｇＡ１型抗体の中和活性比を示すグラフである。単位分子数あたりの中和活性比を示すグラフである。ＣＨＯＹＡ７細胞とｃｉｓ−エレメント使用による多量体抗体の発現増強効果を確認するための未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＢＮ−ＰＡＧＥ）の結果を示す写真である。

＜用語の説明＞
ＩｇＡ型抗体に関連して、従来用いられている用語について以下に説明する。

［単量体ＩｇＡ（ＭｏｎｏｍｅｒｉｃＩｇＡ、ｍＩｇＡ）］
ＩｇＡは、血清中では、主に単量体ＩｇＡとして分子量１７万前後で存在しており、ＩｇＡ１が主要構成要素である。

［二量体ＩｇＡ（ＤｉｍｅｒｉｃＩｇＡ、ｄＩｇＡ）］
二量体ＩｇＡとは、粘膜固有層に存在する形質細胞が産生する二量体ＩｇＡであって、重鎖：軽鎖：Ｊ鎖の割合が４：４：１である分子を指す。ＩｇＡ２が約半分程度存在する。

［多量体ＩｇＡ（ＰｏｌｙｍｅｒｉｃＩｇＡ、ｐＩｇＡ）］
従来、ポリメリックＩｇ受容体により認識される二量体以上のＩｇＡを総称して、多量体ＩｇＡという場合が多い。すなわち、重鎖：軽鎖：Ｊ鎖の構成比が４：４：１の複合体である二量体ＩｇＡが主成分で、抗体Ｊ鎖タンパク質（Ｊｏｉｎｉｎｇｃｈａｉｎ）によりＩｇＡ二分子が結合し、分泌成分タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙｃｏｍｐｏｎｅｎｔ、ＳＣタンパク質）を含む場合と含まない場合の両方について「多量体ＩｇＡ」という用語が使用されている。

すなわち、形質細胞が分泌する多量体ＩｇＡ（重鎖：軽鎖：Ｊ鎖の構成比が４：４：１の複合体）を指して「多量体ＩｇＡ」という場合と、粘膜上皮細胞より分泌されるＳ−ＩｇＡ（重鎖：軽鎖：Ｊ鎖：ＳＣの構成比が４：４：１：１の複合体）を指して「多量体ＩｇＡ」という場合、及びこれら両者を指す場合が散見され、厳密に区別されずに使用されている。電気泳動での移動度、ゲル濾過クロマトグラフィーでの挙動から二量体ＩｇＡより分子量が大きい成分も検出され、二量体以上であろうと予想されて多量体ＩｇＡと呼ばれている場合もあるが、凝集体との鑑別はなされていないため、分子構造の詳細は不明である。

［ポリメリックＩｇ受容体（ｐＩｇＲ、多量体免疫グロブリン受容体）］
粘膜上皮細胞の基底膜側の細胞膜上に発現しているｐＩｇＲは、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するＩ型の膜貫通型蛋白質で、細胞外ドメイン部分、膜貫通部、細胞質内領域からなる。ｐＩｇＲは粘膜固有層に存在する形質細胞が産生したＪ鎖を含む二量体／多量体型Ｉｇ分子を特異的に認識して結合し、上皮細胞中への取り込み後も結合したままアピカル側へ輸送される。上皮細胞内から粘膜面への放出には、ｐＩｇＲの細胞外ドメイン部分と膜貫通部との間で切断が必要で、上皮細胞のタンパク質分解酵素による切断後に内腔側粘膜層へＳ−ＩｇＡとして分泌される。このｐＩｇＲの細胞外ドメイン部分がＩｇＡ複合体の構成成分となる事実に由来して、分泌成分タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙｃｏｍｐｏｎｅｎｔ、ＳＣタンパク質）とも呼ばれている。ｐＩｇＲは五量体ＩｇＭの取り込みにも同様にして機能している。

ＳＣタンパク質はｐＩｇＲの細胞外ドメイン部分であり分子量約７０ｋＤａの高度に糖鎖修飾を受けたポリペプチドである。Ｎ末端から５つの免疫グロブリン様ドメインを持ち、それぞれＤ１からＤ５と名付けられており、このうちＤ１からＤ３までが二量体ＩｇＡとの結合に必要で、特にＤ１は免疫グロブリンの可変領域のｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎｓ（ＣＤＲｓ）に類似した構造をもち二量体ＩｇＡとの結合に重要な役割を担う。この相互作用には、Ｄ１のＣＤＲ１中のＴｈｒ２７−Ｔｈｒ３３が関与する。またＤ１のＣＤＲ２ループ中のＧｌｕ５３−Ｇｌｙ５４も寄与するとの報告もある。Ｊ鎖は分子量１５ｋＤａのポリペプチド鎖であり、Ｎ結合型糖鎖を持ち免疫グロブリン構造をとるように折りたたまれている。哺乳類と鳥類のＪ鎖を比較した場合、一次構造や抗原認識の交差性において非常に高い相同性を持つため、それらの基本特性が生物間で保存されてきたと考えられている。Ｊ鎖は二量体ＩｇＡがｐＩｇＲと相互作用する上で必要不可欠である。Ｊ鎖を取り込んだ二量体ＩｇＡは、ｐＩｇＲのＤ１とＩｇＡのＦｃ領域又はｐＩｇＲとＪ鎖との間に相互作用を生じ、その後にＩｇＡＣα２ドメイン中の３１１番目のｃｙｓ残基とＳＣのＤ５の４６７番目のｃｙｓ残基間にＳ−Ｓ結合が形成されると考えられている。（Mucosal immunology, 4(6), 590-597, 2011、清野宏（２０１０）．臨床粘膜免疫学株式会社シナジー）

［分泌型ＩｇＡ（ＳｅｃｒｅｔｏｒｙＩｇＡ、Ｓ−ＩｇＡ）］
粘膜上皮細胞より分泌され、ＳＣタンパク質を含んだ二量体以上のＩｇＡ複合体を指し、ＳｅｃｒｅｔｏｒｙｄｉｍｅｒｉｃＩｇＡ（Ｓ−ｄＩｇＡ）の場合は重鎖：軽鎖：Ｊ鎖：ＳＣの構成比が４：４：１：１である。

［多量体ＩｇＡと分泌型多量体ＩｇＡの違い］
粘膜固有層に存在する形質細胞が産生する多量体ＩｇＡの分子量等の性状解析は技術的に困難なため、分泌型多量体ＩｇＡ形成の詳細な分子形成過程は不明である。すなわち、生体内で形質細胞が産生する主要な分泌型多量体ＩｇＡは、二量体、三量体、四量体等の多量体のうちどれが主であるか、多量体化は上皮細胞内で起こっているかどうか、粘膜部で生体防御に中心的役割を果たしているのがどの型かも不明である。生体内ＩｇＡ及び組換え体でも二量体（４４０ｋＤａ付近）より大きいＩｇＡも微量検出されているが、凝集体との鑑別はなされていない。

［本明細書での多量体ＩｇＡの定義］
本明細書においては、分泌成分タンパク質（ＳＣ）を分子内に有する多量体抗体を分泌型抗体という。また、次のように表記する場合がある。
・単量体抗体＝ｍＩｇＡ
・二量体抗体＝ｄＩｇＡ
・分泌型二量体抗体＝Ｓ−ｄＩｇＡ
・分泌型三量体抗体＝Ｓ−ｔＩｇＡ
・分泌型四量体抗体＝Ｓ−ｑＩｇＡ
・四量体以上の分泌型多量体抗体＝Ｓ−ｐＩｇＡ
・組換え単量体抗体＝ｒｍＩｇＡ
・組換え二量体抗体＝ｒｄＩｇＡ
・組換え分泌型二量体抗体＝ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＳ−ｄＩｇＡ（ｒＳ−ｄＩｇＡ）
・組換え分泌型三量体抗体＝ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＳ−ｔＩｇＡ（ｒＳ−ｔＩｇＡ）
・組換え分泌型四量体抗体＝ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＳ−ｑＩｇＡ（ｒＳ−ｑＩｇＡ）
・四量体以上の組換え分泌型多量体抗体＝ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＳ−ｐＩｇＡ（ｒＳ−ｐＩｇＡ）
ここでは、分泌成分タンパク質（ＳＣ）を分子内に有する場合に「Ｓ−」を分子名の頭に付記する。分子内にＳＣを有さない抗体は「Ｓ−」を付記しない。また、分子の会合状態を、ＩｇＡの前に略称を付記することにより表記する。単量体は「ｍ」、二量体は「ｄ」、三量体は「ｔ」、四量体は「ｑ」、四量体以上の多量体は「ｐ」を付記する。また、単量体抗体と組換え単量体抗体を特に区別なく「ｍｏｎｏｍｅｒ」と表記する場合がある。また、二量体抗体と分泌型二量体抗体、組換え二量体抗体、組換え分泌型二量体抗体を特に区別なく「ｄｉｍｅｒ」と表記する場合がある。また、分泌型三量体抗体と組換え分泌型三量体抗体を特に区別なく「ｔｒｉｍｅｒ」と表記する場合がある。また、分泌型四量体抗体と組換え分泌型四量体抗体を特に区別なく「ｔｅｔｒａｍｅｒ」と表記する場合がある。また、四量体以上の分泌型抗体と四量体以上の組換え分泌型多量体抗体を特に区別なく「ｐｏｌｙｍｅｒ」と表記する場合がある。

＜抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメント＞
１実施形態において、本発明は、Ａ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する、抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。

抗原結合フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、抗原を認識するために必要な最小単位である重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインをフレキシブルなペプチドリンカーで結合した単可変ドメインフラグメント等が挙げられる。単可変ドメインフラグメントとしては、例えばｓｃＦｖ抗体が挙げられる。

本実施形態の抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ａ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方を中和することができる。

［第一実施形態］
本実施形態の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントは、後述する抗体クローンＦ１１に関連するものである。本実施形態の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントは、（ａ１）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｂ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｃ１）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ１）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｅ１）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｆ１）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメインを有する。

更に、抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメインを有することが好ましい。

更に、抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、及び／又は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを有することが好ましい。

本実施形態の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ａ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する限り、上記（ａ１）〜（ｆ１）の配列番号１〜６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されていてもよい。

ここで、欠失、置換又は付加されていてもよいアミノ酸の数としては１〜５個が好ましく、１〜２個がより好ましい。

［第２実施形態］
本実施形態の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントは、後述する抗体クローンＨ５に関連するものである。本実施形態の抗体又はその抗原結合フラグメントは、（ａ２）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｂ２）配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｃ２）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ２）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｅ２）配列番号１３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｆ２）配列番号１４に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメインを有する。

更に、抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメインを有することが好ましい。

更に、抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、及び／又は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを有することが好ましい。

本実施形態の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ａ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する限り、上記（ａ２）〜（ｆ２）の配列番号９〜１４に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されていてもよい。

［第三実施形態］
本実施形態の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＡ型であることが好ましい。本実施形態の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントは、更に、多量体ＩｇＡ型であることが好ましい。

本実施形態の多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体は、分子内に分泌成分タンパク質（ＳＣ）を含むことが好ましい。また、二量体以上であることが好ましく、三量体以上であることがより好ましく、四量体以上であることが更に好ましい。

粘膜上皮を覆う粘液や分泌液中の主たる抗体はＩｇＡであり、粘膜感染症における生体防御機構の最前線として機能しているにもかかわらず、ＩｇＡは抗体医薬として実用化されていないのが現状である。

発明者らは、次世代インフルエンザワクチンとしてインフルエンザウイルス不活化全粒子抗原を用いた安全で簡便な接種を特徴とする経鼻不活化全粒子インフルエンザワクチンの開発研究を行ってきた。これまでに、動物を用いた基礎研究に加え健康成人ボランティアを募った臨床研究においても良い成績を得ており、実用化を見据えた臨床開発の段階に入りつつある。

この過程で、発明者らは、経鼻不活化インフルエンザワクチンを接種したヒトの呼吸器粘膜上でウイルス感染防御に重要な役割を果たすＩｇＡ抗体の中に二量体よりも大きい多量体抗体が存在し、インフルエンザウイルス中和活性が単量体、二量体抗体よりも高いことを見出した。

また、後述するように、発明者らは、多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体を効率的に作製することに初めて成功し、多量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体が、単量体、二量体抗体よりも高いインフルエンザウイルス中和活性及びＨＡタンパク質結合活性を有することを明らかにした。

したがって、ＩｇＡ型、特に多量体ＩｇＡ型である抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ａ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対するより高い中和活性を有する。

＜インフルエンザウイルスによる感染症の治療又は予防剤＞
１実施形態において、本発明は、上記の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含有する、インフルエンザウイルスによる感染症の治療又は予防剤を提供する。

本実施形態の治療又は予防剤は、Ａ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対するより高い中和活性を有するため、インフルエンザウイルスによる感染症の治療又は予防効果が高い。

本実施形態の治療又は予防剤は、インフルエンザウイルスによる感染リスクが高い対象に対して、予防を目的として投与してもよい。あるいは、インフルエンザウイルスによる感染が認められた患者に対して、治療及びウイルス拡散防止を目的として投与してもよい。

本実施形態の治療又は予防剤は、粉剤、液剤等の剤型に製剤化して投与することができる。本実施形態の治療又は予防剤には、例えば、噴霧した抗体の滞留性を高める目的で、既に市販されているアレルギー性鼻炎に対する点鼻薬に通常含まれるような増粘剤を添加してもよい。

本実施形態の治療又は予防剤は、鼻腔粘膜上への噴霧による投与、ネブライザーを用いた下気道への吸入による投与等により投与することができる。

鼻腔粘膜上への噴霧による投与は、例えば、Ainai A, et al., Intranasal vaccination with an inactivated whole influenza virus vaccine induces strong antibody responses in serum and nasal mucus of healthy adults., Hum Vaccin Immunother. 9(9), 1962-1970, 2013. に記載された、経鼻全粒子不活化インフルエンザワクチンと同様にして行うことができる。

本実施形態の治療又は予防剤を、鼻腔粘膜上に噴霧により投与する場合、例えば、両側鼻孔に片鼻２５０μＬずつ噴霧するとよい。また、投与抗体量は、接種１回（５００μＬ）あたり、数百μｇ〜数ｍｇであってもよい。噴霧には、例えば、経鼻不活化全粒子インフルエンザワクチンに使用される噴霧デバイスを使用すればよい。また、１日あたり２回（朝晩）〜４回（６時間ごとに１回）噴霧すればよい。投与期間としては、例えば１週間が挙げられる。

また、本実施形態の治療又は予防剤を、下気道への吸入により投与する場合、例えば、通常使用されるエアロゾルタイプの吸入器を使用するとよい。吸入抗体量は、例えば、１回の吸入あたり数ｍｇ〜数十ｍｇであってもよい。また、１日あたり２回（朝晩）程度吸入すればよい。投与期間としては、例えば１週間が挙げられる。

本実施形態の治療又は予防剤は、ヒトを対象とするものであってもよく、例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等の家畜；イヌ、ネコ等の愛玩動物；チンパンジー、ゴリラ、カニクイザル等の霊長類；マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類等を対象とするものであってもよい。

本実施形態の治療又は予防剤において、ＩｇＡ重鎖、ＩｇＡ軽鎖、Ｊ鎖、分泌成分タンパク質（以下、「ＳＣ」という場合がある。）は、対象とする動物由来のアミノ酸配列を有している（対象とする動物型である）ことが好ましい。ここで、対象とする動物型であるとは、多量体抗体をコードするＩｇＡ重鎖、ＩｇＡ軽鎖の定常領域が対象とする動物のＩｇＡ重鎖、ＩｇＡ軽鎖の定常領域のアミノ酸配列を有していることを意味する。また、Ｊ鎖、分泌成分タンパク質が対象とする動物型であるとは、Ｊ鎖、分泌成分タンパク質が、対象とする動物のＪ鎖、分泌成分タンパク質のアミノ酸配列を有していることを意味する。ＩｇＡ重鎖、ＩｇＡ軽鎖、Ｊ鎖、分泌成分タンパク質のアミノ酸配列は、目的とする抗原結合活性を有している限り変異を含んでいてもよい。

本実施形態の治療又は予防剤において、抗体はＩｇＡ型抗体と非ＩｇＡ型抗体とのキメラであってもよい。本明細書において、ＩｇＡ型抗体とは、少なくとも１部がＩｇＡ型抗体に由来するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。いい換えると、ＩｇＡ型抗体とは、一般的な抗ＩｇＡポリクローナル抗体が反応するタンパク質であるということもできる。

＜抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸＞
１実施形態において、本発明は、上述した抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸を提供する。

本実施形態の核酸は、抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントの製造に好適に用いることができる。

［第一実施形態］
本実施形態の核酸は、後述する抗体クローンＦ１１に関連するものであり、具体的には、以下の（ｇ１）〜（ｊ２）のいずれかの核酸である。

以下の（ｇ１）〜（ｊ１）の核酸は、後述する抗体クローンＦ１１の重鎖可変ドメインに関連する。
（ｇ１）配列番号１７に示される塩基配列からなる核酸、
（ｈ１）配列番号１７に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の重鎖可変ドメインをコードする核酸、
（ｉ１）配列番号１７に示される塩基配列と同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の重鎖可変ドメインをコードする核酸、又は、
（ｊ１）配列番号１７に示される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の重鎖可変ドメインをコードする核酸。

以下の（ｇ２）〜（ｊ２）の核酸は、後述する抗体クローンＦ１１の軽鎖可変ドメインに関連する。
（ｇ２）配列番号１８に示される塩基配列からなる核酸、
（ｈ２）配列番号１８に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の軽鎖可変ドメインをコードする核酸、
（ｉ２）配列番号１８に示される塩基配列と同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の軽鎖可変ドメインをコードする核酸、又は、
（ｊ２）配列番号１８に示される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の軽鎖可変ドメインをコードする核酸。

核酸としてはＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ等が挙げられる。核酸は、非天然型の塩基配列を有していてもよく、遺伝子組換えされたものであってもよい。本明細書において、欠失、置換又は付加されてもよい塩基の数としては、１〜３０個が好ましく、１〜１５個がより好ましく、１〜１０個が特に好ましく、１〜５個が最も好ましい。

また、本明細書において「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬＳＥＣＯＮＤＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）に記載の方法が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、０．１重量％Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％ホルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、５５〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。

［第二実施形態］
本実施形態の核酸は、後述する抗体クローンＨ５に関連するものであり、具体的には、以下の（ｇ３）〜（ｊ４）のいずれかの核酸である。

以下の（ｇ３）〜（ｊ３）の核酸は、後述する抗体クローンＨ５の重鎖可変ドメインに関連する。
（ｇ３）配列番号１９に示される塩基配列からなる核酸、
（ｈ３）配列番号１９に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の重鎖可変ドメインをコードする核酸、
（ｉ３）配列番号１９に示される塩基配列と同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の重鎖可変ドメインをコードする核酸、又は、
（ｊ３）配列番号１９に示される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の重鎖可変ドメインをコードする核酸。

以下の（ｇ４）〜（ｊ４）の核酸は、後述する抗体クローンＨ５の軽鎖可変ドメインに関連する。
（ｇ４）配列番号２０に示される塩基配列からなる核酸、
（ｈ４）配列番号２０に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の軽鎖可変ドメインをコードする核酸、
（ｉ４）配列番号２０に示される塩基配列と同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の軽鎖可変ドメインをコードする核酸、又は、
（ｊ４）配列番号２０に示される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の軽鎖可変ドメインをコードする核酸。

＜組換えベクター＞
１実施形態において、本発明は、上述した核酸を発現ベクターに挿入してなる組換えベクターを提供する。本実施形態のベクターは、抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントの製造に好適に用いることができる。

本実施形態に用いられる発現ベクターとしては、宿主細胞に抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる細胞系ベクター；適当な細胞から抽出されたタンパク質合成能を有する成分からなるタンパク質翻訳系において抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる無細胞系ベクターが挙げられる。

細胞系ベクターとしては、宿主細胞に適した公知の発現ベクターが用いられる。例えば、大腸菌においてはｐＢＲ３２２誘導体に代表されるＣｏｌＥ系プラスミド、ｐ１５Ａオリジンを持つｐＡＣＹＣ系プラスミド、ｐＳＣ系プラスミド、Ｂａｃ系等のＦ因子由来ミニＦプラスミドが挙げられる。その他、ｔｒｃやｔａｃ等のトリプトファンプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター等を有する発現ベクターも挙げられる。

核酸が組込まれた組換えベクターの宿主への導入は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、カルシウム処理された菌体を用いるコンピテント細胞法や、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、プラスミドベクター以外にもファージベクターを用いて、菌体内に感染させ導入する方法を用いてもよい。

宿主細胞としては、哺乳動物細胞、昆虫細胞等が挙げられる。哺乳動物細胞としては、２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯＹＡ７細胞等が挙げられ、特にＣＨＯＹＡ７細胞（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−０１５３５）が好ましい。昆虫細胞としては、Ｓｆ９細胞株、Ｓｆ２１細胞株等が挙げられる。

ＣＨＯＹＡ７細胞株は、発明者らが樹立した細胞株であり、ｐ１８０タンパク質及びＳＦ３ｂ４タンパク質を細胞内で構成的に発現している。

ｐ１８０タンパク質及びＳＦ３ｂ４タンパク質を細胞中で発現させることにより、当該細胞内の小胞体膜上において、ポリソーム形成を促進することができる。ここで、ポリソームとは、細胞内の小胞体膜上に存在する複数のリボソームに対して、１分子のｍＲＮＡが結合したものである。ポリソーム形成の促進の結果として、タンパク質の合成能を亢進し、目的タンパク質の生産効率を向上させることができる。

細胞内のＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ前駆体は、スプライシングによりイントロン部分が除去され、成熟型ｍＲＮＡに変換される。この過程は、スプライソソームという核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）−タンパク質からなる巨大複合体が担う。スプライソソームには、５種類の低分子リポ核タンパク質複合体（ｓｎＲＮＰ）が存在し、ＳＦ３ｂ４タンパク質はこのうちのＵ２−ｓｎＲＮＰの構成成分であり、ＲＮＡ結合ドメインを有している。

発明者らは、ＳＦ３ｂ４タンパク質が細胞質内の小胞体を含む膜画分で優位に増加し、それとともにｍＲＮＡと結合したＳＦ３ｂ４タンパク質が、ｐ１８０タンパク質のｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインと相互作用することにより、ｍＲＮＡの小胞体への局在化を促進させ、その結果として細胞によるタンパク質の合成能又は分泌能が亢進されることを明らかにした。

したがって、ｐ１８０タンパク質及びＳＦ３ｂ４タンパク質の発現が亢進された細胞において、目的タンパク質をコードする核酸を発現させると、当該核酸から転写されたｍＲＮＡがＳＦ３ｂ４タンパク質又はｐ１８０タンパク質と相互作用した結果、あるいは上記ｍＲＮＡがＳＦ３ｂ４タンパク質と相互作用し、次いでｐ１８０タンパク質のｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインとＳＦ３ｂ４タンパク質とが相互作用した結果、ｍＲＮＡの小胞体への局在化を促進させ、この細胞内において目的タンパク質の合成能又は分泌能が亢進される。

発明者らは、更に、成熟ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に、配列モチーフＧＡＮ_１−（Ｘ）_ｎ−ＡＣＮ_２（ｎは３〜６の整数であり、Ｎ_１及びＮ_２は、それぞれ独立して、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかである。）からなる塩基配列を１〜数個含むｃｉｓ−エレメントが存在すると、当該ｃｉｓ−エレメントを認識するＲＲＭタンパク質が当該ｃｉｓ−エレメントに結合し、分泌タンパク質の合成の場である小胞体の膜上へのｍＲＮＡの輸送／局在化を増強し、翻訳効率を上昇させる機能があることを見出している。

したがって、本実施形態の発現ベクターにおいて、プロモーターの下流、かつ上記の核酸の開始コドンの上流に、上記のｃｉｓ−エレメントを導入すると、発現効率を高めることができる。

本実施形態に用いられる無細胞系ベクターとしては、細胞系ベクターにおいて挙げられたＴ７プロモーターを有する発現ベクターやＴ３プロモーターを有する発現ベクター；ＳＰ６プロモーター又はＴ７プロモーターを有するｐＥＵ系プラスミド等の小麦無細胞タンパク質合成用ベクター等が挙げられる。

無細胞系ベクターを用いたタンパク質合成においては、先ず、転写系を用いて、抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントのＤＮＡを転写して、ｍＲＮＡを合成する。係る転写系としては、ＲＮＡポリメラーゼにより転写させる従来公知のものが挙げられる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。

次いで、翻訳系である無細胞タンパク質合成系を用いて、ｍＲＮＡを翻訳し、タンパク質を合成する。この系にはリボゾーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素等、翻訳に必要な要素が含まれている。このようなタンパク質翻訳系として、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が挙げられる。

更に、上記翻訳に必要な要素が独立に精製された因子のみからなる再構成型無細胞タンパク質合成系が挙げられる。

細胞系ベクター又は無細胞系ベクターを用いて合成されたタンパク質から抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントを精製して用いることができる。精製方法としては、塩析法や各種クロマトグラフィーを用いた方法が挙げられる。発現ベクターが目的タンパク質のＮ末端又はＣ末端にヒスチジンタグ等のタグ配列を発現するように設計されている場合には、ニッケルやコバルト等、このタグに親和性を有する物質を用いたアフィニティーカラムによる精製方法が挙げられる。その他、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィー等、適宜組み合わせて精製することにより、精製抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントの純度を高めることができる。

以下、実験例により本発明を説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。

［実験例１：経鼻不活化全粒子インフルエンザワクチンによりヒトに誘導される抗体可変領域遺伝子の単離及びそれを利用したモノクローナルＩｇＧ１抗体の作製］
（ワクチン接種と末梢血リンパ球の回収）
高病原性トリインフルエンザウイルスＡ／Ｈ５Ｎ１の不活化全粒子ワクチンを健康成人へ３週間隔で２回経鼻接種（片鼻２５０μＬ、計５００μＬ）した。ワクチンとしては、４５μｇのヘマグルチニン（ＨＡ）を含有する不活化全粒子ワクチンを使用した。２回目のワクチン接種から７日後に末梢血を回収し、血球分離溶液Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（ＡＸＩＳ−ＳＨＩＥＬＤ社）を用いて末梢血リンパ球を回収した。

（抗体産生形質細胞の単離及びｃＤＮＡ調製）
経鼻ワクチン接種により末梢血中に誘導された抗体産生形質細胞の単離は、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて実施した。細胞表面マーカーＣＤ２⁻、ＣＤ３⁻、ＣＤ４⁻、ＣＤ１０⁻、ＣＤ２０⁻、ＩｇＤ⁻、ＣＤ１９^ｌｏｗ、ＣＤ２７^ｈｉｇｈかつＣＤ３８^ｈｉｇｈの細胞集団を抗体産生形質細胞とし、単一細胞として分離・回収した。単一抗体産生形質細胞は、各ウェルに４５ｎｇのキャリアＲＮＡを含む滅菌水９μＬを分注した９６穴プレートに回収した。ｃＤＮＡ調製は、Ｔ．Ｔｉｌｌｅｒら（J Immunol Methods, 329, 112-24, 2008）の報告に則り実施した。具体的には、細胞を回収した各ウェルにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩＲＴ（ライフテクノロジーズ社）、ＲａｎｄａｍＨｅｘａｍｅｒ（ライフテクノロジーズ社）、ＲＮａｓｅＯＵＴ（ライフテクノロジーズ社）、ｄＮＴＰｍｉｘ（キアゲン社）を含む６μＬの混合液を添加し、５０℃５０分、８５℃５分の反応を行うことでｃＤＮＡを調製した。

（抗体アイソタイプの決定）
調製したｃＤＮＡを２μＬ用いて、各ウェルに単離された抗体重鎖のアイソタイプをＲｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲにより決定した。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭの各定常領域に対してＴａｑＭａｎプローブとプライマーを準備した。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭに対するＴａｑＭａｎプローブは、それぞれＦＡＭ、ＨＥＸおよびＣｙ５による標識とした。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲＮｏＲＯＸＭａｓｔｅｒＭｉｘ（キアゲン社）を使用し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（ロシュ社）を用いて解析を行った。

（抗体可変領域遺伝子の増幅及びシークエンス）
抗体可変領域遺伝子の増幅は、Ｔ．Ｔｉｌｌｅｒら（J Immunol Methods, 329, 112-24, 2008）の報告に則り実施した。具体的には、調製したｃＤＮＡ１μＬに対して１１．５μＬのＨｏｔＳｔａｒＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（キアゲン社）、ｄＮＴＰｍｉｘ及び各抗体可変領域遺伝子を増幅するプライマーセットの混合液を添加し、１回目のＰＣＲ反応を行った。更にこのＰＣＲ産物１μＬに含まれる各遺伝子に対して更に内側に設計したプライマーセットを用いて２回目のＰＣＲ反応を行った。いずれのＰＣＲ反応においても、９５℃１５分、（９４℃３０秒、５８℃２０秒、７２℃６０秒）×４３サイクル、７２℃２分の条件で増幅を行った。また、ＰＣＲ産物の塩基配列解析（シークエンス）を常法により行った。

（抗体可変領域遺伝子の発現ベクターへのクローニング）
抗体可変領域遺伝子のＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭＡＸＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）を使用して、説明書にしたがって実施した。鋳型として上述の１回目のＰＣＲ産物を使用し、プライマーとしては、上述の２回目のＰＣＲ産物のシークエンスの結果に基づいて、増幅する遺伝子座に適切なペアを選択した。ＰＣＲ条件は９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃１０秒で２５サイクルとした。ＰＣＲ産物の精製はＭｏｎｏＦａｓ（登録商標）ＤＮＡ精製キットＩ（ジーエルサイエンス社）を使用して、説明書にしたがって実施し、３０μＬのＢｕｆｆｅｒＣに溶出した。

精製されたＰＣＲ産物は全量３０μＬでＡｇｅＩ−ＨＦ（全ての鎖）及びＳａｌＩ−ＨＦ（重鎖）、ＢｓｉＷＩ（κ鎖）又はＸｈｏＩ（λ鎖）（以上、ＮＥＢ社）を用いて、適切な条件で制限酵素処理した。各鎖に応じた発現ベクターγ１ＨＣ（重鎖）、κ ＬＣ（κ鎖）、λ ＬＣ（λ鎖）も同様の酵素の組み合わせで制限酵素処理した。制限酵素産物の精製はＭｏｎｏＦａｓ（登録商標）ＤＮＡ精製キットＩ（ジーエルサイエンス社）を使用して、説明書にしたがって実施し、２０μＬのＢｕｆｆｅｒＣに溶出した。

制限酵素処理したＤＮＡのライゲーションはＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ＜ＭｉｇｈｔｙＭｉｘ＞（ＴａＫａＲａ社）を使用して、説明書にしたがって全量１０μＬで実施した。ライゲーション産物は、ＣｏｍｐｅｔｅｎｔＱｕｉｃｋＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社）へ４２℃の加温により１０μＬ形質転換した。プラスミド抽出は、ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）ＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＳｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を使用して、説明書にしたがって実施した。

続いて、１遺伝子につき４クローンをシークエンスした。抽出したプラスミドのシークエンス反応はＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ライフテクノロジーズ社）を使用して、説明書にしたがって実施した。反応産物はＢｉｇＤｙｅＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、説明書にしたがって精製し、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３１３０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ライフテクノロジーズ社）でシークエンスした。読まれた配列と２回目のＰＣＲ産物の配列のアラインメント解析を実施し、最も共通配列を保持するサンプルを選択した。

（遺伝子組換えモノクローナルＩｇＧ１抗体の発現）
遺伝子組換え抗体の作製にはＥｘｐｉ２９３（商標）ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ社）を説明書にしたがって用いた。３０ｍＬの系を以下に例示する。

継代し維持しているＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の密度が３．０×１０^６個／ｍＬ以上であり、生存率９５％以上であり、細胞が凝集していないことを確認した。３７℃に保温されたＥｘｐｉ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍｅｄｉｕｍを用いて、細胞数を２．９×１０^６個／ｍＬに調製した。使い捨てのベントフィルターキャップ付三角フラスコに、調製した細胞懸濁液を２５．５ｍＬ移し、３７℃、８％ＣＯ_２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地にプラスミドＤＮＡ３０μｇ（ＩｇＧ重鎖及び軽鎖各１５μｇ）を添加した。別に用意した１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地に８０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３Ｒｅａｇｅｎｔを添加した。５分間、室温で静置した後、ＤＮＡ溶液をＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ溶液へ全量加え、室温で２０〜３０分静置した。細胞へトランスフェクションミックスを添加した後、３７℃、８％ＣＯ_２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。トランスフェクションの１６〜１８時間後、１５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＥｎｈａｎｃｅｒ１及び１．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＥｎｈａｎｃｅｒ２を加えた。細胞は３７℃、８％ＣＯ_２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。トランスフェクション後６日で上清を回収した。

（遺伝子組換えモノクローナルＩｇＧ１抗体の精製）
細胞のデブリを１０００×ｇ、１０分間の遠心分離により取り除いた後、Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＶＦｉｌｔｅｒＵｎｉｔ（ミリポア社）で上清の濾過を行った。遺伝子組換え抗体の精製はＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ｈｕｍａｎＦｃａｆｆｉｎｉｔｙｍａｔｒｉｘ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、説明書にしたがって実施した。具体的には、カラムは１０カラム容量のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で平衡化し、サンプルをロードし、１０カラム容量のＰＢＳで洗浄し、５カラム容量の０．１ＭＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）により抗体を溶出し、１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で溶出液を中和した。カラムは１０カラム容量のＰＢＳで再平衡化した。抗体の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で測定した。抗体の濃縮はＡｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵｌｔｒａＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒＤｅｖｉｃｅｓ（ミリポア社）を用いて、説明書にしたがって実施した。ＺｅｂａＤｅｓａｌｔＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎｓ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で、説明書にしたがってＰＢ（ｐＨ７．４）にバッファー交換した。バッファー交換後の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐで測定した。

（遺伝子組換えモノクローナルＩｇＧ１抗体の確認）
精製した抗体の確認はＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−ＴｒｉｓＧｅｌ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、説明書にしたがってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を実施した。図１はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。抗体クローンＧ２、Ｈ１０、Ｄ１１、Ｆ９、Ｆ１１、Ｈ５及びＣ１が、ＩｇＧ１型化されたことが確認された。クローンによって発現量にばらつきが見られた。４０ｍＬ培養系において、クローンＢ１２は約４０ｍｇ、クローンＤ１１は約４ｍｇ、クローンＦ９は約１．５ｍｇ、クローンＦ１１は約２．１ｍｇ、クローンＨ５は約１ｍｇの抗体を作製することができた。

［実験例２：性状解析されたモノクローナルＩｇＧ抗体と同一の可変領域を保持するモノクローナルＩｇＡ抗体の作製］
ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体を以下の方法により作製した。実験例１で作製したＩｇＧ１抗体に限らず、配列が既知の抗体は全て以下の方法でＩｇＡ型化することができる。

（α１ＨＣ発現ベクターの作製）
ＩｇＡ１抗体定常領域遺伝子を含む発現ベクターα１ＨＣを作製した。ＩｇＡ１抗体定常領域遺伝子のＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭＡＸＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）を使用して、説明書にしたがって実施した。

具体的には、鋳型としてｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＡ１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）を用い、ＩｇＡ１抗体定常領域遺伝子を増幅した。ＰＣＲ条件は、９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃３０秒で３０サイクルとした。ＰＣＲ産物の精製はＭｏｎｏＦａｓ（登録商標）ＤＮＡ精製キットＩ（ジーエルサイエンス社）を使用して、説明書にしたがって実施し、３０μＬのＢｕｆｆｅｒＣに溶出した。精製したＰＣＲ産物及びγ１ＨＣプラスミドを、全量３０μＬでＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ−ＨＦ（以上、ＮＥＢ社）を用いて３７℃で制限酵素処理した。制限酵素処理産物の精製はＭｏｎｏＦａｓ（登録商標）ＤＮＡ精製キットＩ（ジーエルサイエンス社）を使用して、説明書にしたがって実施し、２０μＬのＢｕｆｆｅｒＣに溶出した。制限酵素処理したＤＮＡのライゲーションはＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ＜ＭｉｇｈｔｙＭｉｘ＞（ＴａＫａＲａ社）を使用して、説明書にしたがって全量１０μＬで実施した。ライゲーション産物は、ＣｏｍｐｅｔｅｎｔＱｕｉｃｋＤＨ５αへ４２℃の加温により１０μＬ形質転換した。

プラスミド抽出は、ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）ＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＳｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を使用して、説明書にしたがって実施した。抽出したプラスミドのシークエンス反応はＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ライフテクノロジーズ社）を使用して、説明書にしたがって実施した。反応産物はＢｉｇＤｙｅＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、説明書にしたがって精製され、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３１３０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ライフテクノロジーズ社）でシークエンスした。

（抗体可変領域遺伝子のα１ＨＣ発現ベクターへのＰＣＲクローニング）
抗体可変領域遺伝子のＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭＡＸＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）を使用して、説明書にしたがって実施した。γ１ＨＣ発現ベクターへクローニングした抗体遺伝子を鋳型として、リバースプライマーをα１ＨＣ発現ベクター用のものに変更し、ＰＣＲ条件は９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃５秒で２５サイクルとした。

ＰＣＲ産物の精製はＭｏｎｏＦａｓ（登録商標）ＤＮＡ精製キットＩ（ジーエルサイエンス社）を使用して、説明書にしたがって実施し、３０μＬのＢｕｆｆｅｒＣに溶出した。精製されたＰＣＲ産物及びα１ＨＣ発現ベクターは全量３０μＬでＡｇｅＩ−ＨＦ及びＮｈｅＩ−ＨＦ（以上、ＮＥＢ社）を用いて、適切な条件で制限酵素処理した。制限酵素産物の精製はＭｏｎｏＦａｓ（登録商標）ＤＮＡ精製キットＩ（ジーエルサイエンス社）を使用して、説明書にしたがって実施し、２０μＬのＢｕｆｆｅｒＣに溶出した。制限酵素処理したＤＮＡのライゲーションはＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ＜ＭｉｇｈｔｙＭｉｘ＞（ＴａＫａＲａ社）を使用して、説明書にしたがって全量１０μＬで実施した。ライゲーション産物は、ＣｏｍｐｅｔｅｎｔＱｕｉｃｋＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ社）へ４２℃の加温により１０μＬ形質転換した。

プラスミド抽出は、ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）ＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＳｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を使用して、説明書にしたがって実施した。抽出したプラスミドのシークエンス反応はＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ライフテクノロジーズ社）を使用して、説明書にしたがって実施した。反応産物はＢｉｇＤｙｅＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、説明書にしたがって精製し、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３１３０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ライフテクノロジーズ社）でシークエンスした。シークエンスの結果、γ１ＨＣ発現ベクターへクローニングした抗体遺伝子と同一であることが確かめられた。

（遺伝子組換えモノクローナルＩｇＡ１抗体の発現）
遺伝子組換え抗体の作製にはＥｘｐｉ２９３（商標）ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ社）を説明書にしたがって用いた。３０ｍＬの系を以下に例示する。

継代し維持しているＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の密度が３．０×１０^６個／ｍＬ以上であり、生存率９５％以上であり、細胞が凝集していないことを確認した。３７℃に保温されたＥｘｐｉ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍｅｄｉｕｍを用いて、細胞数を２．９×１０^６個／ｍＬに調製した。使い捨てのベントフィルターキャップ付三角フラスコに、調製した細胞懸濁液を２５．５ｍＬ移し、３７℃、８％ＣＯ_２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地にプラスミドＤＮＡ３０μｇ（ＩｇＡ１重鎖及び軽鎖各１５μｇ）を添加した。別に用意した１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地に８０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３Ｒｅａｇｅｎｔを添加した。５分間、室温で静置した後、ＤＮＡ溶液をＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ溶液へ全量加え、室温で２０〜３０分静置した。細胞へトランスフェクションミックスを添加した後、３７℃、８％ＣＯ_２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。トランスフェクションの１６〜１８時間後、１５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＥｎｈａｎｃｅｒ１及び１．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＥｎｈａｎｃｅｒ２を加えた。細胞は３７℃、８％ＣＯ_２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。トランスフェクション後６日で上清を回収した。

（遺伝子組換えモノクローナルＩｇＡ１抗体の精製）
細胞のデブリを１０００×ｇ、１０分間の遠心分離により取り除いた後、Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＶＦｉｌｔｅｒＵｎｉｔ（ミリポア社）で上清の濾過を行った。遺伝子組換え抗体の精製はＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ｈｕｍａｎＩｇＡａｆｆｉｎｉｔｙｍａｔｒｉｘ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、説明書にしたがって実施した。具体的には、カラムは１０カラム容量のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で平衡化し、サンプルをロードし、１０カラム容量のＰＢＳで洗浄し、５カラム容量の０．１ＭＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）により抗体を溶出し、１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で溶出液を中和した。カラムは１０カラム容量のＰＢＳで再平衡化した。抗体の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で測定した。抗体の濃縮はＡｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵｌｔｒａＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒＤｅｖｉｃｅｓ（ミリポア社）を用いて、説明書にしたがって実施した。ＺｅｂａＤｅｓａｌｔＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎｓ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で、説明書にしたがってＰＢ（ｐＨ７．４）にバッファー交換した。バッファー交換後の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐで測定した。

（遺伝子組換えモノクローナルＩｇＡ１抗体の確認）
精製した抗体の確認はＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−ＴｒｉｓＧｅｌ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、説明書にしたがってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を実施した。図２はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。抗体クローンＢ１２、Ｄ１１、Ｆ９、Ｆ１１及びＨ５が、ＩｇＡ１型化されたことが確認された。

［実験例３：モノクローナルＩｇＡ抗体の二量体作製］
実験例２において作製したＩｇＡ１抗体発現コンストラクトを用いて、二量体ＩｇＡ１型抗体を作製した。

（抗体Ｊ鎖のクローニング）
抗体Ｊ鎖は人工遺伝子合成サービス（オペロンバイオテクノロジー）を利用して、Ｊ鎖（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．ＮＭ＿１４４６４６）のコード領域（ＣＤＳ）の５’側にＸｈｏＩ切断サイト及びＫｏｚａｋ配列を付加し、３’側にＮｏｔＩ切断サイトを付加した人工遺伝子（配列番号２３）を合成した。Ｊ鎖遺伝子をＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ−ＨＦ（以上、ＮＥＢ社）を用いて、適切な条件で制限酵素処理した。同一の制限酵素で処理したｐＣＸＳＮベクター（ＣＭＶプロモーターとＳＶ４０ｐｏｌｙＡから構成される哺乳類細胞発現用ベクター）にクロ−ニングし、抗体Ｊ鎖の発現プラスミドであるｐＣＸＳＮ−ｈＪＣを得た。

（二量体ＩｇＡ１型抗体の発現）
二量体ＩｇＡ１型抗体の作製にはＥｘｐｉ２９３（商標）ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ社）を説明書にしたがって用いた。３０ｍＬの系を以下に例示する。

継代し維持しているＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の密度が３．０×１０^６個／ｍＬ以上であり、生存率９５％以上であり、細胞が凝集していないことを確認した。３７℃に保温されたＥｘｐｉ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍｅｄｉｕｍを用いて、細胞数を２．９×１０^６個／ｍＬに調製した。使い捨てのベントフィルターキャップ付三角フラスコに、調製した細胞懸濁液を２５．５ｍＬ移し、３７℃、８％ＣＯ_２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地にプラスミドＤＮＡ（Ｊ鎖発現群：ＩｇＡ１重鎖及び軽鎖各１２μｇ、Ｊ鎖６μｇ；Ｊ鎖非発現群：ＩｇＡ１重鎖及び軽鎖各１５μｇ）を添加した。

別に用意した１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地に８０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３Ｒｅａｇｅｎｔを添加した。５分間、室温で静置した後、ＤＮＡ溶液をＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ溶液へ全量加え、室温で２０〜３０分静置した。細胞へトランスフェクションミックスを添加した後、３７℃、８％ＣＯ_２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。トランスフェクションの１６〜１８時間後、１５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＥｎｈａｎｃｅｒ１及び１．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＥｎｈａｎｃｅｒ２を加えた。細胞は３７℃、８％ＣＯ_２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。トランスフェクション後６日で上清を回収した。

（発現させたＩｇＡ１抗体の精製）
細胞のデブリを１０００×ｇ、１０分間の遠心分離により取り除いた後、Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＶＦｉｌｔｅｒＵｎｉｔ（ミリポア社）で上清の濾過を行った。遺伝子組換え抗体の精製はＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ｈｕｍａｎＩｇＡａｆｆｉｎｉｔｙｍａｔｒｉｘ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、説明書にしたがって実施した。具体的には、カラムは１０カラム容量のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で平衡化し、サンプルをロードし、１０カラム容量のＰＢＳで洗浄し、５カラム容量の０．１ＭＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）により抗体を溶出し、１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で溶出液を中和した。カラムは１０カラム容量のＰＢＳで再平衡化した。抗体の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で測定した。抗体の濃縮はＡｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵｌｔｒａＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒＤｅｖｉｃｅｓ（ミリポア社）を用いて、説明書にしたがって実施した。ＺｅｂａＤｅｓａｌｔＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎｓ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で、説明書にしたがってＰＢ（ｐＨ７．４）にバッファー交換した。バッファー交換後の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐで測定した。

（発現させたＩｇＡ１抗体の確認）
精製した抗体の確認は、未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＢＮ−ＰＡＧＥ、３−１３％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により行った。図３はＢＮ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。Ｊ鎖非発現群（−Ｊ）では、単量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体のバンドが確認されたのに対し、Ｊ鎖発現群（＋Ｊ）では、単量体のバンドに加えて、二量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体のバンドが確認された。

［実験例４：モノクローナルＩｇＡ抗体の多量体作製］
実験例２において作製したＩｇＡ１抗体発現コンストラクトを用いて、多量体ＩｇＡ１型抗体を作製した。

（分泌成分（Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙｃｏｍｐｏｎｅｎｔ、ＳＣ）のクローニング）
ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｓｔｒｉｎｇｓ（商標）ＤＮＡＦｒａｇｍｅｎｔｓ（ライフテクノロジーズ社）を利用して、ｐｏｌｙｍｅｒｉｃｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．ＮＭ＿００２６４４）の１８５〜２００５残基の５’側にＸｈｏＩ切断サイト及びＫｏｚａｋ配列を付加し、３’側にＨｉｎｄＩＩＩ切断サイト、ｔｈｒｏｍｂｉｎ切断サイト、ヒスチジンタグ及びＮｏｔＩ切断サイトを付加した人工ＤＮＡフラグメントを、中央付近で重複するように５’側フラグメントと３’側フラグメントの２本合成した。合成した２本のＤＮＡフラグメントを鋳型に用いてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭＡＸＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）を使用したｏｖｅｒｌａｐＰＣＲを行い、分泌成分（ＳＣ）をコードする遺伝子断片を増幅した（配列番号２４）、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで制限酵素処理し、ｐＣＸＳＮベクターにクローニングし、分泌成分の発現プラスミドであるｐＣＸＳＮ−ｈＳＣ−ＨｉｓＴａｇを得た。また、ｐＣＸＳＮ−ｈＳＣ−ＨｉｓＴａｇを鋳型としてインバースＰＣＲを行い、３’側に付与したＨｉｎｄＩＩＩ切断サイト、ｔｈｒｏｍｂｉｎ切断サイト、ヒスチジンタグを除去した分泌成分のみを発現するｐＣＸＳＮ−ｈＳＣを作製した。分泌成分としてどちらのプラスミドを用いても多量体抗体を作製することができた。

（多量体ＩｇＡ１型抗体の発現）
多量体ＩｇＡ１型抗体の作製にはＥｘｐｉ２９３（商標）ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ社）を説明書にしたがって用いた。３０ｍＬの系を以下に例示する。

継代し維持しているＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の密度が３．０×１０^６個／ｍＬ以上であり、生存率９５％以上であり、細胞が凝集していないことを確認した。３７℃に保温されたＥｘｐｉ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍｅｄｉｕｍを用いて、細胞数を２．９×１０^６個／ｍＬに調製した。使い捨てのベントフィルターキャップ付三角フラスコに、調製した細胞懸濁液を２５．５ｍＬ移し、３７℃、８％ＣＯ_２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地にプラスミドＤＮＡ（ＩｇＡ１重鎖及び軽鎖各１２μｇ、Ｊ鎖及び分泌成分各６μｇ）を添加した。

（多量体ＩｇＡ１型抗体のサイズ分画）
濃縮した多量体ＩｇＡ１型抗体を、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１０（ＧＥヘルスケア社）を用いて、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画した。カラムには、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６１０／３００ＧＬ（ＧＥヘルスケア社）を用いた。ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ）を以下のプロトコールで流した。流速０．５ｍＬ／分、カラム平衡化１．５カラム容量、溶出０．５ｍＬ（計１．５カラム容量）。

溶出したサンプルをフラクションごとに回収し、ＩｇＡを含むフラクションをＡｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵｌｔｒａＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒＤｅｖｉｃｅｓ（ミリポア社）を用いて濃縮した。ＺｅｂａＤｅｓａｌｔＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎｓ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で、説明書にしたがってＰＢ（ｐＨ７．４）にバッファー交換した。バッファー交換後の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐで測定した。

続いて、各フラクションに含まれる抗体を、非還元条件下のＢｌｕｅｎａｔｉｖｅＰＡＧＥ（ＢＮ−ＰＡＧＥ）により確認した。図４は、ゲル濾過クロマトグラフィーのチャート及びフラクション１９〜３２に含まれる抗体のＢＮ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。発現させたＩｇＡ１型抗体には、四量体、二量体、単量体が含まれることが示された。この結果は、四量体ＩｇＡ型遺伝子組換え抗体を作製した初めての結果である。

［実験例５：インフルエンザウイルス中和活性の検討］
実験例１において、インフルエンザウイルスに対するヒトＩｇＧ１抗体を作製し、実験例２において、当該ＩｇＧ１抗体と同一の可変領域を有するＩｇＡ１抗体を作製した。また、実験例３及び４において多量体ＩｇＡ１型抗体を作製した。これらの抗体を用いて、インフルエンザウイルス中和活性を検討した。

調製した各抗体の中和活性は、マイクロ中和試験による最小中和濃度測定により定量した。サンプルの２倍段階希釈系列を準備し、１００ＴＣＩＤ_５０（５０％組織培養感染量の１００倍量）のウイルス液と混合後、３０分間３７℃にてインキュベーションした。その後、この混合液をＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓由来株化細胞）に添加して４日間培養を行い、顕微鏡下でインフルエンザウイルスによる細胞変性効果が確認できないサンプル最大希釈倍率でサンプルの濃度を割った値を最少中和濃度とした。最少中和濃度が低いほどウイルス中和活性が高いことを示す。

（単量体遺伝子組換え抗体のインフルエンザウイルス中和活性）
抗体クローンＧ２、Ｈ１０、Ｄ１１、Ｆ９、Ｆ１１、Ｈ５、Ｂ１２及びＣ１の単量体ＩｇＧ１型抗体及び単量体ＩｇＡ１型抗体を用いて、インフルエンザウイルス中和活性を測定した。ウイルスにはＡ／Ｈ５Ｎ１株（ｃｌａｄｅ２．１）及びＡ／Ｈ１Ｎ１株を使用した。

表１に結果を示す。最少中和濃度が低いほどウイルス中和活性が高いことを示す。クローンＦ１１及びＨ５の抗体は、Ｈ５Ｎ１株及びＨ１Ｎ１株の双方に対して良好な中和活性を示すことが明らかとなった。

（二量体ＩｇＡ１型遺伝子組換え抗体のインフルエンザウイルス中和活性）
抗体クローンＤ１１、Ｆ９、Ｆ１１、Ｈ５及びＢ１２の単量体ＩｇＡ１型抗体及び二量体ＩｇＡ１型抗体を用いて、上記と同様にしてインフルエンザウイルス中和活性を測定した。ウイルスにはＡ／Ｈ５Ｎ１株（ｃｌａｄｅ２．１）及びＡ／Ｈ１Ｎ１株を使用した。

表２に結果を示す。最少中和濃度が低いほどウイルス中和活性が高いことを示す。抗体の可変領域の構造は同じであるにもかかわらず、単量体抗体よりも二量体抗体の方が、ウイルス中和活性が高い傾向が示された。

（四量体ＩｇＡ１型遺伝子組換え抗体のインフルエンザウイルス中和活性）
抗体クローンＦ９、Ｆ１１及びＨ５の単量体ＩｇＡ１型抗体、二量体ＩｇＡ１型抗体及び四量体ＩｇＡ１型抗体を用いて、上記と同様にしてインフルエンザウイルス中和活性を測定した。ウイルスにはＡ／Ｈ５Ｎ１株（ｃｌａｄｅ２．１）を使用した。表３に結果を示す。最少中和濃度が低いほどウイルス中和活性が高いことを示す。

抗体の可変領域の構造は同じであるにもかかわらず、単量体抗体よりも二量体抗体の方がウイルス中和活性が高く、二量体抗体よりも四量体抗体の方がウイルス中和活性が高い傾向が示された。

（多量体化によるインフルエンザウイルス中和活性の増加）
抗体クローンＦ１１及びＨ５について、単量体ＩｇＧ１型抗体、単量体ＩｇＡ１型抗体、二量体ＩｇＡ１型抗体及び四量体ＩｇＡ１型抗体の中和能の活性比較のため、図５Ａ及び図５Ｂに単量体ＩｇＧ１型抗体のウイルス中和活性を１とした場合における、単量体ＩｇＡ１型抗体、二量体ＩｇＡ１型抗体及び四量体ＩｇＡ１型抗体の中和活性比を示した。ウイルスにはＡ／Ｈ５Ｎ１株（ｃｌａｄｅ２．１）を使用した。

図５Ａは、単量体ＩｇＧ１型抗体のウイルス中和活性を１とした場合における、単量体ＩｇＡ１型抗体、二量体ＩｇＡ１型抗体及び四量体ＩｇＡ１型抗体の単位タンパク質量当たりの中和活性比を示すグラフである。

図５Ｂは、単量体ＩｇＧ１型抗体のウイルス中和活性を１とした場合における、単量体ＩｇＡ１型抗体、二量体ＩｇＡ１型抗体及び四量体ＩｇＡ１型抗体の単位分子数当たりの中和活性比を示すグラフである。

クローンＦ１１及びＨ５共に、ＩｇＧ１型からＩｇＡ１型に変換することによりウイルス中和活性の増加が認められ、更に、二量体化、四量体化することにより更なる中和活性の増加が認められた。また、抗体１モルあたりのウイルス中和活性は、四量体化することにより、単量体の１００倍以上の上昇が認められた。

［実験例６：抗体の塩基配列及びアミノ酸配列の解析］
抗体クローンＦ１１及びＨ５について、重鎖及び軽鎖の塩基配列及びアミノ酸配列をＩＧＢＬＡＳＴ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）にて解析した。また、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）をＡｎｄｒｅｗＣ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ博士らの方法（http://www.bioinf.org.uk/abs/）により決定した。配列表の配列番号と、各塩基配列及びアミノ酸配列との対応を表４に示す。クローンＦ１１の軽鎖はκ鎖であった。また、クローンＨ５の軽鎖はλ鎖であった。

［実験例７：抗原結合活性の検討］
（遺伝子組換えインフルエンザウイルスHAタンパク質発現ベクターの作製）
インフルエンザウイルスのＨＡのエクトドメインをコードする配列のC末端側に三量体形成配列および精製用タグのコード配列（バクテリオファージＴ４フィブリチン三量体形成フォールドン配列、トロンビン切断部位（ＲＳＲＳＬＶＰＲＧＳＰＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ、配列番号２５）、タンパク質精製用の６×Ｈｉｓｔａｇ配列（Stevens J. et al., Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus., Science 303, 1866-1870, 2004 を参照））を融合したアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を合成し、哺乳類細胞発現用のベクターｐＣＸＳＮにクローニングした。

（遺伝子組換えインフルエンザウイルスＨＡタンパク質の発現）
遺伝子組換えインフルエンザウイルスＨＡタンパク質の作製にはＥｘｐｉ２９３（商標）ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ社）を説明書にしたがって用いた。３０ｍＬ系を以下に例示する。

継代し維持しているＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の密度が３．０×１０^６個／ｍＬ以上であり、生存率９５％以上であり、細胞が凝集していないことを確認した。３７℃に保温されたＥｘｐｉ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍｅｄｉｕｍを用いて、細胞数を２．９×１０^６個／ｍＬに調製した。使い捨てのベントフィルターキャップ付三角フラスコに、調製した細胞懸濁液を２５．５ｍＬ移し、３７℃、８％ＣＯ_２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地にプラスミドＤＮＡ３０μｇを添加した。別に用意した１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地に８０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３Ｒｅａｇｅｎｔを添加した。５分間、室温で静置した後、ＤＮＡ溶液をＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ溶液へ全量加え、室温で２０〜３０分静置した。細胞へトランスフェクションミックスを添加した後、３７℃、８％ＣＯ_２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。トランスフェクションの１６〜１８時間後、１５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＥｎｈａｎｃｅｒ１及び１．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＥｎｈａｎｃｅｒ２を加えた。細胞は３７℃、８％ＣＯ_２に調整した細胞培養用インキュベーターに戻し、１２５ｒｐｍで振盪培養した。トランスフェクション後４−６日で上清を回収した。

（遺伝子組換えインフルエンザウイルスＨＡタンパク質の精製）
まず、回収した上清中の細胞のデブリを１０００×ｇ、１０分間の遠心分離により取り除いた。続いて、Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＶＦｉｌｔｅｒＵｎｉｔ（ミリポア社）を使用して上清をろ過した。続いて、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１０（ＧＥヘルスケア社）を用いたアフィニティー精製により遺伝子組換えインフルエンザウイルスＨＡタンパク質を精製した。カラムにはＨｉｓＴｒａｐｅｘｃｅｌ（ＧＥヘルスケア社）を用いた。より具体的には、平衡化溶液として２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４を使用した。また、洗浄液として２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４を使用した。また、溶出液として、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４を使用した。精製条件は、流速１ｍＬ／分、カラム平衡化１０ＣＶ、カラム洗浄４０ＣＶ、溶出１ｍＬ／フラクション（計５０ＣＶ）、カラム再平衡化５ＣＶとした。タンパク質を濃縮する場合には、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵｌｔｒａＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒＤｅｖｉｃｅｓを用いて、説明書にしたがって濃縮した。精製されたタンパク質の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を用いた吸光測定により測定した。

抗体クローンＢ１２及びＦ１１について、単量体ＩｇＡ１型抗体、二量体ＩｇＡ１型抗体及び四量体ＩｇＡ１型抗体を用いて、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質に対する抗原結合活性を検討した。

９６ウェルハーフプレートに５０μＬの遺伝子組換えＨＡタンパク質（Ａ／Ｈ５Ｎ１株由来、１μｇ／ｍＬ）を添加し、４℃で一晩放置した後、ブロッキングを行った。

続いて、各抗体サンプルの２倍段階希釈系列を４℃で一晩反応させた。ＰＢＳＴでの洗浄後、Ｇｏａｔａｎｔｉ−ＨｕｍａｎＩｇＡＡｎｔｉｂｏｄｙＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅＣｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＢＥＴＨＹＬＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社）を２５００倍希釈したものを、室温で１時間反応させた。続いて、ＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅＳｕｂｓｔｒａｔｅ（ＳＩＧＭＡ社）を用いて発色反応を行い、６９０ｎｍを基準波長として４０５ｎｍの波長における吸光度を測定した。測定された吸光度に基づいて、各抗体のＨＡタンパク質に対する最少結合濃度を求めた。

結果を表５及び表６に示す。抗体クローンＦ１１では、ワクチンと同クレードのウイルス（Ａ／Ｈ５Ｎ１（ｃｌａｄｅ２．１）由来ＨＡに対しては、二量体及び四量体で、単量体よりも結合活性の上昇が見られた。また、ワクチンと別クレードのウイルス（Ａ／Ｈ５Ｎ１（ｃｌａｄｅ１）由来のＨＡに対しては、四量体で最も強い抗原結合活性が見られた。また、単量体の抗体で抗原結合活性を有するクローンは、多量体化することにより、抗原結合活性が向上することが示された。

［実験例８：ＣＨＯＹＡ７細胞とｃｉｓ−エレメント使用による多量体抗体の発現増強効果］
上述した抗体Ｊ鎖タンパク質の発現プラスミドであるｐＣＸＳＮ−ｈＪＣのプロモーターの下流かつＪ鎖タンパク質の開始コドンの上流に、配列番号２１に示すｃｉｓ−エレメント＃１を導入し、ｐＣＸＳＮ−ｃｉｓ＃１−ｈＪＣを得た。遺伝子配列解析によりｃｉｓ−エレメントの向きが正しい挿入方向であることを確認した。

また、上述した分泌成分の発現プラスミドであるｐＣＸＳＮ−ｈＳＣのプロモーターの下流かつ分泌成分タンパク質の開始コドンの上流に、配列番号２２に示すｃｉｓ−エレメント＃２を導入し、ｐＣＸＳＮ−ｃｉｓ＃２−ｈＳＣを得た。遺伝子配列解析によりｃｉｓ−エレメントの向きが正しい挿入方向であることを確認した。

ｐ１８０タンパク質とＳＦ３ｂ４タンパク質を共発現する細胞株である、ＣＨＯＹＡ７細胞及び対照のＣＨＯ細胞それぞれ１×１０^５個に対して、実験例２で構築したＩｇＡ１抗体重鎖発現プラスミド、軽鎖全長の発現プラスミド、ｐＣＸＳＮ−ｃｉｓ＃１−ｈＪＣ及びｐＣＸＳＮ−ｃｉｓ＃２−ｈＳＣの４種類の発現プラスミド各０．５μｇずつを、リポフェクション法にてトランスフェクションした。

５％ウシ胎児血清０．５ｍＬを含むＤＭＥＭ培地中で２４時間培養した後、培養上清各１０μＬを実験例３と同様にしてＢＮ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜へ転写後にぺルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＡ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社）を使用して検出し、多量体ＩｇＡ型抗体産生能を評価した。

図６は、ＢＮ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。レーン１及び２は、ＣＨＯ細胞で多量体ＩｇＡ型抗体を発現させた結果であり、レーン３及び４は、ＣＨＯＹＡ７細胞で多量体ＩｇＡ型抗体を発現させた結果である。また、レーン１及び３は、対照として、ｃｉｓ−エレメントを有しない抗体Ｊ鎖タンパク質の発現プラスミド及びｃｉｓ−エレメントを有しない分泌成分の発現プラスミドを使用した結果であり、レーン２及び４は、ｃｉｓ−エレメントを有する抗体Ｊ鎖タンパク質の発現プラスミド及びｃｉｓ−エレメントを有する分泌成分の発現プラスミドを使用した結果である。矢印は四量体ＩｇＡ型抗体のバンドを示す。

その結果、ｃｉｓ−エレメントを有しない発現プラスミドを用いた場合において、ＣＨＯＹＡ７細胞の多量体ＩｇＡ型抗体の分泌量がＣＨＯ細胞の約２倍に増加したことが示された。更に、ｃｉｓ−エレメントを有する発現プラスミドの使用により、ＣＨＯＹＡ７細胞の多量体ＩｇＡ型抗体の分泌量がＣＨＯ細胞の３．２倍に増加したことが示された。

以上の結果は、ｐ１８０タンパク質及びＳＦ３ｂ４タンパク質を共発現することや、ｃｉｓ−エレメントを有する発現プラスミドを使用することにより、多量体ＩｇＡ型抗体の高効率な発現及び分泌が可能であることを示す。

本発明によれば、本発明は、複数の型のインフルエンザウイルスに対する中和活性を有する抗体又はそのフラグメントを提供することができる。本発明はまた、インフルエンザウイルスによる感染症の治療又は予防剤、及び抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸及びベクターを提供することができる。

Claims

Ａ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する、抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメント。
（ａ１）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｂ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｃ１）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ１）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｅ１）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｆ１）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメインを有する、請求項１に記載の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメント。
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメインを有する、請求項２に記載の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメント。
配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、及び／又は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを有する、請求項２又は３に記載の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメント。
（ａ２）配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｂ２）配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｃ２）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ２）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｅ２）配列番号１３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｆ２）配列番号１４に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメインを有する、請求項１に記載の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメント。
配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメインを有する、請求項５に記載の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメント。
配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、及び／又は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを有する、請求項５又は６に記載の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメント。
ＩｇＡ型である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメント。
多量体ＩｇＡ型である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメント。
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含有する、インフルエンザウイルスによる感染症の治療又は予防剤。
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗インフルエンザウイルス抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸。
（ｇ１）配列番号１７に示される塩基配列からなる核酸、
（ｈ１）配列番号１７に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の重鎖可変ドメインをコードする核酸、
（ｉ１）配列番号１７に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の重鎖可変ドメインをコードする核酸、又は、
（ｊ１）配列番号１７に示される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の重鎖可変ドメインをコードする核酸。
（ｇ２）配列番号１８に示される塩基配列からなる核酸、
（ｈ２）配列番号１８に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の軽鎖可変ドメインをコードする核酸、
（ｉ２）配列番号１８に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の軽鎖可変ドメインをコードする核酸、又は、
（ｊ２）配列番号１８に示される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の軽鎖可変ドメインをコードする核酸。
（ｇ３）配列番号１９に示される塩基配列からなる核酸、
（ｈ３）配列番号１９に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の重鎖可変ドメインをコードする核酸、
（ｉ３）配列番号１９に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の重鎖可変ドメインをコードする核酸、又は、
（ｊ３）配列番号１９に示される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の重鎖可変ドメインをコードする核酸。
（ｇ４）配列番号２０に示される塩基配列からなる核酸、
（ｈ４）配列番号２０に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の軽鎖可変ドメインをコードする核酸、
（ｉ４）配列番号２０に示される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の軽鎖可変ドメインをコードする核酸、又は、
（ｊ４）配列番号２０に示される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなり、かつＡ／Ｈ５Ｎ１型のインフルエンザウイルス及びＡ／Ｈ１Ｎ１型のインフルエンザウイルスの双方に対する中和活性を有する抗体の軽鎖可変ドメインをコードする核酸。
請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の核酸を発現ベクターに挿入してなる組換えベクター。